基因多態(tài)性分析的意義范文

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篇1

【摘要】 目的 探討CYP1A1和GSTM1基因多態(tài)性與個(gè)體肺癌易感性的關(guān)系。方法 全面檢索相關(guān)文獻(xiàn)，應(yīng)用Meta分析方法對(duì)各研究進(jìn)行數(shù)據(jù)的合并與分析。結(jié)果 共8篇文獻(xiàn)入選，累計(jì)肺癌病例1067人，對(duì)照1416人，分別對(duì)CYP1A1*A和GSTM1-、CYP1A1*B/C和GSTM1+、CYP1A1*B/C和GSTM1-聯(lián)合基因型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。異質(zhì)性檢驗(yàn)χ2值分別為6.43、8.83與9.63，P>0.05，文獻(xiàn)有同質(zhì)性，各合并OR及95%CI分別為1.36(1.09～2.77)、1.65(1.26～2.15)和2.01(1.57～2.59)。結(jié)論 CYP1A1和GSTM1突變基因型為罹患肺癌的易感基因型，且兩者存在協(xié)同作用，在腫瘤防治方案中應(yīng)加以重視從而采取相應(yīng)措施達(dá)到有效預(yù)防腫瘤的目的。

【關(guān)鍵詞】 肺癌；CYP1A1基因；GSTM1基因；多態(tài)性； Meta分析

The Polymorphisms of CYP1A1 and GSTM1 Genes on Inpidual Susceptibility to Lung Cancer:Metaanalysis

Key words：Lung cancer；CYP1A1gene；GSTM1gene；Polymorphisms；Meta analysis

以細(xì)胞色素P450(CYP)和谷胱苷肽S轉(zhuǎn)硫酶(GST)為代表的Ⅰ、Ⅱ相代謝酶是環(huán)境化學(xué)致癌物激活、解毒代謝通路中的重要酶類[1]。CYP1A1可將無(wú)活性的前致癌物活化為終致癌物。GSTM1可以與終致癌物結(jié)合使其排出體外，兩者的變異有可能造成終致癌物在體內(nèi)的大量堆積，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。CYP1A1基因5’端4889位點(diǎn)AG的突變，導(dǎo)致編碼異亮氨酸的密碼子ATT被纈氨酸密碼子GTT取代，形成了CYP1A1 Ile/Val 多態(tài)，包括常見(jiàn)基因型A(Ile/Ile)、雜合型B(Ile/Val)及純合型C(Val /Val)。GSTM1基因的高度同源區(qū)發(fā)生了同源染色體的不等交換導(dǎo)致了包括整個(gè)GSTM1基因在內(nèi)的 15KB堿基的丟失，形成了GSTM1+/-多態(tài)，GSTM1+為功能型，GSTM1-為純合子缺失基因型。

肺癌是嚴(yán)重危害人類健康的惡性腫瘤，已列為惡性腫瘤死因的第一位[2]。病因?qū)W研究已肯定的認(rèn)為吸煙、大氣污染等是肺癌發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素，但并非與這些因素密切接觸者都會(huì)發(fā)生肺癌，表明除這些因素外，還有其他因素起著獨(dú)立危險(xiǎn)因素的作用或影響這幾種因素的作用[3]。許多學(xué)者從代謝酶基因多態(tài)變異性與肺癌易感性的方面進(jìn)行了研究，有關(guān)CYP1A1和GSTM1的基因多態(tài)型與肺癌易感性的研究已有不少，但各研究結(jié)果不完全一致，本文運(yùn)用Meta分析方法對(duì)此方面的研究進(jìn)行了綜合客觀的分析評(píng)價(jià)，從而為肺癌的防治策略提供有意義的參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1文獻(xiàn)檢索以“CYP1A1”或“GSTM1”，“Polymorphisms”，“l(fā)ung cancer”為檢索詞，檢索1990年1月～2005年1月在Medline、Elesiver等數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)表的文獻(xiàn)，檢索語(yǔ)種為英語(yǔ)。以“肺癌”，“CYP1A1”，“GSTM1”為檢索詞，檢索1994年1月～2005年1月在CNKI和萬(wàn)方數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)表的文獻(xiàn)，檢索語(yǔ)種為漢語(yǔ)。各文獻(xiàn)有用的參考文獻(xiàn)亦作為本研究入選文獻(xiàn)。

1.2文獻(xiàn)納入標(biāo)準(zhǔn)肺部原發(fā)癌，病理學(xué)診斷確診；有關(guān)CYP1A1 Ile/Val和GSTM1基因多態(tài)性與各型肺癌易感性的病例對(duì)照研究；研究方法相似；有綜合的統(tǒng)計(jì)指標(biāo)：比值比（OR）；匯總的結(jié)果可用相應(yīng)的統(tǒng)計(jì)指標(biāo)表達(dá)。

1.3統(tǒng)計(jì)分析方法[4]參考Lichtentein等[5]提供的文獻(xiàn)質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)篩選文獻(xiàn).以比值比（Odds Ratio，OR）作為評(píng)價(jià)肺癌與易感基因型聯(lián)系強(qiáng)度指標(biāo)，采用Meta分析進(jìn)行數(shù)據(jù)合并。

1.3.1異質(zhì)性檢驗(yàn)采用Q統(tǒng)計(jì)量法，Q服從于自由度為k1的χ2檢驗(yàn)。若研究間無(wú)顯著異質(zhì)性(P

1.3.2發(fā)表性偏倚的評(píng)估采用失效安全數(shù)法來(lái)評(píng)價(jià)。據(jù)公式m>[k×ln(ORMH)/1.96] 2k分析，k 為文獻(xiàn)數(shù)，m為使得合并效應(yīng)量出現(xiàn)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的最少未發(fā)表文獻(xiàn)數(shù)，為k個(gè)文獻(xiàn)的平均權(quán)重。

2結(jié)果

2.1各入選文獻(xiàn)研究質(zhì)量的一般描述

按照材料與方法所述，共8篇文獻(xiàn)入選，這些文獻(xiàn)均報(bào)道了CYP1A1 Ile/Val位點(diǎn)與GSTM1聯(lián)合基因型和肺癌易感性的關(guān)系，入選文獻(xiàn)共有1067例病人，對(duì)照1416例，各基因多態(tài)型的鑒定均采用等位基因特異性PCR和多重差別PCR方法。各文獻(xiàn)研究方法均為分組病例對(duì)照研究，肺癌診斷標(biāo)準(zhǔn)明確，肺癌患者吸煙狀況、年齡均與對(duì)照均衡匹配，對(duì)照均來(lái)源于健康人群。各研究特點(diǎn)及各文獻(xiàn)基因型分布，見(jiàn)表1，其中文獻(xiàn)［1113］將雜合子B與純合突變子C合并研究。

2.2Meta分析結(jié)果

2.2.1文獻(xiàn)異質(zhì)性檢驗(yàn)Q為檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量，見(jiàn)表2。

2.2.2文獻(xiàn)合并OR分析聯(lián)合突變基因型中，擁有B雜合子與GSTM1-聯(lián)合基因型個(gè)體數(shù)在人群中的頻率約是擁有C純合子與GSTM1-聯(lián)合基因型個(gè)體數(shù)的4.5倍[9]，故本研究將CYP1A1突變純合子B和雜合子C基因型合并起來(lái)加以分析。各OR值以常見(jiàn)聯(lián)合基因型CYP1A1*A和GSTM1+個(gè)體為參考算出。本研究采用固定效應(yīng)模型的方差倒數(shù)權(quán)重法分析，各文獻(xiàn)Meta分析結(jié)果見(jiàn)表2、3及圖1。

2.3發(fā)表性偏倚評(píng)估

結(jié)果見(jiàn)表2，顯示本研究受發(fā)表性偏倚影響程度較小，結(jié)論較可靠。

2.4敏感性分析

應(yīng)用隨機(jī)效應(yīng)模型方法再進(jìn)行分析，A和GSTM1-、B/C和GSTM1+及B/C和GSTM1聯(lián)表1入選文獻(xiàn)特點(diǎn)及文獻(xiàn)CYP1A1 Ile/Val位點(diǎn)和GSTM1聯(lián)合基因型分布 注：*指有顯著性意義；"-"指未從原文獲得；GSTM+:功能型； GSTM-:純合子缺失型表2入選文獻(xiàn)Meta分析結(jié)果注：**合并分析時(shí)剔除文獻(xiàn)12; m為發(fā)表性偏倚評(píng)估時(shí)使得合并效應(yīng)量出現(xiàn)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的最少未發(fā)表文獻(xiàn)數(shù)表3CYP1A1和GSTM1聯(lián)合基因型和肺癌易感性的Meta分析結(jié)果合基因型合并后OR值與95%可信區(qū)間分別為1.36(1.08-2.72) 、1.66(1.19-2.29) 和2.02(1.49-2.72)，與方差倒數(shù)權(quán)重法合并的OR相比非常接近，說(shuō)明本研究合并結(jié)果穩(wěn)定性好。

3討論

本文按照經(jīng)典的Meta分析方法，對(duì)有關(guān)CYP1A1 Ile/Val位點(diǎn)和GSTM1 基因突變基因型與肺癌的遺傳易感性進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示CYP1A1 和GSTM1的突變基因型均為罹患肺癌的易感基因型，攜帶CYP1A1 B/C 和GSTM1的聯(lián)合基因型的個(gè)體罹患肺癌的危險(xiǎn)度較攜帶單一突變易感基因型的個(gè)體高，提示兩者協(xié)同作用的存在，說(shuō)明基因基因之間的相互作用也可能會(huì)最終導(dǎo)致肺癌的發(fā)生，提示CYP1A1突變基因型 和GSTM1基因缺失可能是肺癌的一個(gè)生物標(biāo)志物。

CYP1A1 和GSTM1代謝酶的平衡與人體對(duì)環(huán)境化致癌物及致突變物易感性密切相關(guān)，它們的活性因遺傳多態(tài)性的不同而有明顯的差異，從而影響個(gè)體對(duì)致癌劑的易感性。人群中攜帶B與GSTM1-聯(lián)合基因型個(gè)體的頻率約是C與GSTM1-聯(lián)合基因型個(gè)體的4.5倍[9]，因此前者對(duì)人群肺癌危險(xiǎn)度的作用較后者大，更應(yīng)引起更多的重視，同時(shí)有研究也提示CYP1A1 Ile/Val遺傳多態(tài)性中的雜合子對(duì)人群的肺癌危險(xiǎn)度有較大的作用[7]，故本研究將CYP1A1突變純合子和雜合子基因型合并起來(lái)加以分析。酵母微粒體表達(dá)實(shí)驗(yàn)顯示[14]：CYP1A1纈氨酸（Val）型較異亮氨酸（Ile）型有較高的芳烴羥化酶（AHH）活性和誘變性，提示Val型AHH能更好的活化PAH等原致癌物，如不能被GSTM1酶及時(shí)滅活，這種聯(lián)合基因型個(gè)體則顯示有較大的肺癌危險(xiǎn)型。由于環(huán)境暴露因素的強(qiáng)度也強(qiáng)烈的影響甚至掩蓋易感基因的作用，本研究?jī)H僅從遺傳易感性來(lái)研究腫瘤的發(fā)生是片面的。環(huán)境致癌物代謝是涉及多種代謝酶的復(fù)雜過(guò)程，肺癌的發(fā)生也是涉及環(huán)境因子和多種基因相互作用的復(fù)雜過(guò)程，本研究提示攜帶CYP1A1和GSTM1突變基因型的個(gè)體屬肺癌高危險(xiǎn)人群，腫瘤防治方案中應(yīng)加以重視，雖然尚不能通過(guò)改變其腫瘤易感的基因型來(lái)防治腫瘤，但可以根據(jù)其與環(huán)境病因相互作用的特點(diǎn)，采取相應(yīng)的控制環(huán)境病因的措施以達(dá)到有效預(yù)防腫瘤的目的。

由于各種偏倚的存在，且分析中還有各種混雜因素的存在，因此對(duì)于CYP1A1 和GSTM1聯(lián)合突變基因型在肺癌易感性中的作用，還需要更多的資料、更詳實(shí)的數(shù)據(jù)來(lái)研究和證實(shí)。

【參考文獻(xiàn)】

［1］ Smith GB，Harper PA，Wong JM，et al.Human lung microsomal cytochrome P4501A1 (CYP1A1) activities: impact of smoking status and CYP1A1，aryl hydrocarbon receptor，and glutathione Stransferase M1 genetic polymorphisms [J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2001，10(8):839853.

［2］Kiyohara C，Wakai K，Mikami H，et al.Risk modification by CYP1A1 and GSTM1 polymorphisms in the association of environmental tobacco smoke and lung cancer: a casecontrol study in Japanese nonsmoking women[J].Int J Cancer，2003，107(1):139144.

［3］Paolo Vinis.The relationship between polymorphism of xenobiotic metabolizing enzymes and susceptibility to cancer[J].Toxicology，2002，181182(7):457462.

［4］王家良.臨床流行病學(xué)[M].第2版.上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社，2001.314325.

［5］Lichtenstein MJ，Mulrow CD，Elwood PC.Guidelines for reading case control studies[J].J Chron Dis，1987，40 (9):893903.

［6］翟永華，石于波，鐘禮杰，等.非吸煙女性肺癌患者細(xì)胞色素P4501A1和GSTM1的基因型[J].TUMOR（Shanghai），1998，18(2):8082.

［7］Kel Nakachi，Kazue Imai，Shinichi Hayashi，et al.Polymorphisms of CYP1A1 and Glutathione STransferase genes associated with susceptibility to lung cancer in relation to cigarette dose in a Japanese population[J].Cancer Res，1993，53(13):29942999.

［8］Persson I，Johansson I，Lou YC，et al.Genetic polymorphism of xenobiotic metabolizing enzymes among Chinese lung cancer patients[J].Int J Cancer，1999，81(3):325329.

［9］Xue K，Xu L，Chen S，et al.Polymorphisms of the CYP1A1 and GSTM1 genes and their combined effects on inpidual susceptibility to lung cancer in a Chinese population[J] .Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi，2001，18(2):125127.

［11］Shinichi Hayashi，Junko Watanabe，Kaname Kawajiri.High susceptibility to lung cancer analyzed in terms of combined genotypes of P4501A1 and Muclass Glutathione STransferase genes[J].Jp.J Cancer Res，1992，83(8):866870.

［12］Dresler CM，F(xiàn)ratelli C，Babb J，et al.Gender differences in genetic susceptibility for lung cancer[J].Lung Cancer，2000，30(3):153160.

［13］Quinones L，Lucas D，Godoy J，et al.CYP1A1，CYP2E1 and GSTM1 genetic polymorphisms.The effect of single and combined genotypes on lung cancer susceptibility in Chilean people[J].Cancer Lett，2001，174(1):3544.

篇2

[關(guān)鍵詞]阿爾茨海默病；AKTl；基因多態(tài)性

[中圖分類號(hào)]R749.16

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]2095-0616（2016）03-37-04

阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）又稱老年癡呆癥，是一種以進(jìn)行性認(rèn)知障礙和記憶力損害為主的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病…。研究發(fā)現(xiàn)，載脂蛋白E（ApoE）基因、血管轉(zhuǎn)換酶基因（ace）、載脂蛋白c1基因（apocl）、雌激素受體基因等都與阿爾茨海默病發(fā)病有一定關(guān)系，但并不能完全解釋阿爾茨海默病的發(fā)病原因。因此，尋找新的阿爾茨海默病風(fēng)險(xiǎn)因子至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病患者中，阿爾茨海默病的發(fā)病率高于正常人群，與2型糖尿病發(fā)病有關(guān)的胰島素P13K-AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在阿爾茨海默病的病變過(guò)程中的作用值得我們進(jìn)一步的研究。本研究目的探討胰島素P13K-AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)基因AKT多態(tài)性與阿爾茨海默病的關(guān)系，以期深入了解AKT基因多態(tài)對(duì)阿爾茨海默病易感性的影響。

1.資料與方法

1.1一般資料

將2002年1月～2013年12月我院納入管理的阿爾茨海默病患者為病例組研究對(duì)象，病例組入選標(biāo)準(zhǔn)：所有患者符合美國(guó)神經(jīng)病學(xué)、語(yǔ)言障礙及卒中一阿爾茨海默病和相關(guān)疾病學(xué)會(huì)（NINCDS-ADRDA）的診斷標(biāo)準(zhǔn)，所有患者均由兩位神經(jīng)內(nèi)科醫(yī)師做出診斷。同時(shí)選取年齡及性別匹配的健康體檢者為對(duì)照組研究對(duì)象，對(duì)對(duì)照組研究對(duì)象進(jìn)行MMSE（簡(jiǎn)易精神狀態(tài)量表）、ADL（日常活動(dòng)量表）、CDR（臨床癡呆評(píng)定量表）的評(píng)定，其結(jié)果必須均為正常，同時(shí)采用漢密爾頓抑郁量表排除抑郁癥。兩組研究對(duì)象均要排除高血壓、糖尿病、精神病史、酒精或藥物濫用、腫瘤及自身免疫性疾病。兩組研究對(duì)象均為漢族人群，阿爾茨海默病患者本人或家屬對(duì)本研究簽署書(shū)面知情同意書(shū)，對(duì)照組本人簽署書(shū)面知情同意書(shū)。

本研究中，阿爾茨海默病組患者共231例，男113例，女118例，平均年齡（79.6±9.9）歲，Apoε4（+）者67例，平均MMSE評(píng)分（18.6±3.9），健康對(duì)照組患者共231例，男113例，女118例，平均年齡（78.5±8.4）歲，Apoε4（+）者39例，平均MMSE評(píng)分（28.3±2.7），兩組患者平均年齡、性別構(gòu)成、文化程度差別均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），其結(jié)果具有可比性。阿爾茨海默病組Apoε4（+）者比例高于對(duì)照組，平均MMSE評(píng)分低于對(duì)照組。

1.2研究方法

1.2.1DNA提取抽取所有研究對(duì)象靜脈血并提取基因組DNA，血液標(biāo)本儲(chǔ)存于-70℃待用，并進(jìn)行DNA含量及純度檢測(cè)。

1.2.2基因分型通過(guò)NCBI-SNP和HapMap數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，分析AKT基因上的tagSNPs數(shù)據(jù)，應(yīng)用PCR測(cè)序的方法檢測(cè)上述入選對(duì)象胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)基因AKT多態(tài)性基因型。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的處理，運(yùn)用Hardy-Weinberg平衡法則進(jìn)行遺傳平衡吻合度檢驗(yàn)；x2檢驗(yàn)分析各組間基因型及等位基因的頻數(shù)分布差異；計(jì)量資料（x±s）的形式表示，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行計(jì)量資料的比較，以P

2.結(jié)果

2.1 rs2498786基因位點(diǎn)與阿爾茲海默病的相關(guān)性分析

rs2498786為G/C多態(tài)性，包括G/G、G/C、C/C三種基因型。本研究中，AD組與對(duì)照組三種基因型分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

2.2rs74090038基因位點(diǎn)與阿爾茲海默病的相關(guān)性分析

rs74090038為C/F多態(tài)性，包括C/C、C/T、T/T三種基因型。本研究中，AD組與對(duì)照組三種基因型分布差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），等位基因C、T頻數(shù)分布在兩組之間分布差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表2。

2.3rs2494750基因位點(diǎn)與阿爾茲海默病的相關(guān)性分析

rs2494750為C/G多態(tài)性，包括C/C、C/G、G/G三種基因型。本研究中，AD組與對(duì)照組三種基因型分布差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），等位基因c、G頻數(shù)分布在兩組之間分布差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表3。

2.4 rs2494751基因位點(diǎn)與阿爾茲海默病的相關(guān)性分析

rs2494751為A/G多態(tài)性，包括A/A、A/G、G/G三種基因型。本研究中，AD組與對(duì)照組三種基因型分布差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），等位基因A、G頻數(shù)分布在兩組之間分布差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表4。

2.5 rs5811155基因位點(diǎn)與阿爾茲海默病的相關(guān)性分析

rs5811155為T(mén)/-多態(tài)性，包括T/T、T/-、-/-三種基因型。本研究中，AD組與對(duì)照組三種基因型分布差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），等位基因T頻數(shù)分布在兩組之間分布差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表5。

2.6 rs2494752基因位點(diǎn)與阿爾茲海默病的相關(guān)性分析

rs2494752為G/A多態(tài)性，包括G/G、G/A、A/A三種基因型。本研究中，AD組與對(duì)照組三種基因型分布差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），等位基因G、A頻數(shù)分布在兩組之間分布差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），因此，rs2494752的基因多態(tài)性可能與阿爾茲海默病的發(fā)病無(wú)關(guān)聯(lián)。見(jiàn)表6。

3.討論

篇3

關(guān)鍵詞：自然流產(chǎn)；基因；亞甲基四氫葉酸還原酶

 亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）是同型半胱氨酸（Hcy）與葉酸代謝的關(guān)鍵酶。亞甲基四氫葉酸還原酶基因的突變會(huì)引起酶活性有所降低，結(jié)果使葉酸水平降低，DNA低甲基化得產(chǎn)生及血漿Hcy濃度的升高，導(dǎo)致一系列病理的改變引發(fā)多種疾病[1]。最新研究表明，不明原因的重復(fù)性自然流產(chǎn)與血液的高凝狀態(tài)有關(guān)。檢測(cè)了53例自然流產(chǎn)患者和63例健康人，運(yùn)用聚合酶鏈反應(yīng)—限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（PCR-RFLP）技術(shù)，探討了（MTHFR）基因多態(tài)性與自然流產(chǎn)的相關(guān)性，為探索自然流產(chǎn)的發(fā)病機(jī)理提供資料。

1 資料與方法

1.1  一般資料：選取2009年1月～2011年1月期間在我院就診的自然流產(chǎn)非孕期患者53例，年齡（28.4±2.5）歲，平均27歲，其中1次25例，2次18例，3次及以上10例。皆符合自然流產(chǎn)診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]：排除生殖器解剖學(xué)畸形；外周血染色體異常；內(nèi)分泌功能異常；對(duì)照組63例，均為非孕期正常婦女，年齡（26.9±2.8）歲，平均27歲，無(wú)相關(guān)病史。兩組一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2  研究方法：清晨空腹取外周靜脈血4 ml，2%乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）抗凝，嚴(yán)格參照試劑盒說(shuō)明，提取基因組DNA。利用RFLP可對(duì)其基因多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)。MTHFR C677T基因片段擴(kuò)增及突變的檢測(cè)PCR引物[3]：P1（NCO-351）：5′-GAAGCAGGGAGCTTTGAGGC-3′；P2（NCO-352）：5′-CCCATGTCGGTGCATGCCTT-3′。PCR反應(yīng)體系總體積30 μl：10×Buffer 3 μl，4×dNTP 1.5 μl（2.5 mol/L），P1和P2各1 μl（6 pmol/L），Taq DNA聚合酶（Promega 1 U/μl）1.5 μl，模板DNA 5 μl（40 ng/μl）。94℃預(yù)變性5 min，然后進(jìn)入循環(huán)程序：94℃ 45 s，72℃ 50 s，54℃ 30 s，共37個(gè)循環(huán)，75℃延伸15 min。2%瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。6%聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳法檢測(cè)突變結(jié)果。

1.3  統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：運(yùn)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，觀察數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ ）表示，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

    兩組MTHFR基因型和等位基因頻率分布：見(jiàn)表1。

表1  兩組MTHFR基因型和等位基因頻率分布[例（%）]

組別

    例數(shù)

基因型頻率

等位基因頻率

TT

TC

CC

T

C

自然流產(chǎn)組

53

15（28.30）

25（47.17）

13（24.53）

40（54.05）

34（45.95）

正常對(duì)照組

63

12（19.05）

18（28.57）

33（52.38）

38（32.20）

80（67.97）

MTHFR C677T相關(guān)的基因型和等位基因頻率比較：自然流產(chǎn)患者組基因型頻率與正常組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=9.05，P＜0.05）；自然流產(chǎn)患者組等位基因頻率與正常組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.42，P＜0.05）。總的突變T等位基因顯著高于對(duì)照組（χ2=11.35，P＜0.05）。自然流產(chǎn)組MTHFR C677T基因型C/C、T/C、T/T基因型頻率分布與正常對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=9.05，P＜0.05）。自然流產(chǎn)組T等位基因型頻率為54.05%，亦與正常對(duì)照組者分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=11.35，P＜0.05），T等位基因與自然流產(chǎn)發(fā)生明顯相關(guān)（OR=2.28），95%可信區(qū)間：1.24～4.26。

3 討論

重復(fù)性自然流產(chǎn)的病因至今尚不完全清楚，近幾年研究者發(fā)現(xiàn)流產(chǎn)發(fā)生的一個(gè)重要原因與蛻膜絨毛缺血性壞死有關(guān)[4-5]。亞甲基四氫葉酸還原酶缺陷導(dǎo)致同型半胱氨酸向甲硫氨酸轉(zhuǎn)化發(fā)生阻礙，導(dǎo)致同型胱氨酸血癥。本文已確診的自然流產(chǎn)患者與健康人進(jìn)行對(duì)比分析，結(jié)果表明自然流產(chǎn)患者突變等位基因頻率與純合突變基因型頻率均明顯高于對(duì)照組，證明亞甲基四氫葉酸還原酶基因的多態(tài)性可能是自然流產(chǎn)的一個(gè)遺傳風(fēng)險(xiǎn)因素，值得我們進(jìn)一步研究。

4 參考文獻(xiàn)

[1] Goyette P,Sumner JS,Milos R,et al.Human methylenetetrahy-drofolate reductase:Isolation of Cdna,mapping and mutation identification[J].Nature Genet,1994,7(2):195.

[2] 董素琴,杜欣瑩,劉學(xué)云.MHHFR基因與不明原因習(xí)慣性流產(chǎn)的相關(guān)性分析[J].實(shí)用婦產(chǎn)科雜志,2006,22(8):500.

[3] 張家穎,左文靜,武廣恒,等.MTHFR基因C677T多態(tài)性與習(xí)慣性流產(chǎn)的關(guān)聯(lián)性分析[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào)•醫(yī)學(xué)版,2009,35(1):22.

[4] 白慧健,馬太芳,李  釗,等.胚胎血紅蛋白基因變異與自然流產(chǎn)的相關(guān)性研究[J].吉林醫(yī)學(xué),2011,32(36):7689.

篇4

1 資料與方法

1.1 臨床資料 我院2011年—2012年體檢健康人群，無(wú)藥物過(guò)敏史，檢測(cè)CYP2C19基因型，選擇CYP2C19*1/*1野生型10例，CYP2C19*2/*2 or*3突變型純合子10例，CYP2C19*1/*2 or*3突變型雜合子10例。其中男18名，年齡21歲～34歲（28歲±4歲），女12名，年齡20歲～35歲（29歲±5歲）。研究對(duì)象受試前2周及受試期間禁煙、酒，并且不服用任何藥物。

1.2 基因分型 利用ARMS PCR技術(shù)建立CYP2C19基因多態(tài)性檢測(cè)方法，設(shè)計(jì)特異性引物和探針序列，引物和探針委托生工生物工程（上海）有限公司合成及純化。樣本處理：抽取受試者靜脈血3 mL，EDTA抗凝，利用基因組提取試劑盒純化核酸，基因組提取試劑盒購(gòu)自北京天根生化公司，按照其說(shuō)明書(shū)操作。Taq酶擴(kuò)增系統(tǒng)購(gòu)自上海Promega公司。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃預(yù)變性15 s，60 ℃退火、延伸、信號(hào)采集40 s，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)儀器：Mx3000熒光定量PCR儀，購(gòu)自美國(guó)Agilent公司。基因分型結(jié)果由基因測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證。

1.3 ADP誘導(dǎo)的血小板聚集率分析 受試者在第1天（300 mg）、第2天（75 mg）、第3天（75 mg）早飯前空腹服用氯吡格雷，并分別于首次服藥前和服藥后4 h采集靜脈血3 mL，枸櫞酸鈉抗凝。氯吡格雷購(gòu)自法國(guó)賽諾菲-圣德拉堡制藥公司。采血后隨即進(jìn)行血小板聚集率分析。ADP購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，反應(yīng)濃度為5 μmol/L，MPG-3型多功能血液凝聚儀購(gòu)自上海斯隆醫(yī)電公司。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 11.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，同一基因型服藥前后血小板聚集率比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，不同基因型之間血小板聚集率比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 基因分型 采取受試者全血樣本進(jìn)行CYP2C19基因多態(tài)性分型，選擇CYP2C19*1/*1野生型10例，CYP2C19*2/*2 or*3突變型純合子10例，CYP2C19*1/*2 or*3突變型雜合子10例進(jìn)行血小板聚集率分析研究。分型結(jié)果利用基因測(cè)序確認(rèn)，二者一致。

2.2 ADP誘導(dǎo)的血小板聚集率分析 通過(guò)對(duì)受試者服藥前后ADP誘導(dǎo)的血小板聚集率進(jìn)行分析，3組CYP2C19基因型個(gè)體服藥前ADP誘導(dǎo)的血小板聚集率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），服藥后3組個(gè)體均較服藥前明顯降低（P<0.01），其中CYP2C19*1/*1野生型組服藥后聚集率明顯低于CYP2C19*1/*2 or *3突變型雜合子和CYP2C19*2/*2 or*3突變型純合子（P<0.05），CYP2C19*1/*2 or*3突變型雜合子與CYP2C19*2/*2 or*3突變型純合子差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。詳見(jiàn)表1。

3 討 論

氯吡格雷是一種常用的血小板聚集抑制劑，臨床療效顯著，備受關(guān)注。氯吡格雷臨床效果存在明顯的個(gè)體差異，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)ADP誘導(dǎo)的血小板聚集率降低不顯著，未能達(dá)到預(yù)期的抗血小板作用，被稱為“氯吡格雷抵抗（clopidogrel resistance，CR）”。國(guó)外研究約20%的用藥者療效不佳[6]。導(dǎo)致氯吡格雷臨床效果個(gè)體差異的主要因素是CYP2C19基因多態(tài)性，該基因編碼的酶作用于氯吡格雷前體的活性轉(zhuǎn)化。其中CYP2C19*1/*1基因型轉(zhuǎn)化效率最高（強(qiáng)度代謝，EM），CYP2C19*1/*2 or*3突變型雜合子次之（中度代謝，IM），CYP2C19*2/*2 or*3突變型純合子最差（弱代謝，PM）。東亞人群弱代謝突變型分布頻率（20%）遠(yuǎn)高于高加索人群（3%～5%）[7]。

基因多態(tài)性分析的方法有基因測(cè)序、限制性內(nèi)切酶酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)分析法（RFLP）和ARMS PCR等。基因測(cè)序是基因分析的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但操作復(fù)雜，儀器昂貴。限制性內(nèi)切酶酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)分析法同樣操作步驟多，易污染，靈敏度低。ARMS PCR操作簡(jiǎn)便、快捷，靈敏度高，對(duì)實(shí)驗(yàn)室要求較低，適合基層醫(yī)院的使用。本研究基于ARMS PCR技術(shù)，建立了CYP2C19基因多態(tài)性分析方法。并且經(jīng)基因測(cè)序驗(yàn)證，二者的檢測(cè)結(jié)果完全一致。

ADP誘導(dǎo)的血小板聚集率分析結(jié)果顯示，3組CYP2C19基因型個(gè)體服藥前ADP誘導(dǎo)的血小板聚集率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），服藥后3組個(gè)體均較服藥前明顯降低（P<0.01），其中CYP2C19*1/*1野生型組服藥后聚集率明顯低于CYP2C19*1/*2 or*3突變型雜合子和CYP2C19*2/*2 or*3突變型純合子（P<0.05），CYP2C19*1/*2 or*3突變型雜合子與CYP2C19*2/*2 or*3突變型純合子差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。CYP2C19*1/*1，CYP2C19*1/*2 or/*3，CYP2C19*2/*2 or*3基因型個(gè)體服用氯吡格雷的療效逐步降低，進(jìn)一步證明了遺傳因素對(duì)藥物效果的影響。

綜上所述，本文建立了一種CYP2C19簡(jiǎn)便快捷的基因分型方法，進(jìn)一步證實(shí)了CYP2C19基因型與氯吡格雷療效個(gè)體化差異的關(guān)系，彰顯了藥物基因組學(xué)分析的重要性。通過(guò)對(duì)受試者基因分型檢測(cè)，判定受試者的藥物代謝速率類型，從而輔助醫(yī)生合理調(diào)整藥物劑量，提高藥物的有效性，這也符合個(gè)體化醫(yī)學(xué)發(fā)展的趨勢(shì)。

參考文獻(xiàn)：

.Drug Metab Dispos，2010，38（1）：92-99.

篇5

關(guān)鍵詞：TaqMan探針；MTHFR；多態(tài)性；DNA測(cè)序；胃癌

胃癌（Gastric cancer）是世界范圍內(nèi)的高發(fā)腫瘤之一[1]。近年研究表明，低葉酸水平可增加包括胃癌在內(nèi)的許多腫瘤發(fā)生的危險(xiǎn)性[2]。亞甲基四氫葉酸還原酶（methylene tetrahydrofolate reductase，MTHFR）是葉酸代謝途徑中的一 關(guān)鍵酶，MTHFR參與的體內(nèi)同型半胱氨酸（Hcy）和甲硫氨酸之間的循環(huán)反應(yīng)，反應(yīng)中生成的S腺苷甲硫氨酸（SAM）是體內(nèi)代謝唯一的甲基供體，涉及DNA的修復(fù)與合成，影響DNA代謝，與許多腫瘤化療藥物的療效相關(guān)。

MTHFR的活性很大程度上可能受基因多態(tài)性的影響，從而影響疾病的發(fā)生和藥物的療效。MTHFR基因C677T和A1298C為兩個(gè)常見(jiàn)的多態(tài)性位點(diǎn)，有研究表明該位點(diǎn)的基因多態(tài)性會(huì)導(dǎo)致MTHFR酶活性的改變[3]，可能導(dǎo)致患者之間出現(xiàn)較大的個(gè)體差異。因此，測(cè)定MTHFR的基因型對(duì)疾病的預(yù)防和合理用藥有重要的意義。現(xiàn)已有的MTHFR基因多態(tài)性的研究，大多數(shù)采用限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)（PCR-RFLP）技術(shù)，該技術(shù)不僅費(fèi)時(shí)，且易污染造成假陽(yáng)性。不適宜用于臨床檢測(cè)。本研究旨在探討一種可用于臨床快速準(zhǔn)確檢測(cè)MTHFR基因型的方法，故選用TaqMan探針技術(shù)對(duì)MTHFR的C677T和A1298C兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行分型。

1資料與方法

1.1一般資料 經(jīng)CT、MRI或病理組織學(xué)活檢確診的胃癌患者43例，來(lái)源于昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，收集樣本人群的外周靜脈血2 mL。采用Genomic DNA Purification Kit（PROMEGA公司）對(duì)基因組DNA進(jìn)行提取，使用Nanodrop 2000測(cè)定DNA的濃度和純度。

1.2 TaqMan探針技術(shù)檢測(cè)MTHFR基因C677T和A1298C位點(diǎn)的多態(tài)性 TaqMan探針試劑由ABI公司為MTHFR基因C677T（SNP ID：rs1801133），A1298C（SNP ID：rs1801131）多態(tài)性設(shè)計(jì)的TaqMan SNP分析試劑，每個(gè)位點(diǎn)的TaqMan SNP基因分型試劑中，含有兩條MGB探針。MTHFR C677T一條以VIC熒光標(biāo)記堿基G，對(duì)應(yīng)樣本基因突變位點(diǎn)C；一條以FAM熒光標(biāo)記堿基A，對(duì)應(yīng)樣本基因突變位點(diǎn)T。MTHFR A1298C一條以VIC熒光標(biāo)記堿基G，對(duì)應(yīng)樣本基因突變位點(diǎn)C；一條以FAM熒光標(biāo)記堿基T，對(duì)應(yīng)樣本基因突變位點(diǎn)A。探針序列，見(jiàn)表1。

MTHFR C677T及A1298C多態(tài)性 real-time PCR采用25 μL反應(yīng)體系：40×SNP Genotyping Assay Mix：0.625μL；TaqMan 2×PCR Master Mix：12.5 μL；DNA模板：1 μL；dd H2O：10.875 μL。探針檢測(cè)在BIO-RAD IQ5實(shí)時(shí)熒光PCR儀上進(jìn)行。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10 min；95℃，15 s；60℃，1 min，共40個(gè)循環(huán)。由于儀器的限制，本研究使用的BIO-RAD IQ5實(shí)時(shí)熒光PCR儀中沒(méi)有VIC熒光檢測(cè)通道，我們選擇了HEX熒光通道替代，兩種熒光相差1nm波長(zhǎng)。

1.3 DNA測(cè)序法驗(yàn)證TaqMan探針技術(shù)檢測(cè)MTHFR基因多態(tài)性

1.3.1目的片段的擴(kuò)增 設(shè)計(jì)MTHFR C677T及A1298C兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的測(cè)序引物（Invitrogen公司合成），引物序列，見(jiàn)表2。

2結(jié)果

2.1 Taqman探針基因型分析 MTHFR C677T和A1298C real-time PCR散點(diǎn)圖基因分型結(jié)果分別，見(jiàn)圖1、圖2。

2.2 DNA測(cè)序驗(yàn)證 采用Lansergene SeqMan軟件分析測(cè)序結(jié)果。

2.3 MTHFR基因多態(tài)性分型結(jié)果 43例樣本MTHFR C677T基因型分別為野生純合型CC 14例（32.5%）、突變雜合型CT 23例（53.5%）及突變純合型TT 6例（14.0%）。A1298C基因型分別為AA 24例（55.8%）、AC 18例（41.9%）、CC 1例（2.3%）。本研究中，TaqMan探針技術(shù)檢測(cè)及DNA測(cè)序驗(yàn)證，兩種檢測(cè)方法得到的基因分型結(jié)果一致。

3討論

中國(guó)是個(gè)胃癌高發(fā)的國(guó)家，每年新發(fā)病例數(shù)占全球總數(shù)的40%。胃癌化療方案眾多且無(wú)標(biāo)準(zhǔn)方案，目前臨床應(yīng)用最廣泛的是基于氟尿嘧啶類藥物的化療方案，在實(shí)際的化療過(guò)程中，氟尿嘧啶類藥物的個(gè)體差異較大，氟尿嘧啶類藥物在體內(nèi)均需轉(zhuǎn)化為5-FU，繼而發(fā)揮抗腫瘤作用。MTHFR是5-FU代謝中的一個(gè)關(guān)鍵酶，5-FU的活性代謝產(chǎn)物還原型葉酸（CH2FH4）在MTHFR的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)?-甲基四氫葉酸，使CH2FH4與胸腺嘧啶核苷酸合成酶（TS）、三磷酸氟尿嘧啶脫氧核苷（FdUTP）組成的三元復(fù)合物減少，從而削弱5-FU的抗腫瘤作用。

C677T突變產(chǎn)生丙氨酸被纈氨酸取代的錯(cuò)義突變，其合成的蛋白質(zhì)會(huì)出現(xiàn)熱穩(wěn)定性降低和酶活性的改變[4]。有研究提出，MTHFR基因的C677T多態(tài)性通過(guò)影響DNA甲基化和核酸穩(wěn)定性，參與了胃癌的發(fā)生。A1298C突變使得編碼后谷氨酰胺被丙氨酸替代，有報(bào)道稱[5]純合子突變型可使酶活性降低到正常值的60%左右。因此，測(cè)定MTHFR的基因型對(duì)腫瘤患者的個(gè)體化用藥具有至關(guān)重要的意義。

但是，常規(guī)實(shí)驗(yàn)室多應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（PCR-RFLP）的方法檢測(cè)MTHFR的基因多態(tài)性，該方法需要用凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析，易造成樣本間污染，影響結(jié)果判讀。TaqMan探針技術(shù)省時(shí)、簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、安全、實(shí)時(shí)分析是它突出的優(yōu)點(diǎn)[6]。同時(shí)，TaqMan探針在閉合單管中進(jìn)行檢測(cè)，避免了由樣本間污染造成假陽(yáng)性的結(jié)果[7]。

在我們的研究中，為了進(jìn)一步驗(yàn)證TaqMan方法的準(zhǔn)確性，我們進(jìn)行了DNA測(cè)序驗(yàn)證，與TaqMan探針基因分型結(jié)果相比較，發(fā)現(xiàn)結(jié)果完全一致。本研究采用的TaqMan探針?lè)中头椒ńY(jié)果準(zhǔn)確可靠，故我們認(rèn)為使用TaqMan技術(shù)為MTHFR C677T及A1298C基因多態(tài)性分型可用于臨床檢測(cè)。TaqMan探針基因檢測(cè)法具有很好的臨床實(shí)用性，是臨床快速診斷MTHFR基因型較有價(jià)值的方法。

參考文獻(xiàn)：

[1]Meyer H J，Wilke H.Treatment strategies in gastric cancer[J].Dtsch Arztebl Int.2011，108（41）：698-705，706

[2]Choi S W，Mason J B.Folate status：effects on pathways of colorectal carcinogenesis[J].J Nutr.2002，132（8 Suppl）：2413S-2418S.

[3]Etienne M C，F(xiàn)ormento J L，Chazal M，et al.Methylenetetrahydrofolate reductase gene polymorphisms and response to fluorouracil-based treatment in advanced colorectal cancer patients[J].Pharmacogenetics.2004，14（12）：785-792.

[4]Ulrich C M，Robien K，Mcleod H L.Cancer pharmacogenetics：polymorphisms，pathways and beyond[J].Nat Rev Cancer.2003，3（12）：912-920.

[5]Warren R B，Griffiths C E.The potential of pharmacogenetics in optimizing the use of methotrexate for psoriasis[J].Br J Dermatol.2005，153（5）：869-873.

篇6

【摘要】 目的 研究細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(cytotoxic T lymphocyte associated antigen4，CTLA4)基因外顯子1+49A/G位點(diǎn)和啟動(dòng)子318位點(diǎn)多態(tài)性與粵西漢族人Graves病(GD)發(fā)病的關(guān)聯(lián)性。方法 應(yīng)用PCRRFLP分析102例GD患者與100例正常對(duì)照組CTLA4基因的外顯子1+49位點(diǎn)A/G及啟動(dòng)子318位點(diǎn)C/T多態(tài)性。結(jié)果 GD組外顯子1+49A/G位點(diǎn)的GG基因型及G等位基因頻率顯著高于正常組(P

【關(guān)鍵詞】 細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4;格雷夫斯病;多態(tài)現(xiàn)象;遺傳

Abstract:Objective To investigate the relationships between exon 1 (+49A/G)， promoter (318T/C) polymorphism of CTLA4 gene and Graves' disease (GD) in Han population in western region of Guangdong province.Methods The exon 1 (+49A/G) and promoter (318T/C) polymorphism of CTLA4 gene was detected by PCRRFLP in 102 GD patients and 100 healthy controls.Results The frequency of GG genotype and G allele of CTLA4 gene exon 1 (+49 A/G) in GD patients and those with family history was significantly higher than that in control subjects and GD patients without family history (P0.05).Conclusion The predisposing factors of GD patients in western region of Guangdong province could be related to GG genotype and G allele of CTLA4 gene exon 1 (+49 A/G) other than promoter (318T/C) polymorphism， especially in those with family history.

Key words: cytotoxic Tlymphocyte associated antigen4 (CTLA4); Graves' disease; polymorphism; genetics

CTLA4基因的編碼產(chǎn)物CTLA4是與自身免疫疾病有關(guān)的代表標(biāo)志分子，被認(rèn)為是Graves病(Graves'disease，GD)的遺傳候選基因，其與HLA基因各占GD遺傳易感性的50%[1]。但其與GD的遺傳易感性在不同地區(qū)、人種的研究結(jié)論并不一致[23]。為此，本研究對(duì)CTLA4基因外顯子1+49 A/G和啟動(dòng)子318位點(diǎn)多態(tài)性與粵西漢族人GD遺傳易感的關(guān)系作一研究。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象

收集2006年1月至6月廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌專科門(mén)診及住院的GD患者102例(男23例，女79例)，年齡(44.17±1.54)歲，其中有GD家族史37例(男8例，女29例)，GD患者均根據(jù)病史、臨床癥狀、體征、甲狀腺功能檢查得以確診。從廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院體檢健康人群中100例作為正常組，其中男22例，女78例;年齡(44.20±1.46)歲，無(wú)甲狀腺疾病及其他自身免疫性疾病。以上人群均無(wú)親緣關(guān)系，祖籍是粵西地區(qū)，三代均為漢族。

1.2 方法

所有觀察對(duì)象抽取外周靜脈血，取1mL置于EDTA抗凝試管，用血液基因組DNA小量抽提試劑盒(上海生工)提取白細(xì)胞DNA，采用聚合酶鏈反應(yīng)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(polymerase chain reaction fragment length polymorphism， PCRRFLP)方法進(jìn)行檢測(cè)。 引物設(shè)計(jì)與合成：根據(jù)GenBank中的CTLA4 DNA序列設(shè)計(jì)兩對(duì)PCR引物，外顯子1+49 A/G多態(tài)性上游引物5'GCTCTACTTCCTGAAGACCT3'，下游引物5'AGTCTCACTCACCTTTGCAG3'。啟動(dòng)子318C/T多態(tài)性上游引物5'AAATGAATTGGACTGGATGGT3’，下游引物5'TTACGAGAAAGGAAGCCGTG3'。取目的基因10μL行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，再經(jīng)BbvⅠ內(nèi)切酶處理后行3%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像分析系統(tǒng)掃描。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

以Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)分析研究樣本的群體代表性，采用直接計(jì)數(shù)法計(jì)算各組基因型、等位基因數(shù)目及頻率，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)算優(yōu)勢(shì)比(OR)及OR值95%可信區(qū)間(95%CI)。顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)為0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組樣本基因型分布

均符合Hardy-Weinberg平衡，具有群體代表性。

2.2 基因型判定

外顯子1的 PCR擴(kuò)增片段為162bp，酶切結(jié)果為：AA基因型為162bp一個(gè)片段，AG基因型為162、88、74bp三個(gè)片段，GG基因型為88、74bp兩個(gè)片段，見(jiàn)圖1。啟動(dòng)子PCR擴(kuò)增片段為226bp，酶切結(jié)果為：CC基因型為226bp一個(gè)片段，CT基因型為226、130、96bp三個(gè)片段，TT基因型為130、96bp二個(gè)片段，見(jiàn)圖2。

2.3 CTLA4基因外顯子1+49位點(diǎn)A/G多態(tài)性分布

GD組GG基因型及G等位基因頻率顯著高于正常組(P

2.4 CTLA4基因啟動(dòng)子318位點(diǎn)C/T多態(tài)性分布

TT基因型在正常組中例數(shù)為1，理論頻數(shù)很低，將TT及CT組合并。GD組啟動(dòng)子318位點(diǎn)的各基因型、等位基因頻率以及是否有家族史者與正常組相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，詳見(jiàn)表2。表1 GD組與正常組CTLA4基因外顯子1+49位點(diǎn)多態(tài)性分布與正常組比較：*P0.05。

3 討論

CTLA4基因多態(tài)性是從基因表達(dá)調(diào)控角度影響CTLA4分子功能及分子水平。其外顯子1 +49A/G位點(diǎn)A/G多態(tài)性決定了前導(dǎo)序列的蛋白質(zhì)糖基化效率，從而影響前導(dǎo)序列的翻譯后修飾作用[45]。Chistiakov等[6]研究發(fā)現(xiàn)外顯子1第17密碼子49位點(diǎn)A/G的二態(tài)性導(dǎo)致蘇氨酸/丙氨酸的交換可影響前導(dǎo)鏈的構(gòu)象，使之不能正確引導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)CTLA4分子的運(yùn)輸，使細(xì)胞表面CTLA4分子減少。有研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，CTLA4基因外顯子1+49A/G位點(diǎn)為A或啟動(dòng)子318位點(diǎn)為T(mén)的人群，其CTLA4分子表達(dá)水平在受到刺激后及CTLA4 mRNA的表達(dá)水平在不刺激狀態(tài)時(shí)均較高[7]。Han等[8]研究認(rèn)為CTLA4啟動(dòng)子318位點(diǎn)為T(mén)時(shí)的啟動(dòng)子活性較高，可以上調(diào)CTLA4分子的表達(dá)水平。

由于遺傳易感基因受到種族和環(huán)境的影響，CTLA4基因外顯子1+49 A/G位點(diǎn)和啟動(dòng)子318位點(diǎn)C/T多態(tài)性與GD的遺傳易感性在不同的地域、種族、年齡階段不一致。Esteghamati等[4]研究發(fā)現(xiàn)意大利GD患者CTLA4基因外顯子1+49A/G等位基因G的頻率較正常組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;伊朗GD患者CTLA4啟動(dòng)子318位點(diǎn)C/T基因多態(tài)性與GD無(wú)關(guān)聯(lián)性。Braun等[9]則認(rèn)為CTLA4基因啟動(dòng)子的多態(tài)性與GD的相關(guān)性是由于啟動(dòng)子與外顯子1存在連鎖不平衡，因此它只是GD的一個(gè)遺傳危險(xiǎn)標(biāo)志，但不具有獨(dú)立易感作用。在本實(shí)驗(yàn)中，GD組GG基因型及G等位基因頻率顯著高于正常組(P

通過(guò)本實(shí)驗(yàn)，我們認(rèn)為使用基因替代的方法以同源重組方式將保護(hù)基因取代易感基因，或者使用免疫基因治療將融合蛋白CTLA4Ig阻斷協(xié)同刺激信號(hào)途徑以選擇性抑制T細(xì)胞活化階段，有可能減少GD等自身免疫性疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

參考文獻(xiàn)

[1]Zeitlin A A， Heward J M， Newby P R， et al. Analysis of HLA class II genes in Hashimoto's thyroiditis reveals differences compared to Graves' disease [J]. Genes Immun， 2008，9(4):358363.

[2]Akaishi P M， Cruz A A， Silva F L，et al. The role of major histocompatibility complex alleles in the susceptibility of Brazilian patients to develop the myogenic type of Graves' orbitopathy [J]. Thyroid， 2008，18(4):443447.

[3]Sasaki M， Yuzawa M， Saito T，et al. New HLA DRB1 and DQB1 haplotypes in a pedigree of familial Graves' disease in Japan [J]. Endocr J，2007，54(5):721725.

[4]Esteghamati A， Khalilzadeh O， Mobarra Z， et al. Association of CTLA4 gene polymorphism with Graves' disease and ophthalmopathy in Iranian patients [J]. Eur J Intern Med，2009，20(4):424428.

[5]Tanrikulu S， Erbil Y， Ademoglu E，et al. The predictive value of CTLA4 and Tg polymorphisms in the recurrence of Graves' disease after antithyroid withdrawal [J]. Endocrine， 2006，30(3):377381.

[6]Kavvoura F K， Akamizu T， Awata T， et al. Cytotoxic Tlymphocyte associated antigen 4 gene polymorphisms and autoimmune thyroid disease: a metaanalysis[J]. J Clin Endocrinol Metab，2007，92(8):31623170.

[7] Simmonds M J，Gough S C.Unravelling the genetic complexity of autoimmune thyroid disease:HLA，CTLA4 and beyond[J].Clin Exp Immunol，2004， 136(1): 110.

篇7

【摘要】 目的 探討張家口地區(qū)健康中老年人群CYP1A1基因MspⅠ的多態(tài)性。方法 采用等位基因特異性擴(kuò)增和聚合酶鏈反應(yīng)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCRRFLP)技術(shù)，分析了360例張家口地區(qū)健康成人的CYP1A1基因3′端限制性內(nèi)切酶MspⅠ位點(diǎn)的3種基因型的分布規(guī)律。結(jié)果 對(duì)照組MspⅠ基因型TT占35.8%，基因型TC占50.2%，基因型CC占14.0%，等位基因TC分別為60.9%、39.1%;實(shí)驗(yàn)組MspⅠ基因型TT占34.0%，基因型TC占51.2%，基因型CC占14.8%，等位基因T、C分別為59.6%、40.4%。結(jié)論 張家口地區(qū)健康老年人群CYP1A1基因存在MspⅠ的多態(tài)性，與健康中青年人群沒(méi)有顯著性差異。

【關(guān)鍵詞】 細(xì)胞色素P4501A1;等位基因;基因多態(tài)性;MspⅠ

CYP1A1屬細(xì)胞色素P(CYP)450超基因家族成員，是外源性和內(nèi)源性化合物在體內(nèi)代謝的重要Ⅰ相酶之一，參與多種內(nèi)外源性化學(xué)物質(zhì)的體內(nèi)代謝過(guò)程〔1〕。現(xiàn)今，已發(fā)現(xiàn)CYP1A1基因MSPⅠ多態(tài)在不同的種族、年齡、民族和地區(qū)的分布具有差異，并有報(bào)道其多態(tài)性與某些癌變的發(fā)生相關(guān)〔2〕。CYP1A1基因主要分布于肺、腎、胃腸道、皮膚、胎盤(pán)等組織中，對(duì)內(nèi)源性和外源性化合物在體內(nèi)的代謝有重要的作用，主要通過(guò)氧化、還原、水解等作用，改變化合物所具有的功能基團(tuán)，或使其分解。CYP1A1主要參與多環(huán)芳烴類化合物(PAH)的代謝，把其代謝為酚類物質(zhì)活性很強(qiáng)的環(huán)氧化物，這些環(huán)氧化物在致癌、致突變中都有重要作用〔3〕。本研究采用聚合酶鏈反應(yīng)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCRRFLP)的技術(shù)，探討張家口地區(qū)健康中老年人群CYP1A1基因MspⅠ多態(tài)性分布，以期為本地區(qū)癌癥的病發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 對(duì)照組隨機(jī)選擇360例無(wú)血緣關(guān)系的健康張家口地區(qū)人員，均在原籍穩(wěn)定居住2代以上，年齡18～55歲，其中男性186例，女性174例。老年組隨機(jī)選76名無(wú)血緣關(guān)系的健康張家口人：年齡60～78歲，平均年齡65歲，其中女性32例，男性44例。經(jīng)張家口河北北方學(xué)院第一附屬醫(yī)院門(mén)診查體健康，無(wú)遺傳疾病的健康人群。

1.2 標(biāo)本收集 從上述人群中均抽取空腹外周靜脈全血3 ml，應(yīng)用賽百盛公司的基因組DNA快速提取試劑盒提取基因組DNA。

1.3 主要試劑及儀器 引物由北京紐英倫生物公司合成，限制性內(nèi)切酶MspⅠ購(gòu)于北京紐英倫生物公司，德國(guó)Eppendorf PCR擴(kuò)增儀， DYYIII2穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(北京六一儀器廠)，紐英倫生物公司的基因組DNA快速提取試劑盒，BioRad凝膠成像分析儀。

1.4 CYP1A1 MspⅠ位點(diǎn)基因分型 采用等位基因特異性擴(kuò)增方法PCRRFLP技術(shù)為CYP1A1MspⅠ位點(diǎn)基因分型。PCR的反應(yīng)條件:反應(yīng)總體積50 μl，含有200 μmol/L dNTP，上游引物序列為5′CAGTGAAGAGGTGTAGCCGCT3′，0.4 μmol/L，下游引物序列為5′TAGGAGTCTTGTCTCATGCCT3′，0.4 μmol/L，模板DNA 0.4 μg，1 U TaqDNA聚合酶，最后加滅菌雙蒸水補(bǔ)齊至50 μl。擴(kuò)增參數(shù)：97℃預(yù)變性7 min，然后95℃變性50 s，66℃退火50 s，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)后72℃繼續(xù)延伸10 min。取10 μl PCR產(chǎn)物，加10 U MspⅠ限制性內(nèi)切酶，37℃水浴4 h，酶切產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠(含0.5 μg/ml溴化乙錠)電泳60 min，電壓100 V，在凝膠成像分析儀上觀察結(jié)果。

1.5 CYP1A1 MspⅠ基因型測(cè)定 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)酶切后分為3種基因型：沒(méi)有MspⅠ切割位點(diǎn)的等位基因?yàn)榧兒献踊蛐蚑T(野生型)，可見(jiàn)340 bp一個(gè)片段;有MspⅠ切割位點(diǎn)的等位基因?yàn)榧兒献踊蛐虲C(突變型)，可見(jiàn)200及140 bp 兩個(gè)片段;雜合子基因型TC(雜合型)，可見(jiàn)340、200、140 bp 3個(gè)片段。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS11.5軟件，分析等位基因和基因型頻率分布，檢驗(yàn)群體基因型頻率分布是否符合HardyWeinberg平衡定律，組間進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

CYP1A1基因MspⅠ多態(tài)分布，張家口地區(qū)中青年健康人群該多態(tài)位點(diǎn)T及C等位基因的頻率分別為60.9%，39.1%。TT，TC，CC基因型分布頻率分別為35.8%，50.2%，14.0%。經(jīng)χ2檢驗(yàn)基因型分布符合HardyWeinberg平衡定律(χ2=0.031，P>0.05)。張家口地區(qū)老年健康人群該多態(tài)位點(diǎn)T及C等位基因的頻率分別為59.6%，40.4%。TT，TC，CC基因型分布頻率分別為34.0%，51.2%，14.8%。經(jīng)χ2檢驗(yàn)基因型分布符合HardyWeinberg平衡定律(χ2=0.039，P>0.05)。對(duì)張家口地區(qū)健康老年和中青年人群CYP1A1基因MspⅠ多態(tài)分布差異不顯著。該多態(tài)位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的MspⅠ酶切電泳見(jiàn)圖1。

3 討 論

CYP1A1是細(xì)胞色素P450的同工酶，位于第15號(hào)染色體q22qter上，有7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子，基因全序列為6 311個(gè)堿基對(duì)〔4，5〕。CYP1A1在肝臟總的CYP450含量中存在不到1%，但是參與2.5%的物質(zhì)代謝過(guò)程，廣泛分布于機(jī)體組織中〔6～8〕。目前研究發(fā)現(xiàn)，CYP1A1基因發(fā)生在CYPIA1基因的3′非編碼區(qū)腺苷酸下游264 bp處，位于6 235位點(diǎn)，由堿基TC，即CYP1A1基因MspⅠ多態(tài)性，突變基因變異導(dǎo)致酶活性增高，而且提高了酶的誘導(dǎo)性，同時(shí)，CYP1A1基因MspⅠ多態(tài)分布具有明顯的地區(qū)和種族差異。大量研究發(fā)現(xiàn)，CYP1A1基因多態(tài)性與環(huán)境毒素暴露相關(guān)的腫瘤遺傳易感性有關(guān)〔9，10〕。本研究發(fā)現(xiàn)張家口地區(qū)健康中老年人群CYP1A1基因呈多態(tài)性分布，與中青年人群差異不顯著，為進(jìn)一步研究張家口地區(qū)CYP1A1基因多態(tài)性與腫瘤等疾病的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)，并有助于基因多態(tài)性與腫瘤易感性的研究，對(duì)識(shí)別腫瘤高危人群，有針對(duì)性地進(jìn)行行為干預(yù)，對(duì)人類的身體健康和生活質(zhì)量的保證，具有十分重要的臨床意義和實(shí)用價(jià)值。

參考文獻(xiàn)

1 Miyoshi Y，Takahashi Y，Egawa C，et al.Breast cancer risk associated with CYP1A1 genetic polymorphisms in Japanese women〔J〕.Breast J，2002;8(4):20.

2 Singh V，Rastogi N，Sinha A，et al.A study on the association of cytochromeP450 1A1 polymorphism and breast cancer risk in north Indian women〔J〕.Breast Cancer Res Treat，2007;101(1)：738.

3 Belogubova EV，Ulibina YM，Suvorova IK，et al.Combined CYP1A1/GSTM1 at risk genotypes are overrepresented in squamous cell lung carcinoma patients but underrepresented in elderly tumorfree subjects〔J〕.J Cancer Res Clin Oncol，2006;132(5)：32731.

4 李佳圓，龍啟明.有機(jī)氯農(nóng)藥、CYP1A1易感基因型與乳腺癌的相互作用研究〔J〕.現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2008;35(1)：348.

5 Agundez JA.Cytochrome P450 gene polymorphism and cancer〔J〕.Curt Drug Metab，2004;5(3):21124.

6 雷霆雯，饒 敏.苗族人群細(xì)胞色素及CSTM1基因多態(tài)性分析〔J〕. 中國(guó)公共衛(wèi)生，2009;25(10):12023.

7 曹文疆，盛 磊，楊 軍，等.新疆伊犁哈薩克族居民載脂蛋白B基因多態(tài)性與血脂的關(guān)系〔J〕.實(shí)用醫(yī)技雜志，2009;16(10):7702.

8 Hou L，Chatterjee N，Huang WY，et al.CYP1A1 Val462 and NQO1 Ser187 polymorphisms，cigarette use，and risk for colorectal adenoma〔J〕. Carcinogenesis，2005;26 (6):11228.

篇8

【摘要】 目的研究中國(guó)南方漢族人群中血管緊張素原(AGT235)、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACEI/D)、心鈉素(ANP2238)、C型心鈉素受體(NPRC-55)和內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS298)基因多態(tài)性與原發(fā)性高血壓(EH)的關(guān)系。方法選擇EH患者81例及對(duì)照者120例，采用基因芯片技術(shù)檢測(cè)AGT235、ACEI/D、ANP2238、NPRC-55、eNOS298基因多態(tài)性，并比較其基因型及等位基因頻率。結(jié)果EH組AGT235 TT基因型頻率(53.1%)與對(duì)照組(45.8%)無(wú)差異(P>0.05);EH組患者ACEI/D DD基因型頻率(48.1%)與對(duì)照組(4.2%)差異顯著(P0.05);EH組NPRC-55CC基因型頻率為65.4%，對(duì)照組(68.3%)無(wú)差異(P>0.05);EH組eNOS298DD基因型頻率為3.7%，與對(duì)照組(0.8%)無(wú)差異(P>0.05)。結(jié)論ACEI/D基因可能是EH的易感基因，AGT235、ANP2238、NPRC-55和eNOS298基因與EH不具有相關(guān)性。

【關(guān)鍵詞】 原發(fā)性高血壓;基因多態(tài)性;血管緊張素轉(zhuǎn)換酶

原發(fā)性高血壓(EH)的基因多態(tài)性研究有助于闡明EH的病因，為其防治提供依據(jù)。目前對(duì)于EH候選基因的研究大多局限于單個(gè)基因，對(duì)于多個(gè)系統(tǒng)、多個(gè)基因的協(xié)同研究較少。國(guó)內(nèi)外的研究顯示血管緊張素原(AGT235)、 血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACEI/D)、心鈉素(ANP2238)、C型心鈉素受體(NPRC-55)和內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS298)的基因多態(tài)性與EH具有相關(guān)性，但結(jié)果尚不一致〔1〕。本研究采用基因芯片技術(shù)，檢測(cè)EH人群5種基因的多態(tài)性對(duì)EH的影響，旨在確定高危人群探討EH的發(fā)病機(jī)制。

1材料與方法

1.1研究對(duì)象選擇2006年4月至2009年4月我院保健體檢部和老年病科的就診患者。EH患者81例，診斷符合WHO關(guān)于EH的診斷標(biāo)準(zhǔn)，年齡56~93〔平均(76.79±6.96)〕歲，男62例，女19例。對(duì)照組120例，年齡38~59〔平均(50.91±5.59)〕歲，男105例，女15例。經(jīng)相關(guān)檢查除外引起繼發(fā)性高血壓的疾病，以及糖尿病、慢性肝病、慢性腎病、惡性腫瘤等。所有病例為無(wú)血緣關(guān)系的華南地區(qū)漢族人群。

1.2研究方法1.2.1標(biāo)本采集抽取受檢者肘靜脈血3 ml，EDTA抗凝，快速裂解法提取基因組DNA。

1.2.2基因多態(tài)性分析分別在各擴(kuò)增液管中加入Taq酶溶液0.8 ml;在各擴(kuò)增液管中分別加入陰性對(duì)照管溶液、陽(yáng)性對(duì)照管溶液或抽提的樣品上清液，混勻;在PCR儀中擴(kuò)增。取各管PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于98℃熱變性5 min，-20℃保存;在雜交艙進(jìn)行雜交;加入顯色液，44℃放置44 min;BaiO基因芯片識(shí)讀儀檢測(cè)，圖像經(jīng)Array Doctor軟件分析，檢測(cè)AGT235、ACEI/D、NPRC-55及eNOS298基因多態(tài)性位點(diǎn)。BaiO基因芯片識(shí)讀儀和基因芯片檢測(cè)所需的試劑由上海百傲公司提供。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16.0軟件包進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1兩組基因型分布兩組基因型頻率適合度檢測(cè)均符合Hardy-Weinberg平衡。EH組及對(duì)照組AGT235TT基因型頻率分別為53.1%和45.8%，無(wú)顯著差異(χ2=5.96，P>0.05)。EH組ACEI/D DD基因型頻率為48.1%，與對(duì)照組(4.2%)比較有顯著差異(χ2=56.76，P0.05)。EH組及對(duì)照組NPRC-55CC基因型頻率分別為65.4%和68.3%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.06，P>0.05)。EH組及對(duì)照組eNOS298DD基因型頻率分別為3.7%和0.8%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.87，P>0.05)。見(jiàn)表1。表1兩組候選基因的基因型分布

2.2兩組等位基因分布EH組ACEI/D D等位基因頻率為59%，與對(duì)照組(30%)，差異顯著(χ2=31.6，P

S298D等位基因頻率分別為4%和5%，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3討論

EH是多基因遺傳病，其發(fā)生是環(huán)境因素和遺傳因素共同作用，相互累加的結(jié)果。EH的候選基因涉及腎素血管緊張素醛固酮系統(tǒng)、交感神經(jīng)-腎上腺系統(tǒng)、水鹽代謝、內(nèi)皮細(xì)胞功能等至少150余種。十余年來(lái)，國(guó)內(nèi)學(xué)者〔2～6〕對(duì)漢族EH基因多態(tài)性現(xiàn)象進(jìn)行了大量研究。但各家說(shuō)法不一。研究顯示ACE基因I/D多態(tài)性不僅與高血壓發(fā)生相關(guān)，而且與高血壓的多種并發(fā)癥有關(guān)〔7，8〕。在本研究中，我們采用基因芯片技術(shù)分析了201例EH和正常血壓者的5個(gè)心血管基因的多態(tài)性，結(jié)　果顯示，高血壓組ACEI/D DD基因型頻率為48.1%，與對(duì)照組(4.2%)比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P

參考文獻(xiàn)

1Puddu P，Puddu GM， Cravero E，et al.The genetic basis of essential hypertension〔J〕.Acta Cardiol，2007;62(3):281-93.

2趙燕，王峰，苗海衛(wèi)，等.血管緊張素轉(zhuǎn)換酶基因變異與上海地區(qū)漢族人群原發(fā)性高血壓易感性相關(guān)〔J〕.中國(guó)分子心臟病學(xué)雜志，2009;47(4):223-6.

3張琦，沈志霞，李宏芬，等.血管緊張素轉(zhuǎn)換酶基因插入/缺失多態(tài)性在人群中的分布及其與原發(fā)性高血壓的關(guān)系〔J〕.中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志，2003;20(5):438-40.

4沈國(guó)民，龔平原，趙曉，等.AGT基因M235T多態(tài)與原發(fā)性高血壓相關(guān)研究〔J〕.河南師范大學(xué)學(xué)報(bào)·自然科學(xué)版，2009;37(2):113-5.

5陳劍，周智涓，柯劍婷，等.內(nèi)皮型一氧化氮合酶基因G894T多態(tài)性與原發(fā)性高血壓關(guān)系的Meta分析〔J〕.中山大學(xué)學(xué)報(bào)·醫(yī)學(xué)科學(xué)版，2008;29(4s):116-9.

6李南方，張艷敏，李濤，等.新疆哈薩克族原發(fā)性高血壓與心鈉素基因T2238C多態(tài)性的關(guān)系〔J〕.臨床心血管病雜志，2005;21(9):513-5.

篇9

【關(guān)鍵詞】 雙氫克尿噻

【摘要】 目的 探討原發(fā)性高血壓患者血管緊張素Ⅱ受體-1（AT1R）基因多態(tài)性與雙氫克尿噻降壓療效的相關(guān)性。方法 200例未服用過(guò)任何藥物或者已停用抗高血壓藥物兩周的原發(fā)性高血壓患者入選本實(shí)驗(yàn)，其中符合研究目的且資料完整的共計(jì)177例，入選人群同時(shí)開(kāi)始服用雙氫克尿噻12.5mg/日，共6周，在服藥前及服藥后每?jī)芍苡涗浹獕簲?shù)值一次。用聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）及限制性酶切方法進(jìn)行AT1R基因A1166-C位點(diǎn)的多態(tài)性分布檢測(cè)，并測(cè)定入選者的空腹血糖、總膽固醇、甘油三酯和高密度脂蛋白。入選人群按AT1R基因多態(tài)性分為AA、AC基因型兩組。結(jié)果 雙氫克尿噻對(duì)于AA及AC基因型原發(fā)性高血壓患者的收縮壓和舒張壓均有明顯的降壓效果（P均<0.05），并且這種降壓效果主要表現(xiàn)在用藥后的前兩周內(nèi)。AA及AC基因型患者的收縮壓下降程度的比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），而AC基因型患者的舒張壓下降程度與AA基因型患者的比較差異有顯著性（P<0.05）。結(jié)論 雙氫克尿噻對(duì)于原發(fā)性高血壓患者舒張壓的降壓效果可能與AT1R的基因型有關(guān)。

關(guān)鍵詞 血管緊張素Ⅱ受體-1 基因多態(tài)性 原發(fā)性高血壓 血壓 雙氫克尿噻 療效

Correlation of angiotensinⅡTypeⅠReceptor gene A1166C polymorphism with the effect of antihypertensive treatment by hydrochlorothiazide

【Abstract】 Objective To study the correlation of AngiotensinⅡTypeⅠReceptor（AT1R）Gene A1166C Polymorphism with the effect of antihypertensive treatment by Hydrochlorothiazide in essential hypertensive patients.Methods 177hypertensive subjects who were untreated or who had untaken medicine for two weeks were enrolled.Blood pressure was measured before taking medicine and was examined every two weeks after taking Hydrochlorothˉiazide12.5mg per day for six week.Polymerase Chain Reaction（PCR）combined with restriction enzyme digestion was used to detect the variation of A1166C allele.Fasting blood glucose and serum cholesterol、triglyceride and high density lipid were measured in the enrolled subjects.The patients were characterized according to the observed alleles as AA or AC.Results The reduction in SBP was no statistical significant difference between AA and AC groups（P>0.05）.But the reduction in DBP of AC group was higher than that of AA droup（P<0.05）.Conclusion There may be correlation of AT1R A1166C polymorphism with the effect of antihypertensive treatment in DBP by Hyˉdrochlorothiazide in essential hypertensive patients.

Key words angiotensinⅡTypeⅠReceptor gene polymorphism essential hypertension blood presure Hydrochlorothiazide efficacy

盡管目前有多種不同類型的抗高血壓藥物，但是血壓能被較好控制的患者仍然不到40% ［1］ ，不同的患者對(duì)于同一種抗高血壓藥物有不同的反應(yīng)，患者對(duì)于抗高血壓療效的反應(yīng)及藥物副作用的個(gè)體差異與遺傳有一定關(guān)系，因此目前對(duì)于某些基因多態(tài)性與各類抗高血壓藥物降壓效果間的對(duì)應(yīng)性研究頗受關(guān)注。腎素-血管緊張素系統(tǒng)（Renin angiotensin system，RAS）是體內(nèi)調(diào)節(jié)血壓和水電解質(zhì)平衡的主要系統(tǒng)，刺激或抑制該系統(tǒng)可引起血壓的變化，因此在原發(fā)性高血壓（Essential Hypertension，EH）發(fā)病機(jī)理中起著重要的作用，編碼RAS的基因被公認(rèn)是與EH相關(guān)性最強(qiáng)的基因。RAS中的血管緊張素Ⅱ（angiotensin II，AngⅡ）收縮血管的作用主要是通過(guò)AngⅡ受體-1（AT1R）介導(dǎo)的 ［2］ ，本研究旨在觀察抗高血壓藥物雙氫克尿噻的降壓效果與AT1R基因A1166C多態(tài)性的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 本院2001年1月到4月收治的1～2級(jí)EH患者共200例，均未服用過(guò)任何抗高血壓藥物或者已停用抗高血壓藥物兩周，其中符合研究目的且資料完整的共計(jì)177例，男92例，女85例，平均年齡（65±8）歲。血壓的測(cè)量方法及診斷標(biāo)準(zhǔn)采用《1999WHO/ISH高血壓治療指南》。臨床化驗(yàn)檢查除外繼發(fā)性高血壓、其他心腦血管疾病、糖尿病、惡性腫瘤，嚴(yán)重肺部、肝臟、腎臟疾病。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 血液生化指標(biāo)的測(cè)定應(yīng)用自動(dòng)生化分析儀，隨時(shí)質(zhì)控檢測(cè)，性能穩(wěn)定。檢測(cè)AT1R基因:每例采晨起空腹靜脈血3～5ml，2%EDTA抗凝，用低滲法分離白細(xì)胞，蛋白酶K消化，氯仿/異戊醇法提取DNA，TE保存。引物設(shè)計(jì)為:上游5′-ATAATGTAAGCTCATCCACC-3′，下游5′-GAGATTGCATTTCTGTCAGT-3′，PCR反應(yīng)設(shè)置94℃預(yù)變性240s，后進(jìn)入循環(huán)94℃變性60s，94℃退火60s，72℃延伸90s，循環(huán)30次，后延伸72℃，300s后結(jié)束反應(yīng)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)DdeI酶切后，用2%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，紫外線燈下觀察結(jié)果。

1.3 給藥方法 入選人群同時(shí)開(kāi)始服用雙氫克尿噻（江蘇省丹陽(yáng)市藥廠LotNo.242107）12.5mg/日，共6周，在服藥前及服藥后每?jī)芍苡涗浹獕簲?shù)值一次，在觀察期間不加用其它任何抗高血壓藥物或增減藥量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 資料輸入計(jì)算機(jī)，用Excel軟件建立數(shù)據(jù)庫(kù)，用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，組間計(jì)數(shù)資料比較用χ 2 檢驗(yàn)，組間計(jì)量資料比較用t檢驗(yàn)或方差分析，組間血壓下降數(shù)值的比較因?yàn)榉讲畈积R，故比較時(shí)采用秩和檢驗(yàn)。P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

（1）AA、AC不同基因型間的性別、年齡、體重指數(shù)、膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、肌酐、血糖的比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，AA基因型組的收縮壓和舒張壓均較AC組的低，兩組比較差異有顯著性，見(jiàn)表1。

表1 AA、AC兩組人群臨床參數(shù)比較 （略）

（2）AA、AC兩組基因型患者服用雙氫克尿噻2周后收縮壓和舒張壓均有明顯下降，（P均<0.05），并且這種降壓效果主要表現(xiàn)在用藥后的前2周內(nèi)。服藥4周及6周時(shí)的收縮壓、舒張壓與前一次的血壓數(shù)值比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表2。

表2 AA、AC兩組基因型患者治療前、后收縮壓、舒張壓水平變化 （略）

注:組間比較 P<0.05;組內(nèi)比較 Δ P<0.05（服藥后每經(jīng)過(guò)兩周與前一次血壓值比較）

（3）AA及AC基因型患者的收縮壓下降程度的比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），而AC基因型患者的舒張壓下降程度與AA基因型患者的比較差異有顯著性（P<0.05），見(jiàn)表3。

表3 AA、AC兩組基因型患者治療后收縮壓、舒張壓下降水平變化 （略）

注: 組間比較 P<0.05

3 討論

EH是一種由遺傳因素和環(huán)境因素共同作用引起的多基因遺傳病，盡管目前有多種不同類型的抗高血壓藥物，但是血壓能被較好控制的患者仍然不到40% ［1］ ，這與EH發(fā)病需要一組易感基因和一組環(huán)境因素的共同作用、不同患者的發(fā)病可能存在這些因素的不同組合有關(guān)。基于EH發(fā)病機(jī)制的特點(diǎn)，目前對(duì)于高血壓的治療提倡個(gè)體化原則，對(duì)于某些基因多態(tài)性與各類抗高血壓藥物降壓效果間的對(duì)應(yīng)性研究也越來(lái)越受到重視。近年來(lái)一項(xiàng)在美國(guó)進(jìn)行的TOHP臨床實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了血管緊張素原（AGT）基因的G-6A多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)AA基因型組在限鹽攝入或減輕體重后，血壓的降低程度顯著大于GG基因型組，提示基因多態(tài)性分析可幫助我們估計(jì)患者對(duì)治療的反應(yīng)效果。

由于利尿劑可使尿鈉排泄增加，使血漿容量、細(xì)胞外液容量和心輸出量下降，以致使血壓下降的作用已得到肯定，因此利尿劑在EH的治療中被廣泛應(yīng)用。最近Turner等人在EH的個(gè)體化治療的研究中發(fā)現(xiàn)噻嗪類利尿劑（雙氫克尿噻）的降壓效果與G蛋白β 3 亞基C825T基因多態(tài)性有關(guān)，研究表明噻嗪類利尿劑對(duì)于低血漿腎素、主要由容量負(fù)荷所致的EH患者中的TT基因型患者的收縮壓和舒張壓的降壓效果與CC、CT基因型患者的相比療效顯著、兩者比較差異有顯著性 ［3］ 。本研究主要是探討雙氫克尿噻的療效與AT1R基因多態(tài)性的關(guān)系，血管平滑肌細(xì)胞上主要存在的是AT1R，AT1R是調(diào)節(jié)血壓的主要中介，它與AngⅡ結(jié)合后引起多種生物學(xué)效應(yīng)，如血管收縮、醛固酮分泌、心肌細(xì)胞正性肌力作用;此外還參與AngⅡ的促有絲分裂原活性，引起血管平滑肌細(xì)胞增生、間質(zhì)組織膠原表達(dá)以及心肌肥厚 ［4］ ，因此AT1R基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)量的變化與高血壓關(guān)系密切。本研究結(jié)果顯示，AA、AC兩組基因型患者服用雙氫克尿噻2周后收縮壓和舒張壓均有明顯下降（P均<0.05），并且這種降壓效果主要表現(xiàn)在用藥后的前2周內(nèi)，這與利尿劑在最初幾周可使血容量降低以致使血壓下降有關(guān)。雙氫克尿噻對(duì)于不同基因型（AA、AC）EH患者收縮壓的治療效果的比較沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但AC基因型患者舒張壓的降壓幅度要明顯大于AA基因型患者，兩者比較差異有顯著性。說(shuō)明雙氫克尿噻對(duì)于原發(fā)性高血壓患者舒張壓的降壓效果可能與AT1R的基因型有關(guān)。了解不同基因型對(duì)于藥物的不同反應(yīng)，對(duì)于指導(dǎo)我們制定合理的治療方案與估計(jì)療效有一定的指導(dǎo)意義。

有研究表明，AT1R基因A1166C多態(tài)性與血漿血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）活性有關(guān)，但本實(shí)驗(yàn)沒(méi)有測(cè)定不同基因型患者的血漿腎素活性水平、血漿醛固酮濃度、尿醛固酮排泄率、血漿AngⅡ活性水平等指標(biāo)，因此尚不能解釋不同基因型對(duì)于利尿劑的不同反應(yīng)是否與血漿腎素活性水平、血漿AngⅡ水平及醛固酮的激活有關(guān)。另外本實(shí)驗(yàn)入選患者年齡較大、樣本量較小，這是本實(shí)驗(yàn)不足之處。基于EH的特殊遺傳背景，今后的研究除進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，還要在基因 組的水平上，觀察多個(gè)EH后選基因與藥物療效的關(guān)系。用分子生物學(xué)手段檢測(cè)基因型對(duì)于藥物開(kāi)發(fā)及其療效與作用的評(píng)估預(yù)測(cè)有極重要的意義，藥物基因組學(xué)的研究進(jìn)展將最終使我們能夠根據(jù)基因分型結(jié)果實(shí)現(xiàn)EH患者個(gè)體化治療。

參考文獻(xiàn)

1 Meissner I，Whisnant J，Sheps S，et al.Detection and control of high blood pressure in the community:do we need a wake-up call?Hyperˉtension，1999，34:466-471.

2 Smith RD，Timmermans PB.Human angiotensin receptor subtypes.Curr Opin Nephrol Hypertens，1994，3:112-122.

篇10

【關(guān)鍵詞】 人類白細(xì)胞抗原；PCR-SSP；基因； 多態(tài)現(xiàn)象

Investgation of HLA—DQA1 polymorphism in national minority of Inner Mongolia by PCR-SSP

【Abstract】 Objective To investgate the distribution of HLA-DQA1 gene polymorphism in Ewenki and Hui nationalities of Inner Mongolia;Having compared with other groups in China to analyze the charactoristic of the gene types.Methods By the polymerase chain reaction(PCR)-squence specific primer(SSP).Results Gene frequncy of 99 in Ewenki were : *0301（0.394），*0104（0.212），*0102（0.152），*0501（0.152），*0103（0.04），*0201（0.051）；*0601，*0401，*0302were abcent ；Gene frequncy of 56 in Hui were *0301（0.339），*0102（0.214），*0501（0.143），*0601 （0.143），*0401（0.036），*0201（0.054），*0103 （0.071）；*0302，*0101， *0104 were abcent.Conclusion There was not only the same charactoristics but also the special ones in HLA—DQA1 gene polymorphism of Ewenki and Hui nationalities which had some difference by comparing with other groups in China.

【Key words】 human leucocyte antigen;PCR-SSP;gene;polymorphsim

HLA是人類主要組織相容性復(fù)合體，它不僅具有個(gè)體差異，而且還有不同民族的差異。不同群體HLA基因分布的調(diào)查，對(duì)于探討各民族起源有很重要的意義［1］。HLAⅡ類抗原DQ由高度多態(tài)的A、B鏈構(gòu)成，研究DQA的多態(tài)性對(duì)于人類種群關(guān)系研究、人類進(jìn)化、相關(guān)疾病和異體移植有著重要的理論意義和實(shí)踐意義。鄂溫克族是個(gè)人口總數(shù)很少的民族，主要聚居在我國(guó)東北地區(qū)，少數(shù)居住于黑龍江省。回族分布在全國(guó)各地。近幾年隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，對(duì)人類健康群體的研究不斷深入。本文采用PCR-SSP法，從探討鄂溫克族、回族HLA-DQA1基因多態(tài)性入手，研究其基因分布的異同點(diǎn)，并與中國(guó)其他民族做比較。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 99例鄂溫克族健康人標(biāo)本來(lái)源內(nèi)蒙古東部地區(qū)三代以上父母均為鄂溫克族，男48例，女51例，平均年齡23.30歲。靜脈取血2～3ml，加抗凝劑，-20℃保存。56例回族健康人，標(biāo)本來(lái)源健康體檢，男34例，女22例，平均年齡38.60歲。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.2.1 標(biāo)本DNA制備 參照文獻(xiàn)［2，3］。

1.2.2 PCR—SSP法1.2.2.1 引物設(shè)計(jì) HLA-DQA1特異性擴(kuò)增引物參照文獻(xiàn)［4］稍作修改， 9個(gè)5′引物及7個(gè)3′引物共組成12對(duì)不同的引物對(duì)，能鑒定有表達(dá)產(chǎn)物的HLA-DQA1等位基因。

1.2.2.2 PCR擴(kuò)增條件及試劑 每管PCR反應(yīng)液總體積為10μl，包括：DNA模板1μl(80ng);10ⅹBuffher 1μl;4ⅹdNTP 1μl(2.5mM);Primer 1μl(各5pmol);Taq DNA 聚合酶0.35U(華美生物工程公司提供)加去離子四蒸水至10μl，混勻，稍加離心，加2μl無(wú)菌石蠟油以防蒸發(fā)。置PCR儀上按92℃預(yù)變性（2′）；92℃變性（30″）；60℃退火（45″）；72℃延伸（60″）；72℃最后延伸（10″）的程序進(jìn)行32個(gè)循環(huán)擴(kuò)增。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 基因頻率用直接計(jì)算法統(tǒng)計(jì)，群體間的等位基因比較采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 內(nèi)蒙古地區(qū)鄂溫克族、回族HLA-DQA1等位基因頻率 見(jiàn)表1（略）。

2.2 內(nèi)蒙古地區(qū)鄂溫克族、回族HLA-DQA1等位基因分布與其他民族比較 見(jiàn)表2。

根據(jù)測(cè)得的鄂溫克族、回族HLA-DQA1等位基因頻率與國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)其他民族群體該基因位點(diǎn)研究的數(shù)據(jù)進(jìn)行了比較，結(jié)果見(jiàn)表2。 表1 內(nèi)蒙地區(qū)鄂溫克族、回族HLA-DQA1等位基因的分布頻率（略）表2 內(nèi)蒙地區(qū)鄂溫克族、回族HLA-DQA1等位基因頻率（略）注：與鄂溫克族比較：1）P

3 討論

MHC-Ⅱ類抗原在人類稱HLA-Ⅱ類抗原，他是存在于人體第六對(duì)染色體短臂上一組密切連鎖基因群的表達(dá)產(chǎn)物，一般認(rèn)為有三個(gè)亞區(qū)，即DP、DR、DQ，每一個(gè)位點(diǎn)至少有一個(gè)α基因和一個(gè)β基因。據(jù)研究表明［5，6］，HLA不同基因座位的各等位基因在人群中以一定頻率出現(xiàn)，且呈現(xiàn)為連鎖不平衡。由于這些特點(diǎn)，某些單體型在群體中以較高頻率出現(xiàn)，并較之單一HLA基因型更能顯示人種和地理族的特點(diǎn)［7］。

本文運(yùn)用PCR—SSP法對(duì)鄂溫克族和回族人群的DQA1基因多態(tài)性進(jìn)行了研究，并與云南漢族、滿族、維吾爾族、北方蒙古族做比較。研究結(jié)果表明：鄂溫克族和回族的HLA-DQA1*0301、*0501、*0102的等位基因頻率較高；*0201、*0103均較低，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異無(wú)顯著性。而回族的*0601基因是高頻率基因，在鄂溫克族卻未檢測(cè)到；鄂溫克族的*0104是高頻率基因，在回族卻未檢測(cè)到。與其他民族群體比較，鄂溫克族與云南漢族在*0601；與滿族在*0601、*0104、*0301、*0101；與維吾爾族在*0101、*0103、*0201、*0301；與北方蒙古族在*0101、*0102、*0103、*0302、*0601上差異均有顯著性。回族與云南漢族在*0104、*0201、*0601；與滿族在*0101；與維吾爾族在*0101、*0103、*0201、*0301；與北方蒙古族在*0101、*0102上差異均有顯著性。

對(duì)上述資料的解釋為：我國(guó)是個(gè)多民族的國(guó)家，中華民族的形成和發(fā)展經(jīng)歷了一個(gè)復(fù)雜的融和、變遷的歷史過(guò)程。由于歷史、地理、自然環(huán)境、社會(huì)等各種因素的影響，不同民族，甚至同一民族的不同群體的HLA基因型構(gòu)成存在差異。經(jīng)比較鄂溫克族與南方漢族僅在*0601上差異具有顯著性，而在其他基因型上卻無(wú)明顯差異；回族與滿族在*0101上差異有顯著性，而在其他基因型上卻無(wú)明顯差異。這種現(xiàn)象能否運(yùn)用地理、歷史、環(huán)境、社會(huì)等因素來(lái)解釋，有待進(jìn)一步加大樣本量，來(lái)分析以上兩個(gè)民族的遺傳規(guī)律及基因結(jié)構(gòu)。

【參考文獻(xiàn)】

1 陳亭平，王琳琳，林偉雄，等.越南中部京族HLA-DQA1等位基因多態(tài)性分析.中華微生物和免疫學(xué)雜志，2004，24（2）：112-114.

2 J薩姆布魯克，E F弗里奇，J曼尼阿蒂斯.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第二版.北京:科學(xué)出版社，1992，919-924.

3 盧圣棟.現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù).北京:高等教育出版社，1993，571-584.

4 Olerup O，Aldener A，F(xiàn)ogdell A，et al.HLA-DQB1 and HLA-DQA1 typing by PCR amplifi cation with sequence specific primer(PCR-SSP)in 2 hours.Tissue Antigens，1993，41:119

5 Gao XH，Winsey S，Li G， et al.HLA-DR and DQ polymorphsim in bullous pemphioid form Northern China.Blackwell Science Ltd，Clinical and Experimental Dermatology，2002，27:319-321.