基因檢測(cè)范文

導(dǎo)語：如何才能寫好一篇基因檢測(cè)，這就需要搜集整理更多的資料和文獻(xiàn)，歡迎閱讀由公務(wù)員之家整理的十篇范文，供你借鑒。

篇1

社會(huì)熱詞

如今，“基因檢測(cè)”成為一個(gè)社會(huì)熱詞，一些商業(yè)機(jī)構(gòu)打出頗具誘惑性的廣告語：“解碼生命秘密，預(yù)知未來健康”、“只要你的一滴血，甚至一點(diǎn)點(diǎn)口水，就可能預(yù)測(cè)你一生可能遭遇的疾病并加以預(yù)防……”“一口唾液，就能測(cè)出孩子的天賦。如果他有運(yùn)動(dòng)基因，他可能是下一個(gè)博爾特；如果他有音樂基因，你可能把他培養(yǎng)成肖邦……”開展“兒童天賦基因”檢測(cè)的某商業(yè)機(jī)構(gòu)的廣告語是“別把天才放錯(cuò)了位置！”這些機(jī)構(gòu)推出了“基因體檢套餐”、“天賦基因檢測(cè)”、“美容基因檢測(cè)”、“家族性疾病風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)”等項(xiàng)目，有的地方甚至將基因檢測(cè)作為高端體檢項(xiàng)目來推廣，類似金女士這樣做基因檢測(cè)的人越來越多，不少人慷慨解囊，去檢測(cè)自己是否有患遺傳疾病的風(fēng)險(xiǎn)。

那么，基因檢測(cè)到底是怎么回事兒？真的可以準(zhǔn)確預(yù)測(cè)未來疾病，甚至可以預(yù)知孩子的天賦以及未來的發(fā)展嗎？基因檢測(cè)與商業(yè)盈利混同在一起會(huì)不會(huì)有什么問題？

來龍去脈

那還是2006年，科學(xué)家繪制出人體所有23對(duì)染色體的完整基因序列圖譜以后，一些頗具市場(chǎng)眼光的企業(yè)開始進(jìn)入這個(gè)潛力巨大的市場(chǎng)，向顧客提供有償基因檢測(cè)。

基因是什么呢？基因是DNA分子上攜帶有遺傳信息的功能片段，是遺傳信息的基本單位，是決定一切生物物種最基本的因子；基因在一定程度上決定人的生老病死，也在遺傳角度上決定人是否健康、靚麗、長(zhǎng)壽等等。人的長(zhǎng)相、身高、體重、膚色、性格等都與基因密不可分。基因檢測(cè)就是通過分析受檢者特定的基因序列，并根據(jù)這些基因序列與行為、生理活動(dòng)和疾病的相關(guān)性，了解受檢者的遺傳信息以及患病風(fēng)險(xiǎn)。

2013年，美國(guó)好萊塢影星安吉麗娜？朱莉通^基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)自己攜帶家族遺傳的一種缺陷基因，患卵巢癌和乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)較高，于是接受了預(yù)防性的雙側(cè)乳腺切除術(shù)。朱莉是國(guó)際影視界的大牌明星，影響力很大，她這樣做等于給基因檢測(cè)做了一個(gè)特大廣告，吸引更多的人關(guān)注和了解這個(gè)項(xiàng)目。

如今，基因檢測(cè)似乎成為一種“高大上”的新鮮事物。在某些發(fā)達(dá)國(guó)家，檢測(cè)基因、指導(dǎo)疾病預(yù)防比較火；而國(guó)內(nèi)也在悄然升溫，有人把它稱作“科學(xué)算命”。據(jù)了解，目前國(guó)內(nèi)“三甲醫(yī)院”和有的民辦體檢中心爭(zhēng)相開展基因檢測(cè)項(xiàng)目，基因檢測(cè)也成為各體檢中心招攬客源的一大噱頭。據(jù)說目前有一千多種疾病可以通過基因技術(shù)做出預(yù)測(cè)和診斷。

除了實(shí)體健康機(jī)構(gòu)有這個(gè)檢測(cè)項(xiàng)目以外，互聯(lián)網(wǎng)上有諸多基因檢測(cè)中心也做起了“基因檢測(cè)”的生意，要求在網(wǎng)上檢測(cè)基因的人也是絡(luò)繹不絕。許多人之所以選擇通過網(wǎng)上進(jìn)行基因檢測(cè)，是這樣更便捷、更具私密性。操作的流程是：上網(wǎng)選定基因檢測(cè)單位的網(wǎng)站，打開網(wǎng)頁，根據(jù)自己需要選擇檢測(cè)項(xiàng)目；選定項(xiàng)目以后，基因檢測(cè)中心將通過快遞方式將采樣包交轉(zhuǎn)購買人。購買人采樣后，將采樣包寄回，基因檢測(cè)中心組織檢測(cè)并出具檢測(cè)報(bào)告，并給予個(gè)體化健康干預(yù)建議。

商業(yè)動(dòng)作大

沒有人否認(rèn)基因檢測(cè)的價(jià)值，它可以運(yùn)用到新生兒檢測(cè)、遺傳病攜帶者的檢測(cè)、孕期基因檢測(cè)、法醫(yī)基因檢測(cè)。但是，上面提到的這些，都屬于預(yù)測(cè)性檢測(cè)。預(yù)測(cè)性檢測(cè)多半仍停留在學(xué)術(shù)研究階段。在基因檢測(cè)的發(fā)展過程中，很多商家比科學(xué)家先行了一步，他們盯住了社會(huì)上的特殊群體：老人、兒童、慢性病患者以及潛在的癌癥患者。

最能夠吸引老年人的，是諸如高血壓、糖尿病、老年癡呆（阿爾茨海默病）等慢性病的基因檢測(cè)，相關(guān)機(jī)構(gòu)會(huì)告訴你：攜帶高風(fēng)險(xiǎn)基因型的人，在同樣生活環(huán)境及習(xí)慣下，發(fā)病率高出常人數(shù)倍。但真實(shí)情況并非如此，以高血壓為例，《自然遺傳學(xué)》披露的研究結(jié)果顯示，某些獨(dú)特的基因位點(diǎn)，可能會(huì)影響高血壓的發(fā)病率。但是，它可能是幾百種基因互相糾結(jié)、環(huán)境因素累加、時(shí)間因素累加后的共同結(jié)果。

預(yù)測(cè)患癌幾率是目前基因檢測(cè)的最大市場(chǎng)，也是國(guó)人最認(rèn)可的項(xiàng)目。但是，癌癥的發(fā)病是多種因素引起的，大多數(shù)醫(yī)生都認(rèn)為癌癥是一種生活方式疾病，與遺傳因素關(guān)系不大。以乳腺癌為例，大概只有10%的乳腺癌可以確切證明由遺傳因素導(dǎo)致。在已知的癌癥中，也只有5%至10%的癌癥是由遺傳基因引起的；這5%至10%的癌癥，預(yù)防性的基因檢測(cè)能告訴我們的也不多。況且，有了某種基因變異，也并不意味著一定會(huì)罹患癌癥。

有專家指出，各種所謂針對(duì)兒童的“天賦基因”檢測(cè)有兩個(gè)最大的漏洞，其一是故意混淆了統(tǒng)計(jì)學(xué)上的“關(guān)聯(lián)關(guān)系”與“因果關(guān)系”，有關(guān)聯(lián)不等于就是因果，檢測(cè)者把關(guān)聯(lián)說成了因果；其二是避而不談后天環(huán)境對(duì)人的重大影響。專家告誡，目前所有給孩子做的天賦基因檢測(cè)都是騙人的。

隱憂不少

目前，國(guó)內(nèi)的基因測(cè)序儀都是從國(guó)外引進(jìn)的，由于基因測(cè)序儀產(chǎn)地不同，在使用方法和檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)上也各不相同。就是說，兩家基因檢測(cè)公司的儀器不同，得出的結(jié)論也會(huì)有差異，一般人無從辨別查證。

基因檢測(cè)行業(yè)在使用試劑、應(yīng)用范圍等方面也混亂無章。不少基因檢測(cè)公司使用誘惑性語言進(jìn)行的宣傳也明顯言過其實(shí)。

在收費(fèi)方面，基因檢測(cè)項(xiàng)目沒有收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)，也沒有納入臨床檢測(cè)范疇，價(jià)格隨意性很大。

基因檢測(cè)是新興的高精尖技術(shù)，對(duì)從業(yè)人員素質(zhì)要求應(yīng)該相當(dāng)高。但現(xiàn)實(shí)狀況是很多剛從醫(yī)學(xué)院校畢業(yè)的、不能進(jìn)入醫(yī)療機(jī)構(gòu)從事臨床醫(yī)療的人在操作檢測(cè)。由于檢測(cè)過程不規(guī)范，往往導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果也不那么準(zhǔn)確。

篇2

為了預(yù)測(cè)孩子的天賦，中國(guó)很早就開始在新生兒周歲時(shí)舉行“抓周”，以孩子選擇抓起書、筆、紙還是錢，預(yù)測(cè)他們未來會(huì)成為文人或商賈。這種帶著娛樂性質(zhì)的活動(dòng)寄托了家長(zhǎng)的美好期待，如今幾乎不會(huì)有人當(dāng)真。然而，有基因檢測(cè)機(jī)構(gòu)嚴(yán)肅地告訴你，其天賦基因檢測(cè)能立刻獲知孩子具備何種潛質(zhì)，未來你只管好好培養(yǎng)，一切皆有可能……

“一口唾液就能預(yù)測(cè)天賦”

英國(guó)《每日電訊》近日的報(bào)道開頭提到，一位中國(guó)家長(zhǎng)忽然讓孩子放棄圍棋課程，轉(zhuǎn)而學(xué)習(xí)擊劍，原因是根據(jù)“天賦基因報(bào)告”，她的小孩運(yùn)動(dòng)天賦突出，而靜態(tài)思考分析并非強(qiáng)項(xiàng)。另一位范姓母親接受《每日電訊》采訪時(shí)表示，她的兩個(gè)孩子均被檢出具有極高的繪畫天賦，她準(zhǔn)備為他們報(bào)名藝術(shù)課程。

在搜索引擎上輸入“兒童天賦基因檢測(cè)”，記者得到了近20萬條鏈接，相關(guān)機(jī)構(gòu)的檢測(cè)價(jià)格從幾百到幾千元不等，地點(diǎn)遍及北上廣深及很多二線城市。

記者發(fā)現(xiàn)，其中絕大部分公司的檢測(cè)方法十分簡(jiǎn)單：只要在網(wǎng)上注冊(cè)交費(fèi)，然后用指定試劑收集孩子的唾液，郵寄到指定地址，過幾天便能以App收到孩子的“天賦檢測(cè)報(bào)告”。

一家提供天賦基因檢測(cè)產(chǎn)品的公司創(chuàng)始人告訴《每日電訊》，這種檢測(cè)項(xiàng)目已經(jīng)過市場(chǎng)多年的歷練，不算新興產(chǎn)品，它以檢測(cè)者的血液或口腔粘膜細(xì)胞提取、擴(kuò)增其基因信息后，“通過基因芯片技術(shù)或超高通量單核苷酸多態(tài)性分型技術(shù)，對(duì)用戶DNA信息進(jìn)行檢測(cè)，分析其中包括的疾病風(fēng)險(xiǎn)、用藥安全、營(yíng)養(yǎng)代謝、天賦潛能等信息”。

登錄這家公司的W站，記者發(fā)現(xiàn)其提供成人健康檢測(cè)、寶貝密碼健康基因檢測(cè)、寶貝密碼天賦基因檢測(cè)等產(chǎn)品，其中天賦基因檢測(cè)收費(fèi)6999元，號(hào)稱可以一次性檢測(cè)出孩子的智商、情商甚至天賦潛能，指導(dǎo)如何開發(fā)孩子的潛能，乃至將來的工作能力。

這位公司創(chuàng)始人分析說，中國(guó)家長(zhǎng)普遍存在這種焦慮感，他們害怕為孩子作出的選擇不夠好，導(dǎo)致其他機(jī)會(huì)溜走，不僅浪費(fèi)了錢，還會(huì)毀掉孩子的自信。基因檢測(cè)恰到好處地給這些家長(zhǎng)打了一針“強(qiáng)心劑”。

不過，他強(qiáng)調(diào)檢測(cè)結(jié)果只是參考，“小孩子被檢測(cè)出具有某方面的優(yōu)勢(shì)基因，不代表他一定能成為這方面的頂尖分子，對(duì)于一個(gè)人的發(fā)展，天賦起很大作用，后天培養(yǎng)同樣重要”。

專家：不要草率決定孩子的未來

“通過基因去分析人體潛能和性格特征，理論上是有可能的，但缺乏足夠的科學(xué)論證。”浙江大學(xué)遺傳與基因組醫(yī)學(xué)研究中心主任祁鳴曾向國(guó)內(nèi)媒體表達(dá)過對(duì)天賦基因檢測(cè)的專業(yè)認(rèn)識(shí)。

“科學(xué)上從來沒有（定義）一種基因是天賦基因，我們對(duì)基因與才華的關(guān)聯(lián)度認(rèn)識(shí)還比較弱，到底哪個(gè)基因與什么才華有關(guān)系，關(guān)聯(lián)度有多大，認(rèn)識(shí)還很粗淺。只有個(gè)別能力是比較清楚的，像肌肉爆發(fā)力、肌肉耐力、骨密度水平等。市面上的某些天賦基因檢測(cè)項(xiàng)目，很可能是對(duì)一些基因相關(guān)的曲解。”祁鳴說。

篇3

借助于紛繁多樣的新方法，下一代基因測(cè)序技術(shù)將肩負(fù)起在平行序列測(cè)定大量DNA的快速數(shù)據(jù)生成能力。部分下一代基因測(cè)序技術(shù)適用于篩檢出人群是否存在某些特定遺傳性癌癥高危險(xiǎn)，實(shí)際例子是Myriad遺傳性癌癥風(fēng)險(xiǎn)測(cè)試。不止于此，它還可被用于明確癌癥患者的基因變異特征，進(jìn)而盡早從癌癥靶向治療的非適應(yīng)證用藥的新希望中受益。

盡管下一代基因測(cè)序技術(shù)有助于實(shí)現(xiàn)個(gè)體化醫(yī)學(xué)的目標(biāo)，尤其對(duì)推動(dòng)腫瘤學(xué)發(fā)展大有裨益，但不得不承認(rèn)，標(biāo)準(zhǔn)化仍舊是當(dāng)前亟需破解的瓶頸桎梏。伴隨而至的是醫(yī)療保險(xiǎn)覆蓋欠均衡，最終命運(yùn)尚未可知。

為盡早填平這一溝壑，8月17日，美國(guó)醫(yī)療技術(shù)政策中心（CMTP）針對(duì)以下一代基因測(cè)序?yàn)榛A(chǔ)的臨床腫瘤基因檢測(cè)，正式出臺(tái)初步醫(yī)療政策和醫(yī)保覆蓋指南。

“面對(duì)不斷涌現(xiàn)的基因檢測(cè)新工具，與之相適應(yīng)的可供預(yù)測(cè)的醫(yī)保覆蓋和支付政策缺位，必然阻遏腫瘤醫(yī)療服務(wù)行業(yè)快速發(fā)展。”在新聞會(huì)上，CMTP首席執(zhí)行官、美國(guó)醫(yī)療保險(xiǎn)和醫(yī)療補(bǔ)助服務(wù)中心（CMS）前首席醫(yī)療官Sean Tunis如是說。“就建立在下一代基因測(cè)序基礎(chǔ)上靶基因板的醫(yī)保覆蓋事宜達(dá)成一致，無異于向出臺(tái)與臨床基因組學(xué)相匹配的更具全面性和前瞻性的醫(yī)療政策邁出具有里程碑式意義的第一步。”

CMTP報(bào)告顯示，將多部基因檢測(cè)相關(guān)指南整合為一困難重重。一方面，盡管業(yè)界對(duì)下一代基因測(cè)序的臨床有效性和結(jié)果解析仍存質(zhì)疑聲，但不少醫(yī)保付費(fèi)者仍表示對(duì)聚焦于基因測(cè)序檢測(cè)臨床應(yīng)用規(guī)范問題的磋商深表關(guān)注。另一方面，鑒于當(dāng)前缺乏充實(shí)的臨床應(yīng)用實(shí)證，即便是已問世多年的基因和基因組檢測(cè)方法，醫(yī)保覆蓋依舊難盡如人意。

對(duì)于單次測(cè)序，下一代基因測(cè)序不僅可實(shí)現(xiàn)大基因組區(qū)域、高基因通量和（或）可觀樣本數(shù)檢測(cè)，而且較傳統(tǒng)技術(shù)更顯有效性、成本效益比和敏感性優(yōu)勢(shì)。不無遺憾的是，迄今基因測(cè)序板所提供基因變異信息的確切臨床價(jià)值并未盡知，暫無力改變現(xiàn)有臨床干預(yù)決策成為不爭(zhēng)的事實(shí)。

人們有關(guān)下一代基因測(cè)序臨床應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)化的探討順而轉(zhuǎn)向全力填補(bǔ)特定臨床疾病的個(gè)體變異或基因突變的證據(jù)空白，而非直接解決大量涉及如何評(píng)估以下一代基因測(cè)序?yàn)榛A(chǔ)，能同時(shí)分析多種不同基因變異技術(shù)的臨床獲益和風(fēng)險(xiǎn)。

此次頒布指南的要點(diǎn)包括：對(duì)患者而言，覆蓋5～50基因數(shù)的下一代基因測(cè)序試劑盒被視為標(biāo)準(zhǔn)醫(yī)療服務(wù)項(xiàng)目并為臨床必需，醫(yī)保可予付費(fèi)；參照美國(guó)病理學(xué)家學(xué)會(huì)認(rèn)證計(jì)劃和能力驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)，保障下一代基因測(cè)序的分析效度；在特殊醫(yī)療需求情況下，醫(yī)保可對(duì)更趨高通量和更全面的下一代基因測(cè)序癌癥試劑盒實(shí)行預(yù)授權(quán)付費(fèi)；各項(xiàng)建議旨在激勵(lì)實(shí)驗(yàn)室與臨床實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)分享，提升患者的臨床試驗(yàn)和注冊(cè)研究參與度，著力支撐精心策劃的數(shù)據(jù)寶庫以及諸如醫(yī)學(xué)證據(jù)聯(lián)盟、美國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)TAPUR試驗(yàn)等臨床研究項(xiàng)目。

篇4

[關(guān)鍵詞] 金黃色葡萄球菌;中毒休克綜合征毒素-1基因;殺白細(xì)胞毒素基因

[中圖分類號(hào)]R37 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B[文章編號(hào)] 1673-7210(2010)1(b)-070-02

Development of multiplex PCR for the detection of antibiotic-resistant gene and pathogenic genes in staphylococcus aureus

WANG Fengling, LIU Guohua, HOU Yingrong

(Laboratory Department of Cangzhou Traditional Chinese Medicine and Western Hospital, Hebei Province, Cangzhou 061001, China)

[Abstract] Objective: To study the features of staphylococcal toxic shock syndrome toxin (TSST-1), PVL and antibiotic resistant gene carried by staphylococcus aureus. Methods: The detection of PVL gene, mecA gene and TSST-1 gene were carried out by multiplex PCR. Results: 84 strains of staphylococcus aureus were detected mecA gene with multiplex PCR, and the detection rate was 58.3% (49/84). The isolation rate of PVL-positive strain was 23.8% (20/84) in S. aureus isolates. MRSA of PVL-positive had 13 strains (13/49, 26.5%), MSSA of PVL-positive had 7 strains (7/35, 20.0%), they showed no statistical difference(P>0.05). The prevalence of TSST-1 gene was not detected. Conclusion: The antibiotic resistance of staphylococcus aureus is increasing. Staphylococcus aureus may secrete various toxins. We should pay attention to detecting these toxins when separating staphylococcus aureus.

[Key words] Staphylococcus aureus; Toxic shock syndrome toxin-1 gene; Panton-valentine leukocidin gene

感染性疾病是全球最常見的疾病,金黃色葡萄球菌(簡(jiǎn)稱金葡菌)是引起化膿性感染的主要病原菌。隨著抗菌藥物的廣泛應(yīng)用,金葡菌的耐藥性逐漸增加,其中耐甲氧西林金葡萄菌(MRSA)的檢出尤為明顯。MRSA的耐藥機(jī)制主要是它獲得了含有mecA耐藥基因的可移動(dòng)遺傳元件,即SCCmec盒。金葡菌能產(chǎn)生和分泌多種毒素[如殺白細(xì)胞毒素(PVL)、中毒性休克綜合征毒素-1(TSST-1)、葡萄球菌腸毒素及表皮剝脫性毒素等],這些毒素已被證明與食物中毒、中毒性休克、皮膚燙傷樣綜合征及作為超抗原功能有關(guān)[1]。因此,非常有必要對(duì)金葡菌進(jìn)行耐藥基因及致病毒素基因的檢測(cè),防止此類細(xì)菌的播散。我科對(duì)我院臨床分離的金黃色葡萄球菌耐藥基因及致病毒素基因PVL基因和TSST-1基因進(jìn)行檢測(cè),并對(duì)其所引起的感染進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

84株金葡菌均為我科2008年1月～2009年1月從臨床標(biāo)本中分離的菌株,分別來源于痰液、膿液、血液、分泌物、腹腔引流物、腎囊腫穿刺液、胸腔積液、膿皰液、皰液、導(dǎo)管下段及導(dǎo)管尖端,經(jīng)美國(guó)DADE-BERING公司W(wǎng)alkAway-40全自動(dòng)微生物分析儀鑒定核實(shí)為金葡菌。

1.2 細(xì)菌鑒定質(zhì)控菌株

金葡菌ATCC25923,購于衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心。

1.3 儀器與試劑

WalkAway-40全自動(dòng)微生物分析儀(美國(guó)DADE-BERING公司產(chǎn)品),PCR儀(美國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品),測(cè)序儀(美國(guó)ABI公司),凝膠成像儀(美國(guó)FOTODYNE),電泳儀(瑞典Phermacia公司)。PCR試劑購于上海生工生物工程有限公司。

1.4 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中已的基因序列,利用Primer Premier 5.0軟件及參考文獻(xiàn)[2]設(shè)計(jì)mecA基因、TSST-1基因、PVL基因引物,擴(kuò)增產(chǎn)物預(yù)期長(zhǎng)度分別為892 bp、578 bp和578 bp,由上海生工生物工程有限公司合成。

mecA:P1 5'-GCC GTA GTT GTC GGG TTT GG-3',P2 5'-GGC GGA TGT GCG ATT GTA TTG C-3'。

PVL:P1 5'-GTG ATG GCG CTG AGG TAG TC-3',P2 5',-GCT GGG GGT AAT TCA TTG TCT G-3'。

TSST-1:P1 5'-GCT ATC GTA AGC CCT TTG TTG C-3',P2 5'-GCT GGA TCC GTC ATT CAT TGT T-3'。

1.5 細(xì)菌DNA的提取

將冰凍保存的84株實(shí)驗(yàn)菌株用胰酶大豆肉湯復(fù)蘇、轉(zhuǎn)種哥倫比亞羊血瓊脂培養(yǎng)基。用接種環(huán)挑取24 h培養(yǎng)的單個(gè)菌落,置于100 μl裂解液(1 mol/L NaOH+20 g/L SDS)中,100℃水浴30 min,冷卻后用等量的1 mol/L鹽酸中和,離心10 min(13 000 r/min)去沉淀,再用乙醇沉淀DNA(加入400 μl無水乙醇),混勻后-20℃冰凍30 min,13 000 r/min離心15 min,棄上清。加入70%乙醇200 μl,靜置5 min,13 000 r/min離心5 min,吸干上清液,完全晾干沉淀后,用30 μl雙蒸水溶解DNA,作為PCR擴(kuò)增模板。

1.6 多重PCR擴(kuò)增體系及反應(yīng)條件

把3對(duì)引物放入同一反應(yīng)體系建立多重PCR。PCR體系:采用20 μl反應(yīng)體系,模板1 μl,起始引物和終末引物各1 μl,dNTP 1.5 μl,Taq酶0.2 μl,10× Buffer 2 μl,Mg2+ 2 μl,雙蒸水11.3 μl。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性4 min,然后進(jìn)入循環(huán),94℃變性30 s,52℃退火30 s,72℃延伸150 s,共進(jìn)行35個(gè)循環(huán),最后72℃延伸15 min,PCR產(chǎn)物在20 g/L的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳,然后在溴化乙錠溶液中染色20 min,清水沖洗后用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.7 序列測(cè)定

將PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序,結(jié)果與GenBank中的核苷酸序列進(jìn)行同源性比較。

2 結(jié)果

2.1 多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳分析

84株金葡菌中檢出mecA基因陽性49株,檢出率為58.3%;檢出PVL基因20株,占臨床分離株的23.8%,其中,MRSA為13株(13/49,26.5%),MSSA為7株(7/35,20.0%),差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);未檢出TSST-1基因陽性菌株。部分菌株的PVL基因PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖1。

圖1 PVL陽性菌株電泳結(jié)果

(1～6、9～11泳道為PVL基因陰性菌株;7、8泳道為PVL基因陽性菌株;M:PCR marker)

2.2 PVL基因陽性金葡菌的分布特點(diǎn)

PVL基因陽性的分離株中,有7株分離自膿液和創(chuàng)傷分泌物,5株分離自血液,5株分離自痰液,2株分離自腹腔引流物,1株分離自尿液。

2.3 測(cè)序結(jié)果的分析

將測(cè)序結(jié)果與GenBank中的已有序列進(jìn)行比較,同源性為100%。

3 討論

最近,國(guó)內(nèi)學(xué)者報(bào)道葡萄球菌已是醫(yī)院感染分離率最高的細(xì)菌,其中MRSA占較高的比例[3]。近年來,其臨床分離率呈明顯上升趨勢(shì),因具有多重耐藥特征和攜帶多種毒力因子(如PVL、TSST-1、SEC等)已成為臨床治療的難點(diǎn)。筆者對(duì)我院金葡菌感染情況分析發(fā)現(xiàn),我院MRSA感染占58.3%,MSSA占41.7%,明顯高于馬筱玲等[4]報(bào)道的MRSA檢出率(42%),說明我院MRSA感染率較高,并且多為院內(nèi)感染,應(yīng)引起臨床重視。MRSA的甲氧西林耐藥決定簇(mecA)位于SCCmec盒上,該結(jié)構(gòu)類似于轉(zhuǎn)座子,可以介導(dǎo)mecA基因游離傳播,使敏感的金葡菌獲得甲氧西林耐藥;同時(shí)SCCmec盒還可以整合許多其他耐藥基因。因此,MRSA菌株常表現(xiàn)為多重耐藥。MRSA的產(chǎn)生還與臨床上抗生素的不合理應(yīng)用有密切關(guān)系。

PVL是金葡菌產(chǎn)生的一種外毒素,該毒素特異性地吸附并作用于白細(xì)胞,改變白細(xì)胞的通透性,造成大量白細(xì)胞損傷,喪失吞噬能力。同時(shí),由于白細(xì)胞的破壞,處理抗原和呈遞抗原信息的能力下降,損害了機(jī)體的防御屏障和免疫應(yīng)答,從而不能建立有效的特異性免疫。近年來由產(chǎn)PVL金葡菌所致感染而導(dǎo)致死亡病例逐漸增多,尤其是攜帶PVL基因的MRSA[5]。本研究結(jié)果顯示,84株金葡菌中PVL基因陽性的檢出率為23.8%,明顯高于閆中強(qiáng)等[6]報(bào)道的PVL基因檢出率(15.7%)。20株P(guān)VL陽性菌株中,7株分離自膿液和創(chuàng)傷分泌物,5株分離直血液,5株分離自痰液,2株分離自腹腔引流物,1株分離自尿液,說明不同臨床標(biāo)本中都可能檢出PVL陽性的金葡菌,PVL陽性的金葡菌主要造成化膿性感染、肺部感染、血液感染及尿路感染。PVL基因陽性菌株在MRSA中的分離率高于MSSA,PVL基因陽性的MRSA具有多重耐藥性且攜帶PVL,其毒性強(qiáng),有一定的致死性,將會(huì)給患者帶來嚴(yán)重的后果。

TSST-1是金葡菌產(chǎn)生的一種產(chǎn)熱毒素,作為超抗原,TSST-1與MHC-Ⅱ類分子結(jié)合,作用于T細(xì)胞受體,使其大量增殖,并產(chǎn)生白細(xì)胞介素-1、白細(xì)胞介素-2及干擾素等多種細(xì)胞因子,是引起中毒性休克的主要原因[7]。本研究對(duì)84株金葡菌進(jìn)行檢測(cè),未檢出TSST-1基因,可能與感染類型不同、其金葡菌攜帶的毒素基因不同有關(guān)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Becker K, Friedrich AW, Lubritz G, et al. Prevalence of genes encoding pyrogenic toxin superantignes and exfoliative toxins among strains of staphylococcos aureus isolated from blood and nasal soecinens[J]. J Clin Microbiol,2003,41(4):1434-1439.

[2]Yamasaki O, Kaneko J, Morizane S, et al. The association between staphylococcos aureus strains carrying panton-valentine leukocidin genes and the development of deep seated follicular infection [J]. Clin Infect Dis,2005,40(3):381-385.

[3]姚春艷,府偉靈.葡萄球菌醫(yī)院感染的耐藥性分析[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志,2004,14(1):104-106.

[4]馬筱玲,孫光明,戴媛媛,等.金黃色葡萄球菌耐藥性監(jiān)測(cè)[J].臨床輸血與檢驗(yàn)雜志,2007,9(1):18-20.

[5]Lopez-Aguilar C, Perez-Roth E, Moreno A, et al. Association between the presence of the panton-valentine leukocidin-encoding gene and a lower rate of survival among hospital pulmonary patients with staphylococcal disease [J]. J Clin Microbiol,2007,45(1):274-276.

[6]閆中強(qiáng),沈定霞,羅燕萍,等.多重PCR檢測(cè)臨床分離金黃色葡萄球菌Luks/PV基因和mecA基因[J].中國(guó)感染與化療雜志,2008,8(4):255-259.

篇5

目前應(yīng)用最廣泛的基因檢測(cè)是新生兒遺傳性疾病的檢測(cè)、遺傳疾病的診斷和某些常見病的輔助診斷。疾病診斷是用基因檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)引起遺傳性疾病的突變基因。近年來令人非常興奮的是預(yù)測(cè)性基因檢測(cè)的開展。利用基因檢測(cè)技術(shù)在疾病發(fā)生前就發(fā)現(xiàn)疾病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，提早預(yù)防或采取有效的干預(yù)措施。目前已經(jīng)有多種疾病可以用基因檢測(cè)的方法進(jìn)行預(yù)測(cè)。基因檢測(cè)是通過血液、其他體液或細(xì)胞對(duì)DNA進(jìn)行檢測(cè)的技術(shù)。可以診斷疾病，也可以用于疾病風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)。在進(jìn)行基因檢測(cè)的過程，保證基因結(jié)果的準(zhǔn)確性的諸多因素中，采樣的正確是一個(gè)重要的環(huán)節(jié)。今年在我院進(jìn)行基因檢測(cè)預(yù)測(cè)疾病風(fēng)險(xiǎn)的人有60例，過程順利，并取得良好效果，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 資料與方法：

在我院通過基因檢測(cè)預(yù)測(cè)疾病風(fēng)險(xiǎn)的人有60例，其中男26例，女34 例，年齡27-65歲。而這部分人群中，普遍對(duì)自己的身體狀況比較重視，且有腫瘤或心腦疾病家族病史。檢測(cè)時(shí)，工作人員用特制的采樣棒在被檢者的口腔內(nèi)兩頰部輕輕刮取口腔黏膜的脫落細(xì)胞（或留取被檢者的唾液），放入固定液中送檢。實(shí)驗(yàn)室對(duì)被測(cè)者細(xì)胞中的DNA分子的基因信息進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果：

在我院檢測(cè)的60例檢測(cè)者中，59例取樣一次成功，只有一例因取樣因細(xì)胞不夠而需重新取樣。

3 討論：

3.1 工作人員地操作正確與否，直接影響檢查地結(jié)果：抱著對(duì)被檢者認(rèn)真負(fù)責(zé)的態(tài)度，檢查者必須強(qiáng)調(diào)讓被檢者在取樣前半個(gè)小時(shí)內(nèi)不吃東西，如半小時(shí)內(nèi)進(jìn)食過的人必須用白開水輕輕漱口后再進(jìn)行取樣檢測(cè)；取樣時(shí)工作人員帶上口包，手套；刮取口腔黏膜的脫落細(xì)胞時(shí)，動(dòng)作不能過猛，但又不能太輕，過猛會(huì)刮破口輕粘膜，太輕又沒取到足夠的脫落細(xì)胞。刮取的標(biāo)本應(yīng)存放在陰涼干燥的地方，固定液的瓶蓋蓋嚴(yán)實(shí)，并及時(shí)送檢。

3.2 基因檢測(cè)可預(yù)測(cè)身體患病的風(fēng)險(xiǎn)，從而有針對(duì)性地預(yù)防和改善自己的生活環(huán)境和生活習(xí)慣，避免重大疾病的發(fā)生。

3.3 疾病易感基因檢測(cè)與常規(guī)體檢都能起到預(yù)防的作用，但二者反映的是不同的階段。一種疾病從開始到發(fā)病要經(jīng)歷很長(zhǎng)的時(shí)間。基因檢測(cè)是人在沒發(fā)病時(shí)，預(yù)防將來會(huì)發(fā)生什么疾病，屬于檢測(cè)的第一階段；而常規(guī)檢測(cè)是發(fā)生疾病后，疾病到達(dá)什么程度。如：早期、中期等等，這屬于檢測(cè)的第二個(gè)階段，是臨床醫(yī)學(xué)的范疇。所以說，基因檢測(cè)是主動(dòng)預(yù)防疾病的發(fā)生，而傳統(tǒng)的體檢手段則無法起到這樣的預(yù)防作用。 傳統(tǒng)體檢主要針對(duì)人體已經(jīng)出現(xiàn)的臨床病變進(jìn)行診斷和檢查，它的主要任務(wù)是配合疾病的治療，無法在病變之前預(yù)知，下更多、更深的結(jié)論。也就是說，在疾病的預(yù)防上，傳統(tǒng)體檢十分的被動(dòng)和滯后。現(xiàn)實(shí)中很多疾病并無明顯征兆，而一旦發(fā)病，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)往往束手無策，患者及其家人就可能一生痛苦和麻煩。

3.4 基因檢測(cè)為健康管理帶來新思路

3.4.1 基因檢測(cè)為我們確定疾病風(fēng)險(xiǎn)提供了新的思路；隨著基因醫(yī)學(xué)研究的不斷深入，基因檢測(cè)在疾病風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)與評(píng)估方面發(fā)揮了越來越重要的作用。在疾病發(fā)生前，通過對(duì)疾病易感基因進(jìn)行檢測(cè)，從而對(duì)可能引起疾病的遺傳因素進(jìn)行識(shí)別、評(píng)估，找到疾病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)因素，應(yīng)用于個(gè)體化的預(yù)防醫(yī)學(xué)，包括飲食、運(yùn)動(dòng)、生活方式和藥物影響，從而使人最大程度地保持健康 。

篇6

【關(guān)鍵詞】 轉(zhuǎn)基因大豆成分 PCR SDS-PAGE 基因芯片 酶聯(lián)免疫吸附分析技術(shù)

我國(guó)為大豆的原產(chǎn)國(guó)也是大豆的主產(chǎn)國(guó)之一，但是近年來，國(guó)外的轉(zhuǎn)基因大豆大量涌入中國(guó)，中國(guó)國(guó)產(chǎn)大豆失去了價(jià)格優(yōu)勢(shì)，很多企業(yè)選擇低成本的轉(zhuǎn)基因大豆作為原料。中國(guó)是個(gè)飲食文化上很依賴大豆的國(guó)家，各種大豆制品充斥著我們的餐桌，但是由于轉(zhuǎn)基因大豆可能存在安全性問題，很多消費(fèi)者選擇不食用轉(zhuǎn)基因食品，但是有調(diào)查顯示我國(guó)存在很多大豆制品中是使用轉(zhuǎn)基因大豆制作的，但是都沒有進(jìn)行標(biāo)示，所以在食品安全監(jiān)測(cè)方面，亟待一種有效的檢測(cè)產(chǎn)品中是否含有轉(zhuǎn)基因成分的手段。本文列出幾種大豆制品的轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)方法，并對(duì)其優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行了綜述。

1 PCR法

1.1 PCR（polymerase Chain Reaction）

目前，種植最廣的是抗草甘膦大豆由美國(guó)孟都山公司生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因大豆，轉(zhuǎn)基因大豆的外源基因epsps（5-enolypyruvy lshikimate-3-phosphate synthase，來源于A.tumefaciens菌株cp4），調(diào)控元件上游為花椰菜花葉病毒CaMV35S啟動(dòng)子，下游終止子為NOS，檢測(cè)時(shí)主要針對(duì)這三種基因進(jìn)行檢測(cè)，而且還包括大豆的內(nèi)源基因lectin，用于鑒別大豆。利用這四個(gè)基因片段的特異性基因序列，利用Primer Premier5.0設(shè)計(jì)四對(duì)引物，進(jìn)行擴(kuò)增，可以初步確定大豆中是否含有轉(zhuǎn)基因成分。有研究結(jié)果表明，利用CTAB法提取大豆的總DNA，對(duì)大豆的CaMV 35S啟動(dòng)子和內(nèi)源基因Lection PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為118bp和195bp，表明了大豆中有轉(zhuǎn)基因成分。另有研究利用GUS標(biāo)記基因和NOS終止子的pBI221質(zhì)粒作為PCR檢測(cè)的陽性對(duì)照，在轉(zhuǎn)基因大豆中擴(kuò)增出了陽性結(jié)果，并利用Southern雜交驗(yàn)證了結(jié)果的可靠性。這些研究都證明了利用PCR對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆進(jìn)行檢測(cè)是簡(jiǎn)便可靠的一種檢測(cè)手段。

1.2 巢式（nested PCR）和半巢式PCR

在食品檢驗(yàn)領(lǐng)域，很多時(shí)候我們要面對(duì)的是大豆制品，其中的DNA被破壞，可供我們利用的有效的模板少，所以利用普通PCR無法檢測(cè)出是否含有轉(zhuǎn)基因大豆成分。巢式PCR是設(shè)計(jì)2對(duì)引物，其中1對(duì)引物在另1對(duì)引物擴(kuò)增產(chǎn)物的片段上，通過2次PCR反應(yīng)對(duì)某個(gè)基因進(jìn)行檢測(cè)。通常第1次采用能擴(kuò)增較大片段的引物，經(jīng)過20～30 次循環(huán)擴(kuò)增后，將第1次擴(kuò)增的產(chǎn)物作為模板進(jìn)行第2次擴(kuò)增。半巢式PCR的原理與巢式PCR基本相同，只是半巢式PCR只有1對(duì)半引物，有1個(gè)引物被用于2次PCR反應(yīng)中。這2種方法不但可以減少假陽性的出現(xiàn)，而且可以使檢測(cè)的下限下降幾個(gè)數(shù)量級(jí)。從理論上來說，用巢式和半巢式PCR可以檢測(cè)到低于10-11g/μL的DNA模板量。

2 基因芯片

基因芯片是采用光導(dǎo)原位合成或顯微印刷等方法，將大量DNA探針片段有序地固化于支持物的表面，然后與已標(biāo)記的生物樣品中DNA分子雜交，再對(duì)雜交信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)分析，就可得出該樣品的遺傳信息。一次可以檢驗(yàn)大量樣品，但是造價(jià)較高，還有待開發(fā)。

3 酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)

酶聯(lián)免疫吸附分析是指：應(yīng)用一個(gè)酶標(biāo)記的免疫反應(yīng)物和一個(gè)免疫吸附劑的酶免疫分析，通過不同的方法，可用于測(cè)定未知樣品的濃度。Lipp等人在2000年建立測(cè)試和驗(yàn)證了基于ELISA的抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆的特異性檢測(cè)方法，這個(gè)方法利用CP4-EPSPS（5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶）蛋白特異性抗體，初步研究表明，此方法可以檢測(cè)大豆原料中的轉(zhuǎn)基因成分含量范圍在0.3%-5%之間。

4 蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳

研究表明：利用SDS-PAGE蛋白電泳，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因大豆中有一條分子量約為45ku的蛋白帶的表達(dá)量明顯比非轉(zhuǎn)基因大豆強(qiáng)，這樣可以在蛋白檢測(cè)中，從表達(dá)量的大小來區(qū)分轉(zhuǎn)基因大豆與非轉(zhuǎn)基因大豆，但是，這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，由于無法引進(jìn)轉(zhuǎn)基因大豆對(duì)應(yīng)的原始非轉(zhuǎn)基因大豆品種，只能與中國(guó)的大豆進(jìn)行比對(duì)，所以結(jié)果僅作參考，但是這為轉(zhuǎn)基因大豆的檢測(cè)提供了一個(gè)新思路。

5 結(jié)語

轉(zhuǎn)基因大豆的檢測(cè)方法多種多種，各有其優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)，在實(shí)際的檢測(cè)工作中，要根據(jù)具體情況，選擇一種行之有效的方法。

參考文獻(xiàn)：

篇7

【關(guān)鍵詞】人性化護(hù)理；ICU；應(yīng)用

[Abstracr] Objective： Discuss the Mediterranean anemia gene detection in the diagnosis of the Mediterranean anemia screening application value. Method： Of the Mediterranean anemia’s survey 1354 cases of primary school students to proceed blood routine detection、hemoglobin electrophoresis and Mediterranean anemia gene test， statistical analysis of three kinds of screening diagnosis method of the relationship. Result： According to the MCV 80 fl or less Mediterranean anemia for standard screening， αMediterranean anemia missed diagnosis rate was 35.87%， βMediterranean anemia missed diagnosis rate was 6.74%； In MCH 25 pg or less for screening criteria， αMediterranean anemia missed diagnosis rate was 38.48%， β Mediterranean anemia missed diagnosis rate was 15.28%； With the MCV80 fl， MCH 25 pg or less joint criteria for screening， α Mediterranean anemia missed diagnosis rate was 29.26%， β Mediterranean anemia missed diagnosis rate was 5.96%； By hemoglobin electrophoresis HbA2 > 3.5% for screening criteria，β Mediterranean anemia missed diagnosis rate was 0.26%， send a quick zone screening α Mediterranean anemia missed diagnosis rate was 98.00%. Conclusion： The MCV， MCH and hemoglobin electrophoresis can be used as the Mediterranean anemia screening method of a kind of simple、convenient、fast， but not as a gold standard， the Mediterranean anemia gene testing detects in guidance of eugenic and superior nurture plays an irreplaceable important role.

[Key words] MCV； MCH； Hemoglobin Electrophoresis； Mediterranean anemia gene

地中海貧血，又稱海洋性貧血，亦稱珠蛋白生成障礙性貧血。它是一組常染色體遺傳性疾病，其發(fā)病機(jī)理是珠蛋白基因缺陷而導(dǎo)致一種或幾種珠蛋白合成障礙，造成血紅蛋白中的α類和β類珠蛋白比例失衡，以致引起慢性溶血性貧血。臨床癥狀輕重不一，輕型地中海貧血一航無明顯癥狀。對(duì)地貧的篩查診斷方法有多種，常用的有血液分析、血紅蛋白電泳、紅細(xì)胞脆性檢測(cè)等，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，地貧的基因診斷已被應(yīng)用于臨床。現(xiàn)對(duì)1354例在讀小學(xué)生進(jìn)行血液分析、血紅蛋白電泳和地貧基因檢測(cè)，分析地貧基因檢測(cè)的重要性，報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 受檢對(duì)象：隨機(jī)選取德宏州鄉(xiāng)鎮(zhèn)小學(xué)在讀學(xué)生1354人。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器：杭州博日熒光定量PCR儀、日本東亞SysmexXT-1800i全自動(dòng)血液學(xué)分析儀、美國(guó)CVP凝膠成像儀、韓國(guó)COMBI分子雜交箱、北京六一廠31B瓊脂糖水平電泳儀

1.2.2 試劑：亞能生物技術(shù)（深圳）有限公司提供α-地貧和β-地貧基因檢測(cè)試劑盒

篇8

【關(guān)鍵詞】 分支桿菌;結(jié)核;藥物耐受性;基因

鏈霉素(Sm)作為最主要的一線抗結(jié)核藥物之一,但由于單純化療和不規(guī)律化療,其耐藥情況日益嚴(yán)重,對(duì)其耐藥性的研究受到重視。[1]有報(bào)道認(rèn)為結(jié)核分支桿菌耐鏈霉素的產(chǎn)生是由于其核糖體蛋白S12編碼基因rpsL和16SrRNA的編碼基因rrs的缺失和突變所導(dǎo)致 [2]。本院采用采用PCR-寡核苷酸探針反相斑點(diǎn)雜交技術(shù)檢測(cè)了55株肺結(jié)核患者痰標(biāo)本臨床分離株,并對(duì)25例結(jié)核患者痰標(biāo)本直接進(jìn)行rpsL基因、rrs基因突變檢測(cè),現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 23例敏感株和32例耐SM或含耐SM的臨床分離株來自本所。25例耐SM或含耐SM的肺結(jié)核患者痰標(biāo)本來自本院住院結(jié)核患者。按結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)規(guī)程進(jìn)行菌種鑒定及藥敏實(shí)驗(yàn)證實(shí)為結(jié)核分支桿菌并對(duì)鏈霉素耐藥。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌DNA的制備[3] 臨床分離株DNA用常規(guī)酚/氯仿抽提法提取標(biāo)本中DNA。

1.2.2 PCR擴(kuò)增 采用25 μl反應(yīng)體系,4XdNTPs終濃度為0.2 mmol/L,Bio-標(biāo)記引物終濃度為0.2 μmol/L,擴(kuò)增程序?yàn)?94℃變性I min,58℃退火1 min,72℃延伸I min,循環(huán)30次,最后72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳。紫外檢測(cè)出現(xiàn)267 bp條帶。

1.2.3 雜交檢測(cè) 將點(diǎn)有探針的硝酸纖維素膜裝入雜交袋中,加入雜交液放置水浴鍋中進(jìn)行預(yù)雜交:45℃×30 min。將Bio-標(biāo)記引物的PCR擴(kuò)增陽性產(chǎn)物變性:95 ℃×l0 min,取出迅速放入冰盒中,每毫升雜交液一般加l0 μl變性的擴(kuò)增產(chǎn)物,放置水浴鍋中進(jìn)行雜交:45℃×30 min。洗膜:洗液1 、45℃× 3 min,洗液2 、45℃×3 min。SA-AP:用1∶1000的稀釋液(洗液Ⅰ)與膜在37℃作用30 min。洗膜:洗液Ⅰ、45℃× 3 min,洗液Ⅱ、45℃×3 min。顯色:每毫升洗液I加入NBT 6.6 μl、BICP 3.3 μl混勻,將配好的顯色液加入雜交袋中,閉光37℃顯色5 min,觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增,以結(jié)核分支桿菌H37RV為對(duì)照,23株藥物敏感株、32株耐SM分離株rpsL、rrs基因擴(kuò)增均為陽性;25例耐SM肺結(jié)核患者痰標(biāo)本中rpsL基因18例擴(kuò)增陽性、rrs基因14例擴(kuò)增陽性(見表1)。

2.2 應(yīng)用寡核苷酸探針反相斑點(diǎn)雜交技術(shù)檢測(cè)rpsL、rrs基因突變結(jié)果(見表1、2)。

表1

基因例數(shù) 擴(kuò)增陽性數(shù) 基因突變數(shù)突變率(%)

rpsL基因25 18950

rrs基因251417.2

表2

對(duì)55例臨床分離株的檢測(cè)結(jié)果(%)

分離株 例數(shù)rpsL基因突變數(shù)rr 基因突變數(shù)

敏感株23 1(4.3) 0(0)

耐藥株 3221(65.6) 4(12.5)

23株藥物敏感株的rpsL、rrs基因突變率分別為4.3%、0。32株耐SM分離株中,21株rpsL基因發(fā)生突變,突變率為65.6%;4株rrs基因發(fā)生突變,突變率為12.5%。耐SM肺結(jié)核患者痰標(biāo)本中,基因突變檢測(cè)率分別為50.0%、7.2%。

3 討論

迄今,檢測(cè)結(jié)核桿菌藥敏的傳統(tǒng)方法仍然是培養(yǎng)法,但由于結(jié)核桿菌生長(zhǎng)緩慢,使藥敏測(cè)定結(jié)果需要兩個(gè)月,甚至更長(zhǎng)時(shí)間,這也是影響結(jié)核病化療效果的原因之一。因此,建立一種新的快速,有效的藥敏試驗(yàn)方法對(duì)結(jié)核病的早期治療具有重要的意義。有研究表明[4] 結(jié)核分支桿菌耐鏈霉素的產(chǎn)生是由于其核糖體蛋白S12編碼基因rpsL和16SrRNA的編碼基因rrs的缺失和突變所導(dǎo)致。本實(shí)驗(yàn)室前期通過PCR-SSCP方法得出耐鏈霉素時(shí),rpsL、rrs基因總突變率為72.2%。[4]但PCR-SSCP方法建立在凝膠電泳基礎(chǔ)上,難于標(biāo)準(zhǔn)化和質(zhì)量控制,難以大規(guī)模推廣。通過對(duì)rpsL、rrs基因核心易變區(qū)進(jìn)行DNA序列分析。根據(jù)基因突變的中心區(qū)域,設(shè)計(jì)靶基因,制備寡核苷酸探針,點(diǎn)樣在雜交膜上,進(jìn)行PCR-寡核苷酸探針反相斑點(diǎn)雜交。

PCR-寡核苷酸探針反相斑點(diǎn)雜交檢測(cè)rpsL、rrs基因突變,23株藥物敏感株的rpsL、rrs基因突變率分別為4.3%、0。32株耐SM分離株中,21株rpsL基因發(fā)生突變,突變率為65.6%;4株rrs基因發(fā)生突變,突變率為12.5%。由于有4.3%的敏感株也突變,說明某些耐藥菌株的形成可能與rpsL、rrs突變無關(guān)。

筆者用PCR-寡核苷酸探針反相斑點(diǎn)雜交技術(shù)直接檢測(cè)了25例耐SM肺結(jié)核患者痰標(biāo)本,rpsL基因18例擴(kuò)增陽性、rrs基因18例擴(kuò)增陽性,其基因突變檢測(cè)率分別為50.0%、7.2%。低于耐SM臨床分離株。這可能是由于痰標(biāo)本雜質(zhì)多,同時(shí)痰標(biāo)本的處理和靶DNA濃度對(duì)PCR擴(kuò)增有直接影響。PCR-寡核苷酸探針反相斑點(diǎn)雜交技術(shù)以其簡(jiǎn)便、快速、靈敏并可以直接檢測(cè)未經(jīng)培養(yǎng)的痰標(biāo)本中結(jié)核分支桿菌rpsL、rrs基因突變,為臨床檢測(cè)結(jié)核分支桿菌對(duì)鏈霉素耐藥性提供了初步依據(jù)。

參 考 文 獻(xiàn)

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篇9

關(guān)鍵詞：沙門氏菌；ICAN；invA基因

沙門氏菌（Salmonella）為腸桿菌科沙門氏菌屬成員，是一類條件性細(xì)胞內(nèi)寄生的革蘭氏陰性腸桿菌。絕大多數(shù)沙門氏菌對(duì)人和動(dòng)物有致病性，能引起人和動(dòng)物多種不同的臨床表現(xiàn)，主要引起發(fā)熱、胃腸炎、腹瀉和敗血癥等，中毒嚴(yán)重的，可引起死亡，病死率一般是0.5%～1%[2，3]。據(jù)世界衛(wèi)生組織的報(bào)道，沙門氏菌引起的食物中毒常列榜首，給各國(guó)經(jīng)濟(jì)造成重大損失。因而，在醫(yī)學(xué)和公共衛(wèi)生上具有非常重要的意義。目前，對(duì)沙門氏菌檢測(cè)大多采用細(xì)菌分離、生化鑒定、PCR等方法，過程煩瑣、費(fèi)時(shí)費(fèi)力，并且腸桿菌科細(xì)菌間的生化反應(yīng)多有交叉，因此，這些檢測(cè)方法在快速、敏感與特異性等方面有自身的局限性[4～6]。Cocolin等[7]利用PCR擴(kuò)增invA 基因快速檢測(cè)食品中的沙門氏菌；Bohaychuk[8]等人利用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)沙門氏菌invA基因進(jìn)行定量檢測(cè)。隨著對(duì)分子生物學(xué)技術(shù)研究的不斷進(jìn)展，2007年日本學(xué)者Hiroyuki Mukai[1]等發(fā)明了一種嵌合引物介導(dǎo)的恒溫?cái)U(kuò)增法（即ICAN法）。ICAN反應(yīng)在恒溫條件下進(jìn)行，5'-DNA-RNA-3'的嵌合引物、耐熱的RNaseH及具有鏈取代活性的DNA聚合酶是ICAN反應(yīng)必需的。該反應(yīng)的原理包括多引物反應(yīng)和模板轉(zhuǎn)換兩個(gè)機(jī)理， RNaseH在新合成鏈的引物部分的RNA處引入切口后，馬上就會(huì)在切口處發(fā)生鏈取代反應(yīng)取代新合成的鏈，同時(shí)，反應(yīng)液中的嵌合引物立即與模板雜交開始新的延伸反應(yīng)，多條鏈同時(shí)在同一模板進(jìn)行的鏈合成反應(yīng)稱多引物反應(yīng)機(jī)理；模板轉(zhuǎn)換反應(yīng)是指：原反應(yīng)液中的模板合成的新模板在RNaseH酶和鏈取代酶的作用下，可以快速轉(zhuǎn)換出新的模板。由于多引物反應(yīng)和模板轉(zhuǎn)換反應(yīng)的同時(shí)進(jìn)行，ICAN比起一般的擴(kuò)增方法更加快速。ICAN法區(qū)別于其他檢測(cè)方法的最重要的特點(diǎn)是：反應(yīng)時(shí)間短（一般只需60min）、所需模板量少（只需PCR所要求的模板量的1/5）、靈敏度高、擴(kuò)增反應(yīng)不需特殊的儀器（普通水浴鍋即可），另外，因?yàn)镮CAN采用恒溫?cái)U(kuò)增系統(tǒng)，所以我們只要簡(jiǎn)單地增加反應(yīng)液的體積卻不需改變反應(yīng)條件，這有助于DNA的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展[9]。本文主要對(duì)ICAN法應(yīng)用于沙門氏菌檢測(cè)的研究情況加以介紹。

1 材料與方法

1.1菌株 本次試驗(yàn)的菌株全部來自浙江省疾病預(yù)防控制中心微生物檢驗(yàn)所，名稱見表1。

1.2主要試劑和儀器 PCR儀（eppendorf Mastercycler Gradient）、離心機(jī)（eppendorf centrifuge 5417R）、DU800紫外/可見分光光度計(jì)、MiniRun GE-100型凝膠電泳儀、凝膠成像儀（BIO-RAD）、Bca BEST DNA聚合酶（TaKaRa）、Tli RNaseH Ⅱ（TaKaRa）、Hepes（sigma-aldrich）、dNTP Mixture（TaKaRa）。

1.3 ICAN引物 由上海生工生物技術(shù)委托IDT公司合成（引物序列見下表）

1.4菌培養(yǎng)、DNA模板的制備和DNA濃度純度的測(cè)定

1.4.1細(xì)菌的培養(yǎng) 從半固體培養(yǎng)基中挑取菌落接種于普通瓊脂平板上37℃培養(yǎng)18h，再從平板上挑取典型單菌落，用LB肉湯培養(yǎng)液37℃培養(yǎng)過夜。

1.4.2 DNA模板的制備 用細(xì)菌基因組DNA小量純化試劑盒（TaKaRa MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver.2.0）制備，其步驟為：

1.取1～4ml的過夜培養(yǎng)菌液，10000rpm離心2min，棄上清；

2.用150μl的SP Buffer（含RNase A1）充分懸浮細(xì)菌沉淀； 注：注意不要?dú)埩艏?xì)小菌塊，可以使用振蕩器（Vortex）等劇烈振蕩使菌體充分懸浮

3.加入20μl的Lysozyme溶液，均勻混合后室溫靜置5min；

4.加入30μl的EDTA Buffer，均勻混合后室溫靜置5min；

5.加入200μl的Solution A，劇烈振蕩后65℃保溫10min；注：①若Solution A出現(xiàn)沉淀，請(qǐng)于65℃加熱溶解，待恢復(fù)至室溫后使用；②65℃保溫10min后，溶液將由乳濁液變成透明液。如果此時(shí)溶液沒有變成透明，說明細(xì)菌沒有裂解基因組DNA將不能釋放；

6.加入400 μl的Solution B，劇烈振蕩15s； 注：若Solution B出現(xiàn)沉淀，請(qǐng)于65℃加熱溶解，待恢復(fù)至室溫后使用；

7.加入650 μl的Solution C，上下顛倒均勻混合；

8.12000 rpm離心1min；

9.先棄去上層有機(jī)相，然后將水相溶液（無色下層）移入預(yù)先置于1.5ml離心管上的Filter Cup中，12000rpm離心1min； 注：有機(jī)相（上層）請(qǐng)務(wù)必除盡，否則會(huì)阻礙DNA結(jié)合到DNA制備膜上；

10.棄Filter Cup，在濾液中加入450μl的DB Buffer，混合均勻；

11.將試劑盒中的Spin Column安置于Collection Tube上；

12.將上述操作11的混合液轉(zhuǎn)移至Spin Column中，12000rpm離心1min，棄濾液；

13.將500μl的Rinse A加入至Spin Column中，12000rpm離心1min，棄濾液；

14.將700μl的Rinse B加入至Spin Column中，12000rpm離心1min，棄濾液； 注：請(qǐng)沿Spin Column管壁四周加入Rinse B，這樣有助于完全沖洗沾附于管壁上的鹽份；

15.重復(fù)操作步驟14；

16.將Spin Column安置于新的1.5ml的離心管上，在Spin Column膜的中央處加入60μl的滅菌蒸水或Elution Buffer，室溫靜置1min； 注：把水或Elution Buffer加熱至65℃使用時(shí)有利于提高洗脫效率

17.12000rpm離心1min洗脫DNA。

1.4.3 DNA濃度和純度的測(cè)定 其步驟為：

1.打開儀器DU800紫外/可見分光光度計(jì)后部（電源處）的開關(guān)，指示燈亮；

2.打開儀器輔助電腦，雙擊進(jìn)入DU-800軟件的主界面，此時(shí)儀器自檢；

3.待檢測(cè)完成后，點(diǎn)擊"Continue"進(jìn)入操作界面；

4.點(diǎn)擊"UV"打開紫外燈，此過程中會(huì)顯示"UV LAMP IS WARMING"，從黃色的UV燈不閃動(dòng)開始需預(yù)熱20min左右，才能開始下一步操作；

5.向石英杯內(nèi)加入對(duì)照樣本（DNA提取中用到的無菌去離子水），放入池架中，點(diǎn)擊軟件中的"BLANK"按鈕，設(shè)置一個(gè)空白對(duì)照（加樣過程中槍頭不能碰到樣品槽透明面）；

6.取出石英杯，吸去對(duì)照樣本，將樣品（9月22日提取DNA樣品）以1：3（50ul樣品：150ul去離子水）比例充分混勻，加入石英杯并點(diǎn)擊軟件界面的"GO"按鈕，讀出OD值（A260，A280），記錄結(jié)果；

7.打開杯蓋，取出樣品槽，吸除液體，并用無菌去離子水洗滌三遍（每測(cè)一個(gè)樣品后都需進(jìn)行此操作），放回杯盒中；

8.關(guān)閉DU-800軟件，此時(shí)軟件提示："是否關(guān)閉燈"，若短時(shí)間內(nèi)不用，請(qǐng)點(diǎn)擊"YES"關(guān)閉， 關(guān)閉電腦后再關(guān)閉儀器后部電源。

1.5 ICAN擴(kuò)增的方法和步驟 ICAN反應(yīng)體系參考Hiroyuki Mukai[8]，反應(yīng)體積25μL，反應(yīng)體系成分為：2mM IF3、2 mM IB3、0.5U TLiRNaseH II、2.75U BcaBEST DNA聚合酶、32mM Hepes-KOH buffer（PH 7.8）、0.5 mM dNTPs、100 mM KAc、4 mM Mg（Ac）2 、0.11%BSA、1%DMSO、100ng DNA模板，不足25μL部分用無菌去離子水補(bǔ)足。離心（5000rpm，1min）混勻，63℃等溫?cái)U(kuò)增1h。將陽性和陰性對(duì)照于1.5%瓊脂糖凝膠電泳后在生物凝膠成像分析儀（BIO-RAD）下觀察結(jié)果。

1.6 使用PCR緩沖液進(jìn)行invA基因的恒溫?cái)U(kuò)增 只用Takara Ex Taq buffer代替Hepes-KOH buffer（PH 7.8），其他的反應(yīng)液組成及操作步驟都與ICAN擴(kuò)增相同

2 結(jié)果

2.1不同溫度下鼠傷寒沙門菌的ICAN反應(yīng) 對(duì)ICAN反應(yīng)溫度的初步試驗(yàn)，得到反應(yīng)溫度為62.8℃時(shí)擴(kuò)增效率較好（見圖1）。

圖1 不同溫度下84年鼠傷寒沙門菌的ICAN實(shí)驗(yàn)電泳結(jié)果圖

注：1.59.6℃，2.61.1℃，3.62.8℃，4.64.7℃，5.68.5℃，6.70.1℃，7.72.2℃，8.陰性對(duì)照

2.2鼠傷寒沙門菌的ICAN反應(yīng)

圖2 不同年份鼠傷寒沙門菌的ICAN實(shí)驗(yàn)電泳結(jié)果圖

注：1.06年鼠傷寒沙門菌（N-06），2.84年鼠傷寒沙門菌（N-84），3.95年鼠傷寒沙門菌（N-95），4.陰性

2.3用Takara Ex Taq buffer代替的恒溫?cái)U(kuò)增情況 使用Takara Ex Taq buffer 代替Hepes-KOH buffer（PH7.8）時(shí)，對(duì)反應(yīng)溫度、Mg2+濃度、TLiRNaseH II濃度進(jìn)行優(yōu)化，得到反應(yīng)條件為：擴(kuò)增溫度55℃、Mg2+濃度為100mM、TLiRNaseH II為0.5u時(shí)條帶最亮。

圖3 沙門氏菌和其它腸桿菌科細(xì)菌恒溫?cái)U(kuò)增實(shí)驗(yàn)電泳結(jié)果圖（緩沖液用Takara Ex Taq buffer代替）

注：1.鼠傷寒沙門菌（N-84），2.鼠傷寒沙門菌（N-95），3.鼠傷寒沙門菌（N-06）4.鴨沙門菌（W-1），5.腸炎沙門菌（W-2），M.marker，6.陰性對(duì)照，7.耶爾森菌（W-3）8.陰溝腸桿菌（W-4）9.福氏志賀菌（W-5），10. 奇異變形桿菌（W-6），11.大腸桿菌（W-7）

3 討論

ICAN是日本學(xué)者Hiroyuki Mukai[1]等人于2007年發(fā)明的一種核酸恒溫?cái)U(kuò)增新技術(shù)。該方法使用一對(duì)5'-DNA-RNA-3'的嵌合引物，耐熱的RNaseH酶和具有鏈取代活性的BcaBEST DNA聚合酶，通過多引物反應(yīng)和模板轉(zhuǎn)換反應(yīng)兩個(gè)機(jī)理實(shí)現(xiàn)等溫條件下基因快速擴(kuò)增，具有擴(kuò)增反應(yīng)快（只需1個(gè)小時(shí)）、靈敏度高（PCR所要求的DNA量的1/5對(duì)ICAN來說已足夠了）、特異性強(qiáng)、不需要昂貴的儀器（普通電熱恒溫水浴鍋即可）等優(yōu)點(diǎn)。ICAN的高效率得益于三個(gè)關(guān)鍵因素。第一個(gè)因素是嵌合引物可以高效地與模板DNA雜交形成dDNA-引物復(fù)合體。與PCR不同，嵌合引物不需要與互補(bǔ)模板鏈競(jìng)爭(zhēng)以獲得靶模板鏈。在PCR中，引物與互補(bǔ)模板鏈的競(jìng)爭(zhēng)是DNA擴(kuò)增反應(yīng)的限制因素，尤其是在DNA擴(kuò)增的后期階段[10]。第二個(gè)因素是由于RNaseH的作用，從同一模板上同時(shí)進(jìn)行的反應(yīng)可以達(dá)到PCR的兩倍或更高倍數(shù)。這是因?yàn)椋琑NaseH可以在DNA-RNA嵌合引物上切開每一個(gè)RNA殘基的5'端，繼而引導(dǎo)模板鏈的擴(kuò)增反應(yīng)。第三個(gè)因素是由Bca BEST DNA聚合酶引導(dǎo)的多引物反應(yīng)與RNaseH和嵌合引物共同作用。在ICAN擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖像中，可以看到三條特異性條帶：最大的條帶含有兩條引物序列；中間大小的條帶含有其中的一條引物序列；最小的條帶不含引物序列。基于ICAN的高效率，我們可以在需要提供大量已知DNA序列作為模板的情況下采用ICAN，這是ICAN優(yōu)于其他擴(kuò)增方法的一個(gè)很大的方面。因?yàn)镻CR所要求的DNA量的1/5對(duì)于ICAN來說已足夠了。由于ICAN采用恒溫?cái)U(kuò)增系統(tǒng)，所以我們可以簡(jiǎn)單地增加反應(yīng)液的體積而不需改變反應(yīng)條件。目前為止，已經(jīng)證實(shí)當(dāng)反應(yīng)體積從50ul增加到5ml而不改變反應(yīng)條件時(shí)，每體積反應(yīng)液的效率是相同的。但是PCR要求精確的溫度循環(huán)，在反應(yīng)中就很難達(dá)到這一點(diǎn)。我們期待著ICAN的這一特性可以在"DNA產(chǎn)業(yè)"開啟一片新天地[9]。

侵襲蛋白普遍存在于沙門氏桿菌表面[11]，它決定沙門氏桿菌的侵襲力，是毒力決定因子。編碼侵襲蛋白的基因包括invA，invB，invC，invD和invE等。Rahn[12]等以侵襲蛋白基因（invasion protein A，invA）為目的基因，對(duì)630種沙門氏桿菌（包括100多種血清型）和142種非沙門氏桿菌（包括21個(gè)菌屬）進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果除2個(gè)利齊菲爾德沙門氏桿菌（S.1itchfield）和2個(gè)山夫登堡沙門氏桿（S.senftenberg）外，其他沙門氏桿菌均檢出陽性，而142種非沙門氏桿菌中沒有1種菌擴(kuò)增出目的條帶。因此他首次提出invA基因適于做PCR 檢測(cè)沙門氏桿菌的靶基因。我們對(duì)該擴(kuò)增片段進(jìn)行分析，在GenBank已公布的序列里，只有沙門菌具有該擴(kuò)增片段，大腸桿菌、福氏志賀菌、耶爾森氏菌和陰溝腸桿菌等其他腸桿菌科細(xì)菌均沒有該擴(kuò)增片段。另外，使用引物分析軟件對(duì)擴(kuò)增此片段的兩條引物F3：5'-GGCGATATTGGTGTTTATGGGG和B3：5'-AACGATAAACTGGACCACGG分析，其Tm值與Hiroyuki Mukai[1]等人研究中引物的Tm很接近，因此本項(xiàng)研究選擇invA基因作為檢測(cè)沙門菌屬目的基因。invA基因全長(zhǎng)244bp，根據(jù)ICAN的反應(yīng)機(jī)理，結(jié)果應(yīng)得到一條244bp的片段（含兩條引物序列）；一條224bp或222bp的片段（只含其中一條引物序列）；另一條202bp的片段（不含引物序列）。

反應(yīng)溫度對(duì)擴(kuò)增特異性的影響--使用PCR擴(kuò)增時(shí)，可以通過調(diào)節(jié)退火溫度得到最佳反應(yīng)條件。因此，可以設(shè)想：擴(kuò)增溫度也是影響ICAN反應(yīng)的一個(gè)重要因素。如圖1所示：鼠傷寒沙門菌DNA在7個(gè)不同的溫度下擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物通過1.5%的瓊脂糖凝膠電泳顯像可見，當(dāng)擴(kuò)增溫度為61.1℃或62.8℃時(shí)，在目的片段大小處有條帶，擴(kuò)增效果較好。因此，我們可以通過調(diào)節(jié)擴(kuò)增溫度對(duì)ICAN進(jìn)行優(yōu)化。

ICAN反應(yīng)體系組成對(duì)擴(kuò)增結(jié)果的影響--觀察圖2，不同的鼠傷寒沙門菌ICAN擴(kuò)增后都在目的條帶附近有連續(xù)的條帶，但并不是三條清晰的條帶。這個(gè)問題應(yīng)該可以通過改變反應(yīng)條件加以解決。但是我們?cè)趪L試了很多次之后，結(jié)果并不理想，當(dāng)使用與2.2完全相同的實(shí)驗(yàn)條件做重復(fù)試驗(yàn)時(shí)，也沒有重復(fù)出圖2所示的結(jié)果。因此，我們猜想：首先，自己配制的緩沖液穩(wěn)定性不夠好，所以實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性一直不好。另外，研究中用到的KAc、Mg（Ac）2也是自己配制的。最后，因?yàn)槲覀儫o法購得TLiRNaseH酶，所以就用TLiRNaseH II代替了。這兩類酶在特性方面的差異可能也會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

用PCR緩沖液代替Hepes-KOH buffer（PH7.8）做ICAN--由于前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果一直不穩(wěn)定，猜測(cè)是緩沖液不好的緣故。保持原實(shí)驗(yàn)條件不變，換用Takara Ex Taq buffer做ICAN，結(jié)果沙門菌都在稍大于8023bp處擴(kuò)增出了單條片段，而陰性和其他腸桿菌科細(xì)菌都沒有該片段，如圖3。AbouHaidar[13]對(duì)Mg2+的催化特性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)當(dāng)溫度高于55℃或PH值大于7.5時(shí)，Mg2+催化RNA水解的活性增強(qiáng)。我們對(duì)此反應(yīng)的Mg2+濃度優(yōu)化，得出當(dāng)Mg2+濃度為100mM時(shí)效果較好。對(duì)反應(yīng)的擴(kuò)增溫度和TLiRNaseH II優(yōu)化，得到擴(kuò)增溫度55℃、TLiRNaseH II為0.5u時(shí)擴(kuò)增效果較好。對(duì)沙門菌，如副傷寒沙門菌、鼠傷寒沙門菌、鴨沙門菌及腸炎沙門菌等，使用blast對(duì)IF3、IB3兩條引物比對(duì)后，發(fā)現(xiàn)各菌都沒有擴(kuò)增出大于8000bp片段的可能性。因此我們猜想，實(shí)驗(yàn)得到的大于8023bp的片段是多條小片段疊加的結(jié)果，為了驗(yàn)證這種可能性，最好對(duì)這條片段測(cè)序。

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篇10

關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因食品 檢測(cè)技術(shù) 應(yīng)用 發(fā)展

一、對(duì)轉(zhuǎn)基因食品的認(rèn)識(shí)

轉(zhuǎn)基因食品是使用現(xiàn)代的分子生物技術(shù)，把某一些生物的基因移到其他不同類的物種中去，從而改變生物的遺傳信息，讓并讓其在營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)、消費(fèi)品質(zhì)、形狀等等方面向人們需要的方向轉(zhuǎn)變。而以轉(zhuǎn)基因生物直接為食品或者為原材料加工生產(chǎn)而出的食品就是人們所說的轉(zhuǎn)基因食品。并且伴隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，一些以基因工程作為代表的生物技術(shù)同樣取得了非常矚目的成績(jī)，尤其是和人們的生活密切相連的轉(zhuǎn)基因食品更是受到了全世界范圍的關(guān)注。轉(zhuǎn)基因技術(shù)的飛快發(fā)展，在一方面推進(jìn)了生產(chǎn)力的強(qiáng)力發(fā)展，但是另一方面，轉(zhuǎn)基因食品的安全問題也是一直存在著爭(zhēng)議。它是否會(huì)對(duì)人們的身體產(chǎn)生一些不良的反應(yīng)，以及它是否會(huì)對(duì)生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生一些負(fù)面的影響，各學(xué)界都一直爭(zhēng)論不休。

二、轉(zhuǎn)基因食品的利與弊

1、轉(zhuǎn)基因食品的好處

通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以培育出高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗蟲、抗寒、抗旱、抗鹽堿和抗除草劑等等特性的新品種，還可以減少農(nóng)作物對(duì)農(nóng)藥化肥與水的依賴，大大的降低農(nóng)業(yè)成本，并且大幅度地提高了單位面積的產(chǎn)量，緩解了世界糧食短缺的矛盾；轉(zhuǎn)基因食品還可以擺脫氣候、季節(jié)的影響，可以讓人們?cè)谝荒晁募纠锒伎沙缘叫迈r的蔬菜。與此同時(shí)，科研人員還發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因作物長(zhǎng)出的果實(shí)，不管是外形還是味道都有特別的風(fēng)味；在過去要想改變植物的品種大多是通過育種，而這種比較傳統(tǒng)的育種方式要的時(shí)間要長(zhǎng)一點(diǎn)，而且雜交出的那個(gè)品種也是不易控制的，即雜交的目的性差。但是轉(zhuǎn)基因技術(shù)就可以克服這些缺點(diǎn)，通過它可以隨意選擇一個(gè)目的基因轉(zhuǎn)移進(jìn)去，在這之后就可得到一個(gè)想要的新品種，不需用花費(fèi)那么長(zhǎng)的時(shí)間再去篩選了。

2、轉(zhuǎn)基因食品的危害

有一些研究人員認(rèn)為外來的基因會(huì)用一種人們現(xiàn)在還不是很了解的方式去破壞原食物中的一些營(yíng)養(yǎng)成分。例如美國(guó)倫理與毒性中心的實(shí)驗(yàn)報(bào)告上面說，和一般的大豆相比，在耐除草劑的大豆中，異黃酮的成分減少了；同時(shí)大量的轉(zhuǎn)基因生物步入大自然界后可能會(huì)和原野生物種進(jìn)行雜交，從而造成基因污染，甚至影響到生物多樣性的持續(xù)利用和保護(hù)，而且這種污染對(duì)生態(tài)系統(tǒng)和環(huán)境造成的危害是比其他任何一種因素造成的污染都難以消除；根據(jù)有關(guān)報(bào)道，有些科學(xué)家還研究發(fā)現(xiàn)，某些轉(zhuǎn)基因生物產(chǎn)品有可能含有一些特定的有毒物質(zhì)與過敏源，這會(huì)對(duì)人體的健康產(chǎn)生一些不利的影響，嚴(yán)重的話甚至有可能會(huì)致癌或者導(dǎo)致遺傳疾病。盡管現(xiàn)在為止還沒有一些有說服力的實(shí)驗(yàn)報(bào)告表明這些優(yōu)良品種是有毒的，但是有一些研究人員認(rèn)為，對(duì)于基因的添加和人工提煉，有可能在達(dá)到某些效果的同時(shí)，也集聚和增加了食物中的微量毒素。這種毒素的累積是個(gè)相當(dāng)漫長(zhǎng)的過程，但是它確實(shí)有可能正在進(jìn)行中，所以現(xiàn)在誰也不能擔(dān)保這些改良品種是沒有毒的。

三、轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)技術(shù)

因?yàn)檗D(zhuǎn)基因物質(zhì)會(huì)在耕種、收割、加工與儲(chǔ)存的過程中混入食品當(dāng)中去，并且對(duì)食品造成一些偶然的污染。所以，不管是對(duì)轉(zhuǎn)基因食品貼上標(biāo)簽，還是對(duì)非轉(zhuǎn)基因原料與轉(zhuǎn)基因原料分開運(yùn)輸，舊食品與新的轉(zhuǎn)基因原料的檢測(cè)是不可缺少的；除此之外，還要區(qū)分非轉(zhuǎn)基因與轉(zhuǎn)基因食品，要對(duì)轉(zhuǎn)基因食品進(jìn)行選擇性的標(biāo)記，并且對(duì)食物中轉(zhuǎn)基因的含量的多少要加以限制，同時(shí)也需要有效準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)。

1、蛋白質(zhì)印跡法

蛋白質(zhì)印跡法是將電泳的顯色酶反應(yīng)的靈敏性、抗體的特異性與較高的分離能力全部結(jié)合起來，這是檢測(cè)比較復(fù)雜混合物中的特異蛋白質(zhì)最有用的工具之一，且普遍是用于檢測(cè)、分離某些特異的蛋白質(zhì)，其靈敏度為1～5ng。而且它還可以確定一個(gè)樣品中是否有超過或者低于限值水平的目的蛋白，比較適用于目的蛋白的定性檢測(cè)，特別是用于那些不可溶蛋白質(zhì)的檢測(cè)。

2、外源蛋白質(zhì)的檢測(cè)

外源蛋白質(zhì)的檢測(cè)就是從蛋白質(zhì)的水平上對(duì)那些轉(zhuǎn)基因食品進(jìn)行測(cè)定，在實(shí)際應(yīng)用中大多數(shù)采用的是免疫學(xué)檢測(cè)法。這種方法可以檢測(cè)出有抗原性蛋白質(zhì)類的存在，它的基本原理是通過抗體與抗原之間的一些特異反應(yīng)來完成的。外源蛋白質(zhì)檢測(cè)法比較快速，且具有一定的靈敏度，并且也能進(jìn)行半定量，不需要一些特殊的儀器，適用于現(xiàn)場(chǎng)刪選與檢驗(yàn)，但是外源蛋白質(zhì)檢測(cè)法還是有其局限性。

3、核酸水平檢驗(yàn)法

這種方法主要包括兩種：核酸印跡法和PCR檢測(cè)法。核酸印跡法的具體操作就是將要被檢測(cè)的樣品的DNA固定于尼龍膜上面，然后再用被標(biāo)記的核酸探針與之雜交，最后對(duì)標(biāo)記探針進(jìn)行檢測(cè)來檢驗(yàn)樣品中到底是否含有某些轉(zhuǎn)基因的DN段，但是這種方法的靈敏性比較低。PCR檢測(cè)法主要是對(duì)一些目標(biāo)進(jìn)行擴(kuò)增，然后采用某些方法對(duì)已擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。

4、Western雜交法

Western雜交是基因工程中檢驗(yàn)外源基因有沒有表達(dá)出蛋白質(zhì)的一種權(quán)威方法，其將蛋白質(zhì)的印跡、電泳和免疫測(cè)定融為了一體，所以具有很高的靈敏性。使用這種方法可從植物細(xì)胞總蛋白中檢測(cè)出50ng左右的特異蛋白質(zhì)。不過其操作較麻煩，且費(fèi)用較高，不適合用于檢疫機(jī)構(gòu)大量樣品的快速檢測(cè)。這種雜交檢測(cè)的關(guān)鍵在于抗體的制備。假如外源基因正常表達(dá)的時(shí)候，該植株細(xì)胞中就含有些許的目的蛋白。在植物細(xì)胞當(dāng)中提取總蛋白質(zhì)，然后將蛋白質(zhì)樣品溶于含有還原劑和去污劑的溶液中，經(jīng)過電泳讓蛋白質(zhì)按分子的質(zhì)量大小分離，最后把分離出的各個(gè)蛋白質(zhì)條轉(zhuǎn)移到固相膜上面，膜在較高濃度的蛋白溶液中溫浴，達(dá)到封閉非特異性位點(diǎn)的效果。通過抗體和固相支持物上面的靶蛋白的抗體抗原特異性反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)。

5、電化學(xué)發(fā)光技術(shù)

電化學(xué)發(fā)光指的是通過電化學(xué)方法生產(chǎn)一些特殊的東西，然后這些物質(zhì)之間或者其它物質(zhì)與電生物質(zhì)之間更進(jìn)一步反應(yīng)所產(chǎn)生的一種發(fā)光現(xiàn)象。這是電化學(xué)方法和化學(xué)發(fā)光相互結(jié)合的產(chǎn)物。

6、凝膠電泳

凝膠電泳是一種最簡(jiǎn)單的檢測(cè)方法。但是因?yàn)楹桶行蛄械拇笮∠嘟钠溆郉N段也有可能會(huì)被擴(kuò)增出來，因此用凝膠電泳檢驗(yàn)后的PCR產(chǎn)物最少還應(yīng)該接受限制酶的切割檢驗(yàn)。

7、其他檢測(cè)方法

伴隨著國(guó)內(nèi)外對(duì)食品的安全問題的關(guān)注度持續(xù)上升，轉(zhuǎn)基因食品的檢驗(yàn)技術(shù)也在持續(xù)不斷的發(fā)展與更新，檢測(cè)的水平也是在不斷地提高。比如近紅外波譜技術(shù)最先是用于對(duì)谷物的溫度、淀粉含量和蛋白質(zhì)的含量進(jìn)行檢測(cè)的一種方法，但是近幾年以來，這個(gè)技術(shù)主要是應(yīng)用在對(duì)轉(zhuǎn)基因食物的檢測(cè)，這種方法在檢測(cè)過程中比較方便的是不需要對(duì)那些需要被檢測(cè)的食物進(jìn)行處理，外加操作快捷簡(jiǎn)便，而且還能夠?qū)崿F(xiàn)自動(dòng)化的處理。食品企業(yè)為了能夠走出國(guó)門，進(jìn)入國(guó)際市場(chǎng)，必須要加大檢驗(yàn)轉(zhuǎn)基因食品的研究與投入。在檢測(cè)技術(shù)不斷更新之外，還必須要健全我國(guó)轉(zhuǎn)基因食品的安全監(jiān)督機(jī)制，并且完善有關(guān)的法律和制度，這樣才能夠保證轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)向著高品質(zhì)、高靈敏度和低成本的大體方向發(fā)展。

四、轉(zhuǎn)基因食品的發(fā)展

那些關(guān)于轉(zhuǎn)基因作物的爭(zhēng)討應(yīng)該是一種非常正常的現(xiàn)象。首先是現(xiàn)在新開發(fā)的一些品種本身還不是很完善，人們表示擔(dān)心還是有正當(dāng)理由的。其次，不管怎樣總會(huì)有一些意識(shí)比較保守的人對(duì)一些新科技產(chǎn)物不太習(xí)慣，甚至拒絕接受。再就是受貿(mào)易利益的影響，有些國(guó)家的利益集團(tuán)和政府利用轉(zhuǎn)基因食品不是很夠完善而強(qiáng)打貿(mào)易戰(zhàn)，讓事情變得更加復(fù)雜了。不過科學(xué)的腳步是不會(huì)因此而停頓的，科學(xué)家們必會(huì)向人類奉獻(xiàn)出更完滿的轉(zhuǎn)基因食物。

參考文獻(xiàn)：

1、曹澤虹，轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)方法，中國(guó)食品添加劑，2005