基因突變范文

導語：如何才能寫好一篇基因突變，這就需要搜集整理更多的資料和文獻，歡迎閱讀由公務員之家整理的十篇范文，供你借鑒。

篇1

基因突變是基因組DNA分子發生的突然的、可遺傳的變異現象。

從分子水平上看，基因突變是指基因在結構上發生堿基對組成或排列順序的改變。基因雖然十分穩定，能在細胞分裂時精確地復制自己，但這種穩定性是相對的。在一定的條件下基因也可以從原來的存在形式突然改變成另一種新的存在形式，就是在一個位點上，突然出現了一個新基因，代替了原有基因，這個基因叫做突變基因。于是后代的表現中也就突然地出現祖先從未有的新性狀。基因突變可以發生在發育的任何時期，通常發生在DNA復制時期，即細胞分裂間期，包括有絲分裂間期和減數分裂間期。

（來源：文章屋網 ）

篇2

不知為什么，我總覺得他有用不完的活力。整天嘻嘻哈哈的，給人以不務正業的感覺，就拿早上交作業這種芝麻綠豆大的小事來說他吧！

一大早，我都還沒到學校，他就已經早早地坐在位子上了。一般來說只要一到學校就應該先把所有作業本交掉，可是這位大少爺從來沒有過?淥??匕炎饕到蝗???蓯且?乙歡?僭俁??么咚?趴習炎饕到懷隼礎S惺鋇攘慫?習胩歟??詈缶谷幻蛔觶?饋??媸且?凰??帽??芰恕U嫻姑刮揖固?狹蘇餉匆桓鱟樵保。。。。

更氣人的是在上一次的美術課上，老師要求我們畫一幅可以突出別人外表特點的畫，而且要畫同班同學呢！可惡的可恨的陳甲森，他最喜歡笑話人了。在別人畫完后，他就開始了他的“點評”有說別人畫的像豬的，猴子的……還笑別人的畫有多么難看。真是有多可惡就有多可惡！我就沒看到他畫的畫有多么好看。我原本也想奚落一下他的畫的，可是還沒說出口，他就先說：“其實畫繆藝是最簡單的了，只要用圓規畫就可以了。”然后哈哈大笑起來。我知道他是什么意思，不就說我的臉很圓很胖嘛！等等，他的意思是說我的臉很圓很胖。呀！這個該死的陳甲森，如果殺人不犯法的話，他恐怕已經被我殺個幾千次了。

篇3

【關鍵詞】基因突變 染色體變異

[Abstract] This essay discusses the differences in the chromosome formation the cause and the results between gene mutation and chromos omestructure variation

[Keywords]Gene mutationchromosomevariation

我們在學習生物變異一節時，學到了基因突變和染色體結構變異，很多學生在做具體題時二者總是混，分不清。現將二者的區別簡單加以介紹。

基因突變和染色體結構變異均是可遺傳的變異，在遺傳中表現出子代性狀與親代性狀不同，出現親代、祖代從來沒有過的新性狀，且這種性狀能在后代中重新出現，可見是遺傳物質發生變化了。兩者區別表現在：

1 染色體形態

1.1、基因突變是單個基因內部發生變化，從而引起該基因所控制的性狀產生不同于親代的變化。在光學顯微鏡下也看不到染色體形態的變化。

1.2、染色體結構變異是某個染色體在結構上發生變化，在光學顯微鏡下可以觀察到染色體形態的改變。

2 產生的原因

2.1、基因突變是DNA復制過程中產生偶然差錯，個別堿基缺失，增添或替換使基因中相關核苷酸的種類、數量、排列順序發生改變，因而改變了遺傳信息。例如，鐮刀形細胞貧血癥。

2.2、染色體結構變異是由于外界因素作用，染色體發生斷裂和重新組合而造成染色體結構變化，改變遺傳信息，我們課本提到了結構變異的四種情況（缺失、易位、倒位、重復）貓叫綜合癥是人體第五號染色體短辟上的缺失引起的疾病。

3結果不同

3.1、基因突變是不定向的，結果產生等位基因，如基因A可突變a，也可以突變為a1、a2、a3、 ……,a也可以突變成A。即同一性狀在不同生物個體中發生突變后有不同的表現。例如，刮大風海島上有翅昆蟲可突變長翅和殘翅昆蟲。

3.2、染色體相同的結構變異后表現出的生物性狀在不同生物個體均相同。如貓叫綜合癥，患兒都表現兩眼距離較寬，反應遲鈍，往往過早夭折，哭聲似貓叫。

篇4

[關鍵詞] 非小細胞肺癌；KRAS基因突變；抑制KRAS下游效應分子；靶向治療

[中圖分類號] R734.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）06（a）-0032-04

Progress in targeted therapy of KRAS mutations in non-small cell lung cancer

ZHANG Yukun GE Wei

The Two Department of Oncology， Renmin Hospital of Wuhan University， Hubei Province， Wuhan 430060， China

[Abstract] Lung cancer is one of the most deadly malignancies， ranking the first in global cancer-related death. With the development of multidisciplinary comprehensive treatment， the mortality rate of patients with lung cancer is still high. KRAS gene mutations are the most common type of mutations in non-small cell lung. At present， the targeted therapy of KRAS gene mutation mainly through the direct inhibition of KRAS gene， change the KRAS membrane localization， inhibition of KRAS downstream effector molecules， inhibition of KRAS mutant synergistic lethal genes and other aspects of research. In this review， the status and progress of KRAS mutations in non-small cell lung cancer targeted therapy are briefly reviewed.

[Key words] Non-small cell lung cancer； KRAS gene mutation； Inhibition of KRAS downstream effector molecule； Targeting therapy

肺癌居世界范圍內惡性腫瘤死因的第一位，每年有超過100萬人因肺癌死亡[1]。其中非小細胞肺癌（NSCLC）是最常見的組織學類型，占所有肺癌的85%[2]。超過40%的患者確診時已是局部晚期或晚期，失去了手術機會。目前肺癌的治療逐漸多元化，包括手術、放化療、靶向治療、生物免疫治療等，對于晚期NSCLC的一線化療方案是以鉑類為基礎的兩藥聯合，但其療效已經達到治療平臺，隨著醫學分子生物學的飛速發展，分子靶向治療為NSCLC患者帶來了新的希望。靶向表皮生長因子受體（EGFR）和間變性淋巴瘤激酶（ALK）已廣泛應用于NSCLC的治療中。然而，10%～30% KRAS突變型肺癌患者無法從EGFR抑制劑中獲益。此外，盡管早已確定了NSCLC中存在KRAS突變，但這仍然是一個具有挑戰性的靶向治療目標。

1 治療方法

1.1 直接抑制KRAS基因

直接抑制KRAS基因已經被證明在臨床上是有困難的。但也有學者通過抑制KRAS G12C和GTP結合，促進其與GDP的結合，及抑制KRAS和其下游效應分子Braf結合來抑制KRAS基因的活性，如，Ostrem等[3]發現了一個KRAS G12C突變體特異性抑制劑，該抑制劑能有效抑制KRAS G12C突變體和GTP結合，促進其與GDP的結合，使突變KRAS基因失活。Lim等[4]報道了另一個KRAS G12C抑制劑，在不影響正常KRAS的情r下特異性結合突變的KRAS基因，使突變的KRAS失去活性。

1.2 改變KRAS膜定位

抑制KRAS膜定位，包括多種酶，如法尼基蛋白轉移酶抑制劑（FTIs）、香葉基轉移酶、RAS轉換酶1（RCE1）、ICMT。第1代FTIs如Tipifarnib和Lonafarnib，雖然耐受性良好，但表現出較差的臨床效應。盡管缺乏有效性認為是由于香葉基轉移酶對KRAS基因選擇性異戊烯化，但FTIs和香葉基轉移酶的雙重抑制也沒有任何效果[5]。第2代FTIs如Salirasib[6]，在臨床上對肺癌患者無效。這種無效性可能通過香葉基轉移酶對KRAS基因選擇性異戊烯化或選擇性耐藥機制來解釋，如KRAS基因擴增或脫靶效應[7]。此外，一些RCE1和ICMT抑制劑，已在小鼠模型中有了可喜的成果，但是這些藥物還需進一步優化才能進行人體試驗。

1.3 抑制KRAS下游效應分子

1.3.1 PI3K PI3K是KRAS下游的一種胞質分子，也是PI3K/AKT/mTOR通路的一部分，它是一個多途徑融合的位點。在NSCLC中發現約2%的PI3KCA突變。PI3K通路也可以通過PTEN的缺失、上游酪氨酸激酶受體擴增或KRAS基因突變被上調[8]。新型PI3K抑制劑（例如BKM120、GDC0941和XL147）在第一階段臨床試驗中開發并初步顯示出有希望的結果。這些藥物目前正用于PI3KCA突變的晚期NSCLC患者進行的Ⅱ期臨床試驗（NCT01297491、NCT01493843）中。然而，盡管KRAS基因活性依賴于下游PI3K活性，但初步數據表明，KRAS突變的腫瘤對PI3K抑制劑單藥治療是不敏感的[9]。因此，單獨抑制PI3K通路治療KRAS突變的NSCLC是不足的，可嘗試給予多個KRAS下游信號通路的抑制劑聯合治療。

1.3.2 BRAF BRAF是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，可直接作用于結合GTP的KRAS基因及激活BRAF/MEK/ERK/MAPK途徑。BRAF基因突變在NSCLC中占1%～4%，其中50%的突變為V600E[10]。BRAF抑制劑達拉菲尼（Dabrafenib）和危羅菲尼（Vemurafenib），首先在BRAFV600E突變的黑色素瘤中做了研究，而且黑色素瘤V600E突變占BRAF突的百分比超過80%[11-12]，研究證明V600E BRAF突變的晚期NSCLC中，Dabrafenib估計反應率為40%[13]。一開放標簽，多中心Ⅱ期臨床試驗中（NCT01336634），Dabrafenib加曲美替尼（Trametinib）治療BRAF突變（V600E）的NSCLC可達到50%總反應率，且中位無進展生存期>9個月。Dabrafenib加Trametinib治療BRAF突變（V600E）的NSCLC是很有前途的新療法，可獲得較高的總療效，更可觀的是延長了DOR[14]。

1.3.3 mTOR 在PI3K/AKT/mTOR中，mTOR是另外一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，也是PI3K家族的成員。臨床前數據表明，在KRAS基因突變的肺腺癌小鼠模型中，抑制mTOR基因可抑制腫瘤的生長[15]。一些mTOR抑制劑（例如依維莫司、Ridaforolimus）已在NSCLC的治療研究獲得了有前景的結果。一個Ⅱ期臨床試驗，70例患者KRAS突變的NSCLC患者接受Ridaforolimus治療8周，在8周后，28例患者病情是穩定的，隨后被隨機分配接受安慰劑或繼續維持Ridaforolimus治療。最終，接受Ridaforolimus治療的PFS是明顯高于安慰劑組（4個月和2個月，HR=0.36，P=0.013），而且其OS有一個更好的趨勢（18個月和5個月，HR=0.46，P=0.009）[16]。但是Ridaforolimus治療的臨床推廣，仍需要更大型的Ⅲ期臨床實驗來進一步驗證其在改善PFS、OS上的作用。

1.3.4 MEK 在RAS/RAF/MEK/ERK通路中，MEK蛋白激酶是KRAS和BRAF下游信號，也被稱為MAP激酶級聯。磷酸化BRAF激活絲氨酸/蘇氨酸激酶MEK，進而激活絲氨酸/蘇氨酸激酶ERK，從而激活轉錄因子促進細胞周期進程和細胞增殖[17]。已經開發的幾個小分子選擇性抑制MEK，如CI-1040、RO5126766和PD-0325901，都沒有較好的臨床療效。最近，其他MEK-1和MEK-2抑制劑已被開發，如司美替尼和Trametinib已用于KRAS突變的NSCLC治療研究中。在臨床前期研究中，司美替尼對BRAF和KRAS突變的細胞系有生長抑制作用，而且在體內實驗也證明，司美替尼可抑制小鼠皮下異種移植瘤的生長。通過Ⅰ期臨床實驗確定了司美替尼的口服劑量為100 mg，每日兩次。在對未經篩選的NSCLC患者進行的一些Ⅱ期研究中，比較司美替尼與培美曲塞在作為二線及三線方案的療效，雖然其起到了一定的臨床療效，但與培美曲塞相比在延長生存期上沒有優勢。這表明進一步研究需要在BRAF或KRAS突變的NSCLC患者中研究。基于臨床前期實驗及報告的在服用司美替尼后出現的不良事件（腹瀉、惡心、嘔吐等）的條件下，對KRAS突變的NSCLC患者進行了一個Ⅱ期臨床實驗，比較司美替尼聯合多西紫杉醇與多西紫杉醇單藥治療的效果，聯合組大大提高了反應率（37%和0%，P < 0.01）和PFS（5.3個月和2.1個月，P=0.014），但是OS并沒有明顯改善（9.4個月和2.1個月，P=0.21）[18]。進而對KRAS突變的NSCLC患者進行了Ⅲ期臨床試驗，比較多西他賽加司美替尼與多西他賽單藥化療的療效，但是并沒有明顯改善RR、PFS或OS[19]。司美替尼/多西他賽Ⅱ期試驗亞組分析表明，G12C突變使用司美替尼治療可能比其他突變型有更高的反應率和PFS[20]。也有研究證明司美替尼聯合厄洛替尼治療KRAS突變型或野生型NSCLC，與厄洛替尼單藥治療相比，預后并無改善。

KRAS基因可以激活PI3K/AKT/mTOR和BRAF/MEK/ERK通路，因此抑制這兩條信號通路可能需要完全阻斷KRAS基因，有一些前期臨床實驗嘗試了PI3K抑制劑或MEK抑制劑聯合mTOR抑制劑治療NSCLC，患者有較好的耐受性，但這些結果需要行Ⅱ期臨床實驗來進一步論證，但也給治療NSCLC帶來了新思路。

1.4 抑制KRAS突變協同致死基因

KRAS突變可使癌細胞獲得特殊的生物學行為，即其生長和存活依賴于其他協同基因的共同作用，因而抑制這些基因能殺死KRAS突變的癌細胞 ，所以抑制這些協同致死基因是殺死腫瘤細胞的一個間接、有效的策略。這些因子有很多，包括WT1、GATA2或參與NF-κB通路的小分子，并對這些因子作為靶點及特異性抑制劑做了一些臨床前期研究。Vicent等[21]分析了大量樣本，發現WT1基因高表達可能參與KRAS突變的致瘤作用。Kumar等[22]發現GATA-2是這些KRAS突變NSCLC腫瘤細胞存活所必要的基因。硼替佐米是NF-κB的蛋白酶體抑制劑，目前主要用于多發性骨髓瘤的治療。在對16例KRAS G12D突變的肺腺癌進行的Ⅱ期研究中發現，患者的中位生存期達到了13個月[23]。

此外，Puyol等[24]在NSCLC的小鼠腫瘤模型中，發現KRAS基因和細胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）有合成致死效應。Mao等[25]利用KRAS與CDK4基因之間的合成致死效應，使用攜載有針對CDK4siRNA（siCDK4）的混合膠束顆粒對荷瘤小鼠進行治療。結果顯示，攜載有siCDK4的KRAS突變的腫瘤生長有顯著抑制效果，KRAS野生型的腫瘤生長則沒有受到顯著影響，證實該治療方案的特異性、高效性和安全性，為進一步開發針對KRAS突變的siRNA藥物提供了新策略。

1.5 其他

MET是一跨膜酪氨酸激酶受體，主要在腫瘤侵襲、增殖、血管生成和轉移中發揮重要作用，也可以參與激活KRAS信號通路。在肺腺癌中MET擴增約4%，通過激活RAS/PI3K/AKT/mTOR通路，導致EGFR-TKIs獲得性耐藥。在所有NSCLC的研究中MET作為靶點及KRAS信號激活劑做了研究，目前對肺癌效果較好的抑制劑包括小分子c-Met受體酪氨酸激酶抑制劑（Tivantinib）及MET受體單克隆抗體（onartuzumab）。有研究顯示，Tivantinib聯合厄洛替尼并沒有改善晚期NSCLC患者的預后，但患者的PFS有明顯的改善（P < 0.01）[26]。雖然Ⅲ期研究因缺乏療效過早終止，但初步分析亞組似乎證實了上述結果。一個初期的Ⅱ期研究表明，onartuzumab聯合厄洛替尼治療MET陽性的NSCLC患者，有較好的預后[27]。

熱休克蛋白（HSP）是分子伴侶，參與蛋白質的翻譯后折疊和合成。HSP90抑制劑可干擾致癌驅動基因的正常功能，包括突變的EGFR、BRAF、HER2和EML4-ALK。有研究報道，HSP90抑制劑ganetespib聯合多西他賽治療KRAS突變的NSCLC，未能改善患者的PFS和OS，且HSP90抑制劑ganetespib聯合MEK和PI3K/mTOR抑制劑的研究中發現，其加大了對KRAS突變細胞的細胞毒活性[28]。

局部黏著斑激酶（FAK）也作為治療的靶點被研究過，主要黏附于細胞外基質。其中KRAS-RHOA-FAK通路在TP53滅活和CDKN2A缺失的肺癌中，與肺癌的發生、發展密切相關。一個Ⅱ期臨床研究評估FAK抑制劑：VS-6063（Defactinib）對KRAS突變型NSCLC（NCT01951690）的療效，得到了極低的反應率（1/44例），但是12周的PFS率為36%，因此，研究人員認為該抑制劑是有研究前景的[29]。

2 展望

盡管隨著醫學發展，肺癌的治療取得了飛速發展，尤其是NSCLC的靶向治療取得了突破性的進展，但對于KRAS基因突變的NSCLC靶向治療仍然是一個具有挑戰及吸引力的靶向治療目標。但是抑制KRAS下游效應分子（PI3K、BRAF、mTOR、MEK）顯現出令人期待的發展前景，特別是下游效應分子抑制劑聯合使用會有較大的發展空間，我相信在不久的將來針對KRAS基因的靶向治療會為NSCLC患者帶來更有效的治療。

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篇5

【關鍵詞】 角膜營養不良，遺傳性;，基因;，突變;，序列分析，DNA;，聚合酶鏈反應;，系譜

摘要:目的 以基因突變分析一角膜營養不良家系的致病分子基礎。方法 應用PCR產物直接DNA測序及限制性內切酶分析檢測家系中7例患者和6例表型正常成員的K3、K12和BIGH3基因突變情況。結果 該家系患者成員在K3與K12基因的編碼序列區沒有發現突變，而BIGH3基因外顯子12存在CGG>TGG(R555W)突變雜合子，家系表現正常成員及正常對照均無BIGH3基因突變;限制性內切酶分析結果顯示突變與疾病表現型呈完全共分離。結論　利用基因突變分析確診我國首例報道的Meesmann角膜營養不良家系屬于顆粒狀角膜營養不良，且為BIGH3 R555W雜合突變類型。

關鍵詞: 角膜營養不良，遺傳性; 基因; 突變; 序列分析，DNA; 聚合酶鏈反應; 系譜

ABSTRACT: Objective Molecular genetic analysis of a large Chinese corneal dystrophy kindred. Methods Thirteen inpiduals including seven affected and six unaffected family members in this granular corneal dystrophy kindred were studied. Genomic DNA was purified from blood peripheral leukocytes. All of the exons of both the Keratin3 and the keratin12 genes， and the exon 4 and exon 12 of BIGH3 gene were amplified using polymerase chain reaction(PCR)， followed by direct bidirectional sequencing for mutation detection.

The mutation was confirmed by restriction digest analysis. Results Direct sequencing of the patients' genomic DNA revealed there was no mutation in all of the exons of K3 and K12 genes， but a missense mutation(CGG>TGG) in the exon12 of BIGH3(R555W) was found. This mutation in this family completely cosegregates with the disease phenotype. Conclusion This kindred was diagnosed with granular corneal dystrophy harbored a heterozygous R555W mutation of the BIGH3 gene.

KEY WORDS:corneal dystrophy，hereditary; genes; mutation; polymerase chain reaction

基金項目: 福建省自然科學基金資助項目(C0510009)，福建醫科大學科學研究發展基金資助項目(FJGXY04020)

角膜營養不良(corneal dystrophy)是一組與遺傳有關的原發性、具有病理學組織學特征的疾病。目前，已確定與角膜營養不良的致病基因有BIGH3、CHST6、K3、K12、M1S2和GSN等。BIGH3基因突變至少可導致4種類型的角膜營養不良，包括顆粒狀角膜營養不良(R555W)、Avellino角膜營養不良(R124H)、格子狀角膜營養不良(R124C)和ThielBehnke角膜營養不良(R555Q)[1]。K3和K12基因突變導致Meesmann角膜營養不良[2]。筆者研究的家系為福建醫科大學附屬第一醫院眼科普查時發現，先證者在裂隙燈下檢測可見雙角膜中央區有散在的細小圓形小泡，位于上皮層，斜照時呈散在的灰白點狀，后照亮下呈透明小氣泡樣，臨床表現為Meesmann角膜營養不良[3]。2004年，筆者隨訪該家系，家系圖譜表現為常染色體顯性遺傳;在裂隙燈下檢測先證者，發現不僅角膜上皮層受累，而且累及角膜實質層，臨床表現為顆粒狀或Avellino角膜營養不良。筆者對該家系進行分子遺傳學分析，以確定其類型與致病分子機制。

1 對象與方法

1.1　對象

家系3代38人，受累患者12人，獲得其中7例受累患者和6例非受累正常家系成員的血樣標本，10例無眼疾正常人的血樣標本作為正常對照組(圖1)。:獲取血樣標本的家系成員.

1.2 試劑和儀器

PCR所用試劑、瓊脂糖凝膠、溴化乙錠(EB)、BstXⅠ和DNA分子量標記等(大連寶生物公司);PCR擴增BIGH3基因外顯子12的引物序列: BIGH3e12F:5’CAGCGTGGTGAGGTATTTAAGG3　BIGH3e12R:5’GTAGTAAAGGCTTCCCAGGGTT3’

1.3 基因組DNA提取

取外周血樣3 mL，置于EDTAK3抗凝的真空采血管中;按Wizard Genome DNA Purification Kit(Promega)說明書提取基因組DNA。

1.4 聚合酶鏈反應(PCR)

PCR反應體系25 μL，包括10×PCR緩沖液(20 mmol/L Mg2＋plus)2.5 μL、dNTP mix(2.5 mmol/L each)1 μL、PCR上游和下游引物(10 μmol/L)各1 μL、基因組DNA(約100 ng)1 μL和TakaRa Ex TaqTM 0.25 μL、ddH2O補足25 μL;PCR反應條件為:94 ℃ 3 min94 ℃ 30 s55 ℃ 30 s72 ℃ 30 s，30個循環;72 ℃ 3 min。

1.5 PCR產物直接測序

2％瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物特異性后，PCR產物直接送大連寶生物公司測序。

1.6 限制性內切酶分析

BIGH3 R555W位點突變產生一個新的限制性內切酶位點，可被BstXⅠ識別(BstXⅠ識別序列為:CCANNNNN/NTGG);酶切反應體系20 μL，45 ℃ 3 h。

2 結果

2.1 K3和K12基因突變檢測

Meesmann角膜營養不良是由K3和K12基因突變所致，且目前發現的突變全部分布在K3和K12角蛋白高度保守區HIM(helix initiation motifs)和HTM(helix termination motif)區域[2，4]。首先篩查文獻已報道的K3和K12基因突變區域，即K12基因的外顯子1和外顯子6以及K3基因的外顯子7。DNA測序結果表明在這些區域沒有突變，進一步掃描K3和K12基因整個外顯子區域，也未發現突變。2004年隨訪，裂隙燈檢測發現癥狀發生改變，先證者的臨床表現可能為顆粒狀或Avellino角膜營養不良(圖2)。

2.2BIGH3基因突變檢測

PCR擴增BIGH3基因外顯子4和外顯子12，DNA直接測序分析，結果顯示患者(先證者Ⅱ7和Ⅲ1)在BIGH3基因的外顯子12發生雜合突變(CGG>TGG)，即BIGH3 R555W突變(圖3A);另外，在兩位患者的BIGH3基因外顯子12還發現一個多態位點(Phe540Phe)(圖3B);內切酶BstXⅠ分析結果顯示該家系的BIGH3 R555W突變與疾病表現型呈完全共分離(圖3C)，表明該例Meesmann角膜營養不良家系屬顆粒狀角膜營養不良，且為BIGH3基因R555W突變雜合子。

3 討論

角膜營養不良一般依據病史和裂隙燈檢測可作出初步的臨床診斷，且主要按病變發生的解剖學部位將其分為前部、實質部和后部角膜營養不良三類。然而，在進行性病變過程中，角膜營養不良還表現一個共同特點，即開始先侵犯角膜的某一層，晚期可波及鄰近層次，甚至影響全層角膜。因此， A:DNA測序分析突變位點; B:BIGH3單核苷酸多態性位點(T/C); C:限制性內切酶BstXⅠ分析.

在臨床診斷分型，特別是晚期患者的診斷分型帶來很大的混淆。隨著角膜營養不良分子遺傳學的深人研究，以致病基因的分子特征作為臨床診斷和分類、分型的依據，其可靠性和準確性也得到了大大提高，并且越來越受到國內外同行們的廣泛認可。

Meesmann角膜營養不良屬于前部角膜營養不良，臨床表現主要為角膜上皮層內散在著無數細小圓形透明囊泡，是由K3或K12基因突變所致[2]。顆粒狀角膜營養不良屬實質部角膜營養不良，依據角膜表征目前至少可以分為3種類型：Avellino角膜營養不良、典型顆粒狀角膜營養不良和淺表變異型顆粒狀角膜營養不良，分別是由于BIGH3基因的R124H、R555W和R124L突變所致[5]。目前，在世界各國的相關研究中均發現BIGH3基因的第4外顯子的R124和第12外顯子的R555為突變熱點;與BIGH3基因R555W突變相關的顆粒狀角膜營養不良患者在歐洲和美國較為常見，在日本卻較為少見[1]。

分子遺傳學分析結果顯示，筆者研究的家系受累患者存在BIGH3 R555W突變雜合子，突變與疾病表現型呈完全共分離，而在K3和K12基因沒有發現突變。因此，從基因突變分析結果可以確診該家系不屬于Meesmann角膜營養不良，而是典型的顆粒狀角膜營養不良。

據報道在該家系中先證者角膜病變開始發生于上皮層[3]，隨后波及角膜實質部。因此，結合臨床癥狀與基因突變分析，該家系患者又可能是BIGH3 R555W雜合突變導致的角膜上皮層與基質層先后受累的顆粒狀角膜營養不良，可歸于淺表變異型顆粒狀角膜營養不良。Escribano等研究表明角膜上皮細胞特異性高表達BIGH3基因[6];Hirano等認為BIGH3蛋白是由上皮細胞合成，內皮細胞也可能合成BIGH3蛋白[7];Okada曾報道一種由BIGH3 R555W純合子突變導致的淺表變異顆粒狀角膜營養不良[8]。這些報道間接說明BIGH3 R555W雜合突變也又可能導致淺表變異型顆粒狀角膜營養不良。遺憾的是沒有先證者的早期裂隙燈照片及組織病理檢測來直接支持這種可能性。

參考文獻：

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篇6

【關鍵詞】川奇消食化積口服液；小鼠淋巴瘤細胞株；TK基因突變

【中圖分類號】TS201.6 【文獻標識碼】A 【文章編號】1004-7484（2014）07-4119-01

保健食品具有補充膳食來源、延緩衰老、美容、改善睡眠等功能，但在生產過程中的各種問題也日趨明顯，為更好的控制其質量，促進健康發展，應加強其檢驗工作。

TK基因突變試驗的檢測終點是胸苷激酶（thymidine kinase， TK）基因的突變，具有很高的靈敏度，廣泛用于檢測外來化合物的遺傳毒性[1]。該測試系統可檢測外來化合物引起的突變，包括堿基對突變、移碼突變和缺失等，從而評價保健食品引起突變的可能性，本文采用TK基因突變試驗評價川奇消食化積口服液的致突變性。

3 討論

川奇消食化積口服液的主要成分為山楂、雞內金、白扁豆、茯苓，可促進消化吸收，用于消化不良者。我國對化合物（包括食品污染物、藥物、化妝品等）的常規遺傳毒性評價方法包括：①細菌試驗（Ames試驗）；②哺乳動物體細胞突變試驗、小鼠骨髓細胞微核試驗、染色體畸變試驗；③哺乳類生殖細胞突變試驗[2]。

本文采用TK基因突變試驗檢測川奇消食化積口服液的致突變性。tk+/-基因型細胞突變為tk-/-基因型細胞后能拮抗三氟胸苷（TFT）而存活，據突變集落形成數，計算突變頻率，可判定受試物的致突變性[3]。本研究發現，按1%體積比給藥，受試物原液、1/2原液、1/4原液、1/8原液四個劑量組均未產生細胞毒性，在活化狀態及非活化狀態下均不具有致突變性。

參考文獻：

[1] 中華人民共和國衛生部.保健食品檢驗與評價技術規范[S].2003.

篇7

關鍵詞：非小細胞肺癌 ELM4-ALK融合基因 EGFR突變基因

正文

肺癌是全球發病率及病死率最高的惡性腫瘤，其中，非小細胞肺癌的傳統治療方法有化療，放療，手術等。隨著腫瘤發病機制研究的不斷深入，分子靶向治療已經成為了研發熱點，并初步取得了顯著療效。EGFR，EML4-ALK等靶點的分子抑制劑在臨床上的成功讓學者們將更多的精力投入到靶向分子的研究中，2011年ASCO大會提示腫瘤診療已經進入分子靶向治療的時代。以往大部分的研究都認為，非小細胞肺癌中EML4-ALK多數情況下與EGFR及KRAS突變是相互排斥的[1-3]. 近期陸續發現有EML4-ALK融合基因和EGFR突變共存的案例。在強調個體化治療的時代，這部分患者其臨床表現有何特點？該如何治療？本文將就這些問題進行探討。

EML4-ALK融合基因的分子結構及在NSCLC的發生率

ALK(anaplastic lymphoma kinase 間變淋巴瘤激酶)是一個由1620個氨基酸組成的跨膜蛋白，屬于胰島素受體家族[4]。

EML4(echinoderm microtubule—associated protein—like4)由 N末端堿基區、疏水的棘皮動物微管相關蛋白區以及WD重復區3 部分構成，屬于棘皮動物微管相關蛋白樣蛋白家族。

EML4-ALK融合基因是由日本學者Soda等在一名62歲有吸煙史的男性腺癌NSCLC患者的腫瘤組織中首次發現的。基因的重排發生在2號染色體短臂上的2區1帶和2區3帶。ALK基因的3′端與EML4基因的5′倒位融合，EML4基因斷裂后形成不同長度的外顯子拼接片段，插入位置相對保守的ALK基因的19號、20號外顯子之間[5]，融合基因的ALK部分均為20外顯子編碼的酪氨酸激酶結構片段，而EML4部分則為不同的外顯子片段，從而形成有11個變體的EML4-ALK融合蛋白[1, 2, 5-10]，融合基因大多都有致瘤性[11, 12]。

文獻報道[13]，不加選擇的NSCLC患者EML4-ALK融合基因總發生率為3.4%（范圍0.4%-11.6%）。東方人群NSCLC患者的總發生率為4.1%，歐美人群為2.5%。Shaw等[8]在女性，亞裔，不吸煙或者是輕度吸煙（每年吸煙≤10包或戒煙≥1年者）這4個條件中至少滿足2個條件的141名肺腺癌患者的腫瘤組織中用FISH法檢測了EML4-ALK融合基因的發生率，結果顯示其發生率高達13%；在EGFR和KRAS均為野生型的不吸煙/輕度吸煙者則為33%。Zhang等[3]用RACE-coupled PCR sequencing 法在中國NSCLC患者中進行檢測，結果表明在中國的非選擇性NSCLC患者中該融合基因的發生率為11.6%，EGFR和KRAS均為野生型的不吸煙/輕度吸煙者則高達42.8%。

EGFR突變基因的分子結構及發生率

EGFR（epidermal growth factor receptor表皮生長因子受體）具有受體酪氨酸激酶活性，屬于Ⅰ型生長因子受體家族，由1個胞外配體結合區，跨膜區和一個胞內區構成。

EGFR基因位于7號染色體短臂的12-14區，由28個外顯子組成，突變多位于19-21外顯子（酪氨酸激酶功能區），其突變主要有3種類型：a. 19外顯子堿基缺失 改變了受體ATP結合囊（ATP-binding pocket，ABP）角度，增強了腫瘤細胞對TKI的敏感性[14, 15]。Shigermatsu等[16]發現外顯子19突變的發生率最高，占EGFR突變總數的50%以上；b. 20外顯子點突變或堿基插入突變 20外顯子的點突變主要是第790位密碼子出現C-T轉換，從而引起該處的蘇氨酸轉變為甲硫氨酸（T790M），這一突變多見于藥物治療后的復發患者，突變后腫瘤細胞對TKI產生抵抗[17]，插入突變出現在第770-775位密碼子，插入片段為3-9個堿基，其臨床意義目前尚不清楚[16]；c. 21外顯子點突變主要是851位密碼子出現T-G轉換，亮氨酸轉變為精氨酸（L858R），突變提高了腫瘤細胞對TKI的敏感性。

在非選擇性NSCLC患者中，EGFR在美國的非小細胞肺癌腺癌患者中突變率約為15%[18]，在亞裔人群為30%-50%,且大部分是腺癌和支氣管肺泡癌。

EGFR-TKI、ALK-TKI抑制劑與靶向患者的療效

ALK的口服抑制劑PF-023451066（crizotinib)的I期臨床試驗（NCT00585195或A8081001）開始于2006年。2009年ASCO（American Society of Clinical Oncology）年會上報道，PF-023451066的反應率達53％ (10／19)，疾病控制率達到79％(12／19)。鑒于良好的安全性和高有效率，FDA批準此藥研究直接進入Ⅲ期臨床試驗，目前，該藥的全球Ⅲ期臨床試驗正在進行中。2011年ASCO對crizotinib的I期臨床試驗結果進行了更新：入組NSCLC患者已達119例，中位PFS達到10個月（95%，8.2m~14.7m），客觀反應率達61%（95%CI，52%~70%）。中位有效應答時間為48wks，中位生存時間達1年的概率為81%。

EGFR的抑制劑Gefitinib和Erlotinib目前已經廣泛應用于臨床的各線治療。IPASS研究[24]比較了一線使用EGFR-TKI與一線使用化療藥物的療效，該研究結果驗證了EGFR突變對吉非替尼治療NSCLC療效的預測作用，EGFR突變患者是吉非替尼治療最大獲益人群。基于IPASS及其他三項小型臨床試驗的研究結果，ASCO于今年4月了PCO(Provisional Clinical Opinion)，建議對晚期初治的NSCLC患者進行EGFR突變測定以決定患者是進行EGFR-TKI治療還是進行化療[25]。

EML4-ALK與EGFR臨床特征及異同

EML4-ALK融合基因型患者與EGFR基因突變型患者有相似的臨床特征[8, 19]，多見于不/輕度吸煙的腺癌患者，但EML4-ALK融合基因型患者多為年輕的男性患者，且不能從EGFR TKI治療中獲益[8]。

以往的文獻多認為EML4-ALK融合型基因與EGFR基因突變是互為獨立的分子事件[1, 5, 8, 20, 21]，EML4-ALK融合型基因可能是繼KRAS之后的EGFR對TKI耐藥的另外一個原因[8]。但目前已報道有4例[3, 5, 22, 23]EML4-ALK融合型基因與EGFR基因突變共存型患者。#p#分頁標題#e#

臺灣大學附屬醫院的Kuo等[22]報道了一例EML4-ALK融合型基因與EGFR基因突變共存對EGFR TKI治療有效的患者：72歲亞裔女性腺癌（Ⅳ期 腦，骨轉移）不吸煙初治患者，經RT-PCR和DNA測序證實的EML4-ALK融合基因（亞型1）與EGFR突變（19外顯子缺失突變 delE746-A750）共存。經過92天的吉非替尼治療之后，CT顯示右上肺的腫物顯著性縮小，CEA從442.1ng/ml降至87.6ng/ml。

Tiseo等[23]報道了一例48歲的不吸煙高加索男性腺鱗癌患者（大部分的鱗癌混合>10%的局限性低分化腺癌），cT1N0M1(左側第10肋)，順鉑+吉西他濱治療了6周期后PET評估肺部病灶PR，肋骨轉移灶CR。之后患者行右上肺葉，淋巴結，肋骨切除術。肺部的主要病灶為EGFR 19外顯子缺失突變，KRAS野生型，ALK野生型。轉移的淋巴結病灶有EML4-ALK融合基因（經FISH驗證）。3個月后患者復發，接受Erlotinib 150mg/天（兩個月）治療，無臨床受益，最終死于疾病進展。

展望

EML4-ALK融合基因是當前研究的熱點，其已成為NSCLC的一個亞型，PF-023451066（crizotinib)的Ⅲ期臨床試驗正在進行，Crizotinib能否像EGFR TKI一樣成為NSCLC治療上的一個里程碑，讓我們拭目以待。EGFR TKI目前已經廣泛應用于臨床的治療，在治療晚期EGFR突變的NSCLC患者中療效顯著。但對于EML4-ALK融合基因與EGFR基因突變共存型患者，目前的研究和報道還很少，仍有許多問題值得思考和研究：EML4-ALK融合基因與EGFR突變基因究竟是同時存在于同一個腫瘤組織中還是分別存在于一個腫塊之中？共存型患者其EML4-ALK與EGFR的下游的分子生物學行為如何？兩個案例報道中患者對EGFR TKI的反應恰好相反，是否因為EML4-ALK不同亞型對EGFR TKI的敏感性不同？對于共存型患者該如何應用TKI？多靶點抑制劑會不會是共存型患者的更好選擇？期待有深入的實驗研究和臨床研究來解決這些問題，使患者以最小的花費取得最佳療效，真正在基因水平上實現肺癌的個性化治療。

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篇8

【摘要】

目的 應用變性高效液相色譜技術(DHPLC)異源雙鏈分析對鼻咽癌患者XRCC4基因突變進行篩查與鑒定，研究鼻咽癌患者XRCC4的基因突變情況，探討DHPLC在篩查相關基因突變、預測放療敏感性方面的應用。 方法 采用聚合酶鏈反應(PCR)和DHPLC篩查88例鼻咽癌患者XRCC4基因的突變。 結果 對DHPLC圖形異常的PCR擴增片斷進行DNA測序鑒定突變位點及性質，檢測出28例XRCC4基因8號外顯子第377位C變成T，導致126號密碼子的serphe，導致氨基酸殘基的替代變化(絲氨酸苯丙氨酸)。 結論 用PCRDHPLC篩查結合測序分析檢測XRCC4突變是一種高效、經濟、簡便、可靠的方法。

【關鍵詞】 鼻咽腫瘤 輻射耐受性 突變 腫瘤細胞 培養的 DNA修復 色譜法 高壓液相 基因型

DNA分子是惡性腫瘤放療輻射作用的靶點，細胞對電離輻射反應的分子基礎是DNA損傷[1]。DNA雙鏈斷裂是放射治療過程中的主要損傷形式，而細胞內產生的DSBs可以通過同源重組和非同源末端連接兩種途徑進行修復。未修復的DSBs損傷將導致細胞死亡。近年來的研究表明，DNA修復基因突變、單核苷酸多態性均可改變DNA的修復能力。因此檢測DNA修復基因的分子狀態可能成為個體腫瘤放療敏感性的預測指標。XRCC4是DNA損傷修復的主要基因之一，缺乏XRCC4的細胞特別容易受到離子輻射的傷害。XRCC4基因的突變可能影響腫瘤細胞的DNA損傷修復能力，進而影響其對輻射的敏感性以及放射治療的療效。因此，XRCC4基因的突變檢測可為其與腫瘤放射敏感性關系的研究以及探討作為腫瘤個體放療敏感性的預測指標的可行性提供研究基礎。

變性高效液相色譜(denaturing highperformance liquid chromatography，DHPLC)是一種高通量篩選基因組DNA序列變異的新手段。本研究采用聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)和DHPLC異源雙鏈分析與DNA測序等方法對88例鼻咽癌患者進行XRCC4基因突變篩查與鑒定，探討DHPLC檢測該基因突變的適宜條件，為DHPLC技術在篩查相關基因突變，預測放療敏感性的應用方面提供研究基礎。

1 對象和方法

1.1 對象 收集2002年9月-2003年9月福建省腫瘤醫院放療科經病理確診、初治的鼻咽癌患者88例，男性67例，年齡(48±12.71)歲(21～76歲);女性21例，年齡(48±11.15)歲(26～69歲)。治療前經鼻咽鏡取鼻咽活檢組織。DNA抽提試劑盒(德國Qiagen公司);Taq DNA聚合酶(金牌酶，瑞士Roche公司);基因擴增儀(PTC200，美國BIORAD DNA ENGINE公司);DHPLC(4500WAVE，美國Transgenomic公司)。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA抽提 用組織DNA抽提試劑盒抽提患者鼻咽部癌組織基因組DNA，核酸蛋白檢測儀定量，-20 ℃保存備用。

1.2.2 PCR引物設計與合成 人類XRCC4基因有8個外顯子，因為此基因突變多發生于其1號、4號、7號和8號外顯子，其中第8外顯子較長，需分成2個相互重疊的片段進行擴增，故選擇這4個外顯子設計5對引物。引物由上海博鴻生物公司合成。引物序列如下：片段名引物名引 物 序 列Exon1R

FCCGGAAAAGGCGGGATTTAG

GGGGATTCTCGCATTGTGGAExon4R

FGTGTATGCTTAAAACCAGGC

AACAACATAAAGAGGGCTCCExon7R

FTCAATGCTAAAACAGCAAGT

GATTCAAACATTTTACAATTCCExon81R

FCTTTTACTCTATAACAGAAGTT

ATAGTTTAGAATAATGTGCCExon82R

FGTGAATTGAAACCATTGTGC

GGTTACATTTACATTAATAAGCAGT

1.2.3 PCR反應體系及條件 PCR反應體系50 μL，含0.2 mmol/L dNTP，1.5 mmol/L Mg2+，DNA模板100 ng，Taq DNA聚合酶1.25 U，上下游引物各0.2 μmol/L。PCR反應條件：94 ℃變性10 min94 ℃ 40 s54 ℃～64 ℃ 45 s 72 ℃ 35 s，循環35次，72 ℃延伸10 min，PCR產物用1%瓊脂糖(含溴化乙錠0.5 μg/mL)凝膠電泳檢測。

1.2.4 DHPLC篩選XRCC4突變 對有效擴增的PCR 產物行DHPLC篩查突變，檢測PCR反應產物，其分離柱固相為烷基化C18，中間橋分子為TEAA，洗脫緩沖液主要成分為乙腈。標本上機之前通過軟件分析序列的理論溫度分離曲線，摸索出最佳的分離溫度后進行突變篩選分析。

1.2.5 DNA測序 根據DHPLC系統檢測結果，將不同峰型的PCR產物送日本TAKARA公司進行DNA序列測定。

2 結 果

2.1 DHPLC篩查結果 每份樣本均檢測上述5個片段的PCR產物，每份樣品在50 ℃的非變性溫度下均為對稱性單峰;在部分變性的溫度下，1號、4號、7號和8號外顯子的81片斷均為單個色譜峰，只有8號外顯子的82片斷的擴增產物出現雜合峰與純合峰兩種情況，單個色譜峰顯示為純合鏈，雙峰或三峰表示是雜合異源雙鏈。出現雜合峰顯示有突變的異源雙鏈存在。不同樣品的PCR產物的8號外顯子82段在同一DHPLC運行條件下突變峰形基本相同(代表峰形見圖1)，提示8號外顯子的82段具有單一類型的突變。

2.2 DNA測序結果 選擇DHPLC檢測為雜合峰與單個峰的標本測序，測序結果顯示28例患者的XRCC4基因第8號外顯子第377位堿基C變成T(圖2)。

3 討 論

DHPLC異源雙鏈分析法是近年來才發展起來的一項新的基因突變高通量篩查技術。與其他相關技術相比，DHPLC的DNA分離柱具有很好的溫度穩定性和酸堿穩定性，具有很長的有效壽命(>6 000次進樣)和極好的分析穩定性(99%)。DHPLC異源雙鏈分析法解決了RFLP技術受酶切位點和酶切條件的限制、擴大了檢測范圍、提高了檢測的準確性、又解決了SSCP技術耗時耗力的缺點，實現了樣品的自動化檢測;同時檢測的靈敏度、重復性和檢測的通量也得到大提高，從而在基因篩查工作中具有更廣泛的應用范圍[2]。已有學者進行了DHPLC相關的方法學比較研究，均提示其敏感性和特異性可達96%～100%[3]，明顯高于常用的變性梯度凝膠電泳、構象敏感性凝膠電泳、單鏈構象多態性分析等變異檢測技術。DHPLC突變檢測技術與其它方法相比，具有更高的準確性和敏感性[45]。

本組資料應用DHPLC分析鼻咽癌組織XRCC4的突變，探討DHPLC檢測該基因突變的適宜條件。由于PCR產物中雜帶的存在會導致目的峰周圍出現干擾峰，這些干擾峰往往會誤判為突變峰形，應用DHPLC分析時筆者通過以下幾種方法來排除干擾峰：(1)通過優化PCR反應條件防止雜帶產生;(2)通過比較部分變性溫度和非變性溫度下的峰形來排除干擾峰，凡是在部分變性溫度下呈現的雙峰或多峰在50 ℃的非變性溫度下同樣表現出來，則提示有干擾峰的存在;(3)通過保留時間來判斷有無干擾峰存在，因為突變引起的雙峰或多峰的保留時間應相差不大。

本研究通過PCRDHPLC篩查，共檢測了88例患者XRCC4基因各5個片段的PCR產物，在部分變性的溫度下，28例患者的8號外顯子82所擴增的片段中出現雜合峰與純合峰兩種情況，經DNA測序分析證實單個色譜峰樣本未測出突變，雙峰或三峰樣本檢測出突變，即8號外顯子第377位堿基C變成T，此外，不同樣品的PCR產物的8號外顯子在同一DHPLC運行條件下突變峰形基本相同，提示8號外顯子具有單一類型的突變。該變異導致126號密碼子的serphe，致使氨基酸殘基發生替代變化(絲氨酸苯丙氨酸)，這一替代對改變DNA修復能力的作用以及是否影響鼻咽癌細胞DNA損傷修復能力和放射治療療效，還有待于進一步的研究探討。

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篇9

【摘要】 目的 探討急性髓細胞白血病(acute myeloid leukemia， AML)患者人Fms樣酪氨酸激酶3內部串聯重復(Fmslike tyrosine kinase3intenal tandem duplication， FLT3ITD)基因突變及其臨床意義。方法 采用聚合酶鏈反應變性高效液相色譜(polymerase chain reactiondenaturing high performance liquid chromatography， PCRDHPLC)方法檢測60例初治AML患者和10例對照組骨髓FLT3ITD基因突變。結果 60例AML患者FLT3ITD突變陽性率21.67%(13/60)，10例對照組均未檢測到該突變;FAB各亞型FLT3ITD突變率不同，有M3型突變率較高的趨勢;FLT3ITD陽性組外周血白細胞數、骨髓白血病細胞比例高于FLT3ITD陰性組(P

【關鍵詞】 急性髓細胞白血病;FLT3;內部串聯重復;基因;聚合酶鏈反應變性高效液相色譜技術

ABSTRACT: Objective To investigate the mutation of FLT3 internal tandem duplication (ITD) in patients with acute myeloid leukemia (AML) and its clinical significance. Methods The mutation of FLT3ITD in bone marrow samples from 60 patients with de novo AML and 10 control groups was detected by polymerase chain reaction denaturinghigh performance liquid chromatography (PCRDHPLC). Results There were 13 out of 60 (21.67%) AML patients identified with FLT3ITD mutation， which was not identified in 10 of the control groups. Different FAB subtypes of AML had different mutation rate， and M3 had an obviously higher mutation rate than other subtypes. The peripheral white cell count and bone marrow blast cells were significantly higher in patients with FLT3ITD mutation than in those without (P

KEY WORDS: acute myeloid leukemia; FLT3; internal tandem duplication; gene; polymerase chain reaction-denaturing high performance liquid chromatography

人FLT3是Ⅲ型酪氨酸激酶受體(receptor tyrosine kinase， RTK)家族成員的原癌基因，其蛋白產物屬于受體，定位于細胞膜上。在正常人骨髓中，FLT3的表達僅限于CD34+干/祖細胞，該受體與多種胞漿蛋白作用介導一系列細胞內信號傳導，誘導細胞增殖和分化。近來研究發現FLT3基因的異常表達、突變與急性白血病(acute leukemia， AL)的發生、發展、預后有密切關系[13]。酪氨酸激酶受體基因FLT3的內部串聯重復序列(FLT3 internal tandem duplications， FLT3ITD)是一種FLT3的近膜區的突變，由NAKAO等[4]研究急性髓細胞白血病(acute myeloid leukemia， AML)時，于1996年首先報道。為探討AML患者FLT3ITD的突變情況，我們采用聚合酶鏈反應變性高效液相色譜(polymerase chain reactiondenaturing high performance liquid chroma

tography， PCRDHPLC)技術檢測60例初治AML患者骨髓FLT3ITD的突變情況并分析其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 研究對象 60例初治AML患者，診斷及療效標準參照《血液病診斷及療效標準》[5]。男27例，女33例，中位年齡48歲(18～79歲)。FAB分型為M0 3例，M1 3例，M2 14例，M3 13例，M4 13例，M5 12例，M6 2例，M7 0例。老年AML 30例(年齡>60歲)，非老年AML 30例，正常人及良性血液病患者為對照組共10例(3例健康人，5例缺鐵性貧血患者，2例特發性血小板減少性紫癜患者)。

1.2 實驗方法 采用聚合酶鏈反應變性高效液相色譜(PCRDHPLC)方法。①DNA制備。取患者骨髓液2mL，應用美國Promega公司DNA提取試劑盒抽提總DNA。測定吸光度A260nm/A280nm值，確定DNA的純度及濃度，并以去離子水稀釋DNA樣本為1g/L。②PCR擴增。應用Primer Express V2.0軟件包以13號染色體外顯子14、15設計引物，包括整個近膜區(JM)和激酶結構起始部分，擴增產物為329bp。引物由上海捷瑞公司合成，正義引物：5′GCAATTTAGGTATGAAAGCCAGC3′;反義引物：5′CTTTCAGCATTTTGACGGCAACC3′。PCR反應體系(50μL)：10×PCR緩沖液5μL，25mmol/L MgCl2 6μL，10mmol/L dNTP 1μL，10μmol/L正/反義引物各2μL，模板DNA 4μL，Taq DNA酶0.5μL，雙蒸水29.5μL。PCR條件：94℃，5min，1個循環;94℃，45s，56℃，45s，72℃，45s，共循環35次;72℃延伸10min，1個循環。③測序分析。部分變性DHPLC分析突變陽性產物：5μL預處理的PCR產物上樣于Transgenomic公司的DNA sep分離柱，然后觀察DHPLC圖譜形態。發現異常的圖譜形態PCR產物，純化后測序(由大連寶生物生物公司幫助完成)，分析各FLT3ITD序列。

1.3 統計學方法 應用SPSS 11.5統計軟件包對實驗數據進行統計學分析。計量資料在作t檢驗、方差分析前先進行正態性、方差齊性檢驗，單變量兩組資料采用t檢驗，方差不齊者采用非參數檢驗;計數資料采用卡方檢驗，P

2 結 果

2.1 AML患者FLT3/ITD基因突變的檢測 60例初發AML患者，13例FLT3ITD突變陽性患者(21.67%)，其中M2 21.4%(3/14)，M3 30.8%(4/13)，M4 23.1%(3/13)，M5 25.0%(3/12)，M0、M1、M6、M7均未檢測到該突變，有M3型突變率較高的趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)(圖1)。本實驗檢測的突變均為雜和突變，各例突變區域大小不等(6～100bp)，均為框內突變。10例對照組均未檢測到突變。

2.2 FLT3ITD陽性AML患者臨床特征 60例初治AML組中，13例FLT3ITD突變陽性，其中女8例(占25.0%)，男5例(占17.9%)，差異無統計學意義(P>0.05);30例老年AML組，8例 FLT3ITD突變陽性，突變陽性率26.7%，30例非老年AML組，5例FLT3ITD突變陽性，突變陽性率16.7%，二者相比差異有統計學意義(P

2.3 FLT3ITD陽性AML患者的療效 采用DA(柔紅霉素、阿糖胞苷)或HA(高三尖杉酯堿、阿糖胞苷)方案治療;M3首選維甲酸;13例FLT3ITD陽性AML患者6例獲得CR(46.2%)，47例FLT3ITD陰性AML患者34例獲得CR(72.3%)，二者相比差異有顯著性(P

3 討 論

FLT3ITD突變是近年來AML中最常見的突變類型之一。正常情況下，酪氨酸激酶磷酸化作用是由酪氨酸激酶和酪氨酸激酶拮抗調節維持平衡的。如發生基因突變，將導致酪氨酸激酶持續活化，進而阻斷對細胞的分化、增殖和凋亡調節功能，與腫瘤發生有密切關系。有研究表明[67]，約有19.2%～32.0%的AML患者存在有FLT3ITD突變，在成人新發AML的陽性率22.9%，在老年AML的陽性率為31.4%，在FAB亞型中，FLT3/ITD突變在M3的陽性率最高，M5次之，M2、M6的陽性率較低。我們檢測的結果顯示，在AML中FLT3ITD突變陽性率為21.67%，其中M3最高，M5次之。說明FLT3ITD突變在AML患者的疾病發生、發展中起一定作用，也提示FLT3ITD對于M3可能是一個預后不良的指標。

從臨床資料分析，FLT3ITD有它獨特的臨床表現，男女無統計學意義;老年AML患者FLT3ITD突變陽性率高于非老年，二者有顯著性差異，提示FLT3ITD突變可能與年齡有關，與老年AML的發生及預后存在密切關系，這與國內外報道相似[78]。我們的結果還顯示，FLT3ITD突變陽性者具有外周血白細胞數高、骨髓白血病細胞比例多的臨床特點，這與YANADA等[9]報道相似。我們的結果顯示，FLT3ITD陽性AML患者CR率較FLT3ITD陰性AML患者低，二者有顯著性差異。一方面說明FLT3ITD陽性AML患者對化療不敏感，有抗藥性，這與BANG等[10]報道一致，另一方面說明FLT3ITD陽性AML患者預后差。有作者對FLT3ITD重復序列的長度與預后的關系進行了研究，認為較長的重復序列與不良預后相關[11]，我們的結果顯示，FLT3ITD陽性AML患者CR率較FLT3ITD陰性AML患者低，二者有顯著性差異，FLT3ITD陽性AML患者外周血白細胞數、骨髓白血病細胞比例高于FLT3ITD陰性AML患者，這兩個指標均提示預后差，說明FLT3ITD基因突變可作為預測AML預后的一個指標。

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篇10

關鍵詞：遺傳性對稱性色素異常癥；ADAR基因；基因編碼區

Abstract：Objective To detect the ADAR mutant gene in the family of hereditary symmetry pigment abnormalities.Methods clinical data of patients with peripheral blood DNA extraction，all PCR amplification of ADAR gene encoding region of exon and flanking sequences，PCR products were purified and directly sequenced，and compared with the genomic sequence，find no mutation.Results No mutations were found in all the exons and flanking sequences of the candidate gene coding region.Conclusion The ADAR gene coding region is not related to the pathogenesis of hereditary symmetry pigment abnormalities in this study.

Key words：Hereditary symmetry pigment abnormalities；ADAR gene；Gene coding region

遺傳性對稱性色素異常癥（Dyschromatosis symmetrica hereditaria，DSH）是一種少見的常染色體顯性遺傳性皮膚病。主要表現為散在分布于手足背的對稱性色素沉著及色素減退斑，少數伴有面部雀斑樣損害，可延及四肢及全身[1]。2003年張學軍等[2]將該病的致病基因定位于1q11～1q21區域。Miyamura等[3]將該病的致病基因確定為ADAR基因。我們收集到1個DSH家系，利用PCR和直接測序方法進行突變檢測，以期發現在該家系中是否存在ADAR基因突變。

1資料與方法

1.1一般資料 先證者：女，6歲。雙手足背出現色素異常4年，皮疹漸加重，無不適。系統查體：未見明顯異常。皮膚科檢查：雙手足背可見米粒至黃豆大小褐素沉著斑，夾雜色素減退斑，見圖2、圖4。面部散在粟粒至黃豆大小色素沉著斑，見圖1。父母非近親結婚。家系調查：先證者父親，31歲，自3歲起雙手足背、面部出現與先證者相似皮損，見圖3、圖5、見圖6。亦呈夏重冬輕現象。無其他自覺癥狀。系統查體：未見明顯異常。皮膚科檢查：雙手足背可見米粒至黃豆大小褐素沉著斑，夾雜色素減退斑。面部散在粟粒至黃豆大小色素沉著斑。家系圖，見圖7。組織病理檢查：（先證者父親右足背色素斑） 表皮輕度角化過度，表皮基底細胞灶性黑素減少與增加交替分布，真皮淺層血管周圍少許淋巴細胞浸潤，見圖8、圖9。診斷：遺傳性對稱性色素異常癥。

1.2材料與方法

1.2.1 外周血基因組DNA提取。

1.2.2 PCR擴增及DNA測序ADAR基因，見表1。

ABI PRISM 3730XL自動測序儀直接測序。測序結果利用Sequeneher 4.10.1Demo軟件與基因組標準序列進行比對分析。

2結果

2.1 基因突變檢測

2.1. 擴增DSRAD基因的15個外顯子編碼區及側翼序列，經過http：//ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/進行反復仔細比對，未發現任何致病突變。

3討論

遺傳性對稱性色素異常癥（DSH ）， 系常染色體顯性遺傳病，最先由Toyam a于1910年描述， 并于1929年正式命名。嬰兒期或兒童期發病。張學軍等首次將本病定位在1q11-1q21區間內， 該區間內的雙鏈RNA 特異性腺苷脫氨酶基因（ADAR） 被證實是本病的致病基因。迄今已超過140種不同的ADAR基因的突變報道，其中約60%的突變點位于編碼ADEAMc區的堿基序列上，因此有筆者認為ADEAMc區是該病基因的突變熱點區域。本家系2位患者ADAR基因的15個外顯子編碼區及側翼序列進行測序未發現任何致病突變。劉紅等曾對8個DSH家系進行ADAR的直接測序，其中的2個家系也未發現任何突變，分析原因可能位于內含子區域、5'端啟動子區域。考慮到遺傳異質性，原因還可能是致病基因ADAR之外的其它基因。至今中國人遺傳性對稱性色素異常癥的分子遺傳學研究報道中尚未發現除ADAR基因編碼區以外的突變位點。因此定位漢族人群中該病的易感基因或篩查已知易感基因的突變類型仍是該病的一個研究方向。本家系致病基因的定位研究，仍在進行中。

參考文獻：

[1]趙辨.中國臨床皮膚病學[M].第1版.南京：江蘇科學技術出版社，2010.1479.