基因工程疫苗范文

導語：如何才能寫好一篇基因工程疫苗，這就需要搜集整理更多的資料和文獻，歡迎閱讀由公務員之家整理的十篇范文，供你借鑒。

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[關鍵詞]基因工程疫苗 核酸疫苗 免疫

[中圖分類號]Q789-01 [文獻標識碼]A [文章編號]1009-5349（2014）11-0081-01

自Edward Jenne醫生發明天花疫苗開始，已有幾千種疫苗被開發出來，疫苗逐漸成為人類與疾病做斗爭的重要武器之一。傳統疫苗具有生產的成本高、疫苗中含強毒性致病物質、減毒株突變及部分疾病用傳統的疫苗防治收效甚微等缺點。所以，研制更安全、更高效的疫苗十分必要。

DNA重組技術為新一代疫苗――基因工程疫苗的研制提供了全新的方法。基因工程疫苗是指應用DNA重組技術，通過基因組改造，降低病原微生物的致病性，提高免疫原性，進而達到防治傳染病的目的。迄今為止，基因工程疫苗是最先進的疫苗，相比傳統疫苗而言它有巨大的優勢。

一、基因工程疫苗種類

應用基因工程技術開發的已經使用和正在研制的新型疫苗種類主要有基因工程亞單位疫苗、基因工程活載體疫苗、核酸疫苗、合成肽疫苗、轉基因植物可食疫苗等。

（一）基因工程亞單位疫苗

該類疫苗僅包含病原體的抗原，不包含病原體的其他遺傳信息。基因工程亞單位疫苗通過表達病毒的主要保護性抗原蛋白獲得免疫原性，具有安全、便于規模化生產等優點。該類疫苗的制備步驟如下：①了解編碼具有免疫原活性的抗原蛋白對應的基因信息。②從大腸埃希氏菌、酵母、轉基因動植物等表達系統中選擇最適表達載體。如：酵母表達系統已經大規模生產人用重組肝炎疫苗。基因工程亞單位疫苗可細分為：細菌性疾病、病毒性疾病和激素亞單位疫苗。

1.細菌性疾病亞單位疫苗

分離和鑒定致病菌主要免疫原和毒力因子是研究細菌性亞單位疫苗的基礎，目前已研制出與炭疽、大腸桿菌病、牛布魯氏菌病等對應的亞單位疫苗，均能對相應的疾病產生有效的保護作用。史百芬等發現RSVF蛋白亞單位疫苗（PFP-1）注射接種后接種者無呼吸道疾病加劇作用。

2.病毒性疾病亞單位疫苗

大多數病毒基因組已經被克隆和完全測序，因此病毒性亞單位疫苗的研制相對簡單。現在病毒性疾病亞單位疫苗主要有口蹄疫、狂犬病、乙肝疫苗等。中國臺灣省科學家研制的禽流感亞單位疫苗效力遠比滅活疫苗高。祁賢等應用酵母系統表達生產雞傳染性腔上囊病病毒VP2亞單位疫苗，發現其可完全取代傳統滅活疫苗。

3.激素亞單位疫苗

該疫苗是以生長抑制素為免疫原的一類疫苗。杜念興等將大腸埃希氏菌中表達的生長抑制素基因與HbsAg基因融合，通過Vero細胞表達，結果發現表達產物具有良好的免疫原性。杜念興等用SS基因疫苗免疫小鼠，發現口服型SS基因疫苗免疫小鼠后可在小腸表達HBsAg/SS融合蛋白，推測該基因疫苗刺激機體表達蛋白后能產生SS抗體。

（二）基因工程活載體疫苗

此類疫苗生產主要有兩種方法，一是使非致病性微生物表達某種特定病原物的抗原決定簇基因，進而產生免疫原性，另一種是致病性微生物被修飾或去掉毒性基因，但仍保持免疫原性。活載體疫苗結合了活疫苗和死疫苗的共同優點，在免疫力上具有很大的優勢，分復制性和基因突變活載體疫苗。

（三）核酸疫苗

核酸疫苗接種后，抗原合成、增加與病原自然感染十分相似;還具有免疫原性單一;易構建和制備，穩定性好，成本低廉，適于規模化生產等優點。

二、展望

疫苗開發具有安全性、有效性、價廉性、易推廣性等特點。基因工程疫苗具有傳統疫苗無可比擬的優點，是疫苗產品開發的主要方向。研制多聯或多價疫苗是基因工程疫苗的主要發展方向。

【參考文獻】

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我國基因工程制藥實施產業化始于上世紀80年代末期。隨著我國第一個具有自主知識產權的基因重組藥物a－lb型干擾素，1989年在深圳科技園實施產業化，國內基因藥物產業化大發展的序幕也由此拉開。

截至2003年，我國批準上市的基因工程藥物和疫苗主要有重組人a－lb干擾素、重組人表皮因子（外用）、重組人紅細胞生成素、重組鏈激素、重組人胰島素、重組人生長激素、重組乙肝疫苗等。目前，全球最暢銷的十幾種基因藥物在我國都能生產。

基因藥物成為人類對付疾病的新銳，一般來說基因藥物，都應有自己特有的作用靶點，或是人體組織、或是細胞膜、或是細胞漿中的某蛋白質和酶。通過這些作用點，藥物能發揮最佳療效。而現有的藥物除了作用于治療的目標點之外，還常常作用于其他部位，因此常常會帶來很多的副作用。

基因工程制藥將具有藥物作用效果明確、作用機理清楚或作用專一、毒副作用小等優點。這些藥物會使醫生能像發射激光制導“導彈”那樣使用藥物，而不是盲目對疾病“開火”。

而且，基因工程制藥不僅解決傳統藥物“頭痛醫頭腳痛醫腳”的治標問題，還將從基因的個性化角度配制藥物，使疾病得到徹底根治，并同時帶來制藥產業的革命。

從提高人類生存質量角度看，基因工程制藥目前主要瞄準一些重大的常見疾病，如艾滋病、癌癥、糖尿病、抑郁癥、心臟病、老年性癡呆癥、中風、骨質疏松癥等嚴重危害人類健康并流行范圍較廣的病癥。

尋找新的藥物作用靶點是今后新藥研制開發的關鍵。而人類基因組學研究將為尋找新的藥物作用點開辟廣闊的前景，它最終揭示的人類基因中至少有幾千個基因可作為藥物的作用點。

基因工程制藥產業發展迅速，得益于我國舉世矚目的基因技術研究實力。我國是唯一參與人類基因組研究的發展中國家，在參與人類基因組計劃的美、英、日、中、法、德6個國家中，我國基因組測序能力已經超過法國和德國，名列第四。在6國16個基因組測序中心里，我國位居前十強。2000年完成了1％的人類基因組測序任務，2002年又獨立完成了水稻基因組研究。如今又領銜國際人類肝臟蛋白質組研究，這些都是舉世矚目的成就。尤其近年來，在醫學和生命科學的幾大最前沿的領域，如組織器官工程、生物芯片、干細胞技術、克隆技術等方面也均處于世界先進水平。加上基因重組技術、DNA技術、基因化學技術的進步和發展等，這些都將為我國基因工程藥物產業的發展奠定堅實的科學技術基礎，將給基因工程藥物產業帶來深刻的變化和前所未有的發展機遇。

盡管國內基因工程制藥企業現狀不容樂觀，我國生物技術產業與歐美發達國家相比雖有一定距離，但并非不可逾越，這個市場依然被業內人士十分看好。比如我國干擾素的實際消費量不足1億，但市場潛力相當大，專家們估計能達到4億―5億支。尤其經過近10年的努力，我國已造就了若干個具有國際競爭力，甚至能躋身世界基因工程藥物產業前列的中國本土上的龍頭企業。所以盡管基因工程制藥發展道路艱辛，但前景依然十分誘人。

1基因工程與基因板塊前景分析

1.基因工程技術的發展與前瞻性，2000年6月26日，“人類基因組計劃”成功繪制了人類生命的“天書”，人類的遺傳密碼基本被破譯，標志著生物技術，特別是生命科學技術發展進入到一個新的階段。人類基因組計劃（HGP）與曼哈頓原子彈計劃和阿波羅登月計劃一起被稱為二十世紀三大科學工程，它同時將貫穿于整個21世紀，被認為是21世紀最偉大的科學工程。早在20世紀上半葉，遺傳學家就提出了“基因”概念，即基因是決定生物性狀的遺傳物質基礎。特別是1953年沃森和克里克DNA雙螺旋結構模型創立后，進一步從本質上證實基因是決定人類生、老、病、死和一切生命現象的物質基礎。至70年代，DNA重組技術（也稱基因工程或遺傳工程技術）終獲成功并付之應用，分離、克隆基因變為現實，不少遺傳病的致病基因及其他一些疾病的相關基因和病毒致病基因陸陸續續被確定。所有這一切使人們似乎看到了攻克頑癥的曙光，研究基因的熱情空前高漲。

諾貝爾獎獲得者杜伯克進一步提出了基因組研究模式，美國國會于1990年10月1日批準正式啟動HGP，為期15年，政府投資30億美元。人類基因組計劃的目的是要破譯出基因密碼并將其序列化制成研究藍本，從而對診斷病癥和研究治療提供巨大幫助。不久的將來我們不僅可以看到癌癥、艾滋病等絕癥被攻克；人類可以通過基因克隆復制器官和無性繁殖；基因診斷和改動技術可以使人類后代不再受遺傳病的困擾；而且人類將進入藥物個性化時代，人類的生命也將延長。正是由于這些新技術和新領域的不斷出現和日新月異，人類在新世紀的生存和生活方式將發生重大變化。

其一、基因制藥。在過去發現新藥物作用靶點和受體是非常昂貴和漫長的，科學家只是依賴試錯法來實現其藥物研究和開發的目標。人類基因組研究計劃完成后，科學家可以直接根據基因組研究成果確定靶位和受體設計藥物。這將大大縮短藥物研制時間和大大降低藥物研制費用。

其二、基因診斷。人類基因組研究計劃最直接和最容易產生效益的地方就是基因診斷。通過基因診斷可以解決遺傳性疾病的黑洞，基因診斷能夠在遺傳病患者還未發現出任何癥狀之前，甚至還未出生的嬰兒就能確診。

其三、基因治療。基因治療被稱為人類醫療史上的第四次革命，遺傳學表明人類有6500種遺傳性疾病是由單個基因缺陷引起的，而通過基因治療置入相關基因將使人類的許多不治之癥得以克服。

其四、基因克隆。是指把一個生物體中的遺傳信息（DNA）轉入另一個生物體內。利用基因克隆技術不僅可以培育出自然界不可能產生的新物種，而且可以培養帶有人體基因的動植物作為“生物反應器”生產基因工程產品，還可制造用于人體臟器移植的器官，從而解決異體器官的排斥和供移植的人體器官來源不足的問題。現在動植物克隆已成為現代科技進步中最具有沖擊力和爭議性的事件，克隆羊和克隆豬的出現引發人類克隆自身的擔憂，而植物克隆和大量轉基因食物大規模出現引發了人們對于生物物種混亂和污染的擔憂。但不可否認的是，植物克隆可以為人類食品來源開啟廣闊的空間，而動物克隆可以利用動物生產大量人類需要的基因藥物和器官。

其五、基因芯片。由此可見，在21世紀誰能掌握人類自身，誰擁有基因專利越多，誰就在某種基因的商業運用和新藥開發中居于領導地位，基因技術具有巨大商業價值和社會意義。

2中國基因工程產業的發展態勢

1999年7月，我國在國際人類基因組注冊，承擔了其中1％的測序任務。我國人類基因組研究除完成3號染色體3000萬個堿基對即1％的測序任務外，主要著重于疾病相關基因以及重要生物功能基因的結構和功能研究。我國近兩年又在上海和北京相繼成立了國家人類基因組南、北兩個中心，這為大規模進行基因功能研究提供了可靠的保證。

基因技術革命是繼工業革命、信息革命之后對人類社會產生深遠影響的一場革命。它在基因制藥、基因診斷、基因治療等技術方面所取得的革命性成果，將極大地改變人類生命和生活的面貌。同時，基因技術所帶來的商業價值無可估量，從事此類技術研究和開發企業的發展前景無疑十分廣闊。基因工程產業除了眾所周知的高投入、高回報、高技術、高風險外，還具有其它一些十分重要和鮮明的特點。基因工程產品的技術含量非常高，因此，基因工程產品的前期研究和開發投入非常高，國外新藥的研究開發費用基本上占銷售額的15％左右。而基因工程產品的直接生產成本卻非常低，而且對生產的設備要求也不是很高，基因產品的這一特點意味著基因工程領域的進入壁壘并不存在于生產領域，而存在于該產業的上游，即研究開發這一環節，因此只有具備相當資金與技術實力的企業才能問津。基因工程產業不僅在投入上具有非常明顯的階段性，而且基因工程產品的創新期非常長，因為不僅產品的研究開發需要花費大量的時間和精力，而且對產品的審批也相當嚴格，所以一種基因工程產品完成創新階段，從實驗室到消費者手中要經過好幾年時間。

由于基因工程產業的發展前景十分看好，因此一大批國內企業包括許多上市公司近年來紛紛涉足這一行業。自九十年代中期以來，我國已有300多家生物工程研究單位，200多家現代生物醫藥企業，50多家生物工程技術開發公司，上市公司中有30多家企業涉及生物制藥。目前，基因工程藥物、生物疫苗、生物診斷試劑三大類的基因產品均有國內企業參與生產。在這些產品的市場上，國內企業依靠低廉的價格和廣闊的營銷網絡，已在與國外廠商的市場競爭中取得了優勢地位。從行業分布上來看，國內上述幾類基因工程產品的市場格局大致呈現如下的狀況：

細胞因子類產品目前市場已處于飽和狀態。受超額利潤的誘惑，前兩年已有太多的廠家介入該市場，僅EPO一項，光上市公司在生產的就有復星實業（600196）、哈醫藥（600664）、張江高科（600895）、等好幾家，再加上國內非上市公司，目前共有十幾家公司在生產EPO，年生產能力過剩超過了500萬支。而血小板生長因子（TPO），由于國外的知識產權保護而未能為國內廠商所仿制，從而導致該產品被進口品所壟斷。因此，如果不能形成新細胞因子的自主開發能力，對企業來說，該市場的拓展空間將非常有限。

重組類藥物目前還處于實驗室開發階段。目前市場上的水蛭素、降鈣素等產品是通過提取或化學合成，而不是利用基因工程技術的方法獲得的。有許多院校和研究機構已在這方面取得了一定的進展，拿到了目的基因并在實驗室構建了表達載體，但在表達量及分離純化方面還有待突破。可見部分重組類藥物的產業化生產已不再遙遠，國內在這方面與國外的差距還不算大，是一個大有可為的新領域。

生物疫苗市場目前呈現出不平衡的局面。一些疫苗如破傷風疫苗、脊髓灰質炎疫苗，市場上已相當普及，另外一些疫苗如肝炎疫苗，目前的普及還不廣，還有很大的市場空間可以擴展，許多疾病，甚至是常見病，如流感等還沒有找到相應的疫苗。從目前的市場情況來看，國內企業處于相對劣勢，國產疫苗與進口的同類產品相比，雖然價格只有對方的2/3，但質量不穩定，而且操作起來非常不方便，因此在這個市場上，舶來品占據了相當的市場份額。

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一、種類

根據抗原性質可分為滅活疫苗、弱毒活疫苗、亞單位疫苗、工程疫苗、核酸疫苗和轉基因植物可飼疫苗；根據疫苗功效則可分為預防性疫苗和治療性疫苗。

1. 滅活疫苗。將分類離培養的病原微生物（多數為強毒株）用適當的化學試劑將其滅活但保留其免疫原性，與不同的佐劑混合后乳化制成滅活疫苗。目前，用于制備滅活疫苗的佐劑有礦物油佐劑和氫氧化鋁佐劑。前者多用于病毒性疫苗，如當前使用的豬圓環病毒滅活疫苗、偽狂犬病毒滅活疫苗；用氫氧化鋁作為佐劑制備疫苗靜置后，會出現分層，疫苗在使用前搖勻即可，該佐劑多用于細菌疫苗。蜂膠佐劑多用于細菌苗和亞單位疫苗。

滅活疫苗的用途：①新分離的病原，短期內難以致弱。如高致病性豬藍耳病滅活疫苗、豬圓環病毒滅活疫苗和兔瘟滅活疫苗。②血清型較多的病原，疫苗的保護力呈現血清型特異性，如豬胸膜肺炎放線桿菌（15 個血清型）、副豬嗜血桿菌（15 個血清型）、豬鏈球菌（35 個血清型）等。③變異頻率高的病原，如新分離的口蹄疫Mya-98 株。

豬用滅活疫苗中，有豬偽狂犬病滅活疫苗、豬口蹄疫0 型（單價/ 二價/ 三價）滅活疫苗、豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗、豬圓環病毒滅活疫苗、豬細小病毒滅活疫苗、豬乙腦滅活疫苗、豬鏈球菌病單價( 二價/ 三價) 滅活疫苗、副豬嗜血桿菌三價滅活疫苗和豬傳染性胸膜肺炎三價滅活疫苗等。

滅活疫苗的優點是安全性強，疫苗毒株無毒力返強的危險；多數疫苗的免疫接種效果不受仔豬母源抗體水平高低的干擾；貯存條件方面，一般需冷藏保存，不能冷凍。其缺點是需要免疫次數多，接種后局部反應略大，甚至出現接種部位污染，可引起局部炎癥膿腫，影響接種效果，也降低局部的肉品質量。

2．弱毒活疫苗。

疫苗種類指將毒力下降或毒力完全喪失的病原微生物，與牛奶、明膠等佐劑混合后經過低溫凍干后形成的疏松狀制劑。嚴格意義上，此類疫苗不包含采用基因工程方法對基因組改變后引起致病性改變的微生物制備的弱毒疫苗。根據所含的疫苗毒株分類不同，可以分為以下幾種：（1）細菌活疫苗：如仔豬副傷寒疫苗，豬丹毒- 肺疫活疫苗。（2）病毒活疫苗：豬瘟活疫苗、偽狂犬病活疫苗和豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗。（3）豬支原體肺炎活疫苗。預防豬寄生蟲的活疫苗尚未問世。

我國常用的弱毒活疫苗較多，如豬瘟活疫苗、豬偽狂犬病活疫苗、豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗、豬乙肝疫苗、豬丹毒活疫苗、豬肺疫活疫苗、仔豬副傷寒疫苗、豬馬腺疫鏈球菌活疫苗等。

活疫苗的優點與缺點：優點是：（1）免疫途徑多樣：可通過肌肉注射、滴鼻、口服等途徑免疫。（2）刺激產生黏膜免疫：除肌肉注射外，滴鼻和口服途徑免疫后可刺激機體產生局部分泌型IgA, 形成黏膜免疫，在預防呼吸道感染和消化道感染中具有獨特的作用，這是滅活疫苗無法比擬的，如沙門氏菌口服可以刺激機體腸道局部黏膜免疫。（3）免疫后可剌激產生體液免疫和細胞免疫，免疫效果較為確實。（4）免疫次數少于滅活疫苗。（5）接種后局部反應低。缺點：受母源抗體的影響如豬瘟活疫苗、偽狂犬病活疫苗等；受抗菌藥物的影響如仔豬副傷寒弱毒疫苗、豬丹毒- 肺疫二聯弱毒疫苗和豬支原體弱毒疫苗等；活疫苗運輸保存條件嚴格，需冷凍條件。

3. 基因工程疫苗。

利用分子生物學手段改造病原微生物的基因，獲得毒力下降、喪失的突變株或構建以弱毒株為載體、表達外源基因的重組毒（菌）株，并利用它們作為疫苗毒株制備疫苗，包括基因缺失活疫苗和基因工程活載體疫苗。該疫苗與常規弱毒疫苗相比，主要區別在于后者采用常規技術，而非分子生物學技術，來致弱病原微生物，不確定其毒力致弱的分子機制。

作為基因工程疫苗載體的病毒或細菌，其主要特性是：致病力下降或缺失、對靶動物和非靶動物是安全的，基因組龐大、可容納外源基因，并高效表達。常用的活載體有：偽狂犬病毒弱毒株、腺病毒、沙門氏菌弱毒菌株、乳酸桿菌、胸膜肺炎放線桿菌弱毒株。我國在“十一五”期間，在“863”課題資助下，開展了以偽狂犬病毒為載體，表達豬細小病毒、乙腦病毒、口蹄疫病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒主要免疫原性基因的研究。鑒于對其安全性的憂慮，我國規定轉基因生物（包含基因工程 疫苗）必須經歷實驗室和野外安全性觀察測試，獲得安全證書后，方能進行疫苗學研宄，以申報獸用生物制品新獸藥證書。目前，我國己經批準上市的基因工程疫苗有：豬偽狂犬病基因缺失疫苗、口蹄疫基因工程疫苗、豬大腸桿菌K88-K99 基因工程疫苗。重組載體疫苗尚未正式上市。

4．核酸疫苗。

核酸疫苗產生于20 世紀80 年代。將病原微生物或寄生蟲基因組中編碼免疫原性蛋白的基因克隆到真核表達載體中制備重組質粒，這種質粒直接導入動物體內，利用宿主體內的轉錄翻譯系統，合成該蛋白，剌激機體產生針對相應的細胞免疫和體液抗體，因而稱之為DNA 疫苗。DNA 疫苗可以用大腸桿菌大量制備，成本較低。針對細菌病、病毒病和寄生蟲病的DNA 疫苗報道較多。但基于是否整合到宿主染色體等安全性考慮，核酸疫苗多處于實驗研宄階段，尚未大量應用。RNA 疫苗是近幾年才出現的一種核酸疫苗，主要在人類醫學中，作為RNA 類藥物，用于抗腫瘤研宄。在動物疫苗領域尚未見RNA 疫苗的應用報道。

5. 亞單位疫苗與合成肽疫苗。

利用物理化學方法提純病原微生物中具免疫原性的組份，或者利用基因工程表達該組分，純化后加入佐劑而制成。豬傳染性胸膜肺炎的亞單位疫苗中含有毒素I, 毒素II,毒素III 和外膜蛋白等， 能提供對所有15 個血清型的交叉保護力。我國使用的口蹄疫合成肽疫苗，是利用人工方法合成口蹄疫病毒VP1 蛋白中具有較強免疫原性的抗原片段，加入佐劑制成。該疫苗的優點是抗原組分單一，純度高，免疫反應強，副作用低；能迅速針對新出現變異毒株研制其合成肽疫苗。但是，其成本較高。

6．轉基因植物可飼疫苗。

將病原微生物中編碼免疫蛋白的基因插入植物基因組中，獲得表達病原微生物免疫原性的植物，再從植物中提純蛋白用于注射動物或將植物直接飼喂動物，產生免疫力。用于表達免疫原性基因的植物主要是馬鈴薯、玉米、蔬菜、番茄、煙草和香蕉等，稱為轉基因可飼疫苗（ediable vaccine)。此類疫苗在口蹄疫（擬南芥、苜蓿和馬鈴薯為受體)、豬傳染性胃腸炎（馬鈴薯、花椰菜和土豆為受體)、腹瀉（煙草為受體）和輪狀病毒感染（番茄和馬鈴薯為受體）等疾病防控中有研究的報道,但未見臨床應用。目前的技術難題是：選擇直接生食和貯藏方便的植物作為表達植株（煙草不適用于動物基因的篩選和優化其密碼子和使用合適啟動子，使其表達量滿足疫苗免疫劑量的要求；免疫劑量免疫程序的確定；并設法提高口服后黏膜免疫效果。轉基因植物可飼疫苗主要應用在胃腸道疾病中。

二、疫苗使用的注意事項

1． 建立在正確的流行病學調查基礎上，有針對性選擇所需疫苗，不可盲從。對于多血清型菌株感染，應選擇與當地流行菌株血清型一致的疫苗，免疫效果要確實。

2．確保疫苗運輸和使用過程中的冷鏈保障。如疫苗的物理性狀己經改變，如分層現象，不可用手工混勻后再使用，應丟棄。

3．細菌活疫苗使用前后不可同時使用抗生素或有抗菌活性的中草藥。

4．建議使用于健康豬群；正在發病豬群使用緊急接種，可能會加快處于疾病晚期豬只死亡，但是會縮短豬群的病程，因此要有心理準備。

5．制定合理的免疫程序，避免母源抗體干擾。不同疫苗接種之間至少間隔1 周。不同疫苗的同時混合使用，要先做小范圍的觀察，如無副反應，再大群使用。

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關鍵詞新城疫；病毒；疫苗；研究進展

中圖分類號　S851　文獻標識碼　A　文章編號　1007-5739(2012)02-0325-03

新城疫病毒屬于副粘病毒科副粘病毒屬，為有囊膜的單股負鏈RNA病毒。其基因組編碼6個蛋白：RNA依賴的RNA聚合酶(L基因)、血凝素神經氨酸酶(HN)、融合蛋白(F基因)、基質蛋白(M基因)、磷蛋白(P基因)、白(NP基因)。其中F蛋白有使病毒囊膜與宿主細胞融合進而導致病毒傳人宿主細胞膜的作用，是決定病毒毒力的關鍵因子。而HN蛋白是NDV的另一種重要的致病因子，它的主要作用是參與病毒粒子與細胞受體的最初吸附以及破壞這種吸附作用。此外，HN蛋白還可使F蛋白充分接近受體而發生病毒與細胞膜的融合而致病。因此，NDV表面的HN-F糖蛋白在病毒的傳染性和治病性上起到至關重要的作用，許多新城疫基因工程疫苗的研制都依賴于F、HN蛋白。

新城疫(ND)是一種侵害禽類的急性高度接觸性傳染病，由新城疫病毒引起。自1926年首次在印度尼西亞的爪哇島和英國的新城暴發以來，至今已有4次世界范圍內的大流行，給養禽業帶來了嚴重的經濟損失。NDV基因型已經發生了很大的差異(I-Ⅺ)。雖然現有的滅活苗和弱毒苗能獲得較好的免疫效果，但是近年來由強毒引起的非典型ND在免疫雞群中時有發生，因而研究出安全、高效的新型疫苗一直備受有關學者的關注。目前，亞單位疫苗、活載體疫苗、新城疫病毒載體疫苗、DNA疫苗等都被廣泛研究。

1　常規疫苗

1.1　滅活苗

滅活苗一般是由滅活的感染性尿囊液與載體佐劑混合后制得，能夠刺激機體產生有效的免疫應答，使抗體以較高的水平在體內持續較長時間，且易于儲存。目前，廣泛使用的滅活苗為油乳劑滅活苗，多用Ulster2e、B1、LaSota及Rokin等作毒種來生產，這些毒株在雞胚中均能大量增殖，多用于二聯苗或多聯疫苗的制造，使用多聯苗可以節省勞動力，免疫效力受母源抗體影響較小，免疫后副作用小。但由于注射劑量和疫苗對免疫效果有很大的影響。且滅活疫苗中需要添加Avridine、ISCOMS弗氏完全佐劑、礦物油、動植物油、脂質體等佐劑，導致免疫成本大大提高。同時，接種滅活苗的機體產生針對病毒的特異性抗體，干擾臨床檢測檢疫以及流行病學調查，這是以滅活苗防治ND的最大障礙。

1.2　活疫苗

活疫苗一般由感染胚尿囊液凍干而成，通過飲水、進食、噴霧、氣霧等途徑大規模免疫雞群。通常NDV活疫苗分為緩發型和中發型。B1株和Lasota株是天然弱毒株，幾乎無致病性，可作為緩發型疫苗，經滴鼻、點眼、飲水、氣霧等途徑接種免疫，保護效果較好。而H株、Roakin株等屬中發型的疫苗，由于毒力較強，只能用于二次免疫。也有用CS2株、V4株等作活疫苗的，也能達到良好的免疫效果。活病毒感染能刺激機體產生局部免疫，免疫后可較快得到保護，一般接種后3-5d就能產生抗體，抗體一般可維持20-30d。主要產生黏膜抗體(IgA)，對機體呼吸道、消化道等局部黏膜免疫具有重要作用，是阻止外界病毒入侵的屏障。活疫苗易于大規模使用，較便宜，且疫苗毒還可以使免疫雞傳給未免疫雞，但由于環境條件及并發感染，可能引發疾病，母源抗體對初次免疫影響較大。此外，若在生產過程中控制不當，活疫苗易被滅活、污染，有毒力返強的危險。因此，為了使NDV得到更好的控制，人們又開發了其他類型的疫苗。

2　基因工程疫苗

2.1　亞單位疫苗

利用重組DNA技術輔以佐劑將NDV保護性抗原基因在高效的表達系統中表達而制成亞單位疫苗。目前，桿狀病毒表達系統是研究ND亞單位疫苗的主要常用工具。Nagyetal分別利用昆蟲桿狀病毒表達了NDV的F及HN蛋白，對雛雞進行免疫。結果表明，表達的F和HN蛋白能夠產生很好的免疫保護作用。丁壯等應用該系統表達NDV四平和長春2個分離株的HN，用NDV強毒攻毒后，分別達到65％(四平株)和100％(長春株)的保護率。聞曉波等構建含有NDV的M、NP、F、HN 4個基因的桿狀病毒轉移載體，并得到了共表達的NDV的M、NP、F、HN4個蛋白，為進一步研究亞單位疫苗及NDV結構蛋白之間的相互作用奠定了基礎。Kapczynski et al用處理NDV的不具感染性的病毒HN和F蛋白免疫雞，經驗證這些病毒亞單位成分具有良好的免疫保護效果。亞單位疫苗具有安全性高、穩定性好、運輸方便、批量生產容易的優點。是ND疫苗未來發展的一個重要方向，但是由于生產成本高，價格受限，很難真正用于疫苗生產，除非改進表達技術，顯著降低成本。

2.2　新城疫病毒重組活載體疫苗

近年來，采用以病毒或細菌為載體研究新城疫活疫苗的技術路線被多數學者主張。將NDV F和HN基因在動物病毒弱毒或無毒株(如腺病毒、痘苗病毒、反轉錄病毒等)等載體上進行表達，均已獲得成功。目前，痘病毒、腺病毒和孢疹病毒等都是較為理想的病毒載體。1990年Taylor et al將新城疫病毒Texas株F基因插入禽痘病毒中，在培養細胞中得以表達，經糖基化修飾后切割成F1和F2，通過點眼或口服重組病毒可獲得部分攻毒保護，而通過肌肉注射或翅下刺種，免疫1次就可獲得完全攻毒保護。Morgan et al將NDV的F、HN基因分別克隆人火雞孢疹病毒的復制非，必需區(US2)，利用Rous肉瘤病毒LTR的強啟動子構建重組病毒，用其腹腔接種SPF白來航雞，第28天后肌肉注射攻毒，表達F蛋白的重組病毒的保護率高達90％。曹殿軍等將NDV HN基因在重組雞痘病毒中表達，以NDV強毒株F48E9攻毒發現，接種重組病毒106pfu／只時，保護力可達80％，而104pfu／只時，保護力可達60％。說明該重組病毒對雛雞具有一定的保護作用，且該保護作用與接種劑量有一定的相關性。梁雪芽等將含NDV F48E9株融合蛋白(F)基因的真核表達質粒PCDNA3-F的減毒鼠傷寒沙門氏菌ZJIll株(Z]111／PCDNA3-F)口服接種小鼠和雛雞，表明利用該減毒株作為載體傳遞DNA疫苗具有相對安全性。用ZJlll／PEDNA3-F以108cfu／只免疫雛雞，2周后二免，二免后4周攻擊致死劑量的強毒株F48E9。結果表明：重組zJlll／PCDNA3-F菌株不僅能誘導法氏囊B淋巴細胞和胸腺T淋巴細胞的增值反應，而且能誘導雛雞產生NDV抗體，對強毒攻擊的保護率高于PCDNA3-F裸質粒DNA疫苗注射免疫組(50.00％)，達66.7％。活載體疫苗是當今及未來疫苗開發與研制的主要方向之一，其不僅具有傳統疫苗的許多優點，而且還為多價苗及聯苗的生產開辟了新道路。

2.3　新城疫病毒載體疫苗

隨著反向遺傳學的發展，重組NDV載體已成為當今病毒載體系統研究的熱點之一。基于NDV可以誘導機體的體液免疫和細胞免疫能在體內增值，并長期表達抗原基因，使機體得到較強且較持久的免疫保護，且是一種RNA病毒，不會與宿主基因組整合，安全性較高，被學者們認為是很好的疫苗載體。Zhao et al。吩別在NDV強毒株和弱毒株的4個不同基因間區域插入外源基因，結果表明：NDV作為疫苗載體是完全可行的，因為病毒的復制效率和滴度并沒有受到影響。Peeters et al以含禽副粘病毒4型基因的雜合體HN基因取代NDV HN基因，構建的嵌合體病毒作為活疫苗可以產生對NDV的免疫保護以及對F蛋白的中和抗體，不僅能夠抵制致死劑量NDV的攻擊，而且根據其對HN所產生的抗體及血清分析即可區別于野生毒感染。

2.4　核酸疫苗

核酸疫苗最早是由Wolffet al于1990年發現。他們注意到給小鼠直接肌肉注射質粒DNA，質粒及純化的DNA或RNA重組表達載體，可使載體上的基因在局部肌肉細胞內表達，這種表達可持續數日甚至終身，且沒有檢出注射的外源核酸與宿主染色體的混合，之后William，Tang et al也證實了這一點。1994年其被世界衛生組織(WHO)正式統一命名為核酸疫苗(nuclmc acid vaccine)。它是指把外源基因克隆到真核質粒表達載體上，然后將重組的質粒DNA直接注射到動物體內，使外源基因通過宿主細胞的轉錄系統合成抗原蛋白，刺激機體的免疫系統，使機體產生特異性的體液免疫和細胞免疫應答。

NDV DNA疫苗是將病毒的HN或F基因通過表達質粒DNA導入機體，產生針對這些抗原的特異性免疫反應。對于DNA疫苗來說，載體質粒要能在大腸桿菌中高拷貝地擴增，且在動物細胞內能高效表達，但不能復制，也不能含有向宿主細胞基因組內整合的序列。目前，常用的是含有巨噬細胞病毒(cMV)早期啟動子的載體質粒。Sakaguchim et al于1996年用小雞作模型進行包含新城疫F基因的質粒DNA免疫雞試驗，結果表明：2／5用線性的F基因質粒免疫雞產生了特異抗體，新城疫病毒DNA疫苗研究由此開始。陳吉祥等用表面活性劑CATB／DOPE脂質體包裹DNV HN基因的真核表達質粒PcHNM免疫5周齡雛雞，免疫1周后。即可在雞血清中測出特異性HI抗體，但裸DNA免疫HI抗體水平比脂質體DNA免疫組要低。最后用強毒攻擊后，CTAB脂質體DNA免疫組保護率能達到100％，而裸DNA只有81.82％，表明該質粒DNA被脂質體包裹后，提高了特異性抗體產生能力，加強了對強毒的抵抗力。Yin et al研究表明，利用r-干擾素和左旋咪唑2種佐劑協同作用制備的DNA疫苗，比單用DNA疫苗免疫效果更好，對試驗雞抵抗致死劑量NDV的保護率達80％。新城疫DNA疫苗具有免疫效果好，不存在散毒和毒力返強的危險；免疫應答持久：方法簡便，價格低廉；可加工成干燥的小粒，便于貯藏和運輸。但是目前核酸疫苗的安全性、作用機理及如何提高免疫水平仍需進一步研究。

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【關鍵詞】生物制藥 技術 研究

中圖分類號：R9文獻標識碼：B文章編號：1005-0515（2011）3-249-02

Pharmaceutical Biotechnology Progress

【Abstract】Biotechnology drugs are the current and future important areas of drug development, including biotechnology, genetic engineering, application of drugs is a very important area. Biotechnology will be biotech drugs pharmaceutical technology innovation and development have an important influence and role. Snatch scientific high ground that gave birth to science growing point, the strategic focus shifted to achieve pharmaceutical research, will be the way of the development of the pharmaceutical industry.

【Keywords】Biopharmaceutical technology study

生物制藥是指借助生物工程來合成制備有藥物活性的蛋白質產品并應用于制藥工業部分的技術和過程。目前,生物制藥產業已經成為世紀最具前途的產業之一, 是生物工程應用研發中最活躍和進展最快的領域。世界上許多國家都把生物技術產業作為優先發展的戰略性產業之一,不斷加大對生物制藥產業的政策扶持與資金投入。

1 全球新藥研發現狀

1.1 科技發展成為強大動力

科技發展是醫藥行業快速成長的強大動力。隨著現代生活方式和疾病發生情況的改變, 研發工作有了相應調整,生物技術、納米技術和計算機技術等在醫藥產品研發和醫藥產業中的應用日益顯著, 以高通量篩選技術為基礎, 綜合采用計算機處理、新型分析手段、先進設備和快捷的信息技術己經使新藥先導物質的發現時間大大縮短。研發和技術創新日趨全球化, 傳統的研發、生產、銷售模式仍將繼續, 但電子商務、企業客戶管理和信息技術的交流融通持續帶來醫療市場的革命, 對醫藥營銷模式影響深遠。

1.2 藥品消費變化使新藥研發更具挑戰性

全球經濟發展不均衡導致藥品消費不均衡, 目前全球藥品消費有85％以上集中于美、歐、日等幾個發達國家和地區。隨著發展中國家經濟的發展, 其用藥水平將隨之提高, 這為藥品市場日后增長提供了機會, 但各國政府為增進人民健康福利, 勢必大力推廣價格相對便宜的非專利藥物, 或者對于專利藥物采取不甚嚴格的專利保護手段, 這對制藥企業的研發來說將是一大挑戰。

2 生物工程制藥研究進展

生物醫藥領域涵蓋化學制藥、生物工程制藥、生物技術制藥、生物醫藥工程、醫療儀器等方面。近年來, 美、英、法、日等國一些生物技術公司和制藥公司在基因工程、重組疫苗、單克隆抗體、診斷試劑、生物芯片、人造器官、新型給藥系統、新型醫療器械等領域進行了大量積極的研究, 已取得顯著進展。天然植物藥的研究越來越受到重視, 新的用藥選擇極大地推動著植物藥的發展。

2.1 基因工程

基因工程又稱遺傳工程, 即重組DNA 技術的實際應用。它是把在體外重新組合的DNA 引入到適當的細胞中進行復制和表達。利用基因工程細菌等表達人類一些重要基因片段, 可產生具有生理活性的肽類和蛋白質類藥物。這一技術可以大量廉價生產以前不敢想象的醫藥產品[1]。應用基因工程技術改造產生新的雜合抗生素, 為微生物藥物提供了一個新的來源。

現代重組DNA 技術特別是基因顯微注射技術的發展,奠定了轉基因動、植物發展的基礎。轉基因動、植物將發展成為生物藥品的新一代藥廠, 具有光明的前景和廣闊的市場。

此外，1990 年以來利用轉基因植物生產基因工程疫苗的研究得到了迅速發展。利用轉基因植物生產基因工程疫苗, 是將抗原基因導入植物, 讓其在植物中表達, 人或動物攝入該植物或其中的抗原蛋白質, 以產生對某抗原的免疫應答。轉基因植物生產疫苗的研究主要集中在煙草、馬鈴薯、蕃茄、香蕉等植物。

2.2 細胞工程

細胞工程是在細胞水平上的生物工程。細胞工程是在對細胞結構的深入認識和細胞遺傳學的研究基礎上發展起來的。DNA 分子的雙螺旋結構弄清了許多遺傳學原理, 還是從分子水平上揭示結構同機能關系的一個極好例證。這奠定了細胞培養和細胞融合技術的理論基礎[2]。人們認識到培養的動、植物細胞可以通過無性繁殖擴大群體數量同時保持本身遺傳性狀一致; 融合細胞通過容納2 種親本細胞的基因載體-染色體而具有親本雙方的優良性狀。通過細胞融合技術發展起來的單克隆抗體技術取得了重大成就, 該技術被譽為免疫學中的“革命”。細胞培養技術亦取得了豐碩成果。細胞工程同基因工程結合, 前景尤為廣闊。現在應用較廣泛的有單克隆抗體技術、植物細胞培養生產次生代謝產物、動物細胞培養。另外, 細胞培養技術也是基因工程中利用轉基因動、植物生產蛋白質類藥物的基礎技術之一。

2.3 微生物工程

微生物工程也稱發酵工程, 它在原有發酵技術的基礎上又采用了新技術使工藝水平大大提高。所采用的新技術主要應用于3 個方面[3]: 工藝改進、新藥研制和菌種改造。工藝改進主要依賴于計算機理論及技術的發展。新藥研制則得益于醫學研究中對疾病機理的深入了解。菌種改造主要利用基因工程原理及技術。正是由于采用其它學科的理論和新技術成果, 使得微生物工程成為一高新技術。

現酵工程不但生產酒精類飲料、醋酸和面包, 而且生產胰島素、干擾素、生長激素、抗生素和疫苗等多種醫療保健藥物, 生產天然殺蟲劑、細菌肥料和微生物除草劑等農用生產資料, 在化學工業上生產氨基酸、香料、生物高分子、酶、維生素和單細胞蛋白等。

近年來, 隨著基礎生命科學的發展和各種新生物技術的應用, 由微生物產生的具有除抗感染、抗腫瘤作用以外的其它活性物質的報道越來越多, 如酶抑制劑、免疫調節劑、受體頡頏劑和抗氧化劑等, 其生物活性超過了傳統抗生素所包括的范圍。

2.4 酶工程

酶工程就是利用酶的催化作用進行物質轉化,生產人們所需產品的技術, 是將酶學理論與化工技術結合起來的一項高新技術。酶工程技術的應用范圍大致有[4]：對生物寶庫中存在天然酶的開發和生產；自然酶的分離純化及鑒定技術；酶的固定化技術；固定化酶和固定化細胞技術；酶反應器的研制和應用；與其它生物技術領域的交叉和滲透。

酶工程對醫藥、醫療方面貢獻巨大。現在, 菠蘿蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶、胃蛋白酶等十幾種可以進行食物轉化的酶都已進入食品和藥物中, 以解除許多有胃分泌功能障礙患者的痛苦, 此外還有抗腫瘤的L-天冬酰胺酶、白喉毒素, 用于治療炎癥的胰凝乳蛋白酶, 降血壓的激肽釋放酶, 溶解血凝塊的尿激酶等。另外, 新型青霉素產品及青霉素酶抑制劑等也都是酶工程在醫藥醫療領域的成功應用實例。

2.5 蛋白質工程

蛋白質工程也稱“第二代基因工程”。蛋白質工程主要包括通過基因工程技術了解蛋白質的DNA編碼序列、蛋白質的分離純化、蛋白質的序列分析和結構功能分析、蛋白質結晶和蛋白質的力學分析、蛋白質的DNA 突變改造等過程[5]。蛋白質工程為改造蛋白質的結構和功能找到了新途徑, 推動了蛋白質和酶的研究, 為工業和醫藥用蛋白質(包括酶) 的實用化開拓了美妙前景。

第二代基因工程藥物是根據內源性多肽蛋白的生理活性, 應用基因工程技術大量生產這些極為稀有的物質, 以超正常濃度劑量供給人體, 以激發它們的天然活性作為其治療疾病的藥理基礎, 生物制藥作為生物工程研究開發和應用中最活躍、進展最快的領域, 被公認為是21 世紀最有前途的產業之一。生物技術是令人矚目的高新技術, 為人類解決疾病防治、人口膨脹等一系列問題帶來了希望。目前生物新技術的研究取得重大突破, 產生大量有益于人類健康的生物醫藥產品。可以預測, 申報、臨床試驗、使用的生物技術新藥將會越來越多, 生物工程制藥產業不僅將成為利潤豐富的支柱產業, 也將為人類健康提供更多更好的保障。

參考文獻

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[2] 慕金超；曹可；淺談現代生物制藥技術的現狀和發展[J]. 科技創新導報 2007年31期.

[3] 李充璧；王利平；生物技術制藥現狀與發展趨勢[J]. 肇慶學院學報 2008年05期.

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【關鍵詞】生物醫藥 新興產業 必要性

世界上任何一個國家，無論貧富，其政府對醫藥行業在嚴格監管的同時都采取了積極扶植的政策。

生老病死是不以人們意志為轉移的，所以在醫藥市場上，需求是剛性的，其發展較少受經濟周期的影響，在經濟危機中仍能保持一定的增長。2008年金融危機爆發以來，醫藥行業受到的影響遠遠小于金融業和其它制造業。受宏觀經濟影響，醫藥主流市場從傳統的美國、日本等發達國家向以中國、印度為代表的新興市場國家快速轉移，加之中國龐大的人口基數和人口老齡化進程的加快，中國的藥品市場增長速度已排在世界前列，這也使得中國的醫藥市場成為全球競爭最激烈的市場。

醫藥市場是我國最早全面開放的市場之一，從80年代開始世界上知名的跨國公司紛紛涌入中國市場，2009年以來，跨國公司又掀起的第二次進軍中國熱潮，給中國的醫藥企業帶來前所未有的挑戰。

隨著我國經濟的發展，人民生活水平的不斷提高，醫藥衛生體制改革的不斷深入，以及社會保險體系的不斷完善，全社會對醫療、醫藥、公共衛生服務要求不斷提高；加之全球化帶來的國際間日趨激烈的競爭，中國醫藥產業發展必然迎來結構性的調整。內外部競爭形勢迫切要求中國醫藥企業迅速做大做強，以具備與跨國公司巨頭同臺競技的能力。

國務院2010年10月的《關于加快培育和發展戰略性新興產業的決定》，將生物醫藥列為七大戰略性新興產業。2011年中央經濟工作會議進一步強調了把發展生物醫藥等戰略性新興產業作為產業結構升級的重要工作。張德江副總理在2011年12月19日中央企業負責人會議上發表講話要求中央企業“大力推動產業升級，在結構調整中發揮帶頭作用”，強調“要大力培育發展戰略性新興產業。”

2011年10月26日，國務院常務會議討論通過了《疫苗供應體系建設規劃》，充分體現了國家醫改政策以預防為主、高度重視生物疫苗產業發展的思路。《規劃》中明確了國家疫苗供應體系建設的重點項目：一是培育重要急需新產品，盡快完成手足口病疫苗等6種新疫苗的研制及產業化，加快研制和研發一批新的疫苗品種；二是建設關鍵研發設施，重點支持新型疫苗國家研究中心等能力建設；三是擴增急需產能和實物儲備；四是提高疫苗行業裝備水平；五是建立疫苗質量檢驗體系。

中國醫藥市場的巨大潛力，吸引著跨國生物醫藥生產巨頭通過投資設廠、兼并收購民營生產企業等方式加快進軍中國。2007年11月，法國賽諾菲安萬特公司宣布投資9400萬美元在深圳修建流感疫苗生產基地；2009年10月，英國葛蘭素史克公司宣布與云南沃森生物技術有限公司公司成立合資企業并擁有合資企業65%股權；2009年11月，瑞士諾華公司宣布以1.25億美元收購杭州天元生物藥業有限公司85%的股權。跨國公司在中國快速發展生物制藥業，使中國醫藥企業受到了嚴峻的威脅和挑戰。

但是，國家產業政策（特別是國家“863”高技術計劃）的大力支持下，近年來我國生物醫藥產業發展迅速，技術水平和創新能力明顯提高，形成了比較完整的產業體系，與國際先進水平差距逐年縮小。目前已有15種基因工程藥物和若干種疫苗批準上市，另有十幾種基因工程藥物正在進行臨床驗證，還在研制中的約有數十種。國產基因工程藥物的不斷開發生產和上市，打破了國外生物制品長期壟斷中國臨床用藥的局面。目前，國產干擾素α的銷售市場占有率已經超過了進口產品。因此，加大對生物制藥產業，特別是疫苗產業的投入，并以此作為趕超國際先進水平的突破口，有助于促使我國整個醫藥行業的發展。

國家藥監局2011年2月頒布的《藥品生產質量管理規范》（簡稱新版gmp）已經于當年3月1日正式實施。去年3月，我國疫苗監管體系通過了who的評估，這意味著中國的生物疫苗產業產品走出國門、走向世界。目前我國生物醫藥研發和生產水平居發展中國家的前列，生物疫苗產業有附加值高、能源消耗少、污染排量低的特點。中國疫苗銷售占藥品比例不到1%，遠低于全球2.7%的水平，產業發展仍然有很大的市場空間。

大力發展生物醫藥戰略性新興產業，要保障國家防控重大傳染病、流行病及特種儲備所需的生物制品供應；在重大新藥項目研發方面取得突成果，在重大工藝技術研發方面取得突破；加快

發展抗體和診斷試劑產業；努力開拓動物疫苗、生物治療等健康保健領域等。“十二五”時期生物醫藥產業有兩大任務：一是產業升級，包括產品標準升級和質量保障體系的升級；二是占領生物醫藥制高點，順應世界醫藥發展趨勢，追蹤前沿技術，大力發展基因工程藥物、抗體藥物和疫苗。建議市場個體通過生物制品新產品的研究開發、生物制品關鍵技術的開發、新生產基地的建設等作為發展生物醫藥戰略性新興產業的突破口。特別是：

1.關鍵技術平臺建設項目

建立“國家疫苗工程中心”、“國家生物疫苗重點試驗室”等具有自主知識產權的疫苗關鍵技術平臺，研究開發創新疫苗產品，為我國生物技術藥物產業發展提供源頭技術支撐。包括多糖-蛋白質結合疫苗關鍵技術；多聯多價聯合疫苗與更新換代疫苗技術；高效表達系統基因工程技術；大規模培養/發酵技術平臺等關鍵技術；并依托于上述技術平臺體系，針對嚴重危害我國人民健康、臨床急需的重大疾病，研制新的預防性疫苗，包括：ev71病毒滅活疫苗、多價輪狀病毒疫苗、脊髓灰質炎滅活疫苗、帶狀皰疹疫苗、13價肺炎結合疫苗、4價流腦結合疫苗、甲型副傷寒桿菌疫苗、mmrv聯合疫苗、麻疹乙型腦炎聯合減毒活疫苗、無細胞百白破聯合疫苗-hib聯合疫苗、人瘤病毒（hpv）疫苗、戊肝病毒疫苗、增強型重組卡介苗和前s乙肝疫苗等。

2.符合who預認證標準的疫苗生產基地

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【摘 要】通過收集和交流有關轉基因生物資料的活動，使學生們認識到：轉基因生物及其產品是科技進步的結晶，與我們的現實生活息息相關，只有科學合理的運用才能造福人類。

關鍵詞 轉基因；生物；調查

21世紀生物科學是自然科學中最活躍的學科之一。以基因工程、細胞工程等為代表的現代生物技術正廣泛地應用于醫藥、農業、食品、能源、環保、材料與環境等領域，與此相適應的是，在中華人民共和國義務教育生物學課程標準中，“現代生物技術”被列為必修的課程內容。為加深學生對現代生物技術的了解與關注，在這部分學習的活動建議中，課程標準特地明確要求“收集和交流有關轉基因生物資料，有條件的地方進行實地調查”。下面結合我校多年的教學實踐，談談這一活動的教學實施。

1.學生知識背景與情感體驗的分析

1．1知識背景分析：通過八年級上學期生物學遺傳和變異的學習，學生已經知道絕大多數生物體的遺傳物質是DNA，其分子上決定性狀的基本單位是基因。基因的遺傳是有一定的規律的。通過八年級下學期現代生物技術應用的理論學習，也知道科學家們常說的基因工程，就是按照人的意愿，運用人工方法，對生物的基因進行“移花接木”式改造的重組技術。所謂轉基因生物，就是指利用基因工程技術導入外源基因培育出的、能夠將新性狀穩定地遺傳給后代的基因工程生物，涉及到多種微生物、植物、動物。運用轉基因生物改良動植物品種，最特出的優點是能打破常規育種難以突破的物種之間的界限。

1．2情感體驗分析：僅僅通過生物課堂的理論學習，學生對轉基因生物往往有種霧里看花的感覺，覺得現代生物技術是高科技的產物，什么轉基因鼠、轉基因牛、轉基因羊、轉基因水稻、玉米、大豆等，離初中生現實生活相距甚遠，難以達到課程標準中的“關注現生物學相關的社會學問題，初步形成主動參與社會決策的意識”的情感、態度和價值觀的目標要求。

2.“收集和交流有關轉基因生物資料”活動實施的教學理念

轉基因生物及其產品已經影響到我們生活的方方面面。如果僅僅是教師在網上搜集大量的圖片、資料，通過PPT等，向學生展示，雖然用心良苦，但往往收效甚微。當今學習的方式、學習的手段、學習的情景等呈現多元化，因此有必要根據學校現有的條件，通過多種形式，組織學生收集轉基因生物的資料，交流討論，從而喚醒學生關注轉基因生物對人類社會現代和未來的影響。

3.收集與交流活動的具體組織與實施

將全班學生分為四組，每組十人左右。第一組：網絡媒體調查小組。通過互聯網，查閱有關轉基因生物的法律法規資料；第二組：市場調查組。調查本地超市、商場、連鎖店，調查所售商品有哪些是轉基因生物制作而成的。轉基因食品或用品有哪些標識；第三組：醫院藥店調查組。調查有哪些疫苗、藥品是通過轉基因生物研制的；第四組：農林牧副漁業調查組。調查目前在當地有哪些普遍種植、養殖的轉基因生物。

4.交流調查結果

第一組在收集后得知中國農業部已經批準種植的轉基因農作物有：甜椒、西紅柿、土豆；主糧作物有玉米、水稻。今后可能陸續批準的農作物有小麥、甘薯、谷子、花生等。我國為應對轉基因生物及其產品，制定了《中華人民共和國農業轉基因生物安全管理條例》。條例中規定：農業轉基因生物，是指利用基因工程技術改變基因組構成，用于農業生產或者農產品加工的動植物、微生物及其產品，主要包括：a.轉基因動植物（含種子、種畜禽、水產苗種）和微生物；b.轉基因動植物、微生物產品；c.轉基因農產品的直接加工品；d.含有轉基因動植物、微生物或者其產品成份的種子、種畜禽、水產苗種、農藥、獸藥、肥料和添加劑等產品。該項條例在農業轉基因生物的研究與試驗、生產與加工、經營、進口與出口、監督檢查、罰則等方面都作出了明確的規定。其中，中華人民共和國農業部公告第1943號就是針對轉基因棉花而專門制定的。

第二組調查結果表明進口的轉基因食品有大豆油、菜子油、大豆等。目前只有花生油不是轉基因的。麥當勞、肯德基的食品基本全部是轉基因的。

第三組調查結果表明：我國自行生產、擁有自主知識產權的醫藥藥品或疫苗有：治療糖尿病的單體速效胰島素、防治多種腫瘤及病毒感染的干擾素a-2b（安達芬）、用于血液病治療的人造血液、用于治療艾滋病等的白細胞介素、預防乙型肝炎的乙肝疫苗。

第四組調查結果表明：豬、牛、雞飼料是轉基因玉米、轉基因大豆。轉基因大豆油是用6號輕汽油浸出提取的。在我國農村，種植面積較大的作物包括抗蟲的棉花、抗病毒的油菜、抗蟲玉米、抗除草劑大豆等。

5.討論與總結

轉基因生物的優點：①轉基因技術可以把不同植物、動物的優良基因進行組合；②通過轉基因技術可培育高產、優質、抗病毒、抗蟲、抗寒、抗旱、抗澇、抗鹽堿、抗除草劑等特性的作物新品種，以減少對農藥化肥和水的依賴，降低農業成本，大幅度地提高單位面積的產量，改善食品的質量，緩解世界糧食短缺的矛盾。③利用轉基因技術生產有利于健康和抗疾病的食品；④轉基因食品可以擺脫季節、氣候的影響，讓人們一年四季都可吃到新鮮的瓜菜；⑤利用轉基因技術，把生長激素基因、高泌乳量基因、瘦肉型基因、抗病毒基因等外源基因導入動物的受精卵，可培育出生長周期短、泌乳量高，品質優良的動物。

轉基因生物的潛在危險主要有：轉基因逃逸、轉基因導致新病毒和疾病產生、加速昆蟲抗性的進化。

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免費疫苗是國家免費提供、必須接種的疫苗，有口蹄疫疫苗、豬瘟疫苗和高致病性豬藍耳病疫苗。免費疫苗主要特點是使用時間長、免疫效果好，一般是我國自行研制生產的，價格便宜。這類疫苗的選擇和使用，國家每年都出臺具體的指導意見。

自費疫苗是養豬者自費、自愿接種的疫苗，其中病毒類疫苗包括豬偽狂犬病疫苗、圓環病毒病疫苗、豬細小病毒病疫苗、病毒性腹瀉疫苗、日本乙型腦炎疫苗；細菌類疫苗包括豬傳染性胸膜肺炎疫苗、仔豬大腸桿菌病疫苗、豬氣喘病疫苗、副豬嗜血桿菌病疫苗、豬鏈球菌病疫苗、豬肺疫疫苗、豬丹毒疫苗、仔豬副傷寒疫苗等。自費疫苗的特點是免疫效果好，副作用小，部分疫苗由國外進口，制作工藝優良，但使用時間較短，價格較貴。目前，國家對自費疫苗選擇與使用尚無明確的指導意見，那么，如何科學地選擇和使用自費疫苗呢？

1. 自費疫苗的選擇

自費疫苗應根據本地區以及本場傳染病的流行情況，有針對性選用，宜少不宜多。病毒性疫病如豬偽狂犬病、豬圓環病毒病、豬乙型腦炎、豬細小病毒病的疫苗可優先選用，但對細菌性疫病如豬肺疫、豬丹毒、仔豬副傷寒、鏈球菌病的疫苗，只有在本地區或本場發過病后才要考慮選擇使用。此外，要選擇與當地流行疫病病原相同血清型的疫苗。許多病原有多種血清型或基因型（如豬胸膜性肺炎放線桿菌生物Ⅰ型共有13個血清型、生物Ⅱ型有2個血清型，豬副嗜血桿菌血清型達15個以上，大腸桿菌的菌體抗原有100多個血清型），疫苗不對型，免疫得再多也不能使豬群產生均勻有效的抗體，不能抵御疾病的攻擊。

自費疫苗種類主要有弱毒活疫苗、滅活疫苗、基因缺失疫苗、多價疫苗、聯合疫苗等。目前普遍應用且效果較好的自費疫苗主要有：豬偽狂犬病病毒gE基因缺失苗，豬圓環病毒Ⅱ型滅活疫苗，豬傳染性胃腸炎和豬流行性腹瀉二聯滅活疫苗，豬傳染性胃腸炎和輪狀病毒二聯活疫苗，豬細小病毒病滅活疫苗，日本乙型腦炎活疫苗，豬大腸桿菌基因工程四價滅活疫苗，豬大腸桿菌基因工程三價滅活疫苗，豬大腸桿菌基因工程二價滅活疫苗，副豬嗜血桿菌病油乳劑滅活苗，豬喘氣病滅活疫苗，豬傳染性胸膜肺炎多價血清滅活疫苗，豬敗血性鏈球菌病活疫苗和豬鏈球菌多價滅活疫苗。

對疫病監測陰性場最好用滅活疫苗，疫病監測陽性場最好用活疫苗，慎用有爭議的活疫苗。針對某一疾病，豬場僅能使用某一廠家的1種活疫苗，避免使用兩個和兩個以上廠家的活疫苗。不同廠家基因缺失苗也不能在同一個豬場使用。慎用飼料經營企業免費贈送的疫苗。不用非法生產、非法進口等來源不明的疫苗，嚴禁使用無批準文號的疫苗。

2. 自費疫苗的使用

疫苗保管與使用前必須認真閱讀說明書，掌握疫苗特點、用途、瓶裝量、稀釋液、稀釋液的使用量、使用劑量、接種方法、注意事項等。活疫苗要冷凍運輸和儲存，滅活苗要求在2～8℃保存，切忌冷凍。

首次使用某種疫苗時，應選擇一定數量的豬進行小范圍試用，觀察3～5天，確認無明顯副作用或有確切效果時再全群接種。

接種疫苗前，要確保豬只健康、疫苗合格。被免疫豬只必須健康無病，對于發熱、患病（包括恢復期）、過度瘦弱、食欲不振以及剛去勢的豬不宜接種疫苗，否則會加重病情或造成死亡。為確保疫苗合格，凡未按要求保存、過期、無標簽、疫苗瓶有裂紋、瓶塞松動、失真空（稀釋疫苗時不自動吸水）、出現分層的，一律禁用。

使用疫苗時，要規范免疫操作。①選好接種方法和部位。接種疫苗通常可采用皮下或肌內注射，皮下注射部位在耳部與頭部連接部位皮下，采用較短的針頭（15～20毫米）；肌內注射時采用耳根后部肌肉深層接種，根據豬的體重選擇不同長度的針頭（仔豬用l5毫米，母豬用40毫米）。但要注意的是，豬傳染性胃腸炎、流行性腹瀉二聯活疫苗或滅活苗，必須后海穴注射，進針深度3日齡仔豬為0.5厘米、成年豬為4厘米，肌內注射無效；偽狂犬病基因缺失活疫苗對仔豬采用滴鼻接種，免疫效果更好。②做好免疫接種操作。注射器、針頭逐一沖洗后煮沸消毒10分鐘，而不能用化學消毒劑處理，否則殘留的消毒劑會使弱毒苗失活。抽取疫苗時，可用一滅菌針頭插在瓶塞上不拔出，對準針管直接抽藥，絕不能用已給豬注射過的針頭吸取疫苗，以防污染整瓶疫苗。疫苗稀釋后，15℃以下4小時、15～25℃時2小時、25℃以上1小時內必須用完。

篇9

關鍵詞：基因工程；教學改革；探索

中圖分類號：G642.41 文獻標志碼：A 文章編號：1674-9324（2015）03-0119-02

基因工程又稱為基因拼接或者DNA重組技術，是將一種生物體（供體）的基因與載體在體外進行拼接重組，然后轉入另一種生物體（受體）內，使之按照人們的意愿穩定遺傳并表達出新產物或新性狀的DNA體外操作程序。1972年美國人Berg在基因工程基礎研究方面做出了突出貢獻，被公認為“基因工程之父”。1973年美國人Cohen等用核酸限制性內切酶EcoRI，首次基因重組成功。近些年來，基因工程的新概念、新理論及新技術不斷涌現，內容也在不斷豐富與充實，已廣泛應用于生命科學的各個領域[1，2]。21世紀以來，基因組學已進入功能基因組學時代，對基因功能的研究是生物技術發展的新方向，體現了基因工程的重要價值所在。基因工程學作為當代生命科學研究領域最具生命力、最引人關注的前沿學科之一，已經發展成為現代分子生物學、技術學的核心內容，其課程質量的好壞直接關系學生的專業素質和創新能力的培養。作者所在學院（浙江海洋學院海洋科學與技術學院）于2007年新增了生物技術專業，同時開設了基因工程課程。為了不斷提高該課程的教學水平，筆者結合這幾年的教學經驗以及兄弟院校相關課程的授課經驗，努力充實教學內容，不斷更新教學手段，對基因工程課程的教學體系進行了探索式改革。

一、教學內容

1.不斷更新教學內容，突出實用性。基因工程理論作為一種專業性很強的課程，需在學生有一定生物學知識的基礎上教學。在浙江海洋學院本課程于大三下學期開課，在此之前學生已修完細胞生物學、分子生物學、遺傳學等生物學基礎課程，具備了較完整的理論知識體系，在此基礎上開展教學，有利于學生對知識的理解和掌握。基因工程作為一種技術性很強的課程，與上述生物學基礎課程關系密切，同時與酶工程、蛋白質工程、細胞工程等學科緊密聯系，存在一定的內容重復。在教學過程中，對于此類重復，或一筆帶過，點到為主，或采用實例對重要知識加以鞏固，盡量避免重復，突出課程特色。教材是提高教學質量的重要環節，浙江海洋學院第一次即2010年選用的《基因工程》教材由高等教育出版社出版，孫明教授主編。該教材內容全面翔實、章節清晰，對基因工程的原理、策略和技術方法均有系統介紹，具有很強的理論性和前瞻性。但是其內容較多，很多內容對于二本院校本科生來講過于深奧、難以理解，學生也反映該教材較難，建議選其他較易理解的教材。結合該院校是二本院校的實際，筆者從2011年開始使用袁鶩洲主編，化學工業出版社出版的《基因工程》，屬普通高等教育規劃教材。本教材為國家精品課程教材，主要介紹了基因工程的基本概念、基本原理、常用基因工程操作技術以及基因工程與功能基因組學相結合的技術應用進展。主要內容包括三大塊。一是基因工程的基本原理與基本技術，包括工具酶和克隆載體。表達載體及常用的基因表達系統，目的基因獲取、制備、擴增、導入與鑒定的各種方法。二是基因工程在功能基因組學研究中的應用，包括基因表達譜的研究技術，全基因組化學誘變、轉座子飽和誘變的技術，基因敲除與基因敲減的技術，GAL4/UAS過表達系統，酵母雙雜交及免疫共沉淀等蛋白質相互作用研究的技術等。三是基因工程在工農業生產中的應用，包括轉基因植物、轉基因動物的制備與應用，基因治療的原理與策略以及基因工程藥物的研制與現狀等。該教材內容清晰易懂，實例舉證充分，且涉及基因工程在實際生產中的應用，在一定程度上可以提高學生的學習興趣。使用該教材3年來，目前感覺學生反映較好，適合該校學生使用。

2.引領學生了解前沿動態。基因工程作為一門前沿學科，發展速度快，內容日新月異。我們常用教材多側重原理、基礎等理論知識，且更新速度始終落后于基因工程技術本身的發展速度。現代學生思維活躍，求知欲強。為了充分滿足學生的求知欲和好奇心，在基因工程教學過程中，盡可能地添加一些新成果、新理論和新技術[3]，如：生物能源，基因工程疫苗的開發，基因治療等，并結合自己在國外實驗室所學向同學們展示最新技術與相關研究進展。基因工程的新技術多發表于Science、Nature、Cell等頂尖雜志，在教學過程中，對于發表的經典新成果，嘗試讓學生自己閱讀、分段翻譯、小組討論，增加對新知識的了解[3]。一些重要的生命科學論壇，如：生物谷、丁香園、小木蟲等是生命科學領域研究人員交流學習的地方，而知識的碰撞最容易產生科學的火花。因此，鼓勵學生瀏覽這些論壇，并參與討論，增強學習興趣。另外，也鼓勵他們加入相關的QQ群，比如轉基因群、生物信息群，增加同業交流，為自己拓寬理論知識和解決實際技術問題，同時也為今后從事的相關工作打下堅實基礎。

二、教學手段和教學方法多元化

不像動物學、植物學可以直觀地看到實物，基因工程內容抽象，多涉及細胞、分子等微觀內容，且高新技術多，操作流程長，如果僅僅采用文字和語言表述，難以講授明白，學生學起來也比較晦澀難懂[4]。因此，需要運用多種教學方法，使概念、原理講得通俗易懂，學生理解起來就更容易。

1.多媒體教學的應用。目前，大部分高校已廣泛采用多媒體教學。在基因工程多媒體教學過程中，改變原來單純的文字、圖片等內容，不斷嘗試加入一些聲音、錄像、動畫等信息，使課堂圖文并茂、有聲有色、栩栩如生，便于學生理解并強化記憶。如在講解“PCR反應”一節中，自己錄取了PCR的準備、操作以及電泳檢測等全套過程，老師講得省心，同學們聽得舒心，極大提高了基因工程課程的教學效果。

2.小組討論式教學。有價值的討論是促進學生開動腦筋、舉一反三、加深認識的有效手段。在遇到抽象內容時，講解完畢后，鼓勵學生分組討論，并選出一名組長上講臺以PPT的形式匯報本小組的學習心得，組長實行輪換制。下面的同學給匯報的小組分別從以下幾方面打分：匯報PPT的表現，制作PPT的質量，所講內容的條理性、創新性以及講解能力。通過此手段，極大調動了學生的學習積極性。例如，可引導學生討論以下專題：①轉基因動物；②中國的轉基因水稻；③基因工程產品的安全性；④基因治療。

三、改革實驗教學、科研項目與課程教學相結合

本校基因工程實驗是在大三結束后的暑假短學期開展的，共16學時，這時學生已上完基因工程理論課，具備了實驗操作的相關理論知識。實驗內容至關重要，是理論知識的綜合運用。那么如何選擇實驗內容呢？這一點比較關鍵。授課教師多具有博士學位，承擔著較高水平的科學研究工作。在基因工程教學過程中，嘗試將實驗內容和教師的科研項目相結合，讓學生自主參與到科研項目的研究中。學生可根據教師的科研項目自主確定實驗課程內容，從實驗內容的選擇，到實驗方案的設計、試劑的購置、實驗步驟的進行等都由學生自主完成，老師在此過程中起指導作用。筆者將課題“曼氏無針烏賊微衛星富集文庫的構建”分解成幾個小實驗，包括PCR擴增、瓊脂糖凝膠電泳、限制性內切酶酶切反應、載體連接、感受態細胞的制備及轉化、藍白斑篩選與鑒定、測序、序列分析和引物設計等，指導學生進行整個流程實驗，使其知識更具有系統性、完整性。此外，還可鼓勵學生申報省級或校級的大學生創新項目，由筆者指導的“轉基因綠色熒光觀賞魚開發技術探索”以及“青魚β-actin基因的啟動子功能初步檢驗”分別獲得省級可喜獎項，這個實驗培養了學生的創新能力及今后獨立從事科研的能力。

四、試探采用雙語教學

現代高素質專業人才不僅要具備高水平的專業知識，還應具備高水平的專業外語閱讀與寫作能力。為適應學科發展趨勢，并擴充學生的英語專業詞匯，培養英語思維模式，在基因工程教學過程匯總嘗試進行雙語教學[5]。在教學上，以中文課件為主，主要的專業詞匯用英文標注，時而用英文講解，盡量創造雙語教學環境。并且鼓勵學生借閱相關的英文教材，例如，在國際上使用廣泛，權威性和時代感強的英文教材《Principles of gene manipulation and genomics》（7th ed）作為教學參考書。

簡而言之，經過幾年的努力工作，浙江海洋學院在基因工程課程的教學內容方面進行了優化，改進了教學方法與手段，培養了實驗設計能力和創新意識，拓展了他們的知識面，取得了不錯的效果。然而，課程教學改革是一項系統工程，目前還處于探索和實踐階段，必須堅持不斷地探索、實踐、總結，最好建立一支教學團隊，希望把基因工程課程教學改革工作開展得更有效果，為國家輸送更多高素質的專業人才。

參考文獻：

[1]孫明.基因工程[M].北京：高等教育出版社，2006：1-6.

[2]李立家，肖庚富.基因工程[M].北京：科學出版社，2004：1-8.

[3]張傳博，李莉，耿紅衛.基因工程課程教學改進與實踐[J].安徽農業科學，2013，（04）.

篇10

［摘要］豬瘟是由豬瘟病毒引起的危害極大的一種傳染病，具有高度的傳染性和致死性，利用疫苗控制該病的流行是世界各國使用的廣泛策略。E2亞單位疫苗具有安全性好、穩定性強的特點，且具有自然感染和接種疫苗的抗體差異，是未來新型疫苗研究的方向之一。本文綜述了E2亞單位疫苗的保護效力、影響因素及未來發展方向。

［關鍵詞］豬瘟；E2糖蛋白；亞單位

疫苗豬瘟（Classical swine fever，CSF），也稱“爛腸瘟”，是一種由豬瘟病毒引起的傳染性極強的病毒性疾病，臨床上表現為急性、亞急性、慢性或溫和型等形式，也可以呈現亞臨床形式感染，是危害養豬業健康發展的主要傳染病之一。控制CSF流行的主要策略是系統化的預防接種和非疫苗的防控措施如消毒、檢疫、隔離、無害化處理等，其中疫苗的使用一直受到世界各國的廣泛重視。弱毒疫苗如我國科學家研制的豬瘟兔化弱毒疫苗，對該病的控制起到了很大的積極作用。日本由于改良活疫苗的使用，在1993和2003年之間沒有爆發CSF［1］。然而，單純依賴MLV疫苗接種來消除豬瘟面臨一定的困難，因為動物在自然感染和接種疫苗（MLV）產生的抗體差異即血清學DIVA是很難區分的，這就影響臨床工作中的快速篩查和國際貿易。為了克服這個問題，歐盟在1999年開始大規模試驗研究E2蛋白亞單位疫苗，并且成功誘導免疫豬產生抗CSF的免疫保護［2］。

1CSFV的致病機理

豬瘟最常見的感染途徑是經呼吸道感染，當動物口鼻接觸CSFV后，病毒在扁桃體開始復制，感染上皮細胞、巨噬細胞、淋巴細胞和內皮細胞，然后擴散到其他淋巴結。高致病性病毒可迅速分布整個身體，病毒組織中含量更高，可誘導更嚴重的病理變化［3］。在急性病例中，CSF可引起全身出血和免疫抑制，其作用機制是通過下調細胞因子和免疫細胞，包括內皮細胞、淋巴細胞、單核／巨噬細胞和骨髓造血干細胞（骨髓）等來實現的。豬瘟病毒可以誘導內皮細胞壞死，引起血管炎和出血，并伴有嚴重的貧血、血小板減少及干擾纖維蛋白原的合成，從而引起全身性出血。骨髓和B淋巴細胞、粒細胞、T淋巴細胞的減少和壞死可引起免疫抑制。豬瘟病毒通過線粒體跨膜電位和Erns蛋白直接或間接誘導的淋巴細胞凋亡。此外，豬瘟病毒可以誘導TNF－α的產生，促進B淋巴細胞的凋亡。

2E2亞單位疫苗的保護效力

E2包膜糖蛋白是豬瘟病毒的主要保護性抗原，在CSFV感染時誘導中和抗體的產生，E2蛋白已被證明是一個最有效的免疫原［4］。經過深入的研究，重組E2蛋白亞單位疫苗已經商業化，比如BAYO－VACR和PorcilisR。從接種后14d到13個月，該疫苗足以提供有力的免疫保護［5－6］。然而，單劑量疫苗在免疫接種第7天不能提供保護，在第10天有部分保護作用［5］。在第21d，疫苗誘導產生中和抗體，持續6個月［6］。有報道稱，在疫苗接種后14d，可以完全阻止病毒傳播［7］。病毒疫苗株因基因同源或異源存在免疫效力的差異，單次疫苗接種后可以在10d、14d防止病毒水平傳播并維持6個月的保護力，也有報道稱疫苗接種后21d防止病毒水平傳播［5－6，8］。E2亞單位疫苗可以減少垂直傳播，但不能完全預防垂直傳播。在疫苗首次免疫之后可以發生母嬰傳播，即使二免之后仍可以發生母嬰傳播［9］。E2亞單位疫苗接種后，存在感染和接種差異，即DIVA，這種優勢有利于快速篩查受感染的豬，幫助控制和消除CSF［4］。

3影響保護效力的因素

3．1E2糖蛋白抗原結構和抗原表位研究

E2抗原結構和抗原表位具有重要意義，可以為疫苗的改進提供科學依據。研究者基于E2蛋白抗原表位的預測人工合成了多肽Pep1和Pep2，進一步的研究表明Pep1具有很好的反應原性和免疫原性［10］。科學研究表明E2糖蛋白具有四個抗原結構域即B／C／D／A，所有結構域位于E2糖蛋白N－末端的一半［11］。結構域A又被分為A1、A2和A3，E2的非保守表位位于B／C。其中，A1抗原亞區位于E2蛋白791～858位氨基酸區域。科學研究揭示了E2抗原結構模型，結構域B／C是由C693和C737之間的二硫鍵固定，A／D域由兩個二硫鍵形成：一個是在C792和C856之間；另一個在C818和C828之間。在結構域B／C中，753RYLASLHKKALPT765和771LLFD774對維持構象表位的結構完整性是必不可少的［12］。

在B／C中，E713和D729決定基因型2和3型毒株的抗原特異性；D705和K761決定基因1型LPC疫苗株的抗原特異性［13］。在D／A結構域中，R845決定基因型1和3的抗原特異性［11］。具有抗原決定作用的構象表位E902，決定基因型1和2的抗原特異性，存在于C－末端區［11］。E2糖蛋白具有幾個重要的線性表位抗原，比如在772LFDGTNP778中的線性表位抗原。在結構域A中，一個高度保守的中和線性表位抗原829TAVSPTTLR837通過使用單克隆抗體（mAb）WH303進行了鑒定，已被用于基于表位的疫苗開發［14－17］。該單克隆抗體WH303已使用廣泛的免疫組化標記，但WH303具有MLV病毒標志抗原，因此不能用于DIVA，不能進行快速篩查。在E2C端區域，研究發現具有一個病毒線性表位995yyep998之間高度保守的結構［11］。亞單位疫苗表現為非復制單抗原，以單體或二聚物的形式存在，不是錨釘在病毒包膜。像其他蛋白質一樣，注射E2抗原的量在接種后將隨時間而發生衰減，所以在臨床實踐中，都需要二次疫苗接種。

3．2母源抗體的影響

研究發現，3周齡的仔豬母源抗體含量最高；在5或7周齡第一劑量亞單位疫苗，4周后加強亞單位疫苗免疫接種的仔豬具有很高的中和抗體［18］。在2周齡（即仍具有母源抗體時）接種疫苗，機體產生的抗體效價顯著低于3、6個月后仔豬抗體的滴度［19］。

3．3抗原性差異的影響

兩種商業化的豬瘟病毒E2亞單位疫苗來源于布雷西亞毒株基因型1．2和AlfortTübingen基因型1．1。但是，有研究表明，在大多數歐洲和亞洲國家，自然分離獲得的CSFVs已經從原來的基因型1或3變異成基因型2［20］。在我國，疫苗病毒的基因型與目前流行的病毒基因型也存在一定的差異［21］。豬瘟病毒的基因型特異性血清，與外源E2蛋白結合的有效性比同源的E2蛋白低，表明在CSFVs中E2的差異對交叉中和作用至關重要［22－23］。基因序列的改變可能導致E2糖蛋白結構的變化，因此弄清楚亞單位疫苗和豬瘟流行病毒株之間的交叉保護問題至關重要。然而，目前生產的兩個商業化CS－FVE2亞單位疫苗（基因型1．1和1．2）對異源菌株如帕德博恩（Paderborn）基因型2．1不能提供完全保護。不同基因型的病毒的抗原性變異可以通過交叉中和試驗進行評價，同源毒株之間的NT抗體顯著高于異源毒株。

總之，這些研究表明，不同基因型的毒株之間間存在抗原差異，從而影響免疫保護效果。活病毒或重組E2蛋白可以誘導機體產生抗體，這種抗體中對基因同源毒株的作用優于對異源毒株的作用，由活病毒引起的抗體滴度比重組蛋白高。血清交叉中和顯示基因同源株比異源株高，這種差異與單克隆抗體的氨基酸差異有關。豬瘟病毒不同基因型間的抗原變異通過豬瘟病毒特異性單克隆抗體的不同反應模式被證實［22－23］。E2特異單克隆抗體對同源菌株具有很好的結合和中和作用［22－23］。研究表明，B／C結構域中H710，H724，N725，D729，K734，M738的單點突變和D／A結構域中T823，P833，T834，R837的單點突變可以導致中和單克隆抗體結合性質的喪失。在710位置的氨基酸殘基可以影響單克隆抗體的結合和中和［24］。在B／C結構域的D705，E713，D729和K761殘基、在A結構域的R845殘基，以及在C－末端區域的E902殘基是基因型1，2或3的抗原特異性的關鍵因素［11，13］。最近研究表明，基因型2的E2蛋白抗原區變異可以影響血清反應性，其中E37N和V45Q兩個位點置換具有顯著影響，其可能與E2蛋白的構象變化密切相關［25］。

4小結

4．1E2亞單位疫苗的優勢

E2亞單位疫苗僅含病毒的保護性抗原，不含病毒的其他組成成分，不包含遺傳信息，因此與活疫苗相比具有安全性好、穩定性強的特點，在生產工藝上無需進行滅活處理。在臨床應用時存在一個很大的優勢，接種后具有感染和接種的差異性，即DIVA，是典型的DIVA疫苗，從而有利于臨床實踐中的快速篩查。Erns和NS3ELISAs可以用于檢測E2亞單位疫苗，chekitR比priocheckR豬瘟病毒的敏感性較高［4］。4．2面臨的挑戰E2亞單位疫苗保護效果差，低于MLV，研究表明，中國株疫苗比E2疫苗能提前1～2周建立有效的群體免疫。除此之外，E2亞單位疫苗不能完全預防垂直傳播，有報道稱，在疫苗首次免疫之后可以發生母嬰傳播，即使二免之后仍可以發生母嬰傳播［9］。在免疫反應方面，E2亞單位疫苗只能誘導抗體反應，免疫原性比較低，通常需要采用相應的方法如佐劑或載體等。而且E2亞單位疫苗的生產成本比常規疫苗高，這也給該疫苗大規模的商業化生產和推廣應用帶來一個難題。另外，豬瘟病毒變異毒株的產生是豬瘟控制面臨的難題之一，E2亞單位疫苗如何應對豬瘟病毒基因型變異也是不得不面臨的一個挑戰。

4．3未來發展趨勢