基因重組范文
時間：2023-03-23 01:12:48
導(dǎo)語：如何才能寫好一篇基因重組，這就需要搜集整理更多的資料和文獻(xiàn)，歡迎閱讀由公務(wù)員之家整理的十篇范文，供你借鑒。
篇1
說起“電蟒云音響”這款產(chǎn)品，可以說是電蟒科技一群滿懷互聯(lián)網(wǎng)情懷的“大叔”們歷經(jīng)三年潛心研究的成果，也是這群人嘗試跨界整合，用互聯(lián)網(wǎng)思維的方式，對音響市場、產(chǎn)品、企業(yè)價值鏈乃至整個商業(yè)生態(tài)進(jìn)行重新審視，并集成大數(shù)據(jù)分析技術(shù)，為“不將就”的用戶們打造一個“越聽越懂你”的智能音樂平臺。
“6月舉行會，7月開始于京東接受預(yù)約，到7月16日為止，半月時間內(nèi)電蟒云音響的預(yù)約數(shù)量達(dá)到樂51萬臺。”電蟒科技首席營銷官蔡偉杰說。《執(zhí)行官》也為電蟒云音響算了一筆賬：按照1999元一臺計算，51萬臺意味著10.6億元的銷售！而在京東數(shù)碼產(chǎn)品當(dāng)月的預(yù)約量排行榜看，第一名是華為的某款手機，第二名則是中興某款手機，而電蟒云音響緊隨其后。
對于這款產(chǎn)品為何受到市場如此熱捧，電蟒科技董事長趙輝曾對“電蟒云音響到底賣給誰”做了回應(yīng)：“人在面對事情時，分三種本質(zhì)：不將就、將就、猶豫。對于音樂需求，我們不考慮給猶豫的人做產(chǎn)品，搞來搞去不知道要什么，也不考慮給將就的人做產(chǎn)品，而這個市場很大，例如低端的藍(lán)牙音響、多媒體音響等，很多人已經(jīng)做得很好了，我們就不要做小三了，我們只能為一種人做產(chǎn)品，就是不將就的人。”
好產(chǎn)品，不將就
電蟒的故事開始于2011年。喜馬拉雅廣告董事長趙輝跟國光電器的高管開始探討音響的發(fā)展，“如果我們可以把音響和音樂內(nèi)容結(jié)合一起，甩掉播放器，那一定是一款很震撼的產(chǎn)品。”作為喜馬拉雅廣告的創(chuàng)始人，趙輝服務(wù)家電業(yè)十多年，深知行業(yè)發(fā)展之道。趙輝的想法與國光電器一位高管的想法一拍即合，便開始了這款顛覆性音響的嘗試。
3年前，以互聯(lián)網(wǎng)電視為突破口的互聯(lián)網(wǎng)產(chǎn)品的概念開始興起。對于第一代的電蟒音響，純屬于機緣巧合之做，或者說是整合資源的結(jié)果。電蟒科技首席營銷官蔡偉杰也對《執(zhí)行官》表示，現(xiàn)在推出的電蟒云音響已經(jīng)是他們團(tuán)隊的第四代產(chǎn)品了。
“在之前的三代，第一代音質(zhì)好，但是Linux系統(tǒng)兼容和擴(kuò)展性差，系統(tǒng)體驗不好，被否定了；第二代系統(tǒng)使用安卓，卻沒有顯示屏幕；第三代有屏幕，體驗也好，但是觸控屏位置體驗差，原木外觀不接地氣，也被否定了；直到現(xiàn)在成型的鋁合金，過程中廢棄了上百萬的模具，應(yīng)用現(xiàn)成的控制方案不易用，就自己開發(fā)了C-Play播放平臺。”蔡偉杰說，當(dāng)時產(chǎn)品在第四代的時候，因為考慮到年輕人是否喜歡的問題，單是內(nèi)部測試就征集了800多個年輕人的建議。“互聯(lián)網(wǎng)產(chǎn)品需要突出‘人’，如果電蟒的使用需要復(fù)雜的過程才能實現(xiàn)，那么就是失敗的。”
據(jù)說，騰訊高級執(zhí)行副總裁在試用電蟒云音響的軟件體驗和發(fā)燒音質(zhì)后，對其有著極高的評價。電蟒云音響作為新的品類卻可以得到熱捧，的確有著其差異化優(yōu)勢的一面。“從產(chǎn)品上看，沒有一家企業(yè)在做云音響，因為同行都在做手機WIFI音響。而電蟒云音響不用連接手機或者其他播放器，一個音響滿足用戶所有播放需求。”作為一款智能化產(chǎn)品，電蟒的體驗性、友好性優(yōu)勢十分突出。“電蟒的試用跟手機的使用一樣，非常容易操作，甚至不需要說明書。”蔡偉杰認(rèn)為，電蟒在技術(shù)產(chǎn)異化、尖叫的價格和音質(zhì)上贏得了市場的青睞，做到了“alin one”。
先后3年時間，從“大叔”可以接受的木質(zhì)音響，到年輕人可以接受的金屬造型，電蟒的音質(zhì)也隨著技術(shù)的成熟而不斷改進(jìn)。“互聯(lián)網(wǎng)產(chǎn)品就是實現(xiàn)客戶的‘尖叫’，這也是互聯(lián)網(wǎng)產(chǎn)品的核心。”董事長趙輝說。
對于“電蟒”的名字由來，也頗具互聯(lián)網(wǎng)味道。“我們的產(chǎn)品在功能和外觀上可以讓人尖叫，但是名字卻太過普通。現(xiàn)在的互聯(lián)網(wǎng)品牌不是水果就是動物，于是我們想到了‘電蟒’，令人過目不忘。”對于“天韻”這個“好聽不好記”的名字，被這群“大叔”果斷放棄了。于是，第四代音響產(chǎn)品正式命名為“電蟒”。
作為電蟒科技的主導(dǎo)方喜馬拉雅廣告公司，在傳統(tǒng)家電行業(yè)服務(wù)了多年，積累了深厚的基礎(chǔ)。因此除了國光電器外，電蟒的背景也確實強大，不僅有廣晟資產(chǎn)、同方股份、喜馬拉雅廣告從研發(fā)到制造到組裝做一個強有力的技術(shù)支持，還有180萬首的云內(nèi)容、DRA和DPS技術(shù)、智能軟硬件都使電蟒創(chuàng)造了一個比蘋果更純粹的閉環(huán)系統(tǒng)，更別說純藍(lán)牙智能音響B(tài)OSE，JBL之類的音響了。“他們所謂的自有ALL IN ONE云音響生態(tài)系統(tǒng)可稱得上絕對的自產(chǎn)。”一位音響界人士如此評論電蟒。
從2011年開始，一批技術(shù)公司的加入，讓電蟒擁有了核心的技術(shù)能力。“任何數(shù)字音樂都有音質(zhì)和壓縮的難題，為了保證音質(zhì)和音頻細(xì)節(jié)的高質(zhì)量，我們邀請了國內(nèi)最成功的數(shù)碼公司加入。”蔡偉杰說，“華為的優(yōu)勢在于有自己的核心技術(shù)，這是其他國產(chǎn)品牌手機無法比擬的。電蟒在成立之初也考慮到核心技術(shù)的問題，所以才想到了基因重組的方法，把最頂級企業(yè)的整合到供應(yīng)鏈中。”
據(jù)了解，電蟒云音響之所以品質(zhì)穩(wěn)定，有賴于這些傳統(tǒng)制造業(yè)龍頭企業(yè)的支持。“因為供應(yīng)鏈不存在問題，核心技術(shù)我們也掌握了，制造能力也很強大。對于我們基因中的傳統(tǒng)老牌企業(yè)，工藝領(lǐng)先，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定可靠，這樣生產(chǎn)的產(chǎn)品才可以說互聯(lián)網(wǎng)產(chǎn)品。真正的互聯(lián)網(wǎng)產(chǎn)品不是尖叫一下，而是讓消費者尖叫一輩子！”蔡偉杰說。
篇2
【關(guān)鍵詞】基因重組 染色體 轉(zhuǎn)化
高中生物關(guān)于基因重組，有這樣的定義：基因重組是指在生物體進(jìn)行有性生殖過程中，控制不同形狀的基因的重新組合。這樣的定義是依據(jù)高中學(xué)生的知識水平及教材的篇幅而給出的，雖說這句話本身不錯，但作為定義，卻又失嚴(yán)謹(jǐn)性和科學(xué)性，他易給高中生帶來片面的理解。
基因重組是自然界普遍發(fā)生的一種遺傳現(xiàn)象，它可發(fā)生在同種生物之間，也可發(fā)生在有一定關(guān)系的異種生物之間，且隨科學(xué)水平提高，人們可以打破物種間的限制，在人工條件下實現(xiàn)不同物種間的基因重組。因此，基因重組按其發(fā)生原因大致分為自然界的基因重組與人工條件下的基因重組兩大類。
一、自然界的基因重組
自然界發(fā)生的基因重組非常復(fù)雜，有同種生物間的基因重組，有不同種生物間的基因重組，有病毒與原核生物及真核生物間的基因重組。
1.真核生物的基因重組。高中生物學(xué)重點講述了有性生殖中的基因重組，主要表現(xiàn)在減數(shù)分裂時同源染色體間交叉時互換及非同源染色體間自由組合中的基因重組，它是導(dǎo)致同種生物多樣性的主要原因。
2.原核生物的基因重組。在原核生物中，其基因重組的方式主要有轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)和接合幾種形式。
（1）轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化是受體菌直接吸收來自供體菌DN段，通過交換，把它整合到自己的基因組中，在經(jīng)過復(fù)制使其變成一個轉(zhuǎn)化子，它是同種或異種菌株間存在的普遍現(xiàn)象。
（2）轉(zhuǎn)導(dǎo)。通過完全缺陷或部分缺陷噬菌體的媒介，把吧供體細(xì)胞DNA小片段攜帶到受體細(xì)胞，通過交換和整合，從而使后者獲得前者部分遺傳性狀的現(xiàn)象稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)。轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象在原核生物中普遍存在，在低等生物進(jìn)化中，是一種產(chǎn)生新基因組合的重要方式。
3.轉(zhuǎn)座導(dǎo)致基因重組。在原核生物和真核生物中，還存在轉(zhuǎn)座現(xiàn)象，它是由可移位因子介導(dǎo)的遺傳物質(zhì)重排現(xiàn)象。轉(zhuǎn)座中轉(zhuǎn)座單位稱轉(zhuǎn)座子，存在于DNA上并可自主復(fù)制與位移，根據(jù)轉(zhuǎn)座中轉(zhuǎn)座子是否復(fù)制把它分為復(fù)制型轉(zhuǎn)座子與非復(fù)制型轉(zhuǎn)座子，前者是通過復(fù)制而拷貝一個新的轉(zhuǎn)座子，而將原始轉(zhuǎn)座子常留在原來位置，拷貝轉(zhuǎn)座子出現(xiàn)于新位點而導(dǎo)致基因的重組；后者是不經(jīng)復(fù)制，原始轉(zhuǎn)座子作為一個可移動實體直接被移到新位點，同樣導(dǎo)致基因重組。
轉(zhuǎn)座作用發(fā)生頻率低，但生物學(xué)意義很大，可說明細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)許多基因缺失或倒轉(zhuǎn)現(xiàn)象，轉(zhuǎn)座現(xiàn)象出現(xiàn)于細(xì)菌、酵母、果蠅和玉米等不同生物中，導(dǎo)致這些生物體基因組中基因數(shù)目不固定。
二、人工條件下的基因重組
自然界的基因重組是生物體在長期進(jìn)化過程中經(jīng)過自然選擇過程而形成的，它體現(xiàn)在同種生物之間和有一定關(guān)系的不同生物之間。但隨科學(xué)水平的提高，人們已能超越生物體在長期進(jìn)化中形成的基因重組，按人們的意愿來實現(xiàn)多數(shù)生物在自然界所不能完成的基因重組。
1.原生質(zhì)體融合導(dǎo)致基因重組。通過人為方法，使遺傳性狀不同的兩細(xì)胞的原生質(zhì)體發(fā)生融合，并進(jìn)而發(fā)生遺傳重組以產(chǎn)生同時帶有雙親性狀的、遺傳性穩(wěn)定的融合子的過程，成為原生質(zhì)體融合。現(xiàn)在原生質(zhì)體融合的重組頻率已大于1/10，可在屬間、種間甚至更遠(yuǎn)緣的微生物或高等生物等生物體的細(xì)胞間實現(xiàn)融合，從而達(dá)到基因重組。
2.各種人工育種中體現(xiàn)基因重組。隨著科技水平的提高，自然界不能結(jié)合的異種性細(xì)胞，在人工條件下，使其結(jié)合而達(dá)到培育新品種的目的，這一切都是基因重組的結(jié)果。例如，無芒抗病類型水稻及三倍體西瓜的產(chǎn)生。誘變育種是通過基因突變而實現(xiàn)，因其產(chǎn)生新基因，相對于鄰近基因也發(fā)生了基因重組。例如，“黑農(nóng)五號”“衛(wèi)星87—2青椒”“航宇1號水稻”“豫麥13”的產(chǎn)生。
3.基因工程導(dǎo)致基因重組。基因工程是人們在分子生物學(xué)理論指導(dǎo)下的一種自覺的、可事先設(shè)計與控制的育種新技術(shù)，是人工的、離體的、分子水平上的一種遺傳重組的新技術(shù)，是一種可完成超遠(yuǎn)緣雜交的育種新技術(shù)。基因工程中有條件作為載體的，對原核受體細(xì)胞，有細(xì)菌質(zhì)粒與噬菌體兩類；對真核動物細(xì)胞，主要有SV40病毒；對植物細(xì)胞來說，主要是Ti質(zhì)粒。其中目的基因與載體DNA在體外完成重組，形成一個完整有復(fù)制能力的環(huán)狀重組載體—嵌合體，然后導(dǎo)入相應(yīng)的受體細(xì)胞。
篇3
【關(guān)鍵詞】 乙型肝炎病毒；，RNA干擾；，腺病毒；，基因治療
Preparation of recombinant adenovirus mediated siRNA targeting HBVx gene and its suppressive effect on HBVx gene expression
【Abstract】 AIM: To construct the recombinant adenovirus vectors for siRNA targeting HBVx gene （HBx） and to evaluate the inhibitive effect on the expression of HBx gene in human hepatoma HepG2 cell line. METHODS: The shuttle vector pShuttleHBx was cotransfected into E. coli BJ5183 with adenovirus backbone plasmid. The homologous recombinants were transfected into HEK293 packaging cells and adenovirus was packaged and amplified， followed by infection of the HepG2 cells transfected with HBx gene. The expression levels of HBx were determined by RTPCR and Western Blot after the total RNA and protein were collected. RESULTS: The recombinant adenoviral vectors containing siRNA targeting HBx gene were successfully constructed， which were confirmed by restriction enzyme digestion. RTPCR results demonstrated that the HBx mRNA was markedly decreased and Western Blot results showed that the expression of HBx protein was also significantly reduced in HepG2 cell line. CONCLUSION: Adenovirusbased siRNA targeting HBx gene can inhibit HBx expression with great potency and specificity in vitro.
【Keywords】 hepatitis B virus; RNA interference; adenovirus; gene therapy
【摘要】 目的：構(gòu)建針對乙型肝炎病毒x基因（HBx基因）的小干擾RNA (siRNA)重組腺病毒表達(dá)載體，并在能表達(dá)HBx基因的人肝癌細(xì)胞株HepG2中觀察其對HBx基因表達(dá)的抑制作用. 方法：重組腺病毒穿梭載體pShuttleHBx與骨架載體在大腸桿菌BJ5183中同源重組得到重組腺病毒載體，后者轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，包裝并擴(kuò)增出病毒顆粒. 用獲得的病毒感染能表達(dá)HBx基因人肝癌細(xì)胞株HepG2，收集細(xì)胞總RNA和總蛋白，采用RTPCR和Western Blot方法檢測細(xì)胞中HBx基因表達(dá)的變化. 結(jié)果：經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切鑒定，證實針對HBx基因的siRNA重組腺病毒載體構(gòu)建成功. RTPCR和Western Blot方法證實，在HepG2細(xì)胞中，HBx基因在mRNA和蛋白水平均有降低. 結(jié)論：腺病毒介導(dǎo)的針對HBx基因的siRNA在體外能夠高效、特異地抑制HBx基因的表達(dá).
【關(guān)鍵詞】 乙型肝炎病毒；RNA干擾；腺病毒；基因治療
0 引言
乙型肝炎病毒（hepatitis B virus， HBV）基因組中，HBx基因編碼的HBX蛋白是HBV編碼蛋白中唯一具有多種調(diào)控功能的病毒蛋白質(zhì)［1-2］，可以激活宿主細(xì)胞中受損DNA的修復(fù)［3-4］，并且同多種腫瘤相關(guān)分子有相互作用. 因此認(rèn)為，HBX與肝細(xì)胞肝癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān). RNA干擾(RNA interference， RNAi)是雙鏈RNA (doublestrand RNA， dsRNA)介導(dǎo)的、序列特異的轉(zhuǎn)錄后基因沉默（posttranscriptional gene silencing， PTGS）現(xiàn)象，其主要生物學(xué)功能在于抵抗病毒感染，維持基因組中轉(zhuǎn)座子的穩(wěn)定性，清除異常RNA，并參與基因表達(dá)的調(diào)控［5-6］. 我們構(gòu)建針對HBx基因重組腺病毒干涉載體，在人肝癌細(xì)胞株HepG2中檢測其對HBx基因表達(dá)的抑制效果，為乙型肝炎病毒感染以及感染后發(fā)生的肝細(xì)胞肝癌的基因治療提供新思路.
1 材料和方法
1.1材料
含有針對HBx基因的兩個干涉靶序列的干涉表達(dá)質(zhì)粒pSUPERHBx2，pSUPERHBx5（干涉序列分別針對HBx基因的301~319位和198~216位），表達(dá)HBx基因的質(zhì)粒pCNDA3.1HBxmyc，對照載體AdeasyH1，pCDNA3EGFP，大腸埃希菌DH5α，HEK293細(xì)胞以及人肝癌細(xì)胞HepG2（第四軍醫(yī)大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室）. pAdeasy1腺病毒重組系統(tǒng)（Stratgene公司）；限制性內(nèi)切酶Xba I，Hind III和T4 DNA連接酶（ TaKaRa公司）；限制性內(nèi)切酶Pac I和Pme I（New England Biolab公司）；質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒（合肥優(yōu)晶生物技術(shù)有限公司）；HDMEM培養(yǎng)基和RPMI 1640培養(yǎng)基（Hyclone公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；LipofectAmineTM2000，RTPCR試劑盒和TRIZOLTM試劑（Invitrogen公司）； myc標(biāo)簽， EGFP多克隆抗體（Santa Cruz公司）；兔抗人βactin多克隆抗體和辣根酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗（武漢博士德公司）；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒為（Pierce公司）. 用于擴(kuò)增HBx基因的上游引物：5′TTTAAGCTTATGGCTGCTAGGCTGTGCTGCC3′，下游引物：5′TTTGGTACCTTAGGCAGAGGTGAAAAAGTTGC3′；用于擴(kuò)增內(nèi)參照βactin基因的上游引物: 5′TGCGCAGAAAACAAGATGAGATT3′， 下游引物: 5′TGGGGGACAAAAAGGGGGAAGG3′；用于擴(kuò)增EGFP基因的上游引物：5′ATGCCAGCGGGGACAGCAGC3′， 下游引物：5′GGTGTCTCCTGGTCTCTTCC3′，上述引物由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司合成.
1.2方法
1.2.1pShuttleHBx2，pShuttleHBx5載體的構(gòu)建
經(jīng)Xba I和Hind III雙酶切反應(yīng)，從pSUPERHBx2，pSUPERHBx5質(zhì)粒獲取RNAi表達(dá)框片斷HBx2和HBx5（大小300 bp左右），將兩目的片斷回收后亞克隆入同樣經(jīng)Xba I和Hind III雙酶切的腺病毒穿梭質(zhì)粒pShuttle，卡那霉素選擇性培養(yǎng)基篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒，用Xba I和Hind III雙酶切，10 mL/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定. 獲得含小干擾RNA (short interfering RNA， siRNA)表達(dá)框的腺病毒穿梭質(zhì)粒pShuttleHBx2和pShuttleHBx5.
1.2.2pAdeasyHBx2，pAdeasyHBx5載體的構(gòu)建
將pShuttleHBx2，pShuttleHBx5質(zhì)粒用Pme I酶切線性化，與pAdeasy1按10∶1的比例電轉(zhuǎn)化至BJ5183感受態(tài)細(xì)菌. 卡那霉素選擇性培養(yǎng)基篩選陽性克隆，挑取較小的克隆擴(kuò)增培養(yǎng)，提取質(zhì)粒. 用Pme I酶切鑒定質(zhì)粒，將鑒定正確的重組質(zhì)粒再次轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，擴(kuò)增陽性克隆并大量提取質(zhì)粒，得到含針對HBx干涉表達(dá)框的重組腺病毒質(zhì)粒. （陰性對照質(zhì)粒AdeasyH1為帶有H1啟動子的pAdShuttle質(zhì)粒，用Pme I酶切線性化后與pAdeasy同源重組得到）.
1.2.3重組腺病毒的包裝與病毒滴度測定
①包裝細(xì)胞培養(yǎng)：含100 mL/L胎牛血清的HDMEM培養(yǎng)基，37℃，50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HEK293細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)70%~80%時轉(zhuǎn)染. ②重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞：重組質(zhì)粒pAdeasyHBx2，pAdeasyHBx5用Pac I酶切線性化后回收，按照LipofectAmineTM2000說明書轉(zhuǎn)染6孔培養(yǎng)板中的HEK293細(xì)胞，37℃，50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中孵育，10~12 d后收集細(xì)胞，液氮與37 ℃兩個溫度下反復(fù)凍融4次，裂解細(xì)胞以收獲原始病毒，病毒感染HEK293細(xì)胞使病毒大量擴(kuò)增. 重復(fù)上述步驟，最終收集3輪擴(kuò)增的病毒液，分裝保存于-70℃. ③病毒滴度的測定：用 TCID法檢測病毒滴度后，得到1×1010 pfu/mL的病毒工作液.
轉(zhuǎn)貼于
1.2.4RTPCR檢測
重組腺病毒對HBx基因mRNA的降解作用制備的重組腺病毒感染人肝癌細(xì)胞株HepG2，同時轉(zhuǎn)染表達(dá)HBx基因的質(zhì)粒pCNDA3.1HBxmyc和pCDNA3EGFP，后者用來監(jiān)測各組轉(zhuǎn)染效率，對照組轉(zhuǎn)染只含有H1啟動子的質(zhì)粒AdeasyH1. 37℃，50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中孵育，48 h后，分別收集細(xì)胞總RNA和蛋白. 通過RTPCR檢測HepG2細(xì)胞HBx轉(zhuǎn)錄水平的變化：提取實驗組和對照組HepG2細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計測定總RNA濃度，取5 μg總RNA按照SuperScriptTM Ⅱ說明書進(jìn)行cDNA第一鏈的合成 ，以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板在PE2400型DNA擴(kuò)增儀上進(jìn)行PCR反應(yīng). HBx PCR條件為：95℃變性5 min，再95℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 30 s，共30個循環(huán)，最后72℃延伸5 min. 反應(yīng)產(chǎn)物為HBx基因片段，長度為464 bp；內(nèi)參照βactin基因擴(kuò)增條件為：95℃變性3 min后，95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 45 s，共20個循環(huán)，最后72℃延伸5 min，擴(kuò)增片斷大小為438 bp；EGFP基因PCR反應(yīng)參數(shù)為：95℃變性5 min，再95℃ 30 s，58℃ 45 s，72℃ 30 s，共27個循環(huán)，最后72℃延伸5 min，反應(yīng)產(chǎn)物為538 bp. 10 mL/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定，比較干涉組與對照組mRNA水平表達(dá)差異.
1.2.5Western Blot檢測
重組腺病毒對HBX蛋白表達(dá)的影響用100 μL的細(xì)胞裂解液裂解上述各組細(xì)胞，4℃ 10 000 g離心20 min，收集上清液，加入等量2×SDS Loading Buffer， 煮沸5 min， 每孔上樣30 μL， 蛋白樣品經(jīng)SDSPAGE分離后， 電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上. 依次加入5 g/L脫脂奶粉（室溫封閉2 h）， 1∶200 myc標(biāo)簽抗體和EGFP抗體（室溫孵育2 h）， 1∶2000的HRP酶標(biāo)羊抗兔二抗（室溫孵育1 h）. 用TBST緩沖液洗滌后，加入底物發(fā)光劑ECL 1 mL，反應(yīng)5 min后吸干發(fā)光劑，用單層透明薄膜包裹后曝光，X光膠片顯影.
2 結(jié)果
2.1pShuttleHBx2，pShuttleHBx5載體的鑒定
用Xba I和Hind III雙酶切構(gòu)建的腺病毒穿梭質(zhì)粒pShuttleHBx2和pShuttleHBx5，得到6300 bp及300 bp左右的片斷（圖1），與預(yù)期大小一致，證明穿梭質(zhì)粒構(gòu)建成功.
2.2pAdeasyHBx2，pAdeasyHBx5載體的鑒定
用Pme I分別酶切重組質(zhì)粒pAdeasyHBx2，pAdeasyHBx5，得到23 000 bp和4300 bp兩個片斷（圖2），結(jié)果與預(yù)期一致，證明骨架質(zhì)粒同源重組成功.
2.3重組
pAdeasyHBx2，pAdeasyHBx5腺病毒的包裝含重組腺病毒的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞HEK293，培養(yǎng)1 wk后，顯微鏡下可見特征性圓球狀及葡萄串樣聚合的細(xì)胞病理性改變；電鏡下可見病毒感染后的死細(xì)胞，胞體腫脹，胞膜不完整，細(xì)胞內(nèi)充滿病毒顆粒（圖3A，圖中箭頭所示即為病毒顆粒）， 以及感染細(xì)胞的胞核，內(nèi)有成堆的病毒顆粒（圖3B，圖中箭頭所示為病毒顆粒）. 第10日，可見大部分包裝細(xì)胞腫脹脫落，細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病理反應(yīng)（cytopathological effect，CPE）樣變化.
A： 病毒感染的包裝細(xì)胞 ×4000； B： 包裝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的病毒顆粒 ×40 000.
2.4共轉(zhuǎn)HepG2細(xì)胞觀察HBx基因表達(dá)情況
包裝完成的病毒顆粒以30 MOI感染人肝癌細(xì)胞株HepG2，48 h后，分別收集細(xì)胞總RNA和蛋白，檢測其變化. RTPCR結(jié)果表明，與未處理組和轉(zhuǎn)染空載體組細(xì)胞相比，感染腺病毒組細(xì)胞的HBx基因mRNA量明顯降低（圖4A）；Western Blot結(jié)果顯示，感染腺病毒可使細(xì)胞HBX蛋白的表達(dá)量顯著減少（圖4B）.
3 討論
目前，在我國廣泛應(yīng)用的抗HBV藥物主要有兩類，即α干擾素和核苷類藥物如拉米夫定等. 但療效均不理想，新型有效的抗HBV藥物仍在探索中. RNAi用于HBV治療在理論上具有以下優(yōu)點［7］：特異性降解HBV mRNA，從而阻止病毒復(fù)制，對已整合入宿主細(xì)胞基因組的前病毒及無復(fù)制活性的病毒，RNAi也可以起到有效的抑制作用，這是通常抗病毒藥無可比擬的. 其次，RNAi可以針對病毒基因保守區(qū)發(fā)揮作用，從而限制病毒產(chǎn)生逃避突變株的能力. 因而，RNAi技術(shù)為各類慢性HBV感染開辟了新的途徑. 有學(xué)者認(rèn)為RNAi技術(shù)應(yīng)用于抗HBV治療，有望成為治療乙型肝炎的革命性新方法，將有巨大的社會價值［8］. 腺病毒載體是目前基因治療研究和臨床試驗中應(yīng)用最廣泛的病毒載體之一. 由于腺病毒載體宿主范圍廣，感染效率高，可插入外源基因片段大，可介導(dǎo)外源基因短時呈高水平表達(dá)和不整合到感染細(xì)胞的基因組中等特點［9］.
在本實驗中，我們采用He等［10］創(chuàng)建的pAdeasy腺病毒載體系統(tǒng)，通過細(xì)菌體內(nèi)同源重組的方法，構(gòu)建針對HBVx基因的兩個不同位點的siRNA重組腺病毒載體. 該方法不但發(fā)揮了重組腺病毒高效、安全等優(yōu)點，同時，還具有重組效率高，包裝時間短等特點. 腺病毒載體介導(dǎo)的RNA干擾克服了以往用質(zhì)粒作為siRNA輸送載體轉(zhuǎn)染效率低的缺陷.
實驗中我們使用RTPCR， Western Blot的方法在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平證實針對HBx基因的siRNA重組腺病毒有效地抑制了HBx基因的表達(dá).
本實驗表明腺病毒是一種有應(yīng)用前景的抗HBV感染的基因治療載體， 其可為慢性HBV感染以及HBV感染后發(fā)生的肝細(xì)胞肝癌的基因治療提供新思路.
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篇4
作者：姜立 馬文麗 柯杰兵 彭翼飛 李晉 徐兵 鄭文嶺
【摘要】 目的 構(gòu)建人鳥氨酸脫羧酶抗酶（OAZ）突變基因，重組至原核表達(dá)載體中并表達(dá)出重組蛋白。方法 采用基因定點突變技術(shù)在OAZ基因TCCTGATG(199～206)位置造成第202位堿基T堿基缺失，使核糖體的閱讀框+1移位，連續(xù)表達(dá)OAZ基因的ORF2部分。測序鑒定后，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21菌，進(jìn)行突變基因的蛋白表達(dá)。結(jié)果 重組質(zhì)粒經(jīng)測序后確認(rèn)202位堿基T缺失，其余堿基序列無變化。重組的突變基因轉(zhuǎn)入BL21后在IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)OAZ全長蛋白，SDS-PAGE分析在相對分子質(zhì)量45 900左右出現(xiàn)新的蛋白條帶。結(jié)論 成功構(gòu)建人OAZ突變基因重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化BL21后表達(dá)出融合的OAZ全長蛋白，為進(jìn)一步研究其臨床應(yīng)用打下基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】 鳥氨酸脫羧酶抗；突變；蛋白表達(dá)
鳥氨酸脫羧酶（ornithine decarboxylase，ODC）是多聚胺生物合成中的關(guān)鍵酶，催化多聚胺生物合成途徑中的第一步——鳥氨酸向腐胺的轉(zhuǎn)變。隨后，腐胺再轉(zhuǎn)變?yōu)閬喚贰⒕贰DC是該代謝途徑的限速酶，在此過程中扮演著重要的調(diào)控酶角色，其活性可在轉(zhuǎn)錄、翻譯和翻譯后水平受到精確的調(diào)控。鳥氨酸脫羧酶抗酶（ornithine decarboxylase antizyme，OAZ）是在翻譯后水平的一種調(diào)控形式，它可以連接到ODC蛋白上，抑制其催化活性并靶向地促使26S蛋白酶降解ODC，從而負(fù)性調(diào)控細(xì)胞內(nèi)多聚胺含量。有研究表明，細(xì)胞內(nèi)OAZ的過度表達(dá)在降低細(xì)胞內(nèi)多胺水平的同時還能抑制細(xì)胞的生長。由此推測，OAZ在細(xì)胞的生長與分化過程中擔(dān)任著重要的角色［1~3］。OAZ蛋白的表達(dá)有一個非常有趣的移位翻譯現(xiàn)象，其表達(dá)受到精胺的一個稱之為frame-shifting的核糖體移位的調(diào)控。多聚胺通過這種較罕見的調(diào)控機制誘導(dǎo)OAZ蛋白的生成，又反向抑制多聚胺在細(xì)胞內(nèi)的濃度，使細(xì)胞在一個穩(wěn)定的多聚胺水平進(jìn)行正常生長分化。OAZ轉(zhuǎn)錄本的編碼存在兩個不同的閱讀框，ORF1和ORF2。OAZ蛋白其實是一個由短的非保守的ORF1產(chǎn)物和高度保守的ORF2產(chǎn)物的組合。在OAZ mRNA的閱讀框中，需要有一個+1的翻譯移碼過程。在ORF1的5′端終止密碼子處，通常序列為TGCTCCTGATGCC(196~208)。翻譯框架達(dá)到TGA時，如果沒有精胺的存在，核糖體將接受TGA為終止密碼子，翻譯到此終止。當(dāng)精胺濃度一定時，核糖體的翻譯即可受到精胺的調(diào)控進(jìn)行+1移碼，躍過終止密碼子TGA上的T，以GAT指導(dǎo)的天冬氨酸為后續(xù)，翻譯合成ORF2［4-5］。翻譯框架移碼受到細(xì)胞內(nèi)多聚胺水平上升的正調(diào)控，表達(dá)出的OAZ蛋白又能調(diào)節(jié)ODC的酶活性，反向調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)多聚胺的水平，從而影響到細(xì)胞的生長及分化。在生長旺盛的腫瘤組織中，普遍發(fā)現(xiàn)了ODC的高表達(dá)，因此，OAZ蛋白特有的調(diào)控ODC活性的功能，就使之成為腫瘤免疫治療的理想靶分子。但是，OAZ蛋白的表達(dá)受到精胺的誘導(dǎo)，缺乏精胺時，核糖體將不能進(jìn)行+1的移位，翻譯完整的全長OAZ蛋白。為此，本研究對OAZ基因進(jìn)行了特定T堿基的缺失突變，成功構(gòu)建至表達(dá)載體pET-32a中，測序確認(rèn)后命名為pET-32a-OAZ-mutation，并在BL21菌中成功表達(dá)出OAZ全長蛋白，將對進(jìn)一步研究該基因的功能以及以O(shè)AZ為靶點的腫瘤核酸疫苗的制備，具有重要意義。
1 材料和方法
1.1 試劑 大腸桿菌DH5α、BL21和表達(dá)質(zhì)粒pET-32a、pET-32a-OAZ-wild質(zhì)粒由本實驗室保存。QuikChange定點突變試劑盒購自Stratagene公司。質(zhì)粒純化試劑盒、膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、T4DNA連接酶、XhoⅠ和EcoRⅠ內(nèi)切酶均購自TaKaRa公司，其余生化試劑均為國產(chǎn)分析純。 引物根據(jù)OAZ基因所需點缺失堿基處進(jìn)行設(shè)計2條反向互補引物對P1與P2。 P1：5′-CCTCGGTGGTGCTCCGATGCCCCTCACCC-3′；P2：5′-GGGTGAGGGGCATCGGAGCACCACCGAGG-3′。
1.2 方法
1.2.1 反向PCR擴(kuò)增 以pET-32a-OAZ-wild質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR 反應(yīng): 將pET-32a-OAZ-wild質(zhì)粒(10 mg/L) 1 μl、dNTP 1 μl、10×Buffer 5 μl、P1與P2 引物 ( 100 mg/L)各2.5 μl、PfuTurbo DNA多聚酶(2.5 ×106 U/L) 1 μl、雙蒸餾水37 μl 加入PCR 管; 95℃預(yù)變性30 s后， 95℃ 30 s、55℃ 1 min、68℃ 6 min ，共 18個循環(huán)。PCR 產(chǎn)物置于冰上2 min ， 加入1.5 μl DpnⅠ內(nèi)切酶(106 U/L)， 37 ℃水浴2 h，酶解模板DNA。
1.2.2 轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 取感受態(tài)大腸桿菌50 μl， 加入上述DpnⅠ處理液10 μl， 輕輕混勻， 冰浴30 min 42℃熱休克45 s 冰上2 min，加入預(yù)熱的LB 培養(yǎng)液0.5 ml， 置于37℃恒溫?fù)u床中， 200 r/min 振搖1 h。
1.2.3 質(zhì)粒擴(kuò)增、提取及鑒定 取200 μl 菌液鋪到LB 瓊脂培養(yǎng)板( 含Amp) 上， 37℃培養(yǎng)12～16 h。挑取單菌落，提取質(zhì)粒。取質(zhì)粒5 μl， 選取插入片段兩端的酶切位點XhoⅠ和EcoRⅠ 雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠進(jìn)行分析鑒定。含目的基因的質(zhì)粒經(jīng)測序驗證目標(biāo)堿基缺失后，命名為pET-32a-OAZ-mutation。
1.2.4 重組蛋白表達(dá) 將含有pET-32a-OAZ-mutation的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21菌，鋪板挑陽性菌落并酶切鑒定為陽性菌落后，接種至含5 ml LB培養(yǎng)基中（含氨芐青霉素）振培過夜。次晨取100 μl接種至新的5 ml LB培養(yǎng)基中，37℃振培3～4 h，至D值約為0.6時，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至終濃度0.5 mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)2 h和4 h后取菌液1 ml，進(jìn)行15%的SDS-PAGE電泳鑒定表達(dá)產(chǎn)物，以轉(zhuǎn)染空pET-32a質(zhì)粒的BL21菌在同等條件下用IPTG誘導(dǎo)為陰性對照。
2 結(jié) 果
2.1 pET-32a-OAZ-mutation測序圖 PCR擴(kuò)增后，DpnⅠ酶切產(chǎn)物并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取陽性克隆，鑒定含有目的基因后，抽提質(zhì)粒，以T7啟動子序列為測序引物序列于ABI3730測序儀進(jìn)行DNA序列測定，確定OAZ基因的TGCTCCTGATGCC(196~208)處的202位T已缺失，其余序列沒有變化(測序圖中的第312~323號序列為TGCTCC GATGCC，顯示T已缺失)。見圖1。
2.2 重組pET-32a-OAZ-mutation在BL21宿主菌中的蛋白表達(dá) SDS-PAGE分析結(jié)果顯示，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的含重組質(zhì)粒BL21與對照菌相比，在相對分子質(zhì)量為45 900位置上出現(xiàn)1條新帶。見圖2。圖1 T7啟動子測序結(jié)果圖
圖2 表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE圖
MMarker；1BL21菌；2轉(zhuǎn)化pET-32a質(zhì)粒的BL21菌；3轉(zhuǎn)化pET-32a-OAZ-mutation質(zhì)粒的BL21菌，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后2 h；4轉(zhuǎn)化pET-32a-OAZ-mutation質(zhì)粒的BL21菌，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后4 h
3 討 論
細(xì)胞的生命活動需要多聚胺(polyamine)類物質(zhì)，包括腐胺(putrescine)、亞精胺(spermidine)和精胺(spermine)。多聚胺幾乎是所有活細(xì)胞的必要組分，它們的缺失將導(dǎo)致細(xì)胞生長減少甚至死亡，但是當(dāng)它們的含量升高時也會有致癌作用并且可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［6-7］。有研究表明，細(xì)胞內(nèi)OAZ的過度表達(dá)除了能降低細(xì)胞內(nèi)多胺水平，還能抑制細(xì)胞的生長。而OAZ能夠特異地拮抗ODC的催化活性，減少細(xì)胞內(nèi)多胺的生成，因此成為研究抑制腫瘤細(xì)胞惡性增殖的切入點［8］。
從最初哺乳類動物細(xì)胞中克隆出OAZ基因至今，已陸續(xù)發(fā)現(xiàn)有OAZ1、OAZ2和特異性的OAZ3基因。其中OAZ1，也就是通常所說的OAZ基因，其表達(dá)的蛋白產(chǎn)物對于ODC有特異性的拮抗作用。OAZ的的抑制作用不是直接降解ODC，而是OAZ與ODC結(jié)合后，通過26S蛋白酶降解ODC，是一種在翻譯后水平調(diào)節(jié)酶活性的機制。ODC是一個二聚體酶，亞基間的聚合與解聚非常迅速。OAZ對于ODC單體蛋白有非常高的親和力，形成AZ∶ODC的蛋白聚合體，促進(jìn)ODC被26S蛋白酶降解［7～11］。人OAZ蛋白是由兩段ORF的表達(dá)框所翻譯表達(dá)，在第一個表達(dá)框的終止密碼子處，有一個核糖體移位位點，在精胺誘導(dǎo)下，出現(xiàn)程序性的閱讀框的移位。越過終止密碼子，繼續(xù)住下游翻譯，直至第2個表達(dá)框的終止密碼子處。全部蛋白共由228個氨基酸所組成，其中ORF1編碼N末端68個氨基酸，ORF2編碼C末端160個氨基酸。ORF2編碼的C末端氨基酸序列是真正發(fā)揮抗酶活性的肽鏈區(qū)段，但是該區(qū)段的蛋白表達(dá)需要在精胺的誘導(dǎo)下才能出現(xiàn)，因此增加了對于OAZ全長蛋白調(diào)控機制的研究難度。
故此，本研究通過定點突變技術(shù)，成功地使OAZ基因ORF1與ORF2間的核糖體移位位點發(fā)生缺失，也就是使ORF1的終止密碼子的TCCTGATGCC的T發(fā)生缺失，使核糖體按照隨后GAT GCC的三聯(lián)體順序進(jìn)行翻譯，無需精胺的誘導(dǎo)即可表達(dá)出完整的OAZ蛋白。由于選用質(zhì)粒pET-32a作為原核表達(dá)載體，OAZ蛋白表達(dá)的同時，還在其C末端攜帶有多聚組氨酸的標(biāo)簽，可通過His標(biāo)簽蛋白進(jìn)行純化，為進(jìn)一步研究其在腫瘤細(xì)胞中的調(diào)控機制提供了條件，為開發(fā)其臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
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篇5
[關(guān)鍵詞]SFRP2；腺病毒；增生性瘢痕；成纖維細(xì)胞
[中圖分類號]R318 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] [文章編號]1008-6455（2012）11-1981-04
成纖維細(xì)胞作為創(chuàng)傷愈合時的主要效應(yīng)細(xì)胞，在包含增生性瘢痕和瘢痕疙瘩在內(nèi)諸多以過度增生為特征的病變中，常常表現(xiàn)為凋亡抑制，進(jìn)而引發(fā)一系列連鎖反應(yīng)造成創(chuàng)面修復(fù)失控并最終導(dǎo)致過度纖維化而形成增生性瘢痕[1]。我們過去運用從基因芯片中篩選出一個具有抑制細(xì)胞凋亡作用、在早期增生性瘢痕中呈顯著高表達(dá)的基因SFRP2[2-3]，該基因可能在增生性瘢痕形成的過程中起著重要作用。但是目前SFRP2調(diào)控增生性瘢痕成纖維細(xì)胞凋亡的分子機制尚不明了，有必要進(jìn)行進(jìn)一步研究。
本實驗利用pAd-Easy腺病毒載體系統(tǒng)[4]，通過PCR擴(kuò)增SFRP2基因，克隆到腺病毒載體pAdEasy共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，構(gòu)建攜帶SFRP2基因的重組腺病毒，在體外感染人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞以觀察SFRP2基因表達(dá)情況，為進(jìn)一步研究該基因的功能奠定理論和實驗基礎(chǔ)。
1 材料和方法
1.1 材料：pGBKT-SFRP2質(zhì)粒（袁順宗博士惠贈）。感受態(tài)菌株及293細(xì)胞株（我院燒傷研究所）；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清（美國Haclon公司）。限制性核酸內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、T4DNA聚合酶、pMD18-T載體、DNA Marker DL2000、DNA Marker DL15000（Takara公司）。Lipofectamine2000（Invitrogen公司）。Trizol及RT-PCR試劑（美國Invitrogen公司）。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Fermentas公司）。兔抗人SFRP2多克隆抗體（美國CST公司）。
1.2 方法
1.2.1 增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)：采用組織塊法[6]進(jìn)行增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)，具體方法如下：將手術(shù)中取下的增生性瘢痕標(biāo)本仔細(xì)切除皮下脂肪組織和表皮，用加有青霉素和鏈霉素的消毒蒸餾水洗滌3次，再用消毒生理鹽水漂洗3次；在少量含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中用鋒利的刀片將組織切割成約1mm大小的塊，并接種于25ml的培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5% CO2的孵箱中培養(yǎng)，待長成致密層以后，用2.5g/L的胰蛋白酶消化傳代，實驗所用的是第3～6代的細(xì)胞。
1.2.2 SFRP2編碼序列的擴(kuò)增：采用Primer5.0軟件設(shè)計擴(kuò)增人SFRP2基因氨基酸區(qū)域編碼序列的特異性引物，并在引物5'端引入保護(hù)性堿基和限制性酶切位點，其中，上游引物序列為：5'-GAAGATCT ATGCTGCAGGGCCCTGGC-3'，下游引物序列為：5'-TTGTCGAC CTAGCACTGCAGCTTGCGGATG-3'（畫線部分分別為BglII和SalI酶切位點）。以pGBKT-SFRP2質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系組成為：5μl 10×PCR緩沖液、1μl 10mmol/L dNTPs、pGEX-IL-24重組質(zhì)粒模板2μl、10μmol/L引物各1μl及DNA聚合酶1μl，用雙蒸水補足至50μl。擴(kuò)增程序為：94℃變性5 min，然后用逐步程序94℃30 s，56℃30 s，72℃1 min完成30個循環(huán)，最后72℃延伸7 min。
1.2.3 SFRP2重組腺病毒表達(dá)載體的構(gòu)建：2%瓊脂糖凝膠回收SFRP2擴(kuò)增產(chǎn)物，與pMD19-T載體連接并轉(zhuǎn)化到DH5α菌中，藍(lán)白斑初步篩選，挑取單菌落提粒，BglII和SalI雙酶切及PCR鑒定，鑒定正確的質(zhì)粒經(jīng)BglII和SalI雙酶切，膠回收SFRP2目的片段，與線性化的pAdTrack-CMV載體相連接，轉(zhuǎn)化DH5α菌，BglII和SalI雙酶切鑒定并進(jìn)行測序。測序正確的重組載體命名為pAdTrack-CMV-SFRP2。PmeⅠ單酶切消化10μg pAdTrack-CMV-SFRP2重組質(zhì)粒，純化回收后獲得線性化載體，然后與0.1μg骨架質(zhì)粒pAdEasy-1在2.5 kV，200Ω，25μF條件下電穿孔共轉(zhuǎn)化20μl BJ5183感受態(tài)細(xì)胞，卡那霉素抗性平板37℃培養(yǎng)16 h，挑取針尖大小的克隆，PacⅠ酶切鑒定正確后，再轉(zhuǎn)化DH5α菌中擴(kuò)增。鑒定正確的重組載體命名為Ad-SFRP2，進(jìn)行掃描獲取圖像。
1.2.4 SFRP2重組腺病毒的包裝與制備：按照Lipofectamine2000試劑盒說明書，取10μgPacⅠ酶切線性化的Ad-SFRP2轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后7～10天熒光顯微鏡觀察，根據(jù)綠色熒光蛋白GFP和細(xì)胞病變效應(yīng)判斷病毒產(chǎn)生。收集細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液重懸，-80℃和37℃反復(fù)凍融4次，12 000 r/min離心10 min，收集病毒上清，-80℃保存，取部分病毒上清液，再次感染HEK293細(xì)胞擴(kuò)增腺病毒，按TCID法測定病毒滴度。
1.2.5 SFRP2重組腺病毒感染增生性瘢痕成纖維細(xì)胞：原代培養(yǎng)的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞經(jīng)第3次傳代后，在150 mL/LDMEM中培養(yǎng)24h。將Ad-SFRP2純化病毒按其TCID50值加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中，每15min輕搖1次，共4次，4h后換液。
1.2.6 RT-PCR檢測SFRP2表達(dá)水平：按Trizol試劑盒說明書分別提取Ad-SFRP2感染24h后的實驗組和陰性對照組增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的總RNA。RT-PCR反應(yīng)按照Fermentas反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒說明書進(jìn)行操作，利用PrimerPrimer 5.0設(shè)計SFRP2的鑒定引物：上游5'-TGGGGGAAACGGTCGCACTC-3'，下游5'-GGCCACGAGACCATGAAGGAGG-3′。 PCR擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃30s，退火56℃30s，延伸72℃40s，35個循環(huán)；最后延伸72℃5 min。以GAPDH作為內(nèi)參照（退火溫度55℃，25個循環(huán)），GAPDH上游引物5'-ACCCATCACCATCTTCCA GGAG-3'，下游引物5'-GAAGGGGCGGAGATGATGAC-3'（上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成），PCR反應(yīng)結(jié)束后取10μL反應(yīng)產(chǎn)物行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳觀察目的條帶。
1.2.7 Western blot檢測SFRP2表達(dá)水平：分別收集感染Ad-SFRP2 24h后和對照組細(xì)胞，提取蛋白。BCA法進(jìn)行蛋白定量，加入5×SDS凝膠加樣緩沖液，沸水浴5min，按照蛋白定量結(jié)果進(jìn)行加樣，行120g/L SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，采用半干法將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素（NC）膜上。NC膜用50g/L脫脂奶封閉1h，加入SFRP2 pAb （1∶500）或GAPDH mAb（1∶1000）工作液，4℃過夜，兔抗人二抗（1∶4000）于室溫下孵育1h，用ECL發(fā)光，膠片顯色，分析結(jié)果，以GAPDH作為內(nèi)參照。
2 結(jié)果
2.1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果：以pGBKT-SFRP2質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為單一條帶，大小約904bp，見圖1。
2.2 SFRP2重組腺病毒載體的構(gòu)建：將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆入pMD19-T載體，BglII和SalI雙酶切和PCR鑒定確認(rèn)獲得陽性重組克隆（圖2）。進(jìn)而將SFRP2片段亞克隆至pAdTrack-CMV載體，BglII和SalI雙酶切鑒定并經(jīng)測序確認(rèn)獲得陽性重組克隆，命名為pAdTrack-CMV-SFRP2（圖3、圖4）。線性化的pAdTrack-CMV-SFRP2質(zhì)粒與骨架質(zhì)粒pAdEasy-1在BJ5183菌中進(jìn)行同源重組，PacⅠ酶切鑒定陽性重組子，可見1條約30 kb的片段和1條4.5 kb的小片段（圖5），表明同源重組成功，獲得SFRP2重組腺病毒載體，命名為Ad-SFRP2。同時，采用同樣方法，將pAdTrack-CMV空載體與骨架質(zhì)粒pAdEasy-1進(jìn)行同源重組，重組子命名為Ad-EGFP。
2.3 SFRP2重組腺病毒的包裝擴(kuò)增及鑒定：用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染293細(xì)胞有大量GFP表達(dá)，并可見細(xì)胞變圓呈串珠樣聚集（圖6），裂解粗提物中提取重組病毒DNA，PCR鑒定證實重組病毒基因組中含有目的基因SFRP2，提示重組質(zhì)粒在293細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功。收集病毒液，反復(fù)轉(zhuǎn)染293細(xì)胞最終得到滴度約為2.0×1010pfu/mL的重組腺病毒。
2.4 RT-PCR檢測結(jié)果：感染的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中提取mRNA的RT-PCR電泳結(jié)果顯示，以GAPDH為陽性對照，未感染病毒的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞SFRP2、感染空病毒的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞SFRP2與感染SFRP2腺病毒的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞SFRP2表達(dá)一致。其產(chǎn)物為904bp特異條帶，且SFRP2腺病毒感染增生性瘢痕成纖維細(xì)胞后SFRP2基因表達(dá)明顯增高（圖7）。
2.6 Western blot檢測結(jié)果：用SFRP2多克隆抗體進(jìn)行Western blot檢測，以GAPDH為陽性對照，結(jié)果證實感染重組腺病毒載體在增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中SFRP2有較高的穩(wěn)定表達(dá)（圖8）。
3 討論
SFRP2是一個位于4號染色體q31.3，其全長約2kb，編碼大小約34kD的可溶性蛋白質(zhì)，表達(dá)于胞漿，但也可分泌至胞外發(fā)揮作用。SFRP2蛋白所屬的SFRP家族具有富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域同源于細(xì)胞表面卷曲受體（Frizzled receptors）的Wnt結(jié)合位點，但是SFRP2缺乏跨膜結(jié)構(gòu)[5]。目前的研究表明，SFRP2通過調(diào)控Wnt信號為主要途徑的方式發(fā)揮其調(diào)節(jié)細(xì)胞抗凋亡的作用。表現(xiàn)為：①心肌修復(fù)過程中，SFRP2通過阻斷Wnt3a信號途徑、增加細(xì)胞核內(nèi)β-catenin表達(dá)以對抗缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的凋亡作用，從而調(diào)控心肌細(xì)胞修復(fù)[6]；②胃癌中過表達(dá)的SFRP2通過下調(diào)β-catenin-TCF/LEF的下游靶基因如LEF1，cyclin D1，MMP-7等來抑制Wnt信號，調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的增殖與凋亡[7]；③乳腺癌中SFRP2主要通過活化NF-κB或抑制JNK信號來發(fā)揮其抗凋亡作用。同時SFRP2還可以通過與促進(jìn)ECM中的纖維連接蛋白-整合素受體復(fù)合體（fibronectin-integrin receptor complexes）形成從而活化黏附斑激酶（FAK）及其下游信號途徑PI-3K-Akt來抑制細(xì)胞凋亡[8]。
除了抑制凋亡之外，SFRP2對細(xì)胞增殖、分化和運動也還具有一定的調(diào)節(jié)作用，并且SFRP2基因的甲基化被認(rèn)為可用來作為糞便中結(jié)直腸癌的篩選標(biāo)志[9-12]。文獻(xiàn)復(fù)習(xí)還提示SFRP2的高表達(dá)可以促進(jìn)結(jié)締組織生長因子（CTGF）的基因表達(dá)水平增高[6]，而CTGF在HS組織中既可以促進(jìn)Fb增生，又可以促進(jìn)Fb-肌Fb轉(zhuǎn)分化和膠原合成[13]。
綜合上述內(nèi)容，我們認(rèn)為SFRP2在增生性瘢痕組織成纖維細(xì)胞中的高表達(dá)其主要作用可能在于引起成纖維細(xì)胞的凋亡抑制，同時還可能與成纖維細(xì)胞的增殖相關(guān)。根據(jù)既往文獻(xiàn)研究，我們進(jìn)一步推測其調(diào)節(jié)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞凋亡的分子機制可能與Wnt信號相關(guān)，但也不排除還存在著新的信號途徑。然而以上推測尚需進(jìn)一步的實驗證明。
本研究構(gòu)建SFRP2重組腺病毒載體，在293細(xì)胞中表達(dá)、包裝、純化病毒后成功構(gòu)建了攜帶SFRP2重組腺病毒。并且初步研究結(jié)果表明該重組病毒在體外能有效感染正常增生性瘢痕成纖維細(xì)胞，受感染細(xì)胞能高效穩(wěn)定的表達(dá)重組蛋白，為下一步研究SFRP2對病毒自身的復(fù)制與增殖以及宿主細(xì)胞中基因表達(dá)與調(diào)控、細(xì)胞凋亡等過程的機制奠定了基礎(chǔ)。
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篇6
【摘要】
目的 構(gòu)建含有膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)和加強型綠色熒光蛋白基因（EGFP）的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，將其導(dǎo)入包裝細(xì)胞PT67，檢測基因在細(xì)胞中的表達(dá)。方法 PCR法擴(kuò)增GDNF基因及IRES2EGFP基因，測序驗證正確后與逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLXSN連接，構(gòu)建重組逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒pLXSNIRES2EGFPGDNF。EcoR I酶切鑒定重組質(zhì)粒。脂質(zhì)體Lipofectamine 2000介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞PT67，G418篩選并檢測病毒滴度。流式細(xì)胞儀和熒光顯微鏡分別檢測轉(zhuǎn)染效率和基因表達(dá)。結(jié)果 PCR擴(kuò)增得到大小約558 bp和1 308 bp的特異性條帶，測序證實，獲得正確的人GDNF序列和EGFP序列。經(jīng)EcoR I酶切鑒定，成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pLXSNIRES2EGFPGDNF。熒光顯微鏡檢測顯示GDNF基因獲得良好表達(dá)，流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率為24.4%。結(jié)論 正確克隆了人GDNF基因全序列并構(gòu)建重組逆轉(zhuǎn)錄病毒pLXSNIRES2EGFPGDNF質(zhì)粒。基因轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞PT67獲良好表達(dá)。
【關(guān)鍵詞】 膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子；逆轉(zhuǎn)錄病毒；脂質(zhì)體；基因轉(zhuǎn)染
帕金森病(PD)臨床療效不佳，有學(xué)者將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）定向移植入PD鼠模型的黑質(zhì)紋狀體區(qū)，發(fā)現(xiàn)其能夠存活并分化為酪氨酸羥化酶（Tyrosine Hydroxylase，TH）表型神經(jīng)元，從而改善PD大鼠癥狀，但不能阻止神經(jīng)細(xì)胞的進(jìn)一步死亡。于是有學(xué)者探索將神經(jīng)營養(yǎng)因子體外轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞，通過立體定向的方式移植入鼠的黑質(zhì)紋狀體區(qū)，發(fā)現(xiàn)可促進(jìn)PD大鼠的黑質(zhì)紋狀體神經(jīng)通路的結(jié)構(gòu)和功能的恢復(fù)。本課題擬在以上研究的基礎(chǔ)上，應(yīng)用人膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（glial cell linederived neurotrophic factor， GDNF）重組逆轉(zhuǎn)錄病毒體外轉(zhuǎn)染MSCs，立體定向移植入PD大鼠模型的黑質(zhì)紋狀體區(qū)，通過對相應(yīng)指標(biāo)的測定，分析逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)GDNF基因轉(zhuǎn)染MSCs移植治療PD的可行性及其療效。本文為實驗的第一部分，旨在構(gòu)建一個攜帶有治療基因GDNF同時攜帶報告基因加強型綠色熒光蛋白(enhance green fluorescent protein，EGFP)的逆轉(zhuǎn)錄病毒重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞PT67后，檢測基因的表達(dá)及轉(zhuǎn)染效率，為下一步轉(zhuǎn)染MSCs、進(jìn)一步深入探討GDNF基因在神經(jīng)系統(tǒng)疾病基因治療中的作用奠定基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 材料、試劑和儀器
人神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤標(biāo)本，由山東省立醫(yī)院神經(jīng)外科提供。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLXSN質(zhì)粒、攜帶pIRES2EGFP基因片段的質(zhì)粒、PT67、NIH3T3細(xì)胞由山東省立醫(yī)院中心實驗室保存并提供。PCR試劑盒、pMD18T載體試劑盒、限制性內(nèi)切酶Xho I、BamH I、Bgl Ⅱ、EcoR I、T4連接酶均購自大連TAKARA公司；中量質(zhì)粒抽提試劑盒購自O(shè)mega公司；GDNF基因片段及pIRES2EGFP基因片段上、下游引物，由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成；Lipofectamine 2000、OptiMEM無血清培養(yǎng)基購自Invitrogen公司；G418、DMEM培養(yǎng)液購自Gibco公司；Polybrene購自Sigma公司。
1.2 方法
1.2.1 GDNF基因、IRES2EGFP基因的克隆及測序
參照《分子克隆實驗指南》，從人神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤組織中提取總RNA后逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA。以cDNA為模板，PCR擴(kuò)增GDNF基因片段。同時，以含有IrES2序列及EGFP基因片段的質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增EGFP基因片段。擴(kuò)增程序：94℃ 5 min；94℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 1 min，10個循環(huán)；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，20個循環(huán)；72℃ 7 min充分延伸；4℃，保持。GDNF基因引物序列（上游5′TACTCGAGATGAAGTTATGGGATGTCGTGG3′，下游5′CGAGATCTTCAGATACATCCACACCTTTTAGC3′）；IRES2EGFP基因引物序列（上游5′TTATCTCGAGATTAAGATCTTCCGCCCCTCTCCCTCCCCCCC3′，下游5′CGGGATCCTTTACTTGTACAGCTCGTCCAT3′）。引物設(shè)計時分別引入Xho I、BamH I、Bg Ⅲ酶切位點。擴(kuò)增產(chǎn)物純化回收后克隆入T載體，篩選陽性克隆，使用測序儀進(jìn)行測序。
1.2.2 pLXSNIRES2EGFPGDNF重組體的構(gòu)建及鑒定
Xho I和BamH I分別雙酶切pLXSN質(zhì)粒及pIRES2EGFP，T4連接酶連接酶切后產(chǎn)物，得到pLXSNIRES2EGFP；Xho I和Bgl Ⅱ分別雙酶切pLXSNIRES2EGFP及PMD18TGDNF，T4連接酶連接酶切后產(chǎn)物，構(gòu)建pLXSNIRES2EGFPGDNF重組質(zhì)粒，EcoR I酶切鑒定。
1.2.3 病毒轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞PT67
酶切鑒定初步證實質(zhì)粒構(gòu)建成功后，按照質(zhì)粒中量抽提試劑盒說明，中量抽提pLXSNIRES2EGFPGDNF重組質(zhì)粒，測量濃度及純度。復(fù)蘇并培養(yǎng)包裝細(xì)胞PT67，培養(yǎng)液為含10%胎牛血清的DMEM液。轉(zhuǎn)染前1 d，胰酶消化PT67細(xì)胞并計數(shù)接種于6孔板內(nèi)，使用含血清不含抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)，控制其在轉(zhuǎn)染當(dāng)日密度達(dá)到90%左右。第2天，以O(shè)ptiMEM I培養(yǎng)基各250 μl分別稀釋5 μg pLXSNIRES2EGFPGDNF重組質(zhì)粒和15 μl Lipofectamine 2000，將稀釋的DNA和稀釋的Lipofectamine 2000混合，室溫保持20 min后，轉(zhuǎn)染1孔，其他孔按此重復(fù)。37℃，5% CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，將細(xì)胞消化傳代，新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。2 d后加入G418篩選。按照預(yù)實驗結(jié)果，先從200 μg/ml G418濃度開始，根據(jù)細(xì)胞生長情況酌情增量，至500 μg/ml為止。當(dāng)絕大多數(shù)細(xì)胞死亡，只余小部分有絲分裂相細(xì)胞時，將G418濃度下調(diào)至300 μg/ml繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到50%左右匯合時，胰酶消化，按照1∶10比例傳代，300 μg/ml G418繼續(xù)培養(yǎng)。待出現(xiàn)單細(xì)胞克隆后，用克隆環(huán)挑出10個大而邊界清楚的克隆，收集病毒，-70℃凍存。
1.2.4 滴定病毒滴度
復(fù)蘇NIH3T3細(xì)胞并以含10%胎牛血清的DMEM液培養(yǎng)，用于測病毒滴度。測滴度前1 d，將NIH3T3細(xì)胞胰酶消化后重新鋪于6孔板，細(xì)胞密度保持在0.5×105～1×105/孔，每孔加入2 ml完全培養(yǎng)液。測滴度當(dāng)日，將20 ml完全培養(yǎng)液與60 μl Polybrene（4 mg/ml)混合，簡稱溶液1。將方法1.2.3中得到的病毒儲存液經(jīng)0.45 μm醋酸纖維膜濾器過濾。備6只1.5 ml EP管，做標(biāo)記后分別加入1.35 ml溶液1，將過濾好的病毒儲存液150 μl加入第1管后混勻稀釋。將稀釋后的病毒液吸取150 μl加入第2管混合稀釋，依此類推加至第6管，病毒最終被稀釋106倍，第6管溶液簡稱溶液2。每孔加1 ml溶液2，最終孔內(nèi)的Polybrene的終濃度為4 μg/ml。感染細(xì)胞24 h后，更換含300 μg/ml G418的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。1 w后，肉眼計數(shù)形成的抗性細(xì)胞克隆，計算滴度。病毒滴度=細(xì)胞克隆數(shù)×病毒液稀釋倍數(shù)（106）。將高滴度病毒液-70℃凍存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.5 熒光顯微鏡及流式細(xì)胞儀檢測
將方法1.2.3中篩選出的細(xì)胞培養(yǎng)達(dá)到50%～60%融合后，胰酶消化接種于6孔板內(nèi)，300 μg/ml G418繼續(xù)培養(yǎng)。6孔板內(nèi)挑選2孔預(yù)先放入無菌載玻片。待細(xì)胞貼壁后，培養(yǎng)2～3 d，4%多聚甲醛固定。以未經(jīng)轉(zhuǎn)染的PT67細(xì)胞為背景熒光標(biāo)準(zhǔn)，488 nm波長光線激發(fā)下熒光顯微鏡觀測并照相。其余孔內(nèi)，胰酶消化細(xì)胞成單細(xì)胞懸液，PBS洗滌2遍。取109/ml的單細(xì)胞懸液1 ml以預(yù)冷的無水乙醇固定，以同時傳代未轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為對照，行流式細(xì)胞儀檢測。
2 結(jié) 果
2.1 pLXSN質(zhì)粒圖譜 質(zhì)粒大小約為5.9 kb，見圖1。
2.2 目的基因PCR擴(kuò)增、測序
擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果示：擴(kuò)增出一條約500～600 bp的GDNF基因條帶，和一條約1 200～1 500 bp的EGFP基因條帶，見圖2。
應(yīng)用美國ABI全自動序列儀檢測GDNF（558 bp）和pIRES2EGFP DNA（1 308 bp）序列，結(jié)果通過DNASIS軟件與GenBank中的序列進(jìn)行同源性序列分析，pIRES2EGFP的片段與GenBank中序列完全一致。GDNF片段在前蛋白的片段上出現(xiàn)了一個堿基突變，經(jīng)查證屬同義突變，不會影響GDNF蛋白質(zhì)的表達(dá)，與完整序列（636 bp）比對，有78 bp的堿基缺失(圖3中黑框部分)，見圖3。
2.3 pLXSNIRES2EGFPGDNF雙表達(dá)載體的構(gòu)建
經(jīng)酶切、連接等步驟，構(gòu)建pLXSNIRES2EGFPGDNF重組質(zhì)粒。利用EcoR I進(jìn)行酶切鑒定。酶切后電泳后可見2條帶，一條約250 bp，另一條約6 000～8 000 bp，與預(yù)期一致，可初步判斷重組質(zhì)粒pLXSNIRES2EGFPGDNF已經(jīng)構(gòu)建成功，見圖4。
2.4 包裝細(xì)胞病毒滴度測定
挑選的10個陽性細(xì)胞克隆，其病毒滴度最高為2.5×106 cfu/ml，將其細(xì)胞擴(kuò)增并凍存，以備后續(xù)實驗。
2.5 熒光顯微鏡及流式細(xì)胞儀檢測
在熒光顯微鏡下可觀察到，電轉(zhuǎn)染PT67細(xì)胞后，大量的PT67細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)含EGFP的目的基因片段在藍(lán)色熒光激發(fā)下(波長408 nm)，發(fā)出明亮的綠色熒光(波長508 nm)，見圖5。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測，以未經(jīng)轉(zhuǎn)染的PT67細(xì)胞做空白對照，轉(zhuǎn)染效率約為24.4%，見圖6。
3 討 論
目前已證實GDNF對神經(jīng)具有營養(yǎng)、保護(hù)作用，同時還可抑制由毒素、環(huán)境等原因誘發(fā)的神經(jīng)元變性、壞死〔1〕。目前認(rèn)為PD的主要病理特征為中腦黑質(zhì)中多巴胺能（DA）神經(jīng)元進(jìn)行性變性減少，致紋狀體中DA含量下降。Smith等〔2〕發(fā)現(xiàn)GDNF可通過抑制活性氧損傷和細(xì)胞毒物質(zhì)的生成來保護(hù)DA能神經(jīng)元，Zeng等〔3〕研究發(fā)現(xiàn)：GDNF可以逆轉(zhuǎn)細(xì)胞凋亡所致的DA能神經(jīng)元壞死，提高TH陽性神經(jīng)元的存活率。于是，如何應(yīng)用外源性GDNF治療PD成為人們研究的又一熱點。本研究從人腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤中提取GDNF基因片段，期望探索GDNF基因轉(zhuǎn)移高效率表達(dá)的方法，為今后進(jìn)一步應(yīng)用于臨床研究奠定基礎(chǔ)。
本研究最終得到GDNF基因片段為558 bp，測序后結(jié)果與GenBank中完整序列（636 bp）比對，有78 bp的堿基缺失。Grimm等〔4〕檢查了大鼠B49細(xì)胞系和人胚腎HEK293細(xì)胞系中GDNF的表達(dá)狀況，發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞均表達(dá)558 bp和636 bp片段。也有學(xué)者證實，兩種GDNF前體在胚胎鼠的表達(dá)部位一致，生物學(xué)活性相同。本實驗得到的GDNF基因，通過DNASIS軟件與GenBank中的序列進(jìn)行同源性序列分析，發(fā)現(xiàn)在前蛋白的片段上出現(xiàn)了一個堿基突變，但屬于同義突變，故不影響GDNF蛋白質(zhì)的表達(dá)。自此，人GDNF基因成功被克隆。
由于GDNF不能直接通過血腦屏障，故如何將其移植入生物體內(nèi)且發(fā)揮作用是個關(guān)鍵的問題。有學(xué)者嘗試過不同的方法，如：GDNF直接向紋狀體、黑質(zhì)或腦室內(nèi)注射；將胚胎中腦組織用GDNF處理后植入腦內(nèi)等。本研究采用將GDNF基因克隆入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的方法，同時克隆入載體的還有帶IRES序列的報告基因EGFP。這樣做的優(yōu)勢在于：①逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLXSN，含有指導(dǎo)特異性整合的信號，插入的外源基因整合后仍是完整的，能保證基因插入質(zhì)粒后正確表達(dá)，保留基因的生物特性〔5〕。②逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，能夠在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下形成與之互補的前病毒DNA，在int基因的作用下整合至靶細(xì)胞的基因組中，在子代細(xì)胞中形成穩(wěn)定的基因表達(dá)。穩(wěn)定的表達(dá)有利于持續(xù)觀察GDNF基因?qū)ι窠?jīng)元的修復(fù)、保護(hù)作用。③構(gòu)建IRES序列連接的GDNF和EGFP基因的雙表達(dá)載體，同時轉(zhuǎn)錄，但翻譯各自獨立，由于兩者共用一個啟動子，因此所有表達(dá)EGFP的轉(zhuǎn)染細(xì)胞必然也同時表達(dá)目的基因GDNF，在熒光顯微鏡下觀測到亮綠色的熒光蛋白，即等于觀測到了GDNF的表達(dá)，為觀察提供方便。
本研究成功構(gòu)建了pLXSNIRES2EGFPGDNF重組質(zhì)粒，脂質(zhì)體Lipofectamine 2000介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞PT67，G418篩選出高滴度細(xì)胞克隆，為下一步轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞奠定了基礎(chǔ)，在探索PD動物模型的基因治療方面又前進(jìn)一步。
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【摘要】 目的: 觀察攜帶野生型pten基因的重組腺病毒(Adpten)體外轉(zhuǎn)染高轉(zhuǎn)移卵巢癌HO8910PM細(xì)胞后的表達(dá)，并研究其對卵巢癌細(xì)胞抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡和抑制遷移的作用. 方法: 利用AdEasy腺病毒載體系統(tǒng)構(gòu)建Adpten，體外轉(zhuǎn)染高轉(zhuǎn)移卵巢癌HO8910PM細(xì)胞，熒光顯微鏡檢測Adpten的轉(zhuǎn)染效率. Western印跡檢測pten在HO8910PM細(xì)胞中的表達(dá)；MTT實驗觀察pten對細(xì)胞生長的影響；HE染色法觀察外源性pten基因表達(dá)對細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響；細(xì)胞劃痕實驗觀察pten對細(xì)胞遷移的抑制作用；Hoechest33258凋亡染色檢測pten基因?qū)O8910PM細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用. 結(jié)果: 外源性野生型pten基因經(jīng)腺病毒介導(dǎo)成功轉(zhuǎn)入HO8910PM細(xì)胞，Western印跡檢測出有PTEN蛋白的表達(dá)，當(dāng)感染復(fù)數(shù)MOI為100時，體外轉(zhuǎn)染效率高達(dá)90%以上. pten顯著抑制HO8910PM細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)其凋亡并能抑制其遷移. 結(jié)論: 重組腺病毒是高效的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，能將pten目的基因高效地轉(zhuǎn)移到高轉(zhuǎn)移卵巢癌HO8910PM細(xì)胞中，對細(xì)胞產(chǎn)生強有力的生長抑制及凋亡誘導(dǎo)作用，并能抑制其遷移.
【關(guān)鍵詞】 卵巢腫瘤；基因治療；pten基因；腺病毒；細(xì)胞凋亡；遷移抑制
0引言
抑癌基因pten，即第10號染色體缺失的與張力蛋白同源的基因，是繼p53后又一個與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的抑癌基因，其編碼具有雙重特異磷酸酶活性的蛋白，可以反向調(diào)控磷脂酰肌醇(3)激酶（phosphatidylinositol 3kinase，PI3K）/AKt信號傳導(dǎo)途徑，從而抑制細(xì)胞生長增殖. 其突變和缺失多發(fā)于乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌等［1-3］. 在某些pten基因突變或缺失的癌細(xì)胞中過表達(dá)PTEN蛋白能抑制細(xì)胞增殖和腫瘤的形成，使其細(xì)胞周期停滯在G1期并發(fā)生細(xì)胞凋亡［4-5］，而且在某些沒有pten基因突變的癌細(xì)胞中，使pten基因過表達(dá)也能抑制這些癌細(xì)胞生長，誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡［6］；另外，pten基因還能抑制癌細(xì)胞的侵潤轉(zhuǎn)移，降低其遷移能力. 這就提示pten基因用于癌癥基因治療有著重要意義. 而基因治療載體的選擇最為重要，當(dāng)今運用最多最廣泛的就是腺病毒(adenovirus， Ad)載體，其具有在哺乳動物及其他多種生物細(xì)胞上進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移和蛋白表達(dá)的高效性和不整合宿主細(xì)胞的性質(zhì)，是一種比較安全，轉(zhuǎn)染效率又高的載體［7］. 本研究采用攜帶野生型pten基因的重組腺病毒(Adpten)，將pten基因?qū)肴烁咿D(zhuǎn)移卵巢癌HO8910PM細(xì)胞，觀察其在卵巢癌細(xì)胞中的表達(dá)，研究其對卵巢癌細(xì)胞生長抑制、遷移抑制、誘導(dǎo)凋亡的作用，對卵巢癌的基因治療進(jìn)行初步的探索并提供有意義的參考數(shù)據(jù).
1材料和方法
1.1材料人高轉(zhuǎn)移卵巢癌HO8910PM細(xì)胞和人胚腎細(xì)胞293T購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所；野生型pten表達(dá)質(zhì)粒（wtpten）為美國加州大學(xué)Frank Furnari教授惠贈；AdEasy腺病 毒表達(dá)載體系統(tǒng)由美國休斯霍華德醫(yī)學(xué)院及John Hopkins腫瘤中心Bert Vogelstein教授惠贈，其中穿梭載體pAdTrackCMV帶有綠色熒光蛋白報告基因(gfp)，在表達(dá)外源基因同時也能單獨表達(dá)gfp，用于重組腺病毒的快速篩選以及轉(zhuǎn)染率的測定；抗PTEN抗體為美國Santa Cruz公司產(chǎn)品; HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG抗體和馬抗山羊IgG均購自北京生物技術(shù)有限公司；MTT為美國Amerson公司產(chǎn)品. Hoechst33258 細(xì)胞凋亡染色試劑盒購于武漢碧云天生物技術(shù)公司.
1.2方法
1.2.1重組腺病毒載體的構(gòu)建及細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用細(xì)菌內(nèi)同源重組的方法，構(gòu)建攜帶野生型pten基因的重組腺病毒Adpten及陰性對照Adgfp ［8］. HO8910PM細(xì)胞培養(yǎng)于含100 mL/L小牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中，置50 mL/L CO2， 37℃孵箱培養(yǎng).
1.2.2Adpten轉(zhuǎn)染效率的測定取指數(shù)生長期的高轉(zhuǎn)移卵巢癌HO8910PM細(xì)胞，以5×104/孔接種于6孔培養(yǎng)板中，24 h后吸棄培養(yǎng)基，換無血清RPMI1640培養(yǎng)基，用25，50，100感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection， MOI=病毒顆粒數(shù)/轉(zhuǎn)染的細(xì)胞數(shù))的腺病毒感染， 培養(yǎng)6 h后，換完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng). 24 h后在熒光顯微鏡下計數(shù)gfp陽性細(xì)胞百分率. 確定HO8910PM細(xì)胞轉(zhuǎn)染所需的MOI值，使得轉(zhuǎn)染效率＞90%.
1.2.3Western Blot檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)的PTEN蛋白取對數(shù)生長期細(xì)胞，按2×106接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中. 常規(guī)條件培養(yǎng)24 h后，按MOI=100加入病毒，設(shè)Adpten 組和Adgfp 組，培養(yǎng)6 h后，換完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng). 48 h后提取細(xì)胞總蛋白；以Bradford酶標(biāo)儀蛋白定量法測定蛋白含量，然后作SDSPAGE（12 g/L），于4℃冰箱中90 mA恒流電轉(zhuǎn)過夜，使目的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，封閉液于4℃封閉過夜，將膜轉(zhuǎn)至新的封袋中，按0.1 mL/cm2加入適量的一抗稀釋液（小鼠抗人PTEN單抗按1∶300封閉液稀釋，山羊抗人Actin多抗按1∶500封閉液稀釋），封口后，室溫下平緩搖動反應(yīng)4 h. TBS洗滌后加入二抗稀釋液（PTEN， Actin的二抗均按1∶2000封閉液稀釋），同條件反應(yīng)1 h. 大量TBS洗滌去除未結(jié)合的二抗. ECL（化學(xué)發(fā)光）處理，暗箱中以X光膠片曝光，顯影、定影.
1.2.4MTT法測定HO8910PM細(xì)胞增殖抑制率取對數(shù)生長期細(xì)胞，以5×103/孔接種于96孔板培養(yǎng)，常規(guī)條件培養(yǎng)24 h后，吸棄培養(yǎng)基，換無血清RPMI1640培養(yǎng)基，按MOI=100加入病毒，設(shè)Adpten 組，Adgfp組，PBS空白對照組和本底對照組(只加完全培養(yǎng)液，不種細(xì)胞)，培養(yǎng)6 h后，換完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng). 每個時間點設(shè)6個平行孔，在指定時間(24，48，72 h)加入MTT (5 mg/mL) 20 μL/孔，孵育4 h后，小心吸棄孔內(nèi)上清液，加入DMSO 150 μL/孔，振蕩10 min，490 nm作為測定波長，570 nm作為參比波長，在酶標(biāo)儀上測定各孔的光吸收值. 細(xì)胞增殖抑制率=［1-實驗組（A570 nm-A490 nm）/本底對照組（A570 nm-A490 nm）］×100%.
1.2.5HE染色觀察細(xì)胞形態(tài)取指數(shù)生長期高轉(zhuǎn)移卵巢癌HO8910PM細(xì)胞，以5×104接種于35 mm培養(yǎng)皿中，24 h貼壁后，加入Adpten或Adgfp感染，并設(shè)加PBS為空白對照；病毒感染方法同1.2.4，24 h后棄培養(yǎng)基，生理鹽水漂洗，950 mL/L乙醇固定15 min，蘇木素染色3～10 min，自來水沖洗5～8 min， 5～10 mL/L鹽酸酒精分化數(shù)分鐘，自來水沖洗5～8 min，然后加溫?zé)崴?～10 min顯藍(lán)，自來水充分沖洗，伊紅復(fù)染2 min，再次用自來水充分沖洗，普通光學(xué)顯微鏡下觀察.
1.2.6細(xì)胞劃痕試驗取指數(shù)生長期高轉(zhuǎn)移卵巢癌HO8910PM細(xì)胞，按2×104/孔接種于6孔培養(yǎng)板，用RPMI 1640完全培養(yǎng)基孵育24 h后，用移液槍槍尖在細(xì)胞培養(yǎng)基表面劃一條痕跡（長約2 cm），用PBS洗3次后加入無血清RPMI1640培養(yǎng)基，病毒感染方法同1.2.4，設(shè)加PBS為空白對照，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后鏡下觀察.
1.2.7Hoechst33258凋亡染色取對數(shù)生長期HO8910PM細(xì)胞2×104/孔接種于6孔板，病毒感染方法同1.2.4，設(shè)加PBS為空白對照，48 h后用固定液固定10 min，PBS洗2次，Hoechst33258 染色5 min，熒光顯微鏡下觀察.
統(tǒng)計學(xué)處理: 本實驗采用SAS 8.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，用單因素方差分析(ANOVA)， P
2結(jié)果
2.1Adpten對HO8910PM細(xì)胞體外轉(zhuǎn)染效率的測定Adpten在體外感染人高轉(zhuǎn)移卵巢癌HO8910PM細(xì)胞具有較高的轉(zhuǎn)染效率. 在MOI=100時可以達(dá)到90%以上（圖1）.
A: 熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達(dá); B: 同一視野下光學(xué)顯微鏡觀察.
圖1Adpten(MOI=100)感染HO8910PM細(xì)胞的效果×200
2.2Western檢測轉(zhuǎn)染后PTEN蛋白的表達(dá)Western印跡分析結(jié)果表明，Adgfp感染后的HO8910PM細(xì)胞未見特異性條帶；而Adpten感染后的HO8910PM細(xì)胞，則見到特異性條帶，而且Pten蛋白表達(dá)量也較高（圖2）.
圖2Western Blot檢測PTEN蛋白的表達(dá)
2.3Adpten對HO8910PM細(xì)胞增殖的影響以MOI=100病毒感染后24，48，72 h，通過吸光度值計算，Adpten的抑制率分別為(89.76±1.49)%， (91.11±1.38)%， (92.38±1.78)%， 而Adgfp感染組分別為(8.14±2.16)%， (7.82±2.32)%， (6.16±2.86)%，二者比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P
2.4Adpten對HO8910PM細(xì)胞形態(tài)的影響重組腺病毒Adpten感染及非病毒感染(對照)的3組HO8910PM細(xì)胞， 經(jīng)HE染色光鏡下觀察可見，正常對照及Adgfp處理組細(xì)胞成片生長，細(xì)胞間隙緊密，胞質(zhì)舒展，核分裂現(xiàn)象明顯. Adpten處理組細(xì)胞則細(xì)胞間隙變大，胞質(zhì)紅，核固縮，易見凋亡小體(圖3).
A: PBS對照組; B: Adgfp處理組; C: Adpten處理組.
圖3Adpten感染對HO8910PM細(xì)胞形態(tài)的影響HE ×400
2.5Adpten對HO8910PM細(xì)胞遷移能力的影響重組腺病毒Adpten感染后的指數(shù)生長期高轉(zhuǎn)移卵巢癌HO8910PM細(xì)胞與對照組(PBS空白組和Adgfp組)比較，Adpten能有效地抑制HO8910PM細(xì)胞的遷移（圖4）.
2.6Adpten誘導(dǎo)HO8910PM細(xì)胞凋亡Hoechst 33258熒光染色結(jié)果顯示， 重組腺病毒Adpten感染HO8910PM細(xì)胞48 h后，Adpten感染組出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變，可見胞體縮小、胞漿濃縮、核染色質(zhì)聚集、核固縮，還可見膜包裹的凋亡小體. 而PBS對照組和Adgfp組的細(xì)胞均未發(fā)生形態(tài)學(xué)的改變（圖5）.
3討論
隨著分子生物學(xué)及分子遺傳學(xué)的發(fā)展，癌基因的激活和抑癌基因的突變失活，是目前較為公認(rèn)的腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要原因之一. 本文研究的抑癌基因pten，其突變和缺失常見于多種惡性腫瘤，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)系. 目前普遍使用的腫瘤的基因治療方法是導(dǎo)入外源性野生型抑癌基因補充或替代突變的抑癌基因.我們選用重組腺病毒載體導(dǎo)入抑A0，A1: PBS對照組; B0，B1: Adgfp處理組; C0，C1: Adpten處理組; A0， B0， C0: 0 h; A1， B1， C1: 感染后48 h.
癌基因pten，其極少發(fā)生插入突變，載體操作方便、宿主廣泛、容易繁殖，并具有攜帶外源基因容量大，可表達(dá)接近翻譯后成熟水平蛋白質(zhì)等特點，已廣泛用于多種疾病的體內(nèi)基因治療. 國外報道的AdEasy系統(tǒng)［9］除具有腺病毒載體的一般優(yōu)點外，還具備以下優(yōu)點：①在細(xì)菌體內(nèi)完成同源重組，重組效率高，周期短；②利用含不同抗生素篩選重組子，簡化了篩選工作；③經(jīng)重組的腺病毒帶有g(shù)fp基因，可直接通過熒光顯微鏡監(jiān)測病毒的生成，病毒滴度的測定和對宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的檢測都較傳統(tǒng)方法簡便易行. 我們利用AdEasy腺病毒載體系統(tǒng)構(gòu)建了攜帶野生型pten基因的重組腺病毒，導(dǎo)入人高轉(zhuǎn)移卵巢癌HO8910PM細(xì)胞，證實pten 基因在HO8910PM細(xì)胞中能高效地表達(dá). 通過MTT比色檢測，發(fā)現(xiàn)Adpten 對HO8910PM細(xì)胞具有顯著的增殖抑制作用，能有效地抑制該癌細(xì)胞生長. 細(xì)胞劃痕實驗證明Adpten能有效地抑制該癌細(xì)胞的遷移. Hoechst 33258 凋亡染色結(jié)果也表明pten具有誘導(dǎo)該癌細(xì)胞凋亡的作用.
本研究結(jié)果表明，攜帶野生型pten基因的重組腺病毒是一種高效的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，能將pten目的基因轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞中，對人高轉(zhuǎn)移卵巢癌HO8910PM細(xì)胞產(chǎn)生強有力的生長抑制及凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)，并能抑制該癌細(xì)胞遷移，為進(jìn)一步的基因治療卵巢癌的研究奠定了基礎(chǔ).
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篇8
【摘要】 ［目的］應(yīng)用重組骨形成蛋白4/7融合基因腺相關(guān)病毒載體（AAV BMP4/7）轉(zhuǎn)染兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs)，觀察其對BMSCs生物學(xué)行為的影響。［方法］（1）采用RTPCR一步法和基因重組法，從胎盤組織中克隆BMP4和BMP7成熟肽cDNA，獲取BMP4/7融合基因，克隆到質(zhì)粒pGEM質(zhì)粒中；（2）從pGEMBMP4/7質(zhì)粒中切取BMP4/7融合基因克隆到穿梭質(zhì)粒，在大腸桿菌內(nèi)重組，在293細(xì)胞中構(gòu)建AAVBMP4/7重組腺相關(guān)病毒載體；（3）不同MOI值的AAVBMP4/7轉(zhuǎn)染兔BMSCs，觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，MTT法描記細(xì)胞生物曲線，觀察對細(xì)胞增殖的影響，以AAVEDFP做對照；（4）AAVBMP4/7轉(zhuǎn)染兔BMSCs細(xì)胞7、14 d后，行ALP及OC含量測定，觀察成骨活性，以AAVEDFP做對照。［結(jié)果］（1）成功構(gòu)建高滴度的攜帶BMP4/7融合基因的重組腺相關(guān)病毒AAVBMP4/7；（2）AAVBMP4/7轉(zhuǎn)染BMSCs細(xì)胞后，細(xì)胞增殖活性良好，轉(zhuǎn)染效率為72%，細(xì)胞形態(tài)呈典型的成骨改變，1×105 vg/cell的MOI值對細(xì)胞形態(tài)影響較小，而轉(zhuǎn)染效率強于5×104vg/cell(59.38%)。（3）AAVBMP4/7轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，ALP、OC含量均明顯增高，并與轉(zhuǎn)染后誘導(dǎo)培養(yǎng)的時間呈正相關(guān)，與對照組比較差異統(tǒng)計學(xué)意義（tALP=896.88 P
【關(guān)鍵詞】 骨組織工程； 骨形成蛋白； 融合基因； 腺相關(guān)病毒； 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞
Abstract：［Objective］To determine the biological effects of transfection of adenoassociated rirus(AAV) BMP4/7 on rabbit bone marrow stromal cells (BMSCs).［Method］The mature peptide of BMP4 and BMP7 were gained by OneStep RTPCR from the human placenta and the BMP4/7 fusion gene was gained through gene recombinant techniques and then transferred to pGEM plasmid. The BMP4/7 fusion genen was cut down from the pGEMBMP4/7 and the recombination was successfully completed in colibacillus， and recombinant adenoassosiated was produced in 293 cells. Rabbit BMSCs were transfected with the recombinant adenoassosiated virus vectors carrying BMP4/7 fusion gene with differen multiplicitv of infection(MOI) values. Cell growth curves were drawn to evaluate the biologic effect of AAVBMP4/7 on cytoactivity. The transfection efficiency was measured using MTT method. The ossification of cells was evaluated by investigating the shape change of the cell ability of ALP and OC at 7，14 days after transfection. Cells were then transfected with AAVBMP4/7 and AAVEGFP，respectively.［Result］1.We successfully constructed the recombinant adenoassosiated virus with BMP4/7 fusion gene.2.The ttransfection efficiency of AAVBMP4/7 was roughly 72% without siginifficant biologic effect on cytoactivity.The ossification of cells was significant after transfection with AAVBMP4/7. The 1×105 vg/cell MOI value of transfection efficiency was stroger than 5～104 vg/cell MOI value (59.3，8%). 3. The concentrations of ALP and OC in AAVBMP4/7 transfection groups were significantbly higher than in AAVEGFP groups (tALP=896.88 P
Key words：bone tissue engineering; bone morphogenetic protein;fusion gene; adenoassociated virus; bone marrow stromal cells
骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)具有誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)向成骨或成軟骨細(xì)胞分化、促進(jìn)新骨形成的作用。BMPs家族已發(fā)現(xiàn)20余種成員，以BMP2、BMP4、BMP7的活性最強，它們可促進(jìn)軟骨和新生骨形成。在促進(jìn)骨及脊柱融合的實驗中已取得了成功的經(jīng)驗［1］，其中BMP4，7均表現(xiàn)出不同的促進(jìn)骨和脊柱融合的作用［2，3］。人體內(nèi)BMPs多為同源二聚體，也存在少量的異源二聚體，如BMP2／7， BMP4／7等。文獻(xiàn)報道BMPs異源二聚體比同源二聚體的活性高20倍［4，5］。
腺相關(guān)病毒(adenoassiciaed virus，AAV)具有高效轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞，長期穩(wěn)定表達(dá)外源基因及安全性好等特點［6］。本實驗通過構(gòu)建出融合基因BMP4／7的腺相關(guān)病毒載體(AAVBMP4／7)，觀察AAVBMP4／7轉(zhuǎn)染對兔BMSCs細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，從而探討B(tài)MP4／7融合基因是否具有促進(jìn)兔BMSCs細(xì)胞成骨活性，為骨組織工程提供新的治療思路。
1 材料與方法
1.1 實驗材料
OneStep RTPCR試劑盒(CLOTECH公司)，DNAMarker(大連寶生生物工程公司)，pGEMT，DMEM(哈爾濱弘博生物公司)，限制性內(nèi)切酶、Taq酶、T4連接酶(美國Promega公司)，PCR引物(上海Sigma生物制品公司)，堿性磷酸酶(ALP)檢測試劑盒(武漢博士德試劑公司)，骨鈣素(OC)檢測試劑盒(北京東亞免疫技術(shù)研究所)，重組增強型綠色熒光蛋白基因的腺相關(guān)病毒載體(adeno associated virusenhancement green fluore scent protein，AAVEGFP)(本元正陽公司提供)。
引物設(shè)計根據(jù)pGEMBMP4／7質(zhì)粒為測序模板，用pGEM兩側(cè)特異的引物進(jìn)行測序。
1.2 實驗方法
（1）兔BMSCs的體外培養(yǎng)：取健康新西蘭大白兔13只(由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)學(xué)院中心實驗室提供)，雄性，體重20 kg左右，2.5個月齡，按全骨髓法分離培養(yǎng)BMSCs，進(jìn)行原代培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合成單層后，消化傳代，取生長狀態(tài)良好的第3代細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染實驗。
（2）pGEMBMP4的構(gòu)建及鑒定：根據(jù)Gene Bank中和hBMP4的基因序列設(shè)計引物，上游引入EcoR I位點，下游引入BamH I位點，從胎盤組織中，RTPCR一步法擴(kuò)增BMP4成熟肽序列，將BMP4基因克隆入pGEMT載體中，獲得重組質(zhì)粒pGEMBMP4，然后用EcoR I和BamH I酶切pGEMBMP4質(zhì)粒，回收酶切片斷。T4連接酶16℃過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，DH5α感受肽細(xì)胞，篩選陽性克隆，獲得pGMEBMP4，EcoR I、BamH I雙酶切，進(jìn)行1.5％瓊脂糖凝膠電泳鑒定和PCR引物擴(kuò)增鑒定，以pGEM多克隆位點兩側(cè)特異引物進(jìn)行測序，與Gene Bank中的BMP4成熟肽序列比對。
(3)pGEMBMP7的構(gòu)建及鑒定：根據(jù)Gene Bank中hBMP7的基因序列設(shè)計引物，上游引入BamH I位點，下游引入PstI酶切位點，同實驗方法2步驟相同進(jìn)行pGEMBMP7的重組質(zhì)粒構(gòu)建、轉(zhuǎn)化、篩選、及相關(guān)的酶切1．5％瓊脂糖凝膠電泳鑒定和PCR引物擴(kuò)增鑒定，并進(jìn)行測序。
(4)AAVBMP4／7的構(gòu)建及鑒定：采用DNA連接法將BMP4與BMP7基因片段連接，得到BMP4／7融合基因，經(jīng)測序鑒定后，克隆到質(zhì)粒pGEM。從pGEMBMP4／7質(zhì)粒中切取BMP4／7融合基因克隆到穿梭質(zhì)粒，在大腸桿菌內(nèi)重組，在293細(xì)胞中構(gòu)建AAVBMP4／7重組腺病毒。用EcoRI、BamH I Pst I酶切鑒定分析，將AAVBMP4／7質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α細(xì)胞，大量提取腺相關(guān)病毒質(zhì)粒，取脂質(zhì)體Lipofectamine 2 000，按說明書轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，G418篩選培養(yǎng)，獲取抗約克隆細(xì)胞株。
(5)AAVBMP4／7轉(zhuǎn)染對細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響：取生長狀態(tài)良好的第3代細(xì)胞，0.25％胰蛋白酶消化后，接種到24孔板，每孔均勻接種105個細(xì)胞，培養(yǎng)至70％融合，進(jìn)行病毒感染，實驗按照AAV轉(zhuǎn)染細(xì)胞感染復(fù)數(shù)(Multiplicit of infection，MOI)值，按梯度選取4組不同MOI值，分別為5×104 vg／cell，1×105 vg／cell，5×105 vg／cell，1×106 vg／cell，每組6孔，按不同的MOI值，將各孔所需要的病毒量及血清DMEM，加入各孔，轉(zhuǎn)染2 h后，吸出病毒液，加入普通DMEM，常規(guī)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染后每24 h觀察細(xì)胞學(xué)改變。
(6)AAVBMP4／7轉(zhuǎn)染對細(xì)胞增殖活性的影響取MOI值為1×105 vg／cell的病毒轉(zhuǎn)染兔BMSCs (轉(zhuǎn)染組)2 h，取未轉(zhuǎn)染的BMSCs為對照組(非轉(zhuǎn)染組)。將細(xì)胞消化收集后，按1×104／孔接種于96孔板，于接種后12、24、48、72、96h，行MTT法測定細(xì)胞活性(λ630 nm)，并描記細(xì)胞生長曲線，比較兩組細(xì)胞增殖情況，觀察AAVBMP4／7轉(zhuǎn)染對細(xì)胞增殖活性的影響。
(7)AAV病毒的轉(zhuǎn)染效率：取生長狀態(tài)良好的第3代細(xì)胞，以1×105 vg／cell MOI值轉(zhuǎn)染2 h后，行流式細(xì)胞儀檢測綠色熒光表達(dá)，計算細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率(實驗重復(fù)6次)，5×104 vg／cell MOI值為對照。
(8)AAVBMP4／7轉(zhuǎn)染對細(xì)胞成骨活性的影響: 以AAVBMP4／7轉(zhuǎn)染細(xì)胞2 h(實驗組)后，培養(yǎng)7、14 d，在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)改變，觀察成骨分化，以AAVEGFP為對照病毒，進(jìn)行相應(yīng)實驗對照(對照組)(每組樣本量為6份)。于轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)7、14 d，分別收集兩組細(xì)胞上清液，按ALP檢測試劑盒說明處理上清，比色儀測定(520 nm，1 cm光鏡比色)，計算上清液中ALP的含量；另于轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)7、14 d，分別收集兩組細(xì)胞上清液，按照試劑盒說明檢測OC值， 收集細(xì)胞培養(yǎng)液100 μl，與125I標(biāo)記的OC抗體100 μl混合后，4℃下放置24 h，加入分離劑混勻后，室溫放置， 4℃離心棄去上清檢測沉淀物放射劑量，計算各組平均OC含量。
1.3 統(tǒng)計學(xué)處理
應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計學(xué)軟件包進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)用±s表示，組間比較采用兩組獨立樣本的t檢驗，P
2 結(jié) 果
2.1 pGEMBMP4 及pGEMBMP7的構(gòu)建與鑒定
從陽性克隆中提取pGEMBMP4質(zhì)粒及pGEMBMP7質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切后，進(jìn)行1.5％瓊脂糖凝膠電泳鑒定 和PCR引物擴(kuò)增鑒定，分別可見374、451 bp亮帶(圖1，2)測序結(jié)果與Gene Bank中報道的BMP4基因和BMP7基因成熟肽序列完全符合。
2.2 AAVBMP4／7的構(gòu)建與鑒定
成功獲得了AAVBMP4／7，經(jīng)雙酶切鑒定可見826 bp亮帶(圖3)，基因測序結(jié)果與Gene Bank中BMP4、 BMP7成熟肽基因序列一致，并成功在二者之間加入6個連接肽編碼基因。經(jīng)EcoR I、BamH I Pst I鑒定和相應(yīng)的PCR引物擴(kuò)增，在瓊脂糖凝膠電泳上，分別有374、451 bp的亮帶，(圖4)，說明成功獲得了BMP4、BMP7的融合基因，重組產(chǎn)生了攜帶融合基因BMP4／7的腺相關(guān)病毒質(zhì)粒。
圖1 BMP4重組質(zhì)粒雙酶切鑒定 圖2 PCR產(chǎn)物及BMP7重組質(zhì)粒酶切鑒定 圖3 融合基因克隆載體鑒定 M：DNAMarker 1.PGEM／BMP4，PGEM／BMP7，融合基因 2.PCR片斷 圖4 PBV222／BMP4／7表達(dá)質(zhì)粒酶切鑒定 1．丸DNA分子量標(biāo)準(zhǔn) 2．Eco RI與Pst I酶切質(zhì)粒AAVBMP4／7 3．BamH I、Pst I切質(zhì)粒AVVBMP4／7 4．Eco RI與BamHI酶切質(zhì)粒AAVBMP4／7 5．BMP7PCR片斷 6．BMP4PCR片斷 M：DNAMarker
2.3 AAVBMP4／7轉(zhuǎn)染對細(xì)胞學(xué)形態(tài)學(xué)的影響
以不同的MOI值分別轉(zhuǎn)染兔BMSCs細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后24 h，各組均可觀察到細(xì)胞形態(tài)變化，長梭形細(xì)胞收縮， 邊緣不規(guī)則，72 h后上述改變明顯，部分細(xì)胞失去BMSCs典型細(xì)胞形態(tài)，排列不規(guī)則，呈多角形或無規(guī)矩形。上述改變隨著MOI值地增大而顯著，5×104 vg／cell基本無明顯變化，1×105 vg／cell變化較輕，1×106 vg／cell組影響最明顯，部分細(xì)胞崩解(圖5)。
圖5 AAVBMP4／7轉(zhuǎn)染72 h后細(xì)胞改變 5a 5×104 vg／cell細(xì)胞無明顯變化 5b 1×105 vg／cell變化明顯，長梭形細(xì)胞收縮，邊緣不規(guī)則 5c 5×105 vg／cell細(xì)胞進(jìn)一步變化 5d 1×106 vg／cell部分細(xì)胞崩解(×200)2.4 AAVBMP4／7轉(zhuǎn)染對細(xì)胞增殖活性的影響
轉(zhuǎn)染組和非轉(zhuǎn)染組細(xì)胞于接種后12、24、48、72、96 h行MTT(λ=630 nm)法測定細(xì)胞活性，繪制生長曲線，結(jié)果表明兩組細(xì)胞倍數(shù)增殖期均出現(xiàn)于24 h，轉(zhuǎn)染組活性略低于未轉(zhuǎn)染組，但細(xì)胞增殖活躍，提示AAV對細(xì)胞生長曲線的影響小(圖6a、b)。
圖6 AAVBMP4／7轉(zhuǎn)染對細(xì)胞增殖活性的影響及轉(zhuǎn)染BMSCs細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率 6a MOI值1×105 vg／cell轉(zhuǎn)染 6b MOI值5×104 vg/cell轉(zhuǎn)染
2.5 AAVBMP4／7轉(zhuǎn)染效率檢測
取生長狀態(tài)良好的第3代細(xì)胞，以MOI值1×105 vg／cell轉(zhuǎn)染，流式細(xì)胞儀計算轉(zhuǎn)染效率，平均轉(zhuǎn)染效率為72％，MOI值時對細(xì)胞形態(tài)影響較小，而轉(zhuǎn)染效率強于5×104 vg／cell(59.38％)。 (x2=15.58，P
2.6 AAVBMP4／7對細(xì)胞成骨活性的影響
(1)倒置相差顯微鏡觀察：取AAVBMP4／7轉(zhuǎn)染組及AAVEGFP轉(zhuǎn)染組細(xì)胞，于轉(zhuǎn)染后7、14 d，倒置相差顯微鏡觀察，可見AVBMP4／7組于轉(zhuǎn)染后7 d，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，起初細(xì)胞分布不均勻，出現(xiàn)局部密集，局部疏松，細(xì)胞呈多角形，高倍視野下可見胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕褐色顆粒，呈現(xiàn)明顯的成骨改變。14 d后可見細(xì)胞呈復(fù)層生長，胞漿內(nèi)棕褐色顆粒更加明顯，可見細(xì)胞性鈣結(jié)節(jié)形成。AAVEGFP組僅見細(xì)胞收縮，邊緣不規(guī)則，無成骨細(xì)胞分化的特異改變(圖7)。
圖7 AAVBMP4／7轉(zhuǎn)染后倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 7a 轉(zhuǎn)染7 d細(xì)胞分布不均勻；掃現(xiàn)局部密集，局部疏松，細(xì)胞呈多角形，町見胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕褐色顆粒(×200)
7b 轉(zhuǎn)染14 d細(xì)胞呈復(fù)層生長，胞漿內(nèi)棕褐色顆粒更加明顯(×200) 7c AAVEGFP轉(zhuǎn)染組細(xì)胞無明顯變化(×200)
(2)ALP含量測定：取兩組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，7、14 d細(xì)胞上清液，計算ALP含量，AAVBMP4／7組分別為：67.2±8.4金氏單位，106.5±12.1金氏單位，AAVEGFP組分別為：10.1±2.7金氏單位，23.6±4.8金氏單位，兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=896.88，P
(3)OC含量測定：取兩組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后7、14 d的細(xì)胞上清液，計算OC含量，AAVBMP4／7組分別為0.289±0.014 ng／ml，0.363±0.076 ng／ml；AAVEGFP組分別為0.011±0.007 ng／ml，0.017±0.010 ng／ml，兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=543.24， P
3 討 論
BMPs在細(xì)胞生長及骨形成過程中扮演關(guān)鍵角色，一直被廣大學(xué)者所關(guān)注［7，8］。在已發(fā)現(xiàn)的20余種BMPs中，BMP2、BMP4、BMP7的骨誘導(dǎo)能力最強，尤其是BMP4，新近的研究證實重組人BMP4促進(jìn)脊柱融合的作用強于重組人BMP2，所需劑量僅為重組BMP2的1／10，且成骨量與劑量呈正相關(guān)［9，10］。由于BMPs在體內(nèi)異源二聚體活性高于同源二聚體，故本實驗在目的基因的選擇上，選擇了BMP4與BMP7，將二者成熟肽序列成功克隆，利用DNA重組技術(shù)將BMP4、BMP7成熟肽基因融合，將融合基因成功克隆到穿梭質(zhì)粒，在大腸桿菌內(nèi)重組，獲取AAVBMP4／7質(zhì)粒，在293細(xì)胞中成功穩(wěn)定表達(dá)，為進(jìn)一步研究異源二聚體BMP4／7對骨髓基質(zhì)干細(xì)胞是否具有促進(jìn)骨形成的作用打下實驗基礎(chǔ)。
AAV基因組可以整合入宿主細(xì)胞的基因組DNA中，保證了外源基因長期穩(wěn)定表達(dá)。AAV末端重復(fù)序列中的轉(zhuǎn)錄元件方向不指向宿主DNA，插入突變的可能性很小。該病毒載體還可整合入分裂及非分裂期細(xì)胞，宿主范圍較寬［11，12］，因而在應(yīng)用基因工程技術(shù)解決重組基因獲得持續(xù)表達(dá)的問題中，AAV可作為較合適的病毒載體，是目前基因治療基礎(chǔ)和臨床研究中最常用的載體之一。
目前文獻(xiàn)中報道AAV轉(zhuǎn)染細(xì)胞的MOI值差異很大，從1×104～1×106 vg／cell，均有報道［12，13］。本實驗通過采用不同梯度的MOI值轉(zhuǎn)染細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，1×105 vg／cell對細(xì)胞形態(tài)影響較小，對細(xì)胞增殖活性無明顯影響，轉(zhuǎn)染效率為72％，明顯高于文獻(xiàn)中報道的脂質(zhì)體感染率20%～30％。有學(xué)者報道5×104 vg／cell即可達(dá)到良好的轉(zhuǎn)染效率(55%～65％)，對細(xì)胞增殖活性影響也較小［14］。本實驗結(jié)果認(rèn)為，1×105 vg／cell MOI值轉(zhuǎn)染效率高于5×104 vg／cell MOI值，前者可作為常規(guī)選取的MOI值，既保證了一定的轉(zhuǎn)染病毒量，同時也保證了良好的轉(zhuǎn)染效率，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，與文獻(xiàn)［14］報道的轉(zhuǎn)染效率間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
BMSCs屬成骨干細(xì)胞，是具有向多種細(xì)胞系轉(zhuǎn)化潛能的基質(zhì)干細(xì)胞，在一定外界環(huán)境及刺激因子的作用下實現(xiàn)跨系統(tǒng)分化，具有取材方便，易培養(yǎng)等特點，是組織工程良好的種子細(xì)胞來源［15］。本實驗應(yīng)用AAVBMP4／7轉(zhuǎn)染BMSCs，相對于對照組，細(xì)胞形態(tài)由梭形細(xì)胞向多角形、立方形轉(zhuǎn)化，呈現(xiàn)明顯的成骨改變，隨著轉(zhuǎn)染時間的延長，上述特征性改變更加明顯，說明BMP4／7融合基因有成骨活性，與轉(zhuǎn)染時間成正相關(guān)。
研究表明，BMPs在骨發(fā)生的過程中主要起3個作用：促進(jìn)細(xì)胞的趨化、有絲分裂和細(xì)胞分化。BMSCs分化為成熟的成骨細(xì)胞的復(fù)雜過程，是由于許多的系統(tǒng)因子、旁分泌因子和自分泌因子的相互作用完成的。在培養(yǎng)的BMSCs中加入BMPs進(jìn)行誘導(dǎo)，成骨細(xì)胞的過程被誘發(fā)時，向成骨細(xì)胞分化的重要表現(xiàn)是細(xì)胞合成分泌表達(dá)成骨特征性蛋白和細(xì)胞外基質(zhì)成分，如堿性磷酸酶(ALP)和骨鈣素(OC)是常用的檢測指標(biāo)。細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察顯示，AAVBMP4／7轉(zhuǎn)染細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)后的7、14 d細(xì)胞呈現(xiàn)成骨活性，且活性逐漸增強，而對照組AAVEGFP未見明顯的成骨活性。AAVBMP4／7轉(zhuǎn)然后誘導(dǎo)培養(yǎng)7、14 d，細(xì)胞上情液中ALP、OC的含量均明顯增加，并隨著誘導(dǎo)培養(yǎng)時間的延長而遞增， AAVEGFP對照組ALP、OC的含量無明顯增加，結(jié)果證實了通過AAV轉(zhuǎn)染的BMP4／7融合基因有誘導(dǎo)成骨活性，說明BMP4／7融合基因有生物學(xué)活性。
綜上，本實驗成功將BMP4、BMP7連接并構(gòu)建了融合基因BMP4／7，通過AAVBMP4／7轉(zhuǎn)染BMPSs，初步探討了AAVBMP4／7對靶細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，結(jié)果表明，BMP4／7有生物學(xué)活性，可通過AAV在靶細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)，可加速BMSCs向骨表型轉(zhuǎn)化，促進(jìn)骨形成。本實驗為骨組織工程的基因治療提供了一個新的思路，為嘗試用BMPs的融合基因有效提高成骨活性，提供實驗研究基礎(chǔ)。
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篇9
【摘要】
本研究探討轉(zhuǎn)染survivin(SVV)基因的樹突狀細(xì)胞(DC)體外誘導(dǎo)特異性抗淋巴瘤的免疫效應(yīng)。對人外周血DC進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，以AdSVV轉(zhuǎn)染DC，用Western blot 鑒定Survivin的表達(dá)，用乳酸脫氫酶(LDH)釋放法檢測細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）反應(yīng)，用混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)（MLR）測定DC刺激同種異體淋巴細(xì)胞增殖的能力，以ELISA法檢測上清中的細(xì)胞因子IL12含量。結(jié)果表明：在MLR中，刺激應(yīng)答比（S/R）為1∶5、1∶10、1∶50和1∶100時，轉(zhuǎn)染AdSVV的DC有較強刺激同種異體淋巴細(xì)胞增殖的能力；轉(zhuǎn)染AdSVV的DC組所誘發(fā)的CTL活性明顯高于對照DC組；轉(zhuǎn)染病毒后第2天，轉(zhuǎn)染AdSVV的DC組的IL12分泌水平高于對照DC組。結(jié)論：含存活蛋白基因的DC能夠在體外誘導(dǎo)特異性CTL效應(yīng)，對CA46細(xì)胞有明顯的殺傷作用。
【關(guān)鍵詞】 survivin基因 樹突狀細(xì)胞 CA46細(xì)胞系 淋巴瘤 細(xì)胞毒性T細(xì)胞 免疫治療
Induction of Antilymphoma Cytotoxic T Cell Effect by Dendritic Cells Transfected with Recombinant Adenovirus Vectors Carrying Survivin Gene
Abstract
This study was purposed to investigate the immunological effects of modified dendritic cells (DCs) in inducing cytotoxic T cells (CTLs) effect against lymphoma cells. The DCs were derived from human peripheral blood and transfected with recombined adenovirus vector carrying survivin gene， Western blot was used to detect the expression of survivin， the lactate dehydrogenase (LDH) release test was used to determine the cytotoxicity of CTLs， the mixed lymphocyte reaction (MLR) was used to measure the ability to proleferate allolymphocyte by DCs， ELISA was used to assay IL12 level in supernatant.
The results showed that the expression of survivin in transfected dentritic cells was confirmed by Western blot analysis. In MLR assay， DCs transfected with Adsurvivin could induce higher allogeneic lymphocytes reaction at the ratios of 1∶5，1∶10，1∶50 and 1∶100. DCs transfected with Adsurvivin had much higher activity of CTL to CA46 cells than control DCs. The levels of IL12 of supernatants containing DCs transfected with Adsurvivin were significantly higher than that in the control group. It is concluded that DCs transfected with Adsurvivin can induce CTL response in vitro against lymphoma cells.
Key words
survivin gene； dendritic cell； CA46 cell line; lymphoma; cytotoxic T cell; immunotherapy
樹突狀細(xì)胞(dendritic cell， DC)作為機體內(nèi)功能最強的專職抗原呈遞細(xì)胞(APC)，在激活T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)中起關(guān)鍵性作用，而survivin（存活蛋白，SVV）基因是腫瘤組織較為特異的基因，其編碼的蛋白survivin成為腫瘤較理想的靶抗原之一。因此，我們以重組腺病毒介導(dǎo)SVV基因修飾DC，觀察誘導(dǎo)產(chǎn)生的特異性抗淋巴瘤免疫效應(yīng)，為以DC為基礎(chǔ)腫瘤免疫治療提供實驗依據(jù)。
材料和方法
材料
表達(dá)survivin蛋白的重組腺病毒（AdSVV）由本所構(gòu)建、包裝［1］，滴度為： AdSVV 2.65×109pfu/ml；惡性淋巴瘤細(xì)胞株CA46為本室保存株。總蛋白裂解酶、蛋白酶抑制劑為美國Pierce公司產(chǎn)品；兔抗人survivin多克隆抗體為北京中杉生物技術(shù)公司產(chǎn)品；辣根標(biāo)記山羊抗兔IgG、Westernblotting lunimol試劑（ECL）為Santa Cruz 公司產(chǎn)品。Cytotox96 NonRadioactive Cytotoxicity Assay試劑盒購自Promega公司。細(xì)胞因子IL12檢測試劑盒購自深圳晶美生物公司。
中國實驗血液學(xué)雜志 J Exp Hematol 2007; 15(3)轉(zhuǎn)染存活蛋白基因的樹突狀細(xì)胞抗淋巴瘤免疫的研究 DC的分離、培養(yǎng)和病毒感染
人外周血DC的分離和培養(yǎng)參照文獻(xiàn)［1］，收集培養(yǎng)第7天的DC，按MOI為100加入重組腺病毒，分為3組： 轉(zhuǎn)染AdSVV的DC組(AdSVV DC)、空載體轉(zhuǎn)染DC組（AdCMVDC）和未轉(zhuǎn)染DC組（NDC），并補充生長因子GMCSF、IL4（終濃度均為1 000 U/ml）。于37℃ 5% CO2，培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48小時 (第9天)收集細(xì)胞。
Survivin蛋白表達(dá)的Western blot鑒定
收集第9天轉(zhuǎn)染AdSVV的DC組和空載體轉(zhuǎn)染DC組的DC，進(jìn)行蛋白質(zhì)抽提，SDSPAGE電泳，Western blot鑒定外源基因SVV蛋白的表達(dá)［1］。
同種混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)測定
取培養(yǎng)第9天的AdSVVDC和NDC，分別加入絲裂霉素C，使其終濃度為50 μg/ml，在37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)45分鐘，作為刺激細(xì)胞。分別以2×104/孔、1×104/孔、2×103/孔、1×103/孔將DC加入96孔板中，以T淋巴細(xì)胞供者自身的PBMC為對照組，每組設(shè)3個復(fù)孔。每孔均加入1×105的T淋巴細(xì)胞，刺激反應(yīng)細(xì)胞之比（S/R）分別為1∶5，1∶10，1∶50，和1∶100，終體積200 μl，于37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96小時。終止培養(yǎng)前4小時加入MTT 20 μl（5 mg/ml），培養(yǎng)終止后加DMSO 200 μl，充分混勻后靜置。選擇波長為570 nm處測OD570值。計算刺激指數(shù)（SI），結(jié)果以3孔的均值表示。
刺激指數(shù)（SI）=實驗孔OD均值/對照孔OD均值
CTL細(xì)胞體外殺傷活性的檢測
效應(yīng)細(xì)胞的制備 取培養(yǎng)第9天的AdSVVDC組細(xì)胞和NDC組細(xì)胞各5×105，作為刺激細(xì)胞，加入到24孔培養(yǎng)板中，按5×106/孔加入經(jīng)T細(xì)胞尼龍毛柱分離的T淋巴細(xì)胞（反應(yīng)細(xì)胞）；同時以不與DC共孵育的自體淋巴細(xì)胞為對照，每組設(shè)3個復(fù)孔。加入IL2（500 U/ml），于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。以后隔天半量換液，并補充IL2，繼續(xù)培養(yǎng)至第14天，作為效應(yīng)細(xì)胞。
CTL的活性測定 以1×104∕孔加靶細(xì)胞（CA46）到96孔板中，再分別按5∶1、10∶1、20∶1（效應(yīng)細(xì)胞∶靶細(xì)胞）加效應(yīng)細(xì)胞到各孔中，每組設(shè)3個復(fù)孔。同時設(shè)4個對照:靶細(xì)胞最大釋放組、體積校正對照組、背景對照組和自然釋放組。按Cytotox96 NonRadioactive Cytotoxicity Assay試劑盒說明書檢測CTL反應(yīng)，以對靶細(xì)胞的殺傷率表示CTL活性。
細(xì)胞殺傷率(%)= ［（實驗組釋放-效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放-靶細(xì)胞自發(fā)釋放）/（靶細(xì)胞最大釋放-靶細(xì)胞自發(fā)釋放）］×100%
細(xì)胞因子的檢測
收集培養(yǎng)AdSVVDC以及NDC的當(dāng)天、第2天、第4天上清，按試劑盒說明書方法進(jìn)行IL12含量檢測。
統(tǒng)計學(xué)處理
本實驗數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 11.5 統(tǒng)計軟件進(jìn)行方差分析。
轉(zhuǎn)貼于
結(jié)
果
存活蛋白的表達(dá)
經(jīng) Western blot檢測，轉(zhuǎn)染AdSVV的DC在16.5 kD處可見一陽性條帶（附圖），提示經(jīng)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的DC可有效表達(dá)SVV蛋白，而未轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的DC未檢出SVV蛋白表達(dá)。
Figure . Expression of SVV protein detected by Western blot. M: marker. Lane 1: AdCMVtransfected DC. Lane 2: AdSVVtransfected DC.
刺激同種異體淋巴細(xì)胞增殖的能力
在不同的S/R（刺激細(xì)胞/應(yīng)答細(xì)胞為1∶5、1∶10、1∶50、1∶100）比值時，轉(zhuǎn)染AdSVV的DC與未轉(zhuǎn)染的DC比較，具有更強刺激同種異體淋巴細(xì)胞增殖的能力（P
CTL殺傷活性的檢測
在效靶比（E/T）為5∶1、10∶1和20∶1時，轉(zhuǎn)染AdSVV的DC（AdSVVDC）所誘發(fā)的CTL活性均值分別為23.48％、38.24％和46.76%，未轉(zhuǎn)染的DC（NDC組）誘發(fā)的CTL活性為7.32%、8.83%、14.72%，兩組間的CTL活性有顯著性差異（P
細(xì)胞因子的檢測
在轉(zhuǎn)染病毒后第2天、第4天，AdSVVDC組和NDC組的IL12分泌水平分別為50.7±3.2 pg/ml和56.4±2.7 pg/ml及36.5±1.8 pg/ml和42.3±2.6 pg/ml。AdSVVDC組的IL12分泌水平高于NDC（P
討
論
非霍奇金淋巴瘤（NHL）的發(fā)病率及死亡率均有上升趨勢，傳統(tǒng)治療難以徹底消滅腫瘤細(xì)胞，因此如何進(jìn)一步提高療效并最終根治本病，已成為目前研究的熱點和難點。近年來，對樹突狀細(xì)胞在腫瘤抗原呈遞和腫瘤免疫中重要作用的揭示， 開拓了腫瘤免疫治療的又一新領(lǐng)域。腫瘤疫苗即腫瘤的特異性主動免疫治療，近年來取得了可喜進(jìn)展，其中尤以DC疫苗的進(jìn)展最為矚目［2，3］。
Survivin基因是一個抗凋亡基因，它在大多數(shù)腫瘤組織中表達(dá)，而在正常成人組織中不表達(dá)。業(yè)已證明，HL60、K562、CA46、U266等血液腫瘤細(xì)胞系均高表達(dá)survivin［4，5］。因此，應(yīng)用靶向survivin的免疫治療有望成為一種重要的抗腫瘤療法。Schemitz 等［6］將自身DC與可溶性重組survivin共培育，誘導(dǎo)出survivin特異性的CD8+ CTL，首次證實了survivin可作為一種潛在應(yīng)用價值的腫瘤疫苗抗原。
本實驗用重組腺病毒介導(dǎo)SVV基因轉(zhuǎn)染DC，通過檢測證實DC能夠表達(dá)SVV抗原蛋白，轉(zhuǎn)染后成熟DC仍具有較強刺激同種異體T淋巴細(xì)胞增殖和分泌細(xì)胞因子的能力。此研究結(jié)果說明Ad能夠高效介導(dǎo)目的基因感染DC，重組腺病毒不影響DC的成熟及其功能，是目前基因治療研究中較為理想的載體。
在研究靶細(xì)胞毒性實驗中，我們應(yīng)用CytoTox 96 非放射試劑盒測量乳酸脫氫酶（LDH）在細(xì)胞裂解后的釋放量，結(jié)果表明轉(zhuǎn)染survivin基因的DC在體外能誘導(dǎo)特異性CTL，殺傷淋巴瘤細(xì)胞。這提示用重組腺病毒載體介導(dǎo)survivin基因的DC疫苗可能是抗淋巴瘤治療中有效的方法。
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篇10
作者：張惠中 范清宇 楊安鋼
【關(guān)鍵詞】 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體
關(guān)鍵詞: 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體;包裝細(xì)胞;集落形成單位
摘 要:目的 探討產(chǎn)生重組逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞系建立及其病毒滴度（以cfu表示）的影響因素. 方法 用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pSLXCMV，以磷酸鈣共沉淀法轉(zhuǎn)染PA317包裝細(xì)胞，挑選抗性集落（PA317/pSLXCMV）擴(kuò)大培養(yǎng)后，進(jìn)行PA317/pSLXCMV細(xì)胞接種密度、培養(yǎng)溫度（37℃，32℃）、純化方法等對其培養(yǎng)上清中重組病毒cfu影響的比較性研究. 結(jié)果 包裝細(xì)胞的密度是影響cfu滴度的關(guān)鍵因素;降低培養(yǎng)溫度需延長培養(yǎng)時間方可提高cfu滴度;對比離心純化與過濾純化，并未發(fā)現(xiàn)兩者之間的差異. 結(jié)論 該實驗結(jié)果為應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體進(jìn)行的ex vivo基因治療實驗研究提供重要參考指標(biāo).
Keywords:retroviral vector;packaging cell;colony-forming units
Abstract:AIM To optimize the methods of manufacturing retrovirus containing supernatant of PA317packaging cell line for the use in the retroviral-mediated gene transfer.METHODS Studies were conducted using pSLXCMV retro-viral vector.The colony forming unit（cfu）influence factors including packaging cell density，incubation temperature（32℃and37℃），incubation time and different purification method were compared，respectively.RESULTS Results demonstrated that1.2×106 PA317 packaging cells seeded in100mm plate with the incubation condition at37℃for24hours could get the highest cfu titer of retroviral containing supernatant.As for purification，there was no significant dif-ference between filter and centrifugation methods.CONCLUSION These results will be useful for those who use retrovi-ral vector for ex vivo gene therapy experiment.
0 引言
在目前眾多的基因治療臨床試驗方案中，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體仍是被廣泛應(yīng)用的載體之一［1-4］ .作為目的基因轉(zhuǎn)運過程中的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和包裝細(xì)胞，其本身的分子生物學(xué)特性已被廣泛研究，但對于包裝后這些含目的基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒之生物、物理學(xué)特性（如病毒對溫度的敏感性、純化方法等的影響）的研究卻較少.為此，我們對產(chǎn)生重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝細(xì)胞系的建立過程及其上清中重組逆轉(zhuǎn)錄病毒集落形成單位（colony forming unit，cfu）影響因素進(jìn)行了比較性研究.
1 材料和方法
1.1 材料 本實驗所用表達(dá)載體為含有新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（neo）的鼠白血病源性逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體pSLXCMV，PA317包裝細(xì)胞及Swiss小鼠成纖維細(xì)胞NIH3T3培養(yǎng)于含100mL?L-1 小牛血清（GIBCO-BRL）的DMEM培養(yǎng)液中.
1.2 方法
1.2.1 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包裝及包裝后cfu滴度測定 以標(biāo)準(zhǔn)的磷酸鈣共沉淀法（Promega，Inc.Kit）轉(zhuǎn)染20μg pSLXCMV質(zhì)粒到PA317細(xì)胞14h，換液繼續(xù)培養(yǎng)24h，換含500mg?L-1 G418（Geneticin）的培養(yǎng)液直至抗G418的集落形成，挑選60個克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)，測定包裝細(xì)胞上清中病毒的cfu;接種2.5×105 NIH3T3細(xì)胞，次日移出培養(yǎng)液，加入10-2 ，10-4 ，10-6 稀釋的含重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝細(xì)胞上清1mL.4h后加入5mL完全DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)18～24h.換含有500mg?L-1 G418培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)7～10d，直至抗性集落形成.結(jié)晶紫染色，計算三個梯度中的cfu（Fig1）.
圖1 略
1.2.2 包裝細(xì)胞接種密度對其上清中病毒cfu的影響 分別以0.5，0.7，0.9，1.2及1.5×106 不同細(xì)胞密度接種產(chǎn)病毒包裝細(xì)胞，于相同溫度及相同培養(yǎng)時間條件下制備含重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝細(xì)胞上清，并于相同的條件下測定它們的cfu滴度.
1.2.3 培養(yǎng)溫度及培養(yǎng)時間對cfu滴度的影響 取最高cfu的包裝細(xì)胞系集落，以相同的密度接種細(xì)胞，分別在37℃及32℃的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，并于24h及48h分別收集細(xì)胞上清測定病毒cfu滴度.
1.2.4 離心及過濾純化對包裝細(xì)胞上清中病毒cfu影響 選擇高cfu滴度的包裝細(xì)胞克隆用以制備含重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的細(xì)胞上清，分別用1500g離心10min純化及Acrylic.45Micron濾器（Corning Inc）純化，測定cfu，比較它們之間cfu滴度的變化.
2 結(jié)果
在以pSLXCMV質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的PA317細(xì)胞中挑選60個G418抗性細(xì)胞集落，并分別于培養(yǎng)1wk和10wk測定cfu.其中4個克隆# 17，# 19，# 28，# 34于1wk的cfu分別為2.8，3.3，1.8，2.2（colonies?L -1 ），而在10wk測得的cfu分別為1.6，2.7，0.9，0.8（colonies?L-1 ）.
接種0.5，0.7，0.9，1.2及1.5×106 轉(zhuǎn)染后包裝細(xì)胞，24h收集上清測定cfu，結(jié)果cfu隨細(xì)胞密度上升而上升（Fig2）.在PA317/pSLXCMV包裝細(xì)胞密度相同條件下降低溫度需延長培養(yǎng)時間，我們在32℃條件下培養(yǎng)48h獲得了3.0×109 ?L-1 的cfu滴度.
取同一來源的同一份PA317/pSLXCMV包裝細(xì)胞上清，分別經(jīng)離心及過濾除去細(xì)胞及細(xì)胞碎片等，然后以相同的條件測定cfu滴度.結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)明顯的差別. 轉(zhuǎn)貼于
圖2 略
3 討論
目的基因?qū)氚屑?xì)胞是整個基因治療過程中一個重要環(huán)節(jié)，其效率的高低將直接影響整個基因治療的效果甚至成敗，而包裝后逆轉(zhuǎn)錄病毒滴度的高低是重要參數(shù)之一.我們從逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染的PA317包裝細(xì)胞中挑選了60個G418抗性細(xì)胞集落，經(jīng)測定僅有4個集落cfu>106 .經(jīng)1W至10W傳代培養(yǎng)后測定cfu，所有4個在1W cfu很高的細(xì)胞集落經(jīng)10W傳代培養(yǎng)后其cfu滴度均有所下降，其中#28及#34的cfu
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