基因治療范文

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關鍵詞基因治療;治療方式;發展前景

中圖分類號r459.9文獻標識碼a文章編號 1007-5739(2010)01-0025-01

美國是世界上最早開展基因治療的國家,也是目前開展基因治療最多的國家。我國在1991年7月開始基因治療的臨床研究,最早的工作是對b型血友病的基因治療及利用抑癌基因對癌癥的基因治療[1]。基因治療目前主要用于治療對人類健康威脅嚴重的疾病,包括遺傳病、惡性腫瘤、心血管疾病、感染性疾病等[2]。

1基因治療的方式

1.1體內基因治療

體內基因治療是指將具有治療功能的基因直接轉入病人的某一特定組織中。利用反轉錄病毒載體已成功地將真核基因轉入動物細胞,但通過質粒dna的直接操作,將更加省時而且產量較高;采用溫和病毒載體的體內基因治療主要是通過腺病毒和單純皰疹病毒來完成的,即將載有矯正基因的載體直接注射入需要這些基因的組織。以腺病毒為載體的體內療法在遺傳性疾病方面,目前主要見于囊性纖維變性的基因治療研究。多數研究表明,基因治療糾正了呼吸道上皮的氯離子轉運缺陷,使跨上皮基礎電位下降,肺功能有所改善[3]。

1.2反義療法

反義療法主要是通過阻遏或降低目的基因的表達而達到治療的目的。反義療法是通過引入目的基因的rna的反義序列而達到上述目的。當引入的反義rna與mrna相配比后,用于翻譯的mrna的量就大大減少,因而合成的蛋白的量也相應大大減少。引入的反義序列也可能與基因組dna互補配對,從而阻遏mrna的轉錄。這2種情況都會使細胞中靶基因編碼的蛋白合成大大減少,以達到基因治療的目的。

1.3通過核酶的基因治療

20世紀80年代初,美國科學家cech和altman發現了核酶,核酶是指由rna組成的酶,能夠序列特異性地抑制靶mrna。近年來,核酶在抑制癌基因的表達[4]、增強腫瘤對藥物的敏感性及抑制腫瘤血管的生成等方面的應用得到了廣泛的研究。

1.4自殺基因療法

自殺基因療法是惡性腫瘤基因治療領域最有希望的方法之一,已廣泛用于各種惡性腫瘤的基礎研究和臨床試驗性治療。它是用藥物敏感基因轉染腫瘤細胞,其基因表達的產物可以將無毒性的藥物前體轉化為有毒性的藥物,影響細胞的dna合成,從而引起該腫瘤細胞的死亡。

2基因治療存在的問題

2.1基因治療的社會和倫理問題

基因治療不僅僅是一種醫療方法,它還涉及很多其他問題。因為當人們試圖“糾正”人類自身“不正常”的基因時,這種糾正的后果是無法預料的。由于人類的遺傳信息非常復雜,轉基因也可能帶來不可預料的后果,沒有人能保證這種基因結構的改變絕對不會造成人類某一未知功能的缺失。另外,當人們試圖把基因治療引入生殖細胞時,又涉及后代基因結構的改變問題,且改變將直接影響這個“未來人”,這是一個很難解決的倫理問題。

2.2基因治療的技術問題

目前,基因治療的對象是單基因的缺陷,但許多疾病涉及多個基因之間復雜的調控和表達關系。對這類疾病的基因治療難度很大,因為向細胞中導入多個基因后,使幾個基因之間能保持正常的調控關系幾乎是不可能的。即使是單基因缺陷癥,使導入細胞的基因能正常表達也是一個較復雜的問題。將基因導入細胞后,其表達量的多少是直接影響能否達到治療的目的和有無副作用的關鍵。但這個問題將會在人類基因組計劃完成的基礎上,對人類后基因組計劃的開展,弄清了人類基因之間復雜的調控聯系后而最終得到解決。只有這樣,才能在基因治療中盡量做到使導入的基因處于正確的調控下,取得治療效果,消除副作用。

3展望

以基因轉移為基礎的基因治療要在臨床上很好地應用,還有待理論和各種技術的進一步發展。過去20~30年基因治療的發展已取得了巨大成就,已被看成是對先天和后天基因疾病的潛在有效的治療方法,不過其依然存在缺少高效的傳遞系統、缺少持續穩定的表達和宿主產生免疫反應等問題。今后基因治療研究將向2個方向發展:一是基礎研究更加深入,以解決在臨床應用中遇到的一些困難及基因治療本身需要解決的一些難點;二是臨床試用項目增多,實施方案更加優化,判斷標準更加客觀,評價效果更加精確。總之,隨著分子生物學、分子遺傳學以及臨床醫學的發展,基因治療也會不斷發展,日趨成熟,很多難題會得到解決,并在臨床上得到廣泛應用。 編輯整理

4參考文獻

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但是其在醫學上的價值人類依舊不能過于樂觀。

一直備受人關注的人類基因圖譜最近再次迎來了“喜訊”：由中、美、英等國共同發起的大型國際合作項目“千人基因組計劃”最新研究成果10月31日在《自然》在線發表。該協作組公布了1092個高分辨率人類基因組遺傳變異整合圖譜。

基因治療采取極為謹慎態度

“千人基因組計劃”從實施到現在，已經整整5年時間。

不過在中國科學院基因研究所醫學博士甄二真看來，盡管在科學研究上，這樣的測序有著比較大的價值和意義，但是實際應用到人類的健康和疾病治療，依舊還有很長的路要走。

“就算能夠將導致一些疾病發生的基因片段或者特定位置找出來，現在人類對它們實際上還是無能為力。”甄二真說。

隨著基因科學和技術的發展，目前國內外的很多實驗室已經可以通過敲除、關閉、替換具體基因片段或者特定位置的方式對老鼠等一些實驗動物進行部分遺傳性疾病的治療實驗，但是，這樣的實驗目前依舊停留在實驗室階段。

“基因領域中有很多東西對人類而言還十分陌生，盡管人類現在已經了解到人體的一些基因片段或者特定位置的變異是某類疾病的緣由，但是將其敲除、關閉或者替換，會出現什么樣的結果，存在很大的不確定性。因此人類當前實施這樣的手術在安全性上得不到充分的保證。”甄二真說。

國家人類基因組南方研究中心研究員韓澤廣近些年來一直在基因方向上進行肝癌的研究，但現在還沒有可靠的方法改造突變基因來治療癌癥。

韓澤廣說，因為倫理上的一些風險和爭議，目前世界各國對于人類基因工程治病一直采取的都是一種極為審慎的態度。

基因治療存在炒作質疑

人類基因組計劃從1990年正式啟動、先后共有美國、英國、法國、德國、日本和中國共6個國家的眾多科學家共同參與，其預算高達30億美元。但是，最近國內外不少生物學家及醫學專家也都開始質疑基因治療技術的炒作。

2000年，美國總統克林頓與美兩大人體基因研究組織的科學家在白宮聯合宣布：有史以來的第一個人類基因組草圖完成。

“利用這個新知，人類將獲得巨大利益。它能徹底改變我們對大多數疾病的診斷、預防和治療的方式。”克林頓當時如是說。另外他還預言，未來幾年人類通過基因手段有望治愈阿爾茨海默癥、帕金森氏癥、糖尿病和癌癥等。但是時至今日，這些疾病依舊還在嚴重威脅著人類的健康，人類基因圖譜的公布對這些疾病的治療并沒有發揮實質性的作用。

廣州中醫藥大學教授曾慶平認為，盡管現在高分辨率的人類基因組遺傳變異整合圖譜已經公布，但是其在醫學上的價值人類依舊不能過于樂觀。

曾慶平說，如果將人類基因組計劃與千人基因組計劃作一個比較，那么可以說人類基因組計劃的完成是印刷了一部生命的“天書”，而千人基因組計劃的完成就是把這部“天書”重印或再版一次，只不過其間作過重大修改。形象地說，這些基因圖譜上的“基因序列恰如一本火星文小說，沒有幾個地球人能讀懂”，另外現在將基因變異通譯成疾病風險的“字典”也還沒有完全編撰出來。

警惕“基因療法”騙局

甄二真說，這些年來，更為嚴重的是，一些人開始借著全球人類基因組計劃和千人基因組計劃研究成果對患者進行忽悠和欺騙。

目前在國內，有不少醫院都在利用“基因療法”或“基因工程”治病。有的醫院稱自己能進行“基因療法”，能以最新的科技治療乙肝病人；有廣告稱，某醫療機構從研究人體基因入手，根據破譯的人體糖尿病基因密碼，獨創了糖尿病“基因療法”，成功研制出某種新藥。甚至一些皮膚病醫院也都開始打著“基因療法”的招牌。

甄二真告訴記者，目前國內所有的醫療機構聲稱的“基因療法”及“基因工程”根本就不靠譜，他們有很多人甚至自己也不知道“基因工程”是怎么回事，所謂的“基因療法”也更不可靠。

“其實，現在進行宣傳的大多是小型醫院和民營醫院。真正有實力的三甲醫院幾乎看不到這樣的宣傳。”甄二真說目前在世界上，還沒有一個國家有過基因工程成功治病的案例，美國1999年曾經臨床嘗試利用基因操作的方式對一個囊腫性纖維化遺傳病患者進行治療，但是在治療過程中，患者卻意外發生了死亡。

“現在國內一些聲稱進行基因治療的，他們的說法都比較模糊，只是患者不了解而已。” 甄二真說。

近些年，利用人類基因圖譜，國內外有公司已經開始開發貯存個人基因組序列數據的“健康風險身份證”，在未來，也許我們只要花上不到萬元甚至是更少的費用就可以擁有一張自己的“健康風險身份證”，通過該證，我們就可以了解到我們將來患某種疾病的風險，并提前實施積極的預防。

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1990年美國首次成功地進行腺苷脫胺酸（ adenosine deam inase， aDA）缺乏的基因治療（ gene therapy）以來，基因治療已成為當前生物醫學中進展最快的領域之一［1］。基因治療在脊髓損傷（ spinal cordIn-jury， sCI）后軸突再生中亦可望成為有效的手段之一［2—5］。利用外源基因在靶細胞（包括神經元）中的表達，以改變神經元某些內在特性，從而進一步探索 sCI后神經元的存活能力，再生特性和功能恢復的分子機理，最終為 sCI的治療探討新途徑是目前治療 sCI的研究方向。它有助于把 sCI治療提到一個新的水平。值得我們進一步研究。

一、 sCI基因治療有關分子生物學基礎

基因轉移（ gene transrer）是實現基因治療的關鍵技術［6］。因此，基因治療的首要步驟是轉導基因的分子構建。一般轉導基因由目的基因 cDNA，啟動子／增強子和載體三部分組成。目的基因重組時除本身特有的（ cD-NA）序列外，通常還需進行必要的修飾，如轉錄起始修飾，翻譯起始，內含子和聚腺苷酸化信號等的修飾。用于重組的啟動子／增強子，一般有三種：強組成型（ strongconstita-tive），管家型（ housekeeping），及組織持異型啟動子（ tissuesepcific），其中最常用為第一型［7］。理想的體內基因轉移載體要求：轉移具有細胞靶向性，導入基因的表達可調控，而且轉移的方法簡便易行。用于 sCI的基因轉移載體主要是逆轉錄病毒載體（ retroviralvector），即乳腺病毒、莫羅尼小鼠白血病病毒和勞斯肉瘤病毒等。構建轉錄病毒載體的基本原理是：病毒的長末端重復序列（ longterrminalrepeat， lTR）可以對插入的外源基因進行有效轉錄，這樣先在體外構建反轉錄病毒前病毒 dNA載體，即酶切去除基因組中的反式作用區域（ gag， polenv基因區域），產生缺陷型的反轉錄病毒，這種病毒只具有控制感染和整合的序列（即順式作用區域）。缺陷型病毒載體必須依賴包裝細胞提供的蛋白質才能完成包裝，產生帶有外源基因的偽病毒。它能感染受體細胞，載體 dNA將依靠其 lTR整合入受體細胞染色體基因組，這樣外源基因被帶入宿主細胞并得以表達［2、3、6、7］。逆轉錄病毒載體感染率高，最常用于體外間接基因治療，其缺點是要求靶細胞必須有增殖和分裂特性［8］。此外， cao（1995）［9］等研究用陽離子脂質體直接注入 cNS作基因轉移獲得成功。但因陽離子脂質體對 cNS有毒性，故目前致力于發展非病毒技術，一種陽離子多聚體一聚乙烯亞胺（ polyetnyl－ enimine）業已用于基因轉移［10］。另有 selle［6］（1993）等報道的復制缺陷腺病毒也是一種適用于神經系統的理想載體。

在 sCI治療中，由于受體細胞要植入脊髓內，因此所用受體細胞應當符合一定的標準［4、6］：①容易獲取和繁殖；②移植后能長期存活且能繼續分裂和具有活力。③無免疫源性及形成腫瘤的危險。目前已用于 sCI試驗有雪旺氏細胞（ schwann cell， sC）和成纖維細胞［2、3、11］。此外，肌母細胞也是具有應用前景的較好受體細胞，研究表明肌母細胞轉移至 cNS至少可活6個月，且無腫瘤源性［12］。

基因治療的實施，有賴于將目的基因準確、高效地轉入靶細胞，并使之安全，高效和可控地表達。基因治療中基因轉移的策略主要有兩種，即活體外法（ exvivo approach）和在體法（ invivo approach）。活體外法就是在體外先對適當細胞進行遺傳修飾，使其表達和分泌特定的重組蛋白，然后將修飾細胞移植入活體神經組織，通過神經遞質替代或神經營養因子（ neurotrophic factor， nTF）和／其它治療因子的引入恢復正常的神經功能。這種方法尤其適于因缺乏 nTF或神經遞質前體分子等可擴散物質所致的 cNS疾病。如帕金森氏病（ parkinson＇ s diesease， pD）及 cNS損傷。

在體法是利用適當的重組病毒或化學基因轉移載體將目的基因及有治療作用的重組蛋白直接轉移，效率較低，故較少采用。此外，活體外法可采用自體的工程細胞移植，在體外可對高表達細胞克隆進行篩選，有效的控制移植細胞的數量和質量，應用立體定位和成像技術可以將工程細胞十分準確地移植到 cNS特定的區域內，以保證在局部產生高濃度的治療因子。

二、基因治療 sCI的現狀和展望

基因治療 sCI尚處于實驗探索階段。目前，主要是采用 nTF基因修飾雪旺氏細胞（ sC）或成纖維細胞后再將其植入鼠的脊髓損傷區，觀察其軸突再生的情況［2、3、11］。 tuszyski（1994）［11］將 nGF基因導入培養的 sC內，再將 sC移植到損傷的脊髓，發現 sC在體內能穩定地表達 nGF并促進軸突的再生。同年 tuszynski等［2］利用來源于莫洛氏鼠白血病的逆轉錄病毒載體，將人的 nGF基因導入鼠成纖維細胞中，再將成纖維細胞移植到半橫貫損傷的鼠脊髓中（ t7平面）。1年后成纖維細胞仍能表達 nGF，電鏡及免疫組化（ cGRP）檢查，發現有大量的脊髓軸突再生（感覺纖維）。1996年， tuszynski等［3］采用同樣方法，又將 nGF基因導入成纖維細胞中，并將其移植到半橫斷損傷的鼠脊髓中（ t7平面），14月后，通過 rT— pCR技術鑒定成纖維細胞仍表達 nGF。電鏡、免疫組化（ gFAP、 cHAT、 tH、5— hT， cGRP）檢查發現有大量的（感覺和運動）軸突再生。作者在國際上首次構造 po—5＇— flanking介導的21.5KD髓鞘堿性蛋白微基因（暫命名為 pSVPoMcat）的基礎上，通過陽離子脂質體導入 sC中，然后再將基因修飾的 sC移植入成鼠半橫斷損傷脊髓，觀察其對 sCI的再生修復作用，現已發現 pSVPoMcat微基因修飾 sC對 sCI后細胞凋亡有抑制作用［13］。

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原發性肝癌(Primary hepatic carcinoma，PHC)是常見的惡性腫瘤之一。目前對PHC主要治療方法有手術治療、放療、化療以及綜合治療等，然而治療效果并不理想。隨著分子生物學和免疫學技術的發展，基因治療技術在腫瘤的治療中具有廣闊的前景。基因治療的方式有兩類，一類為基因矯正和置換；另一類為基因增補，不去除異常基因，而是通過外源基因的非定點整合，從而補償缺陷基因的功能，達到治療目的。本文就原發性肝癌的基因治療進展綜述如下。

1反義基因治療

肝癌的發生、發展過程中許多癌基因及生長因子的基因產物大量表達，應用反義核酸在轉錄水平和翻譯水平阻斷某些基因的異常表達，以期阻斷癌細胞內的異常信號傳導，使癌細胞進入正常分化軌道或引起細胞凋亡，從而抑制腫瘤的生長。反義基因包括反義RNA、反義DNA和核酶3類。根據堿基互補的原理，利用與目標基因特定序列互補的短鏈核苷酸片段來封閉目標基因表達，或利用核酶與相應的mRNA結合使其降解，均可達到基因治療的目的。Wang等［1］利用AFP反義寡核苷酸治療體外和裸鼠的SMMC7721肝癌模型取得了明顯的抗癌作用，減少了AFP的表達，抑制SMMC7721細胞的增生。有研究顯示［2］，引用反義胰島素養生長因子(Insulingrowth factor I，IGFI) 寡核苷酸轉染人肝癌細胞，發現肝癌細胞的凋亡陽性指數明顯增加，并且被轉染的癌細胞的CEA和AFP的分泌下降，表明反義IGFI寡核苷酸可以抑制肝癌細胞的增殖、促進分化并誘導腫瘤細胞的凋亡。

2自殺基因治療

某些病毒、細菌等原核生物含有一類基因，其編碼的酶能將原來無毒的藥物前體轉化為具有細胞毒性的代謝物而殺傷宿主細胞，這類基因稱為“自殺基因”。這種特有的轉換酶基因-自殺基因導入體內后，利用其產生的酶將無毒或低毒的藥物前體轉成細胞毒性代謝產物，從而殺死腫瘤細胞。近年來有關此類研究顯示出良好的應用前景。目前常用針對肝癌基因治療的有單純病毒Ⅰ型胸苷嘧啶激酶/戊環鳥苷系(HSVTK/GCV) 和胞嘧啶脫氨酶/5氟胞嘧啶(CD/5Fc)等系統。有研究表明［3］，將“自殺基因”單純皰疹病毒胸腺嘧啶激酶(Herpes Simplex Virus Thymidine Kinease，HSVTK)轉染腫瘤組織，則該細胞的HSVTK將前體藥Gancyclovir(GCV)轉化為對分裂細胞有殺傷作用的代謝產物，特異性殺傷腫瘤細胞，對肝細胞肝癌在體外有一定的療效。Won等［4］通過單純皰疹病毒將AFP反轉剪接靶RNA構成酶導入肝癌細胞，取代HCC高效表達AFP的RNA殘基，結果明顯延緩腫瘤細胞生長并降低了細胞中表達AFP的RNA水平。

3免疫基因治療

免疫基因治療通過基因重組技術增強機體的抗腫瘤免疫功能而達到治療腫瘤的目的。目前有基因疫苗免疫治療、免疫刺激性因子免疫治療、共刺激分子免疫治療、活化的淋巴細胞進行過繼免疫治療、DC為基礎的免疫治療。基因疫苗指的是DNA疫苗，即將編碼外源性抗原的基因插入到含真核表達系統的質粒上，然后將質粒直接導入人或動物體內，讓其在宿主細胞中表達抗原蛋白，誘導機體產生免疫應答。DC是體內最強專職抗原遞呈細胞，能有效刺激靜息的細胞，誘發初次免疫應答，還具有發動和調節抗腫瘤免疫反應的特性。薛剛等［5］應用IFNγ修飾的DC刺激T淋巴細胞，發現IFNγDC可促進T細胞增殖，并誘導T細胞向Th1分化。IFNγ的修飾可明顯增強肝癌細胞抗原負載的DC所活化的T細胞對肝癌細胞的殺傷作用。由于IFNγ的修飾能促進DC成熟，增強DC促進T淋巴細胞增殖的作用，誘導細胞免疫，增強T細胞的細胞毒作用，使T細胞能有效地殺傷腫瘤細胞，將VEGFR和Tie 基因共同轉染DC，不僅活化了特異性CTL，還可以阻止腫瘤新生血管生成，從而將腫瘤免疫治療和抗腫瘤新生血管生成治療有效結合起來［6］。

4抑癌基因治療

到目前為止發現的抑癌基因有p53，轉甲狀腺基因及其他抗癌基因和Nras，Cmyc，Cest2，IGFⅡR以及CSF1等，在所有的抑癌基因中p53基因的突變率較高，它的失活會阻止細胞進入凋亡，從而使之處于持續分裂狀態而增加突變及轉化的概率。通過恢復或添加腫瘤細胞中失活或缺乏的抑癌基因，恢復抑癌基因的功能，從而抑制腫瘤的生長和轉移，常用野生型p53、p16 等。p53基因的突變或者失活不僅使細胞本身周期失調具有致瘤性，并且可以影響細胞對其他凋亡信號如TGF的感受性下降。穆紅等［7］使用p53cDNA的真核表達質粒p53pcDNA3對人源性肝癌細胞系HepG2進行轉染，采用RNA原位雜交的方法證明了外源p53cDNA在HepG2p53細胞中的轉染和轉錄，成功導入的p53cDNA可誘導HepG2細胞發生凋亡。p16基因也為抑癌基因，原發性肝癌中p16基因也常表現失活，p16基因能阻抑細胞生長于G1S期，但不誘發凋亡。p16啟動子甲基化后，肝癌發生概率明顯提高，尤其對于HBV感染者。

5抗血管生成基因治療

腫瘤血管生成是腫瘤生長轉移的關鍵步驟，是促血管生成因子和抑制因子作用失衡的結果。腫瘤血管生成是由腫瘤細胞和腫瘤浸潤炎癥細胞，如巨噬細胞或肥大細胞產生的促血管形成因子所介導的。惡性腫瘤的生長和轉移依賴于新生血管的形成，為了不斷地獲得氧和養料，腫瘤細胞就要不斷的分泌促血管形成因子，不少細胞因子與腫瘤血管形成密切相關，因此，抑制腫瘤血管形成可以導致肝癌細胞衰退。腫瘤血管生成中最主要的是血管內皮細胞生長因子(VEGF)。有試驗表明，用脂質體法轉然反義RNA對抗血管內皮生長因子，能夠抑制裸鼠的種植性肝癌的生長［8］。

6RNA干擾技術的應用

RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術，也稱為基因沉寂療法，是利用雙鏈RNA(doublestranded RNA，dsRNA)誘發對宿主細胞特異性RNA轉錄的抑制，從抑制特異的基因表達的方法。利用 RNAi技術可同時阻斷多個癌基因的轉錄表達，從而有效抑制腫瘤的生長，達到治療腫瘤的目的。體外RNA干擾技術的主要特點在于其能利用細胞本身的成分，使外源重組干擾片斷能持續轉錄，同時能以一種類似酶促方式對目標mRNA進行切割，從而形成高效、穩定而持久的干擾效應。尿激酶型纖溶酶原激活劑(uPA)是一種在肝癌細胞中高表達的蛋白，參與機體的多種生理和病理過程，其表達水平與患者的生存呈負相關。李華等［9］構建針對人端粒酶逆轉錄酶(hTERT)基因siRNA真核表達載體pLXSNEGFPU6siTERT，以hTERT siRNA逆轉錄病毒為表達載體，感染HepG2細胞24、48、72 h后，端粒酶活性分別下降了23.84%、58.03%和85.01%( P＜0.05)，感染后24h細胞凋亡29.05%，肝癌細胞生長受到抑制，并存在一定量效和時效關系。除了上述介紹的六種比較經典的基因治療方法外，近年又出現了一些新的基因治療方法。有專家設想利用超聲/微氣泡介導目的基因進入靶組織的靶胞內［1011］，可以達到靶向性、可控性轉導基因治療的目的，有望成為有實用價值的臨床基因治療技術。不同的基因治療策略聯合應用可相互協同，常采用免疫基因和自殺基因的聯合治療［12］，在增強機體抗腫瘤免疫能力同時直接殺傷腫瘤細胞，達到根治腫瘤的目的。

7展望

目前肝癌的基因治療策略已有很大發展，具有廣闊的應用前景，而早期臨床證據和臨床實驗表明，基因作為一種藥物有重要的地位，將來的發展方向主要集中在下列幾方面：①尋找轉染效率高、基因容量高、毒性小的基因治療載體。近年來，利用超聲對比劑微泡作為基因載體并用超聲技術處理，提高轉染率已取得成功［1315］；②開發基因，實現可調控的基因轉染系統，以期提高在肝癌組織中的表達陽性率，進行更加精確的基因治療；③設計更具靶向性和安全性的基因轉運系統，尋找肝癌特異轉錄調控元件，從而使外源基因能夠持續、穩定和特異表達，真正實現肝癌的基因治療從動物實驗轉向臨床應用，將是肝癌基因治療的主要研究方向。盡管還存在很多需要解決的問題，但隨著分子生物學及相關學科的發展，我們相信肝癌的基因治療終將會廣泛地應用于臨床。

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0引言

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis， UC)和克羅恩病(Crohns disease， CD)都屬于炎癥性腸病(inflammatory bowel disease， IBD)， 其發病可能由感染、遺傳、免疫等多種因素相互作用所致. 傳統觀念認為通過基因轉移替代缺陷基因的基因治療只適用于致病基因明確的疾病， 目前慢性炎癥性疾病和自身免疫性疾病也被納入了基因治療的范圍，可通過基因轉移使機體表達免疫相關蛋白質， 從而下調致病的炎癥和免疫反應， 上調保護性反應. 相對于囊性纖維化、重癥聯合免疫缺陷和腫瘤， IBD的基因治療尚處于起步階段. 本文就IBD的基因治療作一概述.

1IBD的免疫病理機制和腸干細胞

CD的腸黏膜炎癥以1型輔T細胞(Th1)型CD4+淋巴細胞占主導地位， 而UC則主要是由Th2型CD4+淋巴細胞介導的. 盡管CD和UC發生的機制并不完全相同，但最終的腸壁損傷均可歸咎于巨噬細胞、粒細胞等炎性細胞及其產生的炎性細胞因子. 一方面， 淋巴細胞、巨噬細胞在腸道局部聚集并釋放各種促炎細胞因子， 如TNFα，白細胞介素(IL)6，IL8，IL12，IL18等， 其中多數與疾病活動性呈正相關; 另一方面， 抗炎細胞因子如IL10，IL4，轉化生長因子(TGF)β等的分泌相對不足. 這種促炎細胞因子和抗炎細胞因子之間的失衡促進和加劇了腸壁的炎癥反應. 細胞因子失衡可由Th1/Th2細胞比例失衡引起， 又可反饋性地加重Th1/Th2細胞失衡， 形成惡性循環， 因此被視為IBD發病機制中的重要環節. 腸上皮細胞不斷更新， 衰老的細胞脫落至腸腔， 新的細胞則由位于腸隱窩底部的干細胞不斷補充， 因此位于腸腺底部的干細胞成了基因治療的最佳靶細胞. 但是腸干細胞缺乏明確的形態學特征或理化特性， 目前還無法與其它腸上皮細胞鑒別， 因此無法直接證明目的基因已成功轉移至干細胞. 給予攜帶目的基因的載體后， 需要對干細胞成功地進行基因修飾， 腸上皮細胞才能持久穩定地表達目的基因. 腺相關病毒(AAV)載體能使腸上皮細胞于口服感染后1 mo內穩定高效地表達目的基因. 予免疫缺陷鼠靜脈注射5型重組腺病毒(AD5)載體， 亦發現結腸上皮細胞長時間表達目的基因， 而消化道其他部位目的基因表達陰性. 腸道相關淋巴組織內的免疫細胞無疑是IBD基因治療中最受關注的靶細胞， 但由于腸道黏膜上皮屏障的存在， 載體不能有效到達固有層. M細胞是存在于黏膜集合淋巴結濾泡頂部上皮中的一種特殊細胞， 其主要功能是將腸腔內抗原和病原體跨上皮轉運至上皮下淋巴組織. 可利用M細胞能廣泛攝取各種抗原物質的功能，及其與免疫細胞之間的對話方式， 通過M細胞將載體導入黏膜淋巴組織， 從而調節局部黏膜免疫反應和機體的系統免疫反應［1］. 有實驗表明AAV載體能感染腸道固有層內細胞， 并使17%～19%的固有層細胞于感染后6 mo內持續表達目的基因.

2目的基因轉移至胃腸道組織

實驗表明［2］， 阻斷小鼠肝動脈和門靜脈后， 經眶后靜脈叢予重組腺病毒載體， 30 min后恢復肝臟血供， 腸壁血管、血管周圍組織和小腸絨毛持續表達目的基因達數周之久. 局部予經包裝的質粒、脂質體、逆轉錄病毒、慢病毒、腺病毒和AAV載體均能將目的基因轉導至腸道黏膜，且黏液溶解劑(二硫蘇糖醇、N乙酰半胱氨酸)和蛋白酶體調節劑(MG101)能促進轉導效率. 上述載體中， 以AAV載體系統的應用前景最廣闊. 重組AAV(rAAV)載體去除了所有編碼序列， 只保留145 bp的末端重復序列， 不含任何病毒基因， 感染細胞后，前病毒DNA定向整合至19號染色體的AAVS1區域. 在人類基因治療的常用病毒載體中， rAAV是目前唯一沒有引起宿主病理反應的載體［3］. 實驗表明， 以AAV載體對空腹大鼠灌胃6 h后， 胃十二指腸和近端空腸固有層細胞開始表達目的基因， 并能持續穩定表達6 mo; 雖然未觀察到結腸有目的基因表達， 但是可以推測灌腸能使目的基因被轉導至結腸固有層細胞. 此外， 雖然沒有直接證據表明AAV載體能感染腸干細胞， 但除固有層外， 腸上皮細胞亦表達目的基因1 mo. AD5是體內實驗使用最多的載體， 該載體由于E1缺失造成病毒復制缺陷. 腺病毒載體可高效感染多種靶細胞， 對分裂期細胞和增殖停止期細胞均有很高的導入效率， 這是逆轉錄病毒載體所不具備的. 據報道， 經十二指腸飼管予大鼠E1缺失的重組腺病毒載體后， 目的基因能有效導入十二指腸、空腸和回腸上皮細胞. 以E1/E3缺失的重組腺病毒載體灌腸后， 結腸上皮細胞能高效表達目的基因. 而且炎癥性腸病的基因治療AD5載體感染IBD患者腸上皮細胞的效率遠高于非IBD患者［4］. 但是經消化道予腺病毒載體主要感染的是更新速率很快的腸上皮細胞， 因此AD5載體轉導的目的基因在腸道內的表達時間只能維持數天， 為達到治療IBD的目的， 需反復給藥， 同時還要避免機體的免疫反應. 有報道稱， 經尾靜脈注射重組腺病毒載體后， 免疫缺陷小鼠結腸上皮細胞和隱窩細胞可長時間表達目的基因， 而消化道其他部位無目的基因表達. 該實驗結果非常誘人，但由于E1缺失造成病毒復制缺陷， AD5載體不能像逆轉錄病毒載體一樣整合至宿主基因組.

3IBD基因治療的策略和研究現狀

3.1下調促炎細胞因子的表達IL18是一個多功能細胞因子， 結構類似IL1家族， 能活化T淋巴細胞內的核因子(NF)κB和激活蛋白(AP)1， 與IL12誘導的STAT4協同促進T 淋巴細胞表達干擾素(IFN)γ［5］. 此外， IL18還通過上調TNFα，IL6和IL1的表達加劇炎癥反應. 以IL18結合蛋白(IL18BP)治療三硝基苯磺酸(TNBS)誘導的小鼠結腸炎， 可減輕腸道炎癥. 鑒于IL18在CD中的重要作用， Wirtz等［6］嘗試以IL18為靶點對CD動物模型進行基因治療. 構建表達IL18反義寡核苷酸的重組腺病毒載體， 予移植CD4+ CD62L+T淋巴細胞形成的CB.17SCID小鼠結腸炎模型灌腸. 蛋白質印跡分析顯示表達IL18反義寡核苷酸的重組腺病毒載體能抑制結腸組織產生IL18， 實驗組結腸炎的內鏡和組織病理學改變均較對照組明顯改善. 此外， 該實驗還觀察到局部給藥方式只抑制結腸固有層單核細胞產生IFNγ， 而不影響來源于脾臟的單核細胞.

3.2上調抗炎細胞因子的表達IL10能抑制巨噬細胞活化和分泌IL1α， ILβ， IL6， IL12， IL18和TNFα等細胞因子， 下調人類白細胞抗原(HLA) Ⅱ類分子的表達; 通過影響抗原遞逞細胞功能而強烈抑制CD4+ T淋巴細胞的增殖和分泌細胞因子. 此外， 其還能直接抑制T淋巴細胞產生IL2，TNF 和IL5. IL10基因敲除小鼠可自發形成Th1型淋巴細胞介導的結腸炎. IL10對IBD動物模型有效， 對CD患者的臨床實驗結果卻不令人滿意， 其原因可能是腸道局部IL10濃度過低， 起不到抑制炎癥的作用， 而加大劑量又會伴隨嚴重不良反應; 也可能是因為IL10半衰期太短所致. 一些研究小組嘗試以不同的給藥方式(灌腸、經靜脈和經腹腔) 評估AD5 IL10對IBD動物模型的預防和治療作用，結果顯示AD5 IL10能預防實驗性結腸炎的發生; 靜脈給藥的血IL10濃度顯著高于腹腔給藥，但并不能顯著提高結腸局部IL10濃度; 灌腸給藥的結腸局部IL10濃度高于靜脈給藥［7-10］. 雖然這些研究沒有得到預期的結果， 但至少證明以病毒載體表達細胞因子在IBD 基因治療中是可行的. 與IL10一樣， IL4也具有抑制巨噬細胞產生TNFα，IL1等促炎細胞因子的作用. 此外， 作為Th0細胞向Th2細胞分化的主要誘導因子， IL4可調節Th1/Th2細胞平衡，緩解結腸炎癥，但有研究［11］顯示IL4抗體能下調SAMP1/Yit鼠IFNγ的表達并明顯緩解腸道炎癥， 而移植分泌IL4的Th細胞可誘導SCID小鼠發生腸炎.

轉貼于 因此， IL4在腸道免疫中可能并非僅起抗炎作用， 其在人類IBD中的確切作用尚有待確定. TGFβ作為一種抗炎細胞因子在腸道免疫平衡中發揮重要作用， Kitani等［12］研究了TGFβ1質粒在TNBS 誘導的結腸炎中的作用，結果顯示鼻內一次給藥可預防和治療實驗性結腸炎， 而腹腔給藥無治療作用. 腸固有層和脾臟持續2 wk表達TGFβ1 mRNA， 并同時出現產生TGFβ1的T淋巴細胞和巨噬細胞， 且并不引起腸道、肺、脾、肝、腎發生纖維化. TGFβ除抗炎作用外， 在組織纖維化， 特別是病理性纖維化中也起重要作用. TGFβ1經蛋白激酶C和細胞外信號調節激酶1/2絲裂原活化蛋白激酶通路促進CD患者腸道成纖維細胞產生纖維連接蛋白、Ⅰ型膠原和結締組織生長因子［13］. Vallance等［14］以表達TGFβ1 的重組AD5載體灌腸， 導致小鼠結腸發生纖維化， TNBS誘導的結腸炎惡化并加速腸壁纖維化進程.

4展望

基因治療為目前無法治愈的疾病提供了希望， 上述臨床前試驗為IBD的基因治療勾勒出了誘人的前景. 分子生物學的不斷發展將使高效、特異性地下調基因表達成為可能. RNA干擾是一種在生物體內普遍存在的、在RNA水平調節基因表達的方式， 雙鏈RNA能高效、特異性地誘導與之同源的mRNA降解. 有報道稱局部給予針對TNFα的小干擾RNA能有效緩解膠原誘導的關節炎癥［15］. 綜上所述， 雖然IBD的基因治療研究已取得了令人鼓舞的成績， 但仍應認識到基因治療在IBD中尚處于起步階段， 在應用于臨床之前還有很長的路要走.

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篇6

原發性高血壓病是由遺傳與環境因素相互作用而導致的多基因遺傳病,遺傳因素對其發病的影響占30%～50%［1］。目前有關高血壓基因治療的研究很多,腎素血管緊張素系統（RAS）是研究的熱點之一。

1腎素血管緊張素系統

降低基因表達（亦稱反義基因療法）是指根據靶基因結構特點設計反義寡核苷酸（AS-ODN）分子，導入靶細胞或機體后與雙鏈DNA或與mRNA結合形成雜合體，從而封閉或抑制升高血壓相關基因的復制或表達，以期達到降壓目的。RAS的過度活動是人類原發性高血壓及許多高血壓動物模型主要病理機制之一。目前腎素基因（REN）、血管緊張素轉化酶基因(ACE)、AngⅡ1型受體（AT1R）和血管緊張素原基因(AGT)是RAS反義基因治療的主要靶點。

1.1腎素基因(REN)Wang等［2］將反義腎素核苷酸導入冷誘導高血壓（CIH）大鼠后降壓幅度達40mmHg，持續至少5周，并有效抑制了整個的RAS。

1.2血管緊張素轉化酶基因(ACE)Gelband 等［3］給新生自發性高血壓大鼠（SHR）心內注射ACE-AS，血壓降低(18±3)mmHg,且持續時間較長，其F1代大鼠也保持了這個水平。與高血壓發展相關的腎血管反應性、電生理及鈣離子的動態平衡均得到改善，該研究還發現雖然ACE-AS對SHR的血壓下降程度不是很大，卻可以永久預防腎血管的病理性改變。Wang等［4］給SHR靜注逆轉錄病毒攜帶的ACE反義核苷酸，結果顯著降壓，并阻斷了高血壓引起的心、腎、血管病理改變。同時還發現ACE-AS被整合入親代基因組傳遞給子代，使子一代的血壓較對照組明顯降低，其心肌肥厚程度也有所改善。

1.3血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)1型受體(AT1R)基因Phyills等［5］以AT1R為靶目標研究反義基因治療的效果，向SHR的心內注射攜帶有AT1R的反義cDNA的白血病病毒逆轉錄載體(leukemia virus retroviral vector,LNSV)，可以觀察到39日齡大鼠的血壓顯著降低。Pachori等［6］以逆轉錄病毒將AT1R的ASODN轉染SHR,可使大鼠血壓持續下降。此外,用轉腎素基因大鼠建立高血壓及其相關心肌肥厚動物模型,以逆轉錄病毒將AT1R的ASODN一次性注入新生大鼠心肌中,結果發現該ASODN能長時間持續抑制AT1R在心血管組織中(包括心臟)的表達,雖然血壓未降至正常水平,但心肌肥厚程度明顯減輕。Hiromichi 等［7］研究發現，AT1R基因可以使血壓下降，并能逆轉心肌肥厚。

1.4血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)2型受體(AT2R)基因AT2R與AT1R介導的作用相反。Metcalfe等將以慢病毒為載體的AT2R cDNA導入SHR體內，轉染21周后，SHR左心室壁厚度降低，心臟肥厚程度下降［8］。由慢病毒介導的AT2R在AngⅡ灌注高血壓大鼠模型中也具有抗肥厚和抗重塑作用。雖然血壓持續升高但AT2R轉染可以保護由高血壓引起的心臟損害［9］。

1.5血管緊張素原基因(AGT)Sugano等［10］將攜帶有AGT mRNA反義核苷酸的重組腺相關病毒載體(rAAV-AGT-AS)一次性注入5 d齡的SHR心肌中,結果發現高血壓發病推遲91 d,且大鼠在成年后血壓明顯降低,并持續6個月。重組腺相關病毒載體穩定,且未見肝臟毒性作用發生。但AGT-AS不能將血壓完全降至正常水平，也不能完全逆轉血管重塑。

2RNA干擾(RNA interference)

RNA干擾(RNA interference,RNAi)是近年來新興的一種由雙鏈RNA誘發的“基因沉默”現象,能高效特異地阻斷靶基因的表達［11］。RNAi技術已廣泛應用于抗病毒、抗腫瘤等與基因高度相關疾病的研究［12-14］。

Chen等［15］把腺病毒介導的AT，aR-shRNA注射入C57BL小鼠腦的背側迷走神經核區域，發現夜間血壓明顯下降。何軍華等［16］用RNAi技術下調ACE表達，觀察其對SHR血壓及腎臟表達ACE的影響。研究顯示:Ads-EGFP-ACE-shRNA經鼠尾靜脈注射后，可被主動脈、肺、心肌、腎臟組織良好吸收。SHR出現明顯的血壓下降，降壓作用至少可持續14 d之久，降壓的同時未引起心率的改變，并且這種效應來源于單次給藥，較現有降壓藥物有明顯的優勢。陳閩荔等［17］觀察應用RNAi技術靶向基因沉默AT1R對腎性高血壓大鼠血壓及組織AT1R基因表達的影響。結果發現注射rAAV-AT1R-shRNA 24 h后,收縮壓較注射前明顯下降(22.3±5.5) mmHg（P

孫成林等［18］實驗證實針對大鼠AT1R的mRNA設計的dsRNA質粒載體轉染體外培養細胞,顯著降低靶基因mRNA和蛋白表達,實現了基因沉默,并可以拮抗AngⅡ所誘導的體外培養血管平滑肌細胞的增殖作用。張璞等［19］發現靶向大鼠AT1R基因mRNA的短發夾RNA腺病毒載體,在體外和體內環境下高效特異性抑制靶基因的表達,能達到基因干擾目的。

張敬群等［20］以高腎素型高血壓模型Goldblatt兩腎一夾腎血管性高血壓大鼠模型為研究對象,用構建的RNAi質粒pAT1a-shRNA1或pAT1a-shRNA2單次尾靜脈注射,不僅阻斷了進行性的血壓升高趨勢,并有一定程度下降,有統計學意義。研究還發現,RNAi質粒能顯著抑制腎血管性高血壓導致的心肌肥厚、重構，血管壁的重構硬化得到顯著改善。

3問題與展望

高血壓的基因治療取得了令人矚目的成就，有著令人鼓舞的前景，但是目前高血壓病的基因療法尚處于動物實驗階段,尚未達到廣泛應用于臨床這一既定目標，有許多問題仍然需要克服和解決。如靶基因的界定，基因轉錄的高效性、安全性、長效性問題、定向表達問題、給藥途徑問題、單一基因轉移為主的基因療法到多基因多因素多環節整體調節等。

但是隨著分子生物學技術迅猛發展，深入了解血壓及高血壓相關基因對血壓的調控機制，闡明人體組織器官生物學特性和疾病發展的病理生理過程，明確動物實驗和臨床研究的差距，相信基因治療能成為高血壓病治療的最佳有效途徑之一。

1）為天津市科委重點基金課題（No.09JCZDJC20600），課題名：中藥干預肝陽上亢型高血壓不同模型物質基礎變化的機理

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篇7

【關鍵詞】 阿爾茨海默病;β淀粉樣蛋白;基因治療

阿爾茨海默病(AD)主要癥狀為進行性記憶力和認知力減退。目前，藥物治療仍是治療AD的主要手段，但現在所開發的藥劑多為化學合成藥，藥物作用位點不專一，特異性弱。相反，采用基因治療的方法不僅定位準確，作用持續時間長，而且沒有非靶器官的副作用，是一種較為理想的治療方法。此外，雖然研究證實AD是一種多病因介導的疾病，但是腦內β淀粉樣蛋白(Aβ)代謝異常造成的Aβ片段聚集沉積引發的級聯反應是AD的主要致病原因。Aβ的穩態水平依賴于生成、清除和內流間的平衡，因此，若能通過基因治療的手段減少Aβ生成或上調酶介導的Aβ降解，促進受體介導的Aβ腦外流，抑制Aβ腦內流，便可有效地治療AD。

1 降低Aβ生成的基因治療

Aβ由分泌酶水解β淀粉樣前體蛋白(APP)產生。體內有α、β、γ三種分泌酶參與APP的降解。α分泌酶的酶切位點位于APP蛋白中部，避免了完整Aβ分子序列的產生，且分解產生的可溶性淀粉樣前體蛋白α(soluble amyloid precursor protein α，sAPPα)對神經細胞具有神經營養和神經保護作用，是正常人體內APP的主要代謝方式;β分泌酶使APP裂解成游離的sAPPβ及仍結合在膜上的CTF99，CTF99再被γ分泌酶水解，生成P3和含有39～42個氨基酸殘基的Aβ，Aβ(尤其是Aβ40和Aβ42)聚集形成淀粉樣斑塊，產生神經毒性。

1.1 APP基因 APP基因突變形成新的酶切位點，易為β、γ分泌酶(尤其是γ分泌酶)水解，進而產生大量的Aβ40和Aβ42，促進了淀粉樣斑塊的形成。用攜帶siRNA的單純皰疹病毒載體封閉APP突變基因的表達有效阻斷了AD小鼠海馬淀粉樣斑塊的形成〔1〕。

1.2 α分泌酶 α分泌酶及β、γ分泌酶兩個酶系統對同一底物APP進行競爭。如果α分泌酶活性增強，既生成了對細胞具有營養作用的sAPPα，又減少了Aβ的產生，因此提高α分泌酶的活性或表達，利于對AD的治療。

α分泌酶不是單一的蛋白酶，而是一類膜結合蛋白。金屬蛋白酶10(adisintegrin and metalloproteinase 10，ADAM10)具有α分泌酶的生物學功能。Colciaghi等〔2〕發現在AD患者中，ADAM10的水平降低，且隨疾病的進展，其下降程度增加。通過轉基因技術，使AD模型小鼠神經元中適度過表達ADAM10基因，sAPPα的分泌增加，淀粉樣斑塊的生成減少;相反，轉染ADAM10突變基因的AD模型小鼠，腦內淀粉樣斑塊的沉積加劇〔3〕。這些結果在一定程度上提示了ADAM10對于AD具有潛在的治療作用。ADAM10并非唯一的α分泌酶，過表達ADAM9、ADAM17或ADAM19的細胞，sAPPα的分泌也增加。因此，它們也是α分泌酶的活性成分之一，但其在AD治療中的潛在作用還需要進一步的研究。

1.3 β分泌酶 1999年，Vassar等〔4〕用基因篩選的方法純化出一種新的、在β分泌酶位點剪切APP的蛋白酶，稱之為APP的β位點剪切酶(betasite APPcleaving enzyme 1，BACE1)。細胞實驗顯示，將化學合成的針對BACE1的siRNA轉染APP基因突變小鼠神經元，干擾內源BACE1基因的表達，Aβ的生成下降〔5〕。Kobayashi等〔6〕的研究也發現BACE1基因敲除的AD模型小鼠的大腦Aβ沉積顯著降低。構建BACE1 siRNA的慢病毒表達載體，將載體注射到AD模型小鼠海馬中，小鼠海馬組織BACE1的表達顯著下降，Aβ的生成及淀粉樣沉積顯著降低，小鼠的行為學缺陷也得到一定改善〔7〕。

BACE2和BACE1同樣具有剪切APP的功能，但它主要在Aβ序列的19Phe20Phe和20Phe21Ala部位進行剪切，破壞完整Aβ的形成而具有了類似α分泌酶的作用。BACE2與BACE1相互拮抗，競爭同一作用底物APP，從而抑制Aβ的生成。用慢病毒載體介導BACE2基因轉染AD模型小鼠，BACE2在神經元內高表達，小鼠腦內Aβ的沉積顯著降低〔8〕。

1.4 γ分泌酶 γ分泌酶是一組復雜的多亞基復合體，早老素(presenilin，PS)1和PS2為同源異構體，是γ分泌酶的組分之一。PS1和PS2基因突變可使Aβ42的水平選擇性升高。APP、PS1和PS2基因突變被認為與早發型AD密切相關。除PS是γ分泌酶復合體組分外，還有Nicastrin(Nct)、APH1和PEN2，任一組分表達水平下調均將導致γ分泌酶復合體形成障礙。例如，用siRNA抑制細胞PS1的表達，γ分泌酶活性下降的同時，細胞中Aβ42的生成也顯著降低〔9〕。γ分泌酶的相關研究為AD基因治療提供了新的靶點，但其仍有待于深入的研究。

2 加速Aβ降解的基因治療

降解Aβ的酶有很多種，主要是腦啡肽酶(Neprilysin，NEP)、內皮素轉化酶(endothelinconverting enzyme，ECE)和胰島素降解酶(insulin degrading enzyme，IDE，也稱insulysin)。此外，還有纖維蛋白溶酶(plasmin)、組織蛋白酶B(cathepsin B，CatB)等。

2.1 NEP NEP屬中性M13Zn金屬蛋白酶家族，是位于腦神經軸突和突觸膜上的II型跨膜糖蛋白，主要在黑質紋狀體通路表達，海馬和大腦皮質也有表達。NEP的催化位點暴露在細胞外，是腦中細胞外不溶性Aβ的主要降解酶。NEP水平及活性的降低會導致Aβ的沉積，促使AD的發生。研究發現，隨年齡的增長，NEP的表達下降。AD患者大腦皮層和海馬處NEP的活性和水平也顯著降低〔10〕。用慢病毒載體、腺相關病毒載體或單純皰疹病毒載體將NEP基因導入AD模型小鼠腦中，顯著降低腦內Aβ水平，減少淀粉樣斑塊的沉積，降低氧化應激和炎癥反應，抑制海馬和額葉的神經病變，提高了AD小鼠的空間識別能力〔1，11〕。

2.2 ECE ECE也是M13Zn金屬蛋白酶家族的一員，參與腦內Aβ的降解。細胞學研究顯示，抑制ECE的活性，Aβ的聚集增加;ECE過表達，Aβ的聚集減少。動物實驗研究顯示，ECE基因缺失的小鼠腦內Aβ的水平升高〔12〕;相反，將表達ECE的重組腺相關病毒注射到AD模型小鼠大腦皮層及海馬中，注射部位Aβ水平顯著降低〔13〕。

2.3 IDE IDE位于神經元細胞膜上，主要參與細胞內可溶性Aβ單體的降解。隨年齡增長，腦IDE的水平逐漸下降。敲除IDE基因，小鼠腦中Aβ的降解下降，腦內Aβ水平顯著升高。IDE基因缺陷也將導致AD患者皮層微血管Aβ累積，形成腦淀粉樣血管病變。通過轉基因技術使AD模型小鼠腦IDE的表達增加了約2倍，顯著降低腦Aβ的水平，延遲或完全預防腦中淀粉樣斑塊的形成〔14〕。

2.4 Plasmin Plasmin介導的酶解過程除了在纖溶、細胞遷移等病理生理過程發揮作用外，也參與腦內Aβ的降解。有活性的plasmin是由組織型纖溶酶原激活劑(tissue plasminogen activator，tPA)和尿激酶型纖溶酶原激活劑(urokinasetype plasminogen activator，uPA)催化沒有活性的血纖維蛋白溶酶原(plasminogen)而形成的。在AD模型小鼠腦中可見tPA和plasminogen共同表達于淀粉樣沉積部位，對Aβ42降解起到了重要的作用。但在plasmin基因敲除小鼠腦中并未觀察到內源性Aβ水平的升高，推測plasmin可能在Aβ聚集發生以后才發揮降解作用〔15〕。在AD患者或AD模型動物腦內，plasmin的表達與正常個體相比均顯著降低。而用uPA或tPA和plasminogen聯合應用均可顯著降低AD模型小鼠腦內Aβ的沉積及淀粉樣斑塊的形成，為治療AD提供了新的策略〔16，17〕。

2.5 CatB CatB也可以降解Aβ，尤其是Aβ42。抑制AD模型小鼠CatB基因的表達，Aβ42的表達升高，淀粉樣沉積加劇。用慢病毒介導CatB基因轉染老年AD模型小鼠，顯著降低了已有的Aβ沉積〔18〕。CatB具有抗淀粉樣沉積和保護神經作用。

3 加速Aβ轉運的基因治療

腦內Aβ的轉運清除包括血腦屏障(bloodbrain barrier，BBB)轉運和經非特異性腦間質液泵流到腦脊液后進入血液清除。腦內絕大多數的Aβ是經BBB途徑轉運出腦，10%～15%的Aβ由腦間質液泵流清除。可溶性Aβ通過BBB，是由受體介導的跨膜轉運完成的：低密度脂蛋白受體相關蛋白(LRP)和P糖蛋白(Pgp)介導可溶性Aβ由腦轉運至血液，進而轉移至肝臟降解;晚期糖基化終產物受體(RAGE)介導Aβ經血液由外周轉運至大腦。

3.1 LRP 胞外可溶性Aβ與血管內皮細胞表達的LRP結合，經轉胞作用過BBB進入血液循環;腦內可溶性Aβ通過腦間質液進入腦脊液同樣需要LRP的介導;血清中還存在一種可溶性的LRP(sLRP)可以結合血清中70%～90%的Aβ，抑制血液中的Aβ進入腦內。AD患者或AD模型小鼠腦微血管LRP的表達與正常個體相比顯著降低〔19〕。LRP基因缺失或表達量降低，造成AD模型小鼠腦Aβ沉積加劇，神經功能損傷加強。因此，增加血管內皮細胞LRP的表達或外周血液sLRP的含量，可有效降低腦中Aβ的積聚，為臨床治療AD提供了一條新的途徑。2007年，Sagare等〔20〕利用重組型sLRPIV對AD模型小鼠進行治療，顯著降低了血管壁和腦中Aβ的沉積，改善了AD小鼠的學習記憶能力。

3.2 Pgp Pgp是一種膜結合蛋白，屬于轉運蛋白ATP結合物(ABCT)超家族成員之一，由MDR1基因編碼。Pgp分布廣泛，在擔負重要生物屏障作用的腦毛細血管內皮細胞和腸上皮細胞中呈高表達。Pgp與多藥耐藥的產生關系非常密切，也參與腦脊液及BBB處的Aβ轉運，介導Aβ的腦外流。Aβ40或Aβ42和Pgp相作用經囊泡轉運出細胞。將Aβ40和Aβ42顯微注射到Pgp基因缺失小鼠腦中，Aβ從腦內的清除速率與野生型小鼠相比下降了50%。抑制AD模型小鼠Pgp的活性，腦間質液中Aβ的水平在數小時內就有顯著升高。敲除AD模型小鼠Pgp基因，腦內Aβ水平升高，Aβ的沉積加劇〔21〕。因此，增加Pgp的表達，促進Aβ的腦外流，降低腦內Aβ的水平，為治療AD提供了又一可能，但目前尚未見此類報導。

3.3 RAGE RAGE是一種多功能的細胞表面受體，屬于免疫球蛋白家族，分胞外域、跨膜域和胞內域。AD患者腦中過度的Aβ數量可上調RAGE的表達。腦微血管內皮細胞RAGE表達的升高，使RAGE介導的Aβ腦內流更加顯著，加重了神經功能障礙;Aβ與小膠質細胞表達的RAGE相作用，促進前炎癥因子的釋放，導致持久的慢性神經炎癥反應的發生;Aβ和神經元上的RAGE結合還將導致神經元存活率的下降〔22〕。Arancio等〔23〕通過轉基因技術使AD小鼠腦中表達的RAGE缺乏胞內域，不能觸發細胞內信號轉導，緩解了Aβ誘導的神經功能損傷，使AD小鼠的學習記憶力得到了部分保留，神經病理表現也較輕微。此外，機體內還有一種RAGE缺乏跨膜域和胞內域，僅具備胞外域，可由細胞分泌出來進入血液循環，形成可溶性RAGE(sRAGE)，sRAGE與全長RAGE競爭和血液中的Aβ結合形成sRAGEAβ復合物，但是sRAGE不能穿過血腦屏障，抑制了Aβ的腦內流，從而間接抑制了RAGE的功能。目前，Deane等〔24〕將通過轉基因技術獲得的sRAGE對AD模型小鼠連續注射3個月，小鼠表現出較正常的空間識別和學習能力。

4 總結與展望

由于世界范圍人口老齡化，AD發病率的日益上升，研制與開發安全有效的治療方案面臨巨大挑戰。基因治療以其特異性強、作用時間長、療效好和副作用低等優勢具有廣闊的發展前景。目前，部分基因治療在嚙齒類和靈長類動物中已被證明安全有效，對人類的治療正進入臨床試驗階段，進一步臨床研究正在進行中〔25，26〕。Aβ代謝相關基因更是因為其和AD的發展密切相關，越來越受到人們的關注，很有可能在不久的將來Aβ代謝相關的基因治療會成為治療AD的主要手段。

但要把基因治療真正應用于臨床，還需要克服許多技術上的困難和障礙。例如，攜帶目的基因的病毒載體本身會引起機體抗病毒的免疫反應，從而對組織器官產生損害。此外，上調或抑制Aβ代謝相關基因的表達，雖然可以治療和預防AD，但這些基因產物除了參與Aβ代謝外，還參與其他的生理功能，其表達水平改變給治療帶來的副作用也不容忽視。例如：(1)敲除BACE1基因的AD模型小鼠，Aβ的沉積有所減少，但把正常小鼠的BACE1基因敲除，出現了意想不到的感覺運動障礙，空間記憶力衰退等癥狀。因此BACE1除了誘導Aβ的生成，其在正常的學習、記憶和感覺運動過程中也發揮著一定的作用〔27〕。(2)在封閉γ分泌酶表達的同時，還可能會影響到一些重要信號通路的傳導(如Notch)。Notch為一膜蛋白受體，其介導的信號途徑與胚胎發生、造血及神經干細胞分化、發育有關，因此有可能會帶來一些嚴重的副作用。(3)除Aβ外，NEP還有很多作用底物，持續的NEP激活也會對機體造成傷害。例如，過表達NEP可以降低AD模型果蠅腦內Aβ42的沉積和神經元損傷，但同時也引發了年齡依賴的軸突衰退，使果蠅的壽命縮短了一半〔28〕。(4)臨床上ECE抑制劑常被用于治療高血壓病，若上調ECE水平，有可能導致患者血壓升高。(5)過多的plasmin的生成，易造成細胞連接降低。(6)LRP除介導Aβ的腦外流，還促進APP和BACE1發生相互作用，導致Aβ生成增加〔29〕。因此，研制更安全的病毒載體，選擇性地提高或抑制Aβ代謝相關基因中與Aβ代謝相關結構域的表達將會成為AD基因治療研究的重點。若這些問題能得到妥善解決，相信AD的徹底治療也就為期不遠了。

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篇8

【關鍵詞】脂聯素;脂聯素受體;內皮細胞;保護作用;基因治療

糖尿病大血管病變是糖尿病患者致死、致殘的最主要原因之一。脂聯素(adiponectin)脂肪細胞分泌的具胰島素增敏作用的細胞因子,對血管內皮細胞有著潛在的保護作用。與其他脂肪因子不同,在肥胖患者及肥胖相關疾病,如動脈粥樣硬化、2型糖尿病、血脂代謝異常中,脂聯素的水平往往是降低的。相反,提高血漿脂聯素水平,可有效地降低血管并發癥的發生。載脂蛋白E缺陷小鼠的球狀脂聯素轉基因表達的動物模型顯示:球狀脂聯素可改善載脂蛋白E缺陷小鼠的動脈粥樣硬化病變。故深入對脂聯素的血管保護作用機制的研究,有助于為糖尿病大血管病變的防治提供新的思路。

1脂聯素及其受體概述

脂聯素,亦稱apM1(脂肪組織最豐富的基因轉錄產物)、GBP28(28KDa凝膠結合蛋白)、Acrp30(30KDa脂肪補體相關蛋白)等,是由脂肪細胞特異性分泌的具有244個氨基酸的多肽,包括N端信號肽、氨基端非螺旋功能區、膠原結構域以及C端球形結構域(gAcrp)。人脂聯素定位于染色體3q27處糖尿病及心血管疾病的易感位點。脂聯素因其具有改善胰島素抵抗、抗動脈粥樣硬化、降血糖、血脂、抗炎、抗氧化等作用而成為當前研究的熱點。

2003年6月Yamauchi等克隆了脂聯素受體(Adiponectinreceptor,AdipoR)AdipoR1與AdipoR2后,AdipoR也成了新的研究熱點,2004年Hug同樣用分子克隆技術得出結論T鈣粘蛋白(Tcadherin)是脂聯素的一種新受體,且Tcadherin是脂聯素六聚體和高分子質量多聚體的受體,不與脂聯素球狀結構域、脂聯素三聚體結合。

2脂聯素的胰島素樣血管活性作用

脂聯素的胰島素樣血管活性作用是指脂聯素可致內皮依賴性血管舒張,主要體現在脂聯素對血管舒張因子一氧化氮(NO)生成的影響。

內皮源性NO通過增強血管舒張、抑制血小板聚集、單核細胞黏附以及血管平滑肌細胞增殖等作用而對血管系統起著保護作用。脂聯素可以通過以下三個方面影響內皮細胞NO的生成,從而保護血管內皮細胞。第一,AMPKPI3KAKTeNOS途徑:AdipoR1與AdipoR2都在人臍靜脈表達。脂聯素作用于其受體后,可激活AMPK,AMPK再活化eNOS。活化eNOS的過程依賴于絲/蘇氨酸激酶(Akt)的活化,其中Akt與其上游磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)信號通路相連。因而通過上述途徑,脂聯素有益于血管內皮NO的產生,從而保護內皮功能;第二,接頭蛋白APPL1對NO生成的影響。接頭蛋白APPL1是AMPK的上游信號分子,新近研究表明,脂聯素與其受體的結合將促進接頭蛋白APPL1與AdipoR1、AdipoR2的胞質尾區相互作用。而通過RNA干擾抑制人臍靜脈內皮細胞APPL1的表達,將減弱脂聯素誘導的AMPK第172位蘇氨酸位點和eNOS第1177位絲氨酸位點的磷酸化激活,也減弱eNOS和HSP90復合物的形成,最終導致NO產量的明顯下降。可見APPL1介導脂聯素誘導的內皮細胞NO產量和內皮依賴性血管舒張;第三,抑制NADPHOxidaseRos途徑,一項在主動脈內皮細胞進行的研究提示,球形脂聯素可通過抑制NADPH氧化酶(NADPHOxidase)的活性,抑制氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)誘導的反應性氧化產物(ROS)的產生,從而恢復eNOS的活性并減少NO的破壞。

3脂聯素的抗炎、抗氧化作用

3.1脂聯素的抗炎作用現在已知的與內皮細胞作用相關的物質有:自由脂肪酸,細胞因子如腫瘤壞死因子(TNFα),以及氧化強化劑分子如氧化修飾型低密度脂蛋白(oxLOL)等。這些物質激活信號激酶,也與活性氧(ROS)密切相關。代謝綜合征和糖尿病就根源于ROS主導的炎癥反應。目前發現脂聯素對血管功能和炎癥細胞都有直接影響,在動脈粥樣硬化早期,炎癥因子如TNFα能激活產生黏附分子,從而使單核細胞與血管內皮細胞黏附。脂聯素可抑制TNFα誘導的細胞黏附分子(如VCAM1,E選擇素,ICAM1)在人主動脈內皮細胞表面表達,脂聯素通過激活環磷酸腺苷(cAMP)蛋白激酶A(PKA)信號通路,抑制TNFα介導的核因子κB(NFκB)的抑制分子(IκBα)的快速磷酸化及降解,從而抑制NFκB的活化,來減輕內皮細胞的炎癥反應。脂聯素還可減少TNFα誘導的人主動脈內皮細胞中的IL8的表達水平。此外,脂聯素的抗炎癥效果還包括抑制白細胞聚集、減輕噬菌細胞的活性以及降低巨噬細胞TNFα的分泌水平。

3.2脂聯素的抗氧化作用不斷增加的氧化應激是肥胖和糖尿患者血管機能障礙的致病基礎。臨床研究也表明,血漿脂聯素水平與反應氧標記物呈負相關。

當低密度脂蛋白(LDL)顆粒在血管壁處吸收并氧化,可以促進泡沫狀細胞的形成,遏制內皮型一氧化氮合酶(eNOS)的活性,引起炎癥反應并刺激活性氧(ROS)的產生,從而最終導致動脈粥樣硬化的形成。利用大動脈內皮細胞進行研究,結果表明脂聯素(gad)能夠抑制oxLDL誘導的細胞增殖、過氧化物的釋放和對有絲分裂原激活蛋白激酶(p42/p44MAPK)的活化,對內皮起到抗氧化作用。較新的一項研究亦表明,脂聯素可通過cAMP/PKA途徑,抑制高糖狀態下的內皮細胞反應氧的產量,從而發揮血管內皮保護作用。

4抗動脈粥樣硬化

動脈粥樣硬化的發生發展的兩個主要機制是:一,單核細胞在細胞黏附因子的作用下黏附于血管內皮,分化為巨噬細胞,然后轉化成泡沫細胞;二,內膜增厚,中層平滑肌細胞增生并遷移至內膜下。脂聯素通過對這兩個過程的干預,進而發揮抗動脈粥樣硬化的作用。

脂聯素通過對這兩個機制的干預,起到抗動脈粥樣硬化的作用。第一,脂聯素通過減少黏附分子在血管內皮細胞上的表達來抑制單核細胞對內皮細胞的黏附;通過減少血管內膜下巨噬細胞清道夫受體的表達和脂質的積聚來抑制其向泡沫細胞的轉變;第二,脂聯素可抑制諸如成纖維細胞生長因子、表皮樣生長因子、血小板源性生長因子BB等致動脈粥樣硬化生長因子介導的人主動脈平滑肌細胞的增殖和向內膜下的遷移[14]。類似地,一項新近的研究也表明,脂聯素可抑制由血小板源性生長因子BB誘導的載脂蛋白E缺陷小鼠肺主動脈平滑肌細胞的增殖。脂聯素的抗平滑肌增殖的作用可能是由于其與那些生長因子的結合,從而阻斷了生長因子與它們相應的膜受體的結合。

5脂聯素對內皮保護的相關基因治療研究

脂聯素的基因治療目前處于體外細胞轉染和體內動物實驗的階段,通過載體將脂聯素基因輸入細胞或體內,使其表達,從而達到研究目的。

篇9

【關鍵詞】 pUDKH基因；血管；肌肉；組織病理

【Abstract】 AIM: To observe the effects of pUDKH administration locally on blood vessels and muscles in dogs with hindlimb ischemia. METHODS: Dogs were anesthetized with an intravenous injection of sodium pentobarbital (30 mg/kg). Then the left external iliac artery as well as all of the above arteries were ligated completely with silk thread. Thus the completely ischemic hindlimb model was established. The dogs with completely ischemic hindlimb were randomly pided into 2 groups: control group (control vector pUDK) and HGF transferred group (pUDKH)， 4-6 dogs each. Then pUDKH or pUDK was injected directly into the left ischemic limb muscles. Three months (90 d) after injection， left external iliac arteriography was performed， blood flow rate of the left femoral artery was quantified and the temperature of distal muscle in hindlimb was measured. At the same time，the left femoral artery and femoral around muscles at the sites of injection of pUDKH and pUDK plasmids were removed and stained with HE to observe their histopathological changes by light microscopic examination. RESULTS: The degree of augmentation of collateral vessel formation was significantly greater than that treated by control vector in hindlimb ischemia models. In addition， the blood flow rate of femoral artery in dogs treated with pUDKH was recovered on day 90， while the flow rate was only 1/5 to 1/3 in control dogs. Degeneration and breakage of muscle fibers and edema among muscle bundles were observed in ischemic limb of control dogs， but in ischemic hindlimb transfected with pUDKH， no significant pathological changes were found. For control dogs， collapse of the left femoral artery， thickening of vessel wall and stenosis even occlusion of small blood vessel among muscle bundles were observed， few new blood vessels were found. But in pUDKH dogs， above all were almost normal. CONCLUSION: pUDKH has a protective effect on blood vessels and muscles in dogs with hindlimb ischemia.

【Keywords】 pUDKH；artery；muscle；histopathology

【摘要】 目的: 觀察pUDKH(攜帶肝細胞生長因子基因的質粒)基因治療犬下肢缺血后對其血管和肌肉組織病理學的影響. 方法: 雜種犬在靜脈內注射苯巴比妥鈉麻醉下，于左后側腹股溝在股動脈由髂外動脈分支處的起始端進行全結扎，造成肢體缺血模型. 模型犬被隨機分為對照組和pUDKH處理組，并在結扎后即刻分別注射pUDK（空白質粒）或pUDKH. 于手術后3 mo，行左髂外動脈造影術，測定股動脈血流量和下肢遠端局部溫度，并從被結扎的后肢股動脈及內外側肌肉取組織標本，經常規組織病理切片染色，光學顯微鏡下觀察. 結果: 3 mo時血管造影pUDKH組可見明顯血管網的形成，而轉移空質粒的對照組僅見少量新生血管；此時轉移pUDKH組犬股動脈血流量已恢復到結扎前的水平，而對照組股動脈血流量僅為結扎前的1/5~1/3；轉移pUDKH組結扎側肌肉溫度與健側相比無明顯差異，而對照組兩肢體肌肉溫度卻相差1~2℃. 組織學觀察對照犬可見結扎點遠端股動脈塌陷，肌束間動脈管壁變厚，管腔變小甚至消失，少見新生的小血管；pUDKH處理組犬結扎點遠端股動脈管腔開放，肌束間小動脈壁均普遍未見增厚，管腔亦未縮小；對照犬結扎側肌纖維變性、斷裂、肌束內水腫、脂肪性變，pUDKH處理組結扎側的肌肉組織中上述病變不明顯. 結論： pUDKH的局部注射對犬下肢缺血后血管和肌有保護作用.

【關鍵詞】 pUDKH基因；血管；肌肉；組織病理

0引言

下肢缺血主要是血栓閉塞性脈管炎或糖尿病性下肢中小血管病變、周圍神經病變等所造成的下肢慢性缺血，涉及血管、神經、肌肉等組織的病變，當病變進展而減少了動脈的橫截面積至80%或更多時，患者表現間歇性跛行、功能障礙，甚至肢體壞死（壞疽）. 目前對此尚無理想的藥物治療方法，最終需行截肢手術而致殘，預后較差［1-4］. 近年來基因治療為其開辟了一條新的途徑，通過合適的載體介導，轉移促血管生長因子的基因于缺血組織，可促進新血管在局部的產生，形成血管“網”和血管“橋”，建立“分子搭橋”機制.

人肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor， HGF）是一多功能生長因子，除促進血管新生外［4］，對器官/組織的損傷有一定的修復作用［5］，包括肌肉、神經等. 本文利用犬后肢結扎股動脈造成血管閉塞性疾病的動物模型，采用股動脈周圍骨骼肌肉內多點注射攜帶HGF基因的裸質粒pUDKH方法，探討其治療犬肢體缺血時對其血管和肌肉組織病理學的影響，為局部pUDKH基因治療的實際應用提供實驗依據.

1材料和方法

1.1材料

動物：河北地區草狗18只，雄性，年齡為1.5~3歲，體質量12~15 kg，由軍事醫學科學院動物實驗中心提供. pUDKH: 攜帶人肝細胞生長因子基因的重組裸質粒， pUDK: 未攜帶人肝細胞生長因子基因的空質粒， 軍事醫學科學院放射醫學研究所三室提供.

1.2方法

1.2.1動物模型的建立犬經15 g/L戊巴比妥鈉靜脈麻醉（30 mg/kg）后. 在無菌條件下分離左側髂外動脈遠端及分支和股動脈近端，將髂外動脈遠端及股動脈分支全部結扎，造成左下肢血管完全閉塞性血管病模型. 在股動脈處安置血流量計探頭，左外側肌肉插入THRNST針型體溫度電極，測定股動脈完全閉塞前、后10 min內股動脈血流量及左、右外側肌肉溫度，以判斷左側髂外動脈遠端已完全閉塞. 右側下肢動脈不予結扎.

1.2.2基因轉移將模型動物隨機分為4組：模型對照組（給予不攜帶HGF基因的空質粒pUDK 0.30 mg/kg (6只），pUDKH 0.15 mg/kg組(4只)，pUDKH 0.30 mg/kg組(4只)和pUDKH 0.60 mg/kg組(4只). 按每公斤體質量給犬的藥量，將pUDK或pUDKH稀釋在1 mL生理鹽水中，于手術后10 min內，在左大腿肌內側注射3點，左大腿肌外側注射2點，每點注射體積為0.2 mL，最后逐層關閉傷口. 以后的飼養過程中不再進行基因轉移.

1.2.3動脈血管造影每組全部犬的術后90 d，于右側股動脈內插管行至髂總動脈端，行左髂外動脈造影術，導管尾端連接一高壓注射器快速注入泛影葡胺，拍攝X光片以觀察新生血管和側支循環的形成情況.

1.2.4股動脈血流量及肢體溫度測定在術前和術后0 d，90 d各測定股動脈血流量和下肢遠端局部溫度一次.

1.2.5組織病理學檢查于手術轉基因后3 mo，從結扎的后肢股動脈及內與外側肌肉取組織標本，經常規組織病理切片染色，光學顯微鏡下觀察.

統計學處理： 實驗數據采用SPSS 10.0軟件分析. 實驗數據以x±s表示，用方差分析法及LSDt檢驗比較各給藥組與對照組的差異，組內左、右比較采用配對t檢驗. P

2結果

2.1血管

2.1.1轉移質粒pUDKH可明顯促進缺血肢體血管網的建立股動脈完全結扎后，轉移質粒pUDKH組于結扎后即刻進行血管造影便可見到血流完全阻斷，90 d時有明顯的新生血管和血管網形成. 這些新生血管和血管網形成后，從股動脈結扎點到股動脈遠端由許多小血管網連接，從而使髂外動脈灌注到結扎點遠端股動脈血流運行通暢（圖1A）. 單純轉移空質粒

A： pUDKH組，轉移pUDKH 0.30 mg/kg后第90日；B： 對照組，轉移空質粒pUDK 0.30 mg/kg后第90日， 箭頭所示為結扎部位.

(pUDK)的對照組，90 d的新生血管數顯著少于轉移pUDKH基因組，股動脈結扎點以下的動脈全部消失(圖1B). 轉移pUDKH 0.15，0.30，0.60 mg/kg三個劑量組之間差別不明顯，0.60 mg/kg組比其他2個給藥組更容易使髂外動脈結扎點到股動脈接點縮短.

轉染pUDKH的三個劑量組在/100 cm2骨骼肌內、外側和皮膚中血管數明顯比模型對照組多，差別非常明顯. 與未手術的右下肢骨骼肌內、外側和皮膚比較，無明顯的差異. 轉pUDKH基因大、中、小劑量組犬骨骼肌組織之間的血管數與健康肢骨骼肌組織血管數相差不明顯(表1).表1左下肢內、外側骨骼肌和皮膚血管數的變化(略)

2.1.2股動脈血流量及肢體溫度測定髂外動脈完全結扎后即刻，股動脈血流量從平均(41.50±5.99) mL/min，下降為0，隨著術后飼養時間的延長，模型對照組下肢股動脈血流有所增加，術后90 d比術后即刻增加了7 mL/min. 而轉染pUDKH的3個劑量組在術后90 d，結扎側股動脈流量已經恢復到術前的水平(表2).表2轉染pUDKH后股動脈血流量（略）的變化

轉染pUDKH后90 d犬左側下肢肌肉溫度與健側肌肉溫度無明顯差異，而模型對照組左右后肢肌肉溫度相差1~2℃(表3).表3轉染pUDKH后左側肢體溫度的變化(略)

2.1.3股動脈形態對照犬有的股動脈仍處于塌陷狀態，致使管腔幾乎完全消失（圖2A）；pUDKH 處理犬股動脈的橫截面上可見內彈力板完整，有的管腔已伸展完全，可與正常犬者相當（圖2B）.

2.1.4肌束間血管形態對照犬肌束間小動脈管壁變厚、管腔變小甚至消失，且肌束間或肌外衣下纖維組織中也罕見新生的小血管. 中等大小動脈管腔亦變小、管壁變厚（圖3A）. pUDKH處理犬除個別者外，肌束間小動脈壁均普遍未見增厚，管腔亦未縮小. 此外，肌束間或肌外膜下的結締組織中常含有較多的新鮮紅細胞（圖3B）.

2.2肌肉形態對照犬觀察到結扎側肌纖維變性、橫紋不清晰；肌纖維及細胞核變細、斷裂、染色淡，肌束內水腫，以及出現脂肪（圖4A）. pUDKH處理犬經各劑量處理的結扎側的肌肉組織中上述病變均已不很明顯（圖4B）.

3討論

在實驗中，經活體股動脈血管造影已清楚地觀察到，pUDKH處理組犬使結扎側肢體比用不攜帶HGFA： 對照組，轉移空質粒pUDK后第90日，示肌束內及肌束間中小動脈管壁變厚，管腔變小，甚至幾盡消失; B：pUDKH組，轉移pUDKH（0.30 mg/kg）后第90日，示肌束間中小動脈管壁未見增厚，管壁無縮小，管腔內充滿新鮮的紅細胞.

基因的空質粒處理的對照組犬的相應肢體中，更早而更多地出現新生的血管，轉染pUDKH后90d血管造影可見到血管“橋”和“網”的大量的形成，髂外動脈完全結扎點血流仍然通暢，在結扎點周圍有許多血管“網”和血管“橋”，使髂外動脈與股動脈血流通暢無阻，結扎點下方的股動脈血管變粗，血管充盈，使缺血損傷的股動脈的血管功能恢復，骨骼肌內、外側有大量小血管形成，有助于股動脈遠端的肌肉組織血液供應，從而使轉染pUDKH動物肢體功能恢復，提高了動物的生存質量. 本文通過結扎后3 mo活殺時所取標本進行常規組織病理學觀察的結果，也為此提供了組織形態學的證據. 轉染pUDKH 0.15，0.30，0.60 mg/kg三個劑量組之間差別不明顯，0.60 mg/kg組比其他2個給藥組更容易使髂外動脈結扎點到股動脈接點縮短或完全融合成一個完整的血管網. 轉染pUDKH的三個劑量組在/100 cm2骨骼肌內、外側和皮膚中血管數明顯比模型對照組多，差別非常明顯. 與未手術的右下肢骨骼肌內、外側和皮膚比較，無明顯的差異. 轉pUDKH基因大、中、小劑量組犬骨骼肌組織之間的血管數與健康肢骨骼肌組織血管數相差不明顯，表明轉染pUDKH的骨骼肌組織內血管并沒有因藥物劑量增加而血管成倍量的增長.

由于被結扎的肢體于用HGF處理后得到了充分的血液供應，該患肢的肌肉也理所當然地獲得了足夠的氧氣和必需的營養物質，從而促使其恢復因缺氧和營養物質而造成的結構與功能的損傷. 本文的組織病理學觀察結果也為此提供了形態學的證據. 此外，結扎股動脈后只予以空白質粒處理犬的患肢肌肉中出現有肌纖維變細、斷裂或某些肌束中有缺失肌組織以及脂肪組織浸潤的現象，而在pUDKH處理組肌束中則少見這種圖像；因此可以推測，隨著血運逐漸重建的過程，已發生變性的肌肉就會發生逆轉，而肌組織缺失處也會有新生的肌纖維予以補充. 這也是可能發生的，因已有報道表明HGF對能夠形成新生肌纖維的肌衛星細胞有刺激增殖的作用［5］.

本文觀察的結果（資料未列出）還表明，因股動脈被結扎而使血運嚴重受到干擾的患肢中從股神經直到肌束間的細小神經都發生了顯著的退行變，累及軸突、髓鞘和施旺氏細胞核，而經pUDKH處理犬的各級神經均已得到了明顯的恢復，有的甚至已經達到了正常犬的圖像. 這些外周神經的恢復，估計得利于HGF的雙重作用：①缺血造成的神經纖維損傷，由于HGF促進了供血系統的重建而得以修復；②據文獻報道HGF本身也有促進神經恢復的作用［6］. 這兩種因素在本實驗模型中究系各起到多大比重，目前尚無法加以估計.

本實驗只是一個探索性的工作，因而沒有在結扎并用空白的或攜帶HGF基因的裸露質粒處理后的不同時間段，進行系統性的動態取樣觀察. 推測在血管新生和形成血管網的早期節段，能夠在劑量效應關系方面，或全或半結扎模型的療效差別方面作出一定的評價. 如有可能今后可以做這方面的探討，還要做一些特殊染色（例如肌肉和髓鞘等特殊染色方法）的觀察. 除此之外，如有條件，還可做一些生理學指標的觀察，例如在供血系統重建過程中對肌力和神經傳導速度的動態觀測量等.

【參考文獻】

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［4］Ha XQ，Ren JP，Bi JJ，et al. Therapeutic angiogenesis induced by human hepatocyte growth factor gene in dog hindlimb ischemia models［J］.Chin Sci Bulletin， 2003，48(7):676-680.

［5］Miller KJ，Thaloor D，Matteson S， et al. Hepatocyte growth factor affects satellite cell activation and differentiation in regenerating skeletal muscle［J］. Am J Cell Physiol，2000，278(1):C174-181.

篇10

【關鍵詞】消化系統；基因診斷；治療

【中圖分類號】R57 【文獻標識碼】C 【文章編號】1008-6455（2010）11-0186-01

1基因診斷技術及應用

基因診斷是以基因型為基本，因而可在疾病未出現癥狀前，及至胚胎時期便可明確診斷。傳統基因診斷時常應用基因探針技術和聚合酶金鏈反應（PCR）技術檢測相關基因的核苷酸序列。基因探針技術包括斑點雜交、Southern印跡法、Northern印跡法、原位雜交竺，其中以Southern印跡法最為常用，但這些技術操作復雜、自動化程序低，對洗繁的基因篩選幾乎是無能為力的。基因芯片技術的旌為疾病的基因診斷提供了新的解決方案。基因芯片（gene chip），也稱基因微矩陣（microarray），是在玻璃、硅待載體上有序地、高密度地（目前點與點之間的距離小于500um）排列，以固定大量的靶基因片段（也稱分子探針）。樣品核酸分子經過標記，與固定在載體上的DNA陣列中的點同時進行雜交，雜交信息通過計算機進行集約化和平行處理，獲得信息量的效率是傳統生物學技術無法比擬的，可以同時研究成千上萬個基因地某種生理和病理條件下的表達變化，為疾病的基因診斷提供了一個強有力的工具。

消化系統惡性腫瘤是一類多基因異常疾病，在腫瘤發病的不同階段，可 相應的基因異常，一直為基因診斷研究的熱點。與已明確胰腺癌最常見的基因異常是K-ras基因12密碼子的點突變，食管癌、胃癌、結腸癌、肝癌的P53突變率達50%-60%，胃癌中CD44異常表達幾近100%，結腸癌中K-ras點突變也達80%。基因芯片為癌相關基因大規模篩查提供了可能，目前國內外已有學者應用基因芯片技術對食管癌、肝癌、結直腸癌和胰腺癌等組織或體外細胞株進行基因表達譜的研究，成功地發現了涉及細胞生長周期、細胞內信號傳遞、炎癥反應和細胞因子等上百條表達上調或下調的基因，并結合基因導入的方法，開展了關鍵基因的功能研究，如：Lu等應用cDNA芯片篩查了正常黏膜組織、輕度不典型增生、中度不典型增生、原位癌（CIS）和鱗狀細胞癌等5個級別食管病變組織細胞基因表達譜的改變，通過聚類分析發現了一批與食管癌的基因草圖，構建人結直腸癌、正常結腸黏膜和結腸癌轉移灶的基因表達情況。可以設想：應用基因技術分析腫瘤不同階段基因表達譜的改變，找出與惡性腫瘤發生發展、生物學特征、治療敏感性及不同預后有關的基因，重新組合、設計制作成用于惡性腫瘤早期診斷、疾病特征分析和預后判斷的工具芯片，理論上是完全可行的。雖然基因消化系統腫瘤的基因診斷中剛剛起步，但已顯示出廣闊的應用前景。

除對腫瘤的診斷外，基因診斷還應用到消化系多個方面。炎癥性腸 （Znflammatory Bowel Disease，ZBD）因在我國的發病呈顯著上升趨勢而得到越來越多的關注，IBD病因至今不清，種族發病差異較大，近年來在歐美和澳大利亞進行了疾病候選基因的研究和篩查，已成功定位了疾病相關連鎖區，主要有16、12、6、14和5號染色體，已分別命為IBD1-5，并發現了NOD2基因，NOD2基因產物為細菌組分的細胞內受體，由此證明了IBD與天然免疫之間的重要聯系。

2基因治療方法與應用

基因治療是指將新的遺傳物質（治病基因）轉入由于基因缺陷而致病的細胞或組織中，以糾正疾病細胞的表型，達到治療疾病目的的一類治療方法。用于基因治療的基因轉移方法分兩大類：一類為病毒載體，包括應用逆轉錄前病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體、單純皰疹病毒載體、痘苗病毒等。近年來，又探索將慢病毒家庭中的人免疫缺陷病毒（HIV）經改造作為載體。第二類基因轉移方法為非病毒法，包括陽離子脂質體轉染法、裸DNA直接注射法、磷酸鈣沉淀法、微粒子轟擊法（基因槍）、微注射法、受體介導法等。

目前，一個新基因治療系統-EC-CD/5-FC（大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶、5-氟胞嘧啶）系統正日益受到高度關注。胞嘧啶脫氨酶是大腸桿菌代謝旁路中的一種酶，哺乳動物細胞中不含該酶。Ausin等于1992年首先從大腸桿菌菌株中采用傳統方法提取質粒DNA，并初步構建成原核細胞中表達的CD質粒載體，由于哺乳動物細胞中不存在胞嘧啶脫氨酶，因而不能將胞嘧啶轉化成尿嘧啶，更不能將5-氟胞嘧啶（5-Fluorocytosine，5-FC）轉化成5-氟尿嘧啶（5-Flu-orouracil，5-FU）。但通過基因轉移技術將胞嘧啶脫氨酶基因轉入哺乳動物細胞，則哺乳動物細胞可將一些原來無毒性的原藥（5-FC）經胞嘧啶脫氨酶轉化為有細胞毒性的代謝產物（5-FU），導致細胞自殺性死亡。現已用于結腸癌、肝癌、胰腺癌等多種消化系腫瘤的研究，取得了很好的效果，但設計安全、高效、穩定、特異、可控、簡便易行并可攜帶不同長度DNA的新載體仍是該基因治療研究中亟待解決的問題。