淺談3R原則及實驗設計

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摘要：3r原則（即替代，減少，優化）廣泛適用于實驗教學和任何科研領域的動物實驗中。成功應用3R的關鍵是在收集數據之前，需要提前考慮好合理的實驗設計和分析方法。很多實驗設計原則，比如實驗設計要有效、可靠和高效；實驗結果的統計方法要清晰透明；在實驗室確保對動物福利的尊重和理解，都是有助于實現3R原則目標的關鍵。

關鍵詞：3R原則；實驗設計；應用

3R原則適用范圍很廣，比如基礎醫學的實驗教學，科學研究，或是獸醫學，最直接的就是實驗室的動物實驗。然而目前，3R原則是否可以成功應用于實驗室，仍然是一個不容樂觀的問題。十年前歐盟每年用于研究和藥物檢測的實驗動物大約1200萬只，美國每年至少1700～2200萬只[1]。而最近幾年每年全球實驗動物使用量預計至少在一億以上。然而，這還僅僅是保守估計，因為很難準確統計出所有用于實驗的動物數量，大部分國家不會將相關數據公布出來。從現有的數據可以清楚地看到，在過去幾十年里，用于科學研究的實驗動物數量有增無減。合理應用3R原則可以有效解決這個問題，因此，3R原則及其在實驗中的應用和推廣至關重要。

13R原則

3R原則是1959年英國動物學家WilliamRussell和微生物學家RexBurch在經典著作《仁慈試驗技術原理》提出的[2]。3R原則中的“R”分別是replacement（替代），reduction（減少），refinement（優化）。作為實驗動物倫理法則，應用于任何與動物實驗相關的科學研究、實驗教學及其他領域中。旨在倡導研究者在工作中用其他實驗方法或實驗材料取代實驗動物，通過合理的實驗設計把實驗動物的使用量降到最低，改善或者降低實驗動物承受的痛苦。第一個“R”，replacement（替代），分為絕對替代和相對替代。絕對替代是最理想的結果，比如通過計算機建立虛擬模型來替代活體動物和動物來源的細胞、組織、器官，完全取代實驗動物。而相對替代，則是指使用動物來源的，已經建立好的細胞系，或者用低疼痛感的模式動物（單細胞動物）替代哺乳動物。第二個“R”，reduction（減少），指在不影響實驗數據的“質”和“量”的前提下，盡可能減少實驗動物的使用量，提高實驗動物的利用率和實驗的精確度。“減少”不單是指在原有的實驗上減少使用實驗動物的數量，除此之外，還有一層“相反”的含義，就是增加單個小實驗的動物使用量，所獲得的實驗結果可以有效減少整個實驗設計所需的動物數總量。最后，第三個“R”，refinement（優化），指通過任何途徑來避免或減少實驗動物現有的或潛在的精神緊張、痛苦和不良反應，提高實驗動物福利。Russell和Burch把對動物的傷害分為必然傷害和偶然傷害。必然傷害是指實驗設計帶給實驗動物的傷害，偶然傷害則是由于操作不當對實驗動物造成的意外傷害。

23R在實驗設計中的應用

無論是教學還是科研，3R原則在實驗設計部分的應用至關重要，因為實驗設計與分析方法從根本上決定了實驗動物的“最少”使用量和實驗動物承受的“最低”痛苦。“最少”和“最低”是指在理想狀態下，沒有因實驗操作不當造成實驗動物意外的死亡和不必要的傷害。實驗設計的目的，通常是驗證假設，一般我們可以通過檢測某個特異性指標來驗證假設。無論是通過何種方法驗證假設，3R原則都應該始終貫穿其中，即與實驗設計和分析緊密相連，盡量用模式動物替代哺乳動物，或者在實驗教學中，用模擬實驗替代動物實驗；減少對實驗結果價值很少甚至沒有價值的實驗動物的使用，避免不必要的浪費；優化實驗方法，以避免或減少實驗動物的痛苦，精神緊張和傷害的時間，以改善實驗動物福利[3]。如何在保證實驗結果的前提下，遵循3R原則，在實驗設計階段，把實驗動物使用量降到最低，把實驗動物承受的痛苦降到最低，是每一個研究者在設計研究方案期間必須思考的問題。2.1減少實驗中所需要的動物數量。2.1.1判斷適當的樣本大小。理想情況下，如果不考慮倫理，資金，時間，人力物力或其他方面的成本，研究人員希望通過檢測全部目標人群來揭示事物的本質或者真理。顯然，在絕大多數情況下，這既不可能也不可取，因此，研究人員必須在保證研究結論具有一定可靠性的前提下，估算最少的樣本量。不能少于“必要的數量”，也不能過多。這個數字無論過多還是過少，對實驗結論和實驗動物都是不負責的表現。理論上，“必要的數量”（樣本量）取決于實驗設計，統計的變量類型（連續型變量，分類型變量等）。檢驗水準、檢驗功效、總體標準差、容許誤差都是決定樣本含量的要素。實驗設計和分析方法越復雜，精密度準確度要求越高，需要估計的未知變量越多，樣本就越大，計算也越復雜。2.1.2采用高效的設計方案。為了增加實驗的檢驗功效，研究者可以增加樣本量，減少現有實驗的變異，采用替代措施，在解答相同研究假設的基礎上，獲得更大的（標準化）效應量。比如應用區組化設計消除個體變異對實驗結果的影響，或者在嵌套設計中，采用因素組合而不是一次測試一個因素，這樣可以從相同數量的動物中收集更多信息，并且每個因素組合可以設計有相對較少數量的動物。2.2使用其他手段替代動物實驗。在實驗設計中應用絕對替代，必須保證獲得的數據與其所替代的基于動物實驗所獲得的一樣可靠、有效。如果失去這個前提，特別是在醫學模型設計或者毒理學試驗中，就變得沒有意義了。關于相對替代，英國1986年制定的《動物（科學方案）法令》（《實驗動物法》）對動物物種以及物種的發育階段進行分級，作為實驗設計中相對替代的選擇原則。替代方案合理性的評估指標是相關性和可靠性。相關性相當于預測效度，而可靠性是指實驗的重現性。2.3優化現有實驗，減少動物受到的痛苦和傷害。Russell和Burch把“優化”分為兩種，一種是針對由實驗設計本身給實驗動物帶來的痛苦，一種是針對由于疏忽大意給實驗動物帶來的意外傷害。第一種一般是建立模擬人類某種疾病的動物模型，這種情況，我們應該盡可能在設計實驗時，降低由疾病造成的實驗動物痛苦的時間，減輕傷害的程度。比如，美國動物倫理委員會規定，荷瘤小鼠的腫瘤最大直徑不能超過2cm，違反動物倫理要求，再有貢獻的研究數據也會被撤銷，甚至研究結論也會遭到質疑。2015年，一篇4年前發表于《Nature》的文章引起了爭議，原因就是研究人員使小鼠腫瘤體積超過了規定大小。最后文章雖然沒有被撤稿，但有關小鼠的實驗數據被撤銷。除此之外，實驗動物在過程中的恐懼和痛苦，會對實驗結果進行干擾，增加實驗的變異性/偏差[4]。優化實驗設計，注重實驗動物福利，不僅是倫理要求，也是對實驗結果的一種負責。

3結語

動物實驗廣泛存在于基礎研究（教學），臨床藥物研究以及獸醫研究中。每年為此貢獻出生命的實驗動物數量相當龐大。一項科學研究，想要得出客觀理性的結論，必須有扎實的統計數據做保證，設計不佳的實驗和不充分的統計分析，會造成實驗動物不必要的損失，違背實驗動物倫理學的3R原則。想要在實驗中成功應用3R原則，關鍵在于收集數據前反復思考的實驗設計和統計方法。而3R原則的應用也可以起到改進實驗研究的目的。比如，合理、可靠、高效的實驗方案；清晰、明確的觀察指標；實驗中對實驗動物福利的重視。將實驗動物的使用減到最少，對實驗動物的傷害降到最低，是我們一直需要努力的方向。

參考文獻

[1]PeterSinger.動物研究中的倫理學問題[J].中國醫學倫理學，2004，17（2）：31-34，36．

[2]RussellWMS，BurchRL．ThePrinciplesofHumaneExperimentalTechnique[M].London：Methuen，1959．

[3]白晶.動物實驗3R原則的倫理論證[J].中國醫學倫理學，2007，20（5）：48-50．

[4]楊青.國內外醫學實驗動物福利現狀與思考[J].天津醫學，2011，23（4）：74-76．

作者:苑博 單位:天津醫科大學基礎醫學院