整合子系統與銅綠假單胞菌多重耐藥性

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［摘要］多重耐藥性銅綠假單胞菌是臨床抗感染治療中的一個棘手的問題，除了外排系統，外膜通透性障礙等天然耐藥機制之外，整合子介導的多重耐藥基因也是造成銅綠假單胞菌多重耐藥的主要原因之一。本文就整合子的結構與分類、基因盒的種類與表達以及與銅綠假單胞多重耐藥性的關系進行綜述。

［關鍵詞］多重耐藥性；銅綠假單胞菌；整合子；基因盒

整合子(Integron)是1989年由StokesHW等首次提出的一個與細菌耐藥性傳播有關的基因系統，可捕獲和整合細菌耐藥基因，在細菌耐藥性的傳播和擴散中起了重要的作用。質粒和轉座子攜帶整合子增加了抗生素耐藥基因在細菌之間的傳播。整合子通過位點特異性的基因重組可整合多種耐藥基因對細菌多重耐藥性的形成起著重要作用，整合子介導的多重耐藥基因也是造成銅綠假單胞菌多重耐藥性的原因。

1整合子的結構與種類

整合子由整合酶基因(IntI)，重組位點(attI)，1個或2個負責插入基因盒表達的啟動子所組成［1］。整合子根據整合酶基因不同分為6種類型，但研究較為詳盡的是前4種類型，臨床分離的多重耐藥性銅綠假單胞菌主要含有Ⅰ類整合子和Ⅲ類整合子。Ⅰ類整合子基本結構由三部分組成，兩端是一段高度保守的序列，分別稱作5’CS和3’CS，5’CS和3’CS之間的區域稱作可變區，可變區由一個或多個外來插入的基因盒組成。5’CS區有一個編碼整合酶的IntI基因，一個基因重組位點attI及啟動子(P1和P2)。3’CS包括三個開放閱讀框架：季銨鹽化合物及溴乙錠耐藥基因，磺胺耐藥基因。基因盒由一個結構基因和59堿基單元即attC組成［2］。Ⅰ型整合子的整合酶主要催化attI和attC位點間的重組，可將外源性耐藥基因撲獲并整合入整合子，兩個attC位點間或attI位點間也可被催化重組［3］;Ⅱ類整合子常與Tn7有關［4］，基整合酶基因是缺陷的INTI基因，它的產物INTI1的產物有40％同源性，3保守末端包括5個tns基因，協助轉座子的移動;Ⅲ類整合子攜帶僅發現在一型整合子中出現的碳青霉烯類耐藥性金屬酶基因blaIMP，基整合酶基因intI3與intI1有61％同源性;Ⅳ類整合子又稱為超級整合子，在霍亂弧菌基因組中首次發現。最近假單胞菌中發現的In5504被認為介于多重耐藥整合子與霍亂弧菌超級整合子之間。

2基因盒的結構和種類

基因盒由一個結構基因和3端的一個回文序列attC組成，attC位點有1個59堿基長的片段，所以attC以前被稱為“59片段”。attC由1個可被整合酶識別的特異性重組位點組成，attC位點的長度從576bp到141bp不等［5］。迄今報道在整合子上發現幾十種耐藥性基因盒，不同的基因盒有不同功能和結構，基因盒一般由一個或多個編碼不同的抗性的基因組成，包括最初發現的編碼氨基糖苷類和氯霉素鈍化酶的基因，編碼磺胺類，β內酰胺類耐藥的基因，以及近來發現的編碼超譜β內酰胺酶及碳青霉烯類水解的基因［6］。銅綠假單胞菌多重耐藥性菌株中含有介導氨基糖苷類耐藥的aac296基因，AAC(6)296能緊密接合隔絕藥物，而介導對抗生素的耐藥性［6］，目前發現的IMP1、VIM1、VIM2這3種金屬酶基因均位于Ⅰ類整合子的可變區，可以在不同銅綠假單胞菌和不同的細菌間傳播，造成耐藥性播散［7］，BlavEM1是位于整合子的基因所編碼的一種EsBL，介導銅綠假單胞對B內酰胺類抗生素耐藥。銅綠假單胞菌染色體中發現的介導對氯霉素耐藥CatBl基因和CatB7基因與CatB2、CatB3及CatB5等基因盒關系密切［8］。

3基因盒的表述

細菌通過整合酶的作用，捕獲外來的耐藥基因，并在位于整合子上游的啟動因子作用下得到表述，使細菌具有耐藥性和多重耐藥性［9］，由于絕大多數基因盒不含有啟動因子，自身并不能表述，因而總是以相同的方向插入整合子，且其從5’保守片段中的啟動因子開始轉錄，整合子通過位點特異性的基因重組于整合多種耐藥基因，對細菌多重耐藥性的形成起重要作用［10］。由于基因盒按照從5’到3’的方向整合于attI位點，所以啟動區可使插入其中的基因盒共表達，在整合子5’CS含有P1和P2兩種啟動因子，P1是共同啟動因子，也是主要啟動因子。目前發現P1有幾種變異體，他們都有含有一段6個堿基的共同序列。TTGACA(35)和TAAACT(10)為強啟動因子。少數整合子還有P2啟動因子，位于P1的下游119堿基處，17堿基的P2變異體是強動子，當P1為弱變異體時，基因盒的表達主要依賴P2的作用。啟動因子的強弱會影響基因盒的表達水平，而且基因盒插入整合子的位置也會影響基因盒的表達。目前研究發現，靠近啟動因子的基因盒表達水平最強，位于一個或多個其他基因盒的下游會逐漸減弱。極少數基因盒自身含有啟動因子，不依賴于5’CS的啟動因子而自身可以表達。弱啟動因子下游或處于基因盒下游的耐藥性基因盒在抗生素選擇性壓力下，有可能借助整盒酶介導的基因重組，插入到強啟動因子下或靠近P1的位置，從而由低水平轉為高效表達，耐藥性水平隨之增強。

4基因盒—整合子系統和銅綠假單胞多重耐藥性

多重耐藥革蘭陰性桿菌特別是銅綠假單胞菌感染在全世界不斷增加，臨床出現的多重耐藥的銅綠假單胞菌與整合子對耐藥基因的積累分不開的，整合子上常常有新的整合子結構。它是有強的整合酶的結合位點和新的可變區結構，該可變區除有攜帶VIM2型金屬酶基因外，還攜有一個新的AACA4等位基因，編碼對氨基糖苷類抗生素的耐藥性，這表明整合子結構與基因酶的銅綠假單胞菌多重耐藥的獲得有關。基因盒整合子屬于可移動基因元件，可位于細菌的質粒或染色體上，能整合不同的耐藥基因盒，且一個整合又可捕獲多個基因盒，因此，可表達出對抗生素的多重耐藥性。Sckiguchi等［2］對引起尿路感染爆發的多重耐藥性銅綠假單胞菌進行分析，發現多重耐藥性的銅綠假單胞菌IMCJZ。S1菌株存在克隆擴增，對氨基糖苷類、β內酰胺類、氟喹諾酮類、四環素類、磺胺類等抗生素具有廣譜的耐藥性。IMCJZ，S1菌株含有存在于染色體而不存在質粒上新Ⅰ類整合子，它有三種耐藥基因即bla、aadal和aac(6’)Iae。Poerec等［13］發現銅綠假單胞菌表達超廣譜B內酰酶(GES9)基因，這種基因位于Ⅰ類整合子上，介導對多種B內酰類抗生素的耐藥性。近年來，由整合子攜帶多重耐藥性銅綠假單胞菌引起的醫院感染爆發流行，與金屬酶不斷出現和編碼金屬酶的基因定位于整合子上有關［14］。Pagani等［15］對意大利南部醫院引起下呼吸道感染的多重耐藥性銅綠假單胞菌進行分析，發現多重耐藥性銅綠假單胞菌有金屬β內酰胺酶活性。這種金屬酶基因(IMP13)，由Ⅰ類整合子所攜帶，同時Ⅰ類整合子攜帶編碼AAC(6’)Ib酶的aacA4氨基糖苷類基因盒。銅綠假單胞菌耐藥機制日趨復雜，是其耐藥性常為多種機制并存。研究細菌整合子性質和種類，基因盒的種類和表達，有利于對銅綠假單胞菌多重耐藥性的發生和轉移機制的了解。目前認為抗生素的廣泛應用和不合理應用，形成強選擇性壓力是銅綠假單胞菌多重耐藥菌株出現的主要原因，因此加強臨床合理、有序應用抗生素，提高抗生素的有效性，同時減低抗生素的壓力，削弱整合子的發生從而減少銅綠假單胞菌多重耐藥性菌株的產生。

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