糖尿病皮膚潰瘍大鼠分析論文

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【關鍵詞】糖尿病;皮膚潰瘍;轉化生長因子β1;大鼠

糖尿病潰瘍是糖尿病的常見并發癥之一。益氣化瘀中藥治療糖尿病潰瘍取得了良好療效［1］，為進一步探討其促進糖尿病潰瘍創面愈合的機制，開展了本研究。

1材料與方法

1.1實驗動物清潔級2月齡SD大鼠60只，雄性，體質量200～250g，平均（223.05±14.91）g，由中國科學院上海實驗動物中心提供。動物合格證號：醫動字第02222號。

1.2藥物益氣化瘀方由生黃芪、太子參、桃仁和地龍組成，劑量比例為2.5∶2.5∶1∶1，大鼠的劑量為11.61g/(kg·d)，減壓濃縮至濃度為含生藥2.5g/ml。拆方益氣方由生黃芪和太子參組成，大鼠的劑量為6.75g/(kg·d)，減壓濃縮至濃度為含生藥1.5g/ml。拆方化瘀方由桃仁和地龍組成，大鼠的劑量為4.86g/(kg·d)，減壓濃縮至濃度為含生藥1g/ml［2］。均由上海中醫藥大學龍華醫院制劑室按水煎醇沉工藝制備成煎劑濃縮，4℃冰箱保存備用。堿性成纖維細胞生長因子（basicfibroblastgrowthfactor,bFGF）貝復濟，珠海東大生物制藥有限公司產品（批準號：國藥準字S10980077）。

1.3主要實驗試劑轉化生長因子β1（transforminggrowthfactorβ1,TGFβ1）一抗，SantaCruz公司產品（Sc146），工作濃度1∶80；HRP標記山羊抗兔二抗，北京中山生物工程公司產品（ZB2301）；化學發光底物，Pierce公司產品；NC膜（0.45μm），Millipore公司產品。

1.4主要實驗儀器RM2145切片機，Leica公司產品；IMS細胞圖像分析儀，上海申騰信息技術有限公司產品；MVCP410攝像機，Panasonic公司產品；BH2顯微鏡，Olympus公司產品；DYY8C電泳儀、DYCZ24D電泳槽和DYCZ40D轉印槽，均為北京六一儀器廠產品；721分光光度計，上海分析儀器總廠產品。

1.5糖尿病潰瘍大鼠模型建立實驗前12h禁食，定量飲水。將1％鏈脲佐菌素（streptozotocin,STZ）溶液，以60mg/kg劑量腹腔內注射2d。3d后動物血糖濃度大于16.7mmol/L及尿糖為（++++）時，即成糖尿病鼠模型。參照付小兵等［3］全層皮膚缺損法制成動物體表潰瘍模型，將糖尿病大鼠用鹽酸氯胺酮（100mg/kg）腹腔注射麻醉后背部備皮，在脊椎兩側分別作直徑15mm的圓形標記，在無菌條件下，用外科方法切除標記處全層皮膚，止血后用無菌紗布覆蓋，即成糖尿病潰瘍模型。造模后每只大鼠每日予青霉素40萬U肌肉注射，連續4d。

1.6實驗動物分組及給藥方法60只大鼠先隨機抽取10只為正常對照組；其余50只大鼠建立糖尿病潰瘍模型，成模后再隨機分為益氣化瘀組、益氣組、化瘀組、貝復濟組和模型組。各組于造模后次日開始給藥，換藥前均以1/5000呋喃西林溶液清潔創面。正常對照組及模型組外敷單層生理鹽水紗布，生理鹽水灌胃，1次/d；益氣化瘀組、益氣組和化瘀組外敷單層生理鹽水紗布，中藥灌胃，1次/d；貝復濟組灌服等量生理鹽水，外敷以貝復濟浸透紗布（60U/cm2），按創面大小剪成小塊貼于創面上，然后均在創面上加蓋兩層消毒干紗布，用膠布“豐”字形固定。連續用藥7d，用藥后第8天，分別將動物麻醉（鹽酸氯胺酮），取局部創面新生肉芽組織為所需實驗樣品。

1.7實驗方法

1.7.1免疫組織化學SP法及圖像分析每組隨機抽取8個標本作為實驗樣本，取4μm石蠟切片，常規脫蠟，PBS沖洗3次，3min/次；3％H2O2室溫20min，PBS沖洗3次，3min/次；檸檬酸鹽緩沖液中微波處理（98℃）2次，10min/次；10%正常血清封閉內源性非特異性抗原，室溫30min，一抗4℃過夜，PBS沖洗3次，3min/次；生物素化羊抗兔IgG1∶200，37℃30min，PBS沖洗3次，3min/次；StreptavidinHRP1∶200，37℃30min，PBS沖洗3次，3min/次；DAB顯色8～12min，水洗；蘇木素襯染，水洗，吹干，樹脂封片。顯微鏡下觀察，有棕黃染色者為陽性。采用IMS細胞圖像分析系統，對各組免疫組化切片進行圖像分析。根據各組切片中的染色條件，在統一閾值下進行。在10倍物鏡下，每張切片隨機選取3個視野，輸入圖像，測定各組在統一光度下陽性細胞的總面積。

1.7.2Westernblotting法每組隨機抽取6個標本作為實驗樣本，分別取大約200mg組織制備樣品，提取創面肉芽組織總蛋白，各樣品取30μg上樣，Marker取10μl上樣（上樣前按說明書進行預處理），進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。電轉移至硝酸纖維膜上，用5%脫脂奶粉封閉，分別與特異性的TGFβ1抗體進行孵育，充分洗滌后孵育HRP標記山羊抗小鼠抗體，電化學發光，X線攝片。用QuantityOne4.3.1（Biorad）軟件對照片進行掃描分析，測定蛋白表達量。

1.8統計學方法采用SPSS11.5統計軟件，以方差分析比較各組間TGFβ1表達水平的差異。

2結果

2.1免疫組織化學法檢測各組創面肉芽組織中TGFβ1的表達水平模型組TGFβ1表達明顯低于正常對照組（P＜0.01）；益氣化瘀組TGFβ1表達量高于益氣組、化瘀組、貝復濟組和模型組（P＜0.05或P＜0.01），與正常對照組相比，差異無統計學意義（P＞0.05）；益氣組和化瘀組的TGFβ1表達量也明顯高于模型組（P＜0.01），與貝復濟組相比，差異無統計學意義（P＞0.05）；益氣組和化瘀組相比，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1、圖1。

2.2Westernblotting法檢測各組創面肉芽組織中TGFβ1的表達水平模型組TGFβ1表達明顯低于正常對照組（P＜0.01）；益氣化瘀組TGFβ1表達量明顯高于益氣組、化瘀組、貝復濟組和模型組（P＜0.01），與正常對照組相比，差異無統計學意義（P＞0.05）；益氣組和化瘀組明顯高于模型組（P＜0.01），益氣組和化瘀組相比，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1、圖2。

表1各組創面TGFβ1的表達（略）

Table1TGFβ1expressionofskinulcersinratswithdiabetes

*P＜0.05,**P＜0.01,vsuntreatedgroup;△P＜0.05,△△P＜0.01,vsnormalcontrolgroup;▲P＜0.05,▲▲P＜0.01,vsYiqiRecipetreatedgroup;□P＜0.05,□□P＜0.01,vsHuayuRecipetreatedgroup;■P＜0.05,■■P＜0.01,vsbFGFtreatedgroup.

圖1術后第7天各組大鼠肉芽組織中TGFβ1的表達水平（SP,×100）（略）

Figure1ExpressionofTGFβ1ingranulationtissueoftheratsinsixgroupssevendaysafterskinlesion(SP,×100）

A:YiqiHuayuRecipetreated;B:YiqiRecipetreated;C:HuayuRecipetreated;D:Untreated;E:bFGFtreated;F:Normalcontrol.

YiqiHuayuRecipetreated;B:YiqiRecipetreated;C:HuayuRecipetreated;D:Untreated;E:bFGFtreated;F:Normalcontrol.

圖2術后第7天各組6個大鼠肉芽組織樣本中TGFβ1的表達水平（Westernblotting）（略）

Figure2ExpressionofTGFβ1ingranulationtissueoftheratsinsixsamplessevendaysafterskinlesion(Westernblotting)

3討論

糖尿病潰瘍的發生、發展和變化是“因虛感邪，邪氣致瘀，瘀阻傷正”的過程，其病本虛標實，正氣不足，氣陰兩虛為其本，濕熱互結，氣血瘀滯為其標。“虛”、“瘀”是糖尿病患者創面難以愈合的關鍵。唐漢鈞教授在長期臨床和實驗研究的基礎上，認為只有氣血足、瘀滯祛除，才能斷生腐之源，生肌長皮，故以“祛瘀生新”為指導，提出“祛瘀生肌”、“補虛生肌”理論，臨床以益氣化瘀法為主

治療糖尿病取得良好的臨床療效［4］。隨著近年來分子生物學等學科的發展，對糖尿病創面愈合機制的研究日趨深入。多種細胞、細胞因子和細胞外基質之間錯綜復雜的網絡作用是該過程中的關鍵因素之一［5］。各種生長因子參與了傷口愈合的調控，在組織修復中有決定意義。其中TGFβ的主要作用是調節細胞的生長和分化，誘導細胞外基質的合成及細胞凋亡，是一類對創面修復有重要調控作用的多功能的生長因子［6］。TGFβ主要分為三個亞型。遭受創傷后，TGFβ1、2、3的表達開始增加，其中TGFβ1的表達時程變化與微小血管形成有一致性，說明TGFβ1對血管形成有影響作用。TGFβ2、3的表達持續時間較長，可能參加愈合后期的組織塑性。而主要發揮增加膠原沉積，加速創傷愈合，同時促進瘢痕形成作用的為TGFβ1。因此，TGFβ1在潰瘍創面組織中含量的變化對潰瘍發生和修復愈合發揮核心作用，其表達水平的高低直接關系到創面愈合的速度和質量。國內外研究發現，皮膚傷口愈合包括連續而又相互重迭的3個階段，即炎癥期、肉芽組織形成期和瘢痕形成期［7］。傷后第7天，即創傷愈合的中期，是成纖維細胞增生和膠原合成的高峰期，TGFβ1的含量在此時也達到最高值［8,9］。TGFβ1在早中期表達的升高，對促進成纖維細胞合成膠原蛋白、蛋白聚糖、纖維聯接蛋白和整合蛋白，增強上皮細胞遷移與成纖維細胞合成細胞外基質有關鍵性作用，是其促進創面愈合的一個重要方面［10］。本研究發現，與正常對照組相比，模型組創面愈合率較低，愈合時間較長，并且TGFβ1表達水平也較低（P＜0.01），提示糖尿病創面難以愈合可能與TGFβ1表達水平下降有密切關系。益氣化瘀組、益氣組及化瘀組的創面愈合率較高，愈合時間短，與模型組相比，創面TGFβ1的表達明顯增高（P＜0.01），且益氣化瘀組TGFβ1的表達高于益氣組及化瘀組。因此可以初步證明，在創傷愈合的早中期運用益氣化瘀中藥，可能通過上調TGFβ1的表達水平而促進創面愈合，且益氣及化瘀中藥也分別有一定程度的作用。結合TGFβ1促進成纖維細胞增生和膠原合成的主要生物學作用，也初步印證了“化瘀生肌”和“補虛生肌”的學術理論。益氣化瘀組的治療效果要優于益氣組和化瘀組?！夺t林改錯》有云：“元氣既虛，必不能達于血管，血管無力，必停留而瘀。”氣為血帥，絡脈空虛，則無力推動血行，使氣血運行稽遲，瘀血內生，或停留于局部而為瘀；瘀血不去，新血不生，正氣無由恢復，則正氣耗損益劇，兩者互為因果。而益氣法和化瘀法中藥配伍使用，正氣足則瘀滯除，瘀祛則新生，兩者相互為用，其作用更為顯著，體現了中醫相須配伍的科學性，是臨床取得療效的關鍵所在，也體現了中醫辨證論治的精華。

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