醫學生社會實踐論文：小鼠Wnt

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【關鍵詞】Wnt

ExpressionandbiologicalactivityofmouseWnt3ageneinNIH3T3cells

【Abstract】AIM:ToexpressrecombinantmouseWnt3asignalproteinwithbiologicalactivity.METHODS:Therecombinanteukaryoticexpressionplasmid,pSecTag2/HygroBWnt3a,wastransfectedintoNIH3T3cellsbyliposome,thentheexpressedproteinwasdetectedbyWesternBlot.ThesaturationdensityandthecapabilityofsuppressingapoptosisinWnt3a/NIH3T3cellswereevaluated.RESULTS:TheWnt3asignalproteinwasstablyexpressedinWnt3a/NIH3T3cells.ThesaturationdensityandthecapabilityofsuppressingapoptosisinWnt3a/NIH3T3cellsweremarkedlyincreased.CONCLOUSION:WesuccessfullyconstructtherecombinantWnt3asignalproteinwithbiologicalactivity.

【Keywords】Wnt3a;eukaryoticexpression;contactinhibition;apoptosis

【摘要】目的：表達具備生物活性的重組小鼠wnt3a信號蛋白.方法：應用脂質體轉染試劑將重組真核表達載體pSecTag2/HygroBWnt3a轉染并篩選穩定表達的NIH3T3細胞，WesternBlot鑒定重組Wnt3a蛋白的表達，并對Wnt3a/NIH3T3細胞的融合密度及抗凋亡能力給予檢測.結果：Wnt3a信號蛋白在Wnt3a/NIH3T3細胞中獲得穩定表達，Wnt3a信號蛋白能夠明顯提高NIH3T3細胞的融合密度及抗凋亡能力.結論：在NIH3T3細胞中表達的重組Wnt3a信號蛋白具備生物活性.

【關鍵詞】Wnt3a；真核表達；接觸抑制；細胞凋亡

0引言

小鼠Wnt3a基因是Wnt基因家族中的重要成員，其編碼表達Wnt3a信號蛋白.Wnt3a信號蛋白可以激活經典的Wnt/βcatenin信號通路.Wnt3a信號蛋白對神經干細胞表現出明顯的促神經元分化的作用.我們應用基因重組的方法，從小鼠胚腦中克隆Wnt3acDNA，構建真核表達載體，通過陽離子脂質體試劑將目的基因導入NIH3T3細胞中，建立穩定表達Wnt3a信號蛋白的NIH3T3細胞株，并對其生物學活性進行初步分析.

1材料和方法

1.1材料真核表達載體pSecTag2/HygroBWnt3a由本研究室構建.NIH3T3細胞株由安徽醫科大學病理教研室吳強教授惠贈.多聚賴氨酸購自博士德公司；胎牛血清及DMEM購自Gibco公司.潮霉素及LipofectamineTM2000轉染試劑盒、購自Invitrogen公司.質粒小量提取試劑盒WizardPlusSVMiniprepsDNAPurificationsystem,ReverseTranscriptionSystemRTPCR試劑盒購自Promega公司；鼠抗mycmAb、鼠抗βcateninmAb購自SantaCruz公司，FITC標記的兔抗鼠二抗、TRITC標記的兔抗鼠二抗購自北京中山公司；臺盼藍購自sigma公司.其他試劑均為進口分裝或國產分析純.

1.2方法

1.2.1NIH3T3細胞的培養將凍存的NIH3T3細胞復蘇后用含100g/L的胎牛血清的DMEM培養液，在37℃50mL/LCO2培養箱中培養，3d換液1次,傳代3至4次使細胞達到良好的生長狀態.

1.2.2NIH3T3細胞的轉染按LipofectamineTM2000試劑說明書操作進行.轉染前24h用胰蛋白酶消化貼壁的NIH3T3細胞，再以無血清及無雙抗的DMEM培養基重懸，并按1×105的細胞密度接種于6孔培養板，培養24h后，當細胞生長至85%～90%融合度時，取純化的重組質粒pSecTag2/HygroBWnt3a2μg，溶于250μL無血清的DMEM培養基中，得到A液.取3μLLipofectamineTM2000加于97μL無血清的DMEM培養基中，得到B液.將A,B液混勻，室溫放置30min后加入0.8mL含100g/L胎牛血清的DMEM培養基，輕輕混勻，均勻滴加于經無血清培養基洗滌的貼壁細胞表面，于37℃50mL/LCO2培養箱中培養24h.棄去轉染液，加2mL完全培養液繼續培養.轉染后48h，待細胞生長至接近融合時收集上清，并按1∶3的密度傳代.繼續培養至細胞密度達50%～70%.棄去培養液，更換濃度為600mg/L的潮霉素培養液進行篩選.轉染時，設置轉染空載體pSecTag2/HygroB的組和正常細胞陰性對照組.約14d后，可見有陽性克隆形成，繼續擴增培養.穩定表達Wnt3a蛋白的細胞株命名為Wnt3a/NIH3T3（W/3T3），轉染空載體的細胞株命名為empty/NIH3T3（E/3T3），正常細胞陰性對照組命名為control/NIH3T3（C/3T3）.

1.2.3重組Wnt3a蛋白鑒定轉染48h后，分別收集C/3T3,E/3T3和W/3T3細胞各約1×106及其培養上清液.以SDS煮沸法裂解細胞并收集上清，并將其與細胞培養上清液真空冷凍干燥，濃縮至1/2體積，以鼠抗mycmAb為一抗，HRP標記的山羊抗兔IgG為二抗，使用WesternBlot方法行重組Wnt3a蛋白的鑒定.

1.2.4βcatenin的表達鑒定分別在轉染后6,12,24h收集W/3T3,E/3T3及C/3T3細胞各約1×106，以SDS煮沸法裂解細胞并收集上清，以鼠抗βcateninmAb為一抗，HRP標記的山羊抗兔IgG為二抗，使用WesternBlot方法進行鑒定.

1.2.5Wnt3a/NIH3T3細胞增殖特性的鑒定以密度約1×105接種W/3T3,E/3T3及C/3T3細胞于24孔培養板，隔日觀察，臺盼藍染色并使用血細胞計數板計數活細胞.

1.2.6Wnt3a/NIH3T3細胞抗凋亡實驗以密度約1×105接種W/3T3,E/3T3及C/3T3細胞于24孔培養板，24h后臺盼藍染色并使用血細胞計數板計數活細胞數，同時更換含10g/L胎牛血清的DMEM培養液，定時觀察并臺盼藍染色并使用血細胞計數板計數活細胞，計算存活細胞與原始細胞數的比值.

統計學處理：用SPSS11.5統計軟件進行單因素方差分析.

2結果

2.1重組Wnt3a蛋白在的NIH3T3細胞中獲得表達WesternBlot鑒定發現轉染Wnt3a基因的NIH3T3細胞裂解液中有一Mr約為45×103的特異性條帶，在轉染Wnt3a基因的NIH3T3細胞培養上清液、E/3T3及C/3T3細胞裂解液和細胞培養上清液中，均未發現相應條帶(圖1).

1:W/3T3組細胞裂解液；2：W/3T3組細胞培養上清液；3：E/3T3組細胞裂解液；4：C/3T3組細胞裂解液.

圖1WestemBlot鑒定Wnt3a信號蛋白的表達（略）

2.2Wnt3a/NIH3T3細胞中βcatenin的表達上調對Wnt信號通路中的重要信息分子βcatenin的表達情況進行WesternBlot鑒定，在Mr約90×103處出現特異性條帶(圖2)，但無時間依賴性.

1~3:培養6,12,24h.

圖2各實驗組βcatenin表達（略）

2.3Wnt3a/NIH3T3細胞融合密度明顯增高經臺盼藍染色計數活細胞，以密度約1×105接種的E/3T3及C/3T3細胞3d后生長至融合密度，此時細胞融合密度約4.6×105，但W/3T3細胞繼續生長至第6d，細胞融合密度約13×105，與另外兩組相比，W/3T3細胞融合密度明顯增高（P<0.01）(圖3，4).

A：W/3T3；B：E/3T3；C：C/3T3.

圖3各實驗組細胞融合密度觀察(倒置×100)（略）

2.4W/3T3細胞抗凋亡能力明顯增高經臺盼藍染色計數活細胞，更換含10g/L胎牛血清的培養液48h后，E/3T3及C/3T3細胞大量凋亡，細胞數明顯減少，但W/3T3細胞數無明顯減少，抗凋亡能力明顯提高（P<0.01）(圖5，6).

圖4實驗組細胞數變化（略）

A：W/3T3；B：E/3T3；C：C/3T3.

圖5各實驗組細胞抗凋亡能力觀察(倒置×100)（略）

圖6實驗組存活細胞比例（略）

3討論

Wnt信號蛋白為含有23～24個保守型半胱氨酸殘基,在人類的基因組中已經發現Wnt基因19種［1-2］.Wnt3a是Wnt基因家族的重要成員，其基因早在1992年就已經被發現，而且多種的真核細胞被用于它的表達，但由于其低溶解度及疏水性等特點，一直未能純化出具備生物活性的Wnt3a信號蛋白.1998年，Shibamoto等［3］使用L細胞（鼠胸腺激酶缺陷細胞株；LMTK）作為表達細胞時，在培養上清中發現了大量具備生物活性的Wnt3a蛋白，約400μg/L.Willert等［4］所純化的Wnt3a信號蛋白通過激活Wnt信號通路促使骨髓中的造血干細胞分裂和自我復制，認為Wnt可能在一系列組織的自我更新中起信號作用.

βcatenin是經典的Wnt/βcatenin信號通路中重要的信息分子［5］，其在Wnt信號通路關閉的情況下，βcatenin被磷酸化而迅速降解.Wnt信號通路被激活后，βcatenin在胞內大量聚集，并進入細胞核，啟動下游靶基因的轉錄，產生生物學效應.βcatenin表達的明顯上調代表Wnt信號通路被激活.實驗中WesternBlot鑒定發現βcatenin表達明顯上調，但沒有發現與時間有依賴關系.實驗中表達的重組Wnt3a信號蛋白帶有myc標簽，Burrus等［6］認為如果Wnt3a信號蛋白帶有標簽將影響其活性，甚至失活.但同樣有文獻［7,8］中應用的Wnt3a信號蛋白帶有myc,HA等標簽，而且文獻中對其活性同樣做了詳細的描述.本實驗夠構建的重組Wnt3a信號蛋白具備生物學活性，但未能與野生型（wildtype）Wnt3a信號蛋白活性做詳細的比較，其生物學活性的變化有待進一步分析.

Wnt3a蛋白可以促進神經干細胞向神經元分化.在使用含有Wnt3a信號蛋白的條件培養液培養E11.5d的胎鼠前腦神經干細胞發現，神經干細胞大量分化成為MAP2陽性的神經元.去除Wnt3a信號蛋白后，神經干細胞恢復增殖能力，而且當條件培養液中的FGF2去除后，分化的神經元形態更為成熟［8-9］.來源于小鼠大腦皮質的神經干細胞轉基因后超表達Wnt信號蛋白，即使在培養液中加入FGF2，依然大量向神經元分化，但阻斷Wnt信號通路后神經元的分化被抑制［10］.

Wnt信號通路的生物學作用十分復雜，不同的Wnt基因，不同的細胞，甚至不同的細胞狀態都有可能產生不同的作用［11］.在本實驗中我們采用pSecTag2/HygroBWnt3a真核表達載體，NIH3T3細胞作為表達細胞，成功表達重組Wnt3a信號蛋白，初步探討了Wnt3a信號蛋白的生物學活性，為進一步建立用于以治療為目的的分子移植的方法奠定基礎.

【參考文獻】

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