哮喘發作與細胞骨架重建相關基因的差異表達

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【關鍵詞】抑制性消減雜交技術；哮喘；嗜酸細胞；細胞支架蛋白質類

Differentiallyexpressionofgenesassociatedwithcytoskeletalremodelingofperipheralbloodeosinophilsduringasthmaticattack

【Abstract】AIM:Todeterminethedifferentiallyexpressedgenesassociatedwithcytoskeletalremodelingofperipheralbloodeosinophils(EOS)inpatientsduringasthmaticattack.METHODS:DoublestrandedcDNAwasamplifiedfromtotalRNAofEOSatthetimeofasthmaticattackandafterimprovementrespectivelybySuperSMARTcDNASynthesistechology,Suppressionsubtractivehybridization(SSH)andPCRselectdifferentialscreeningtechnologywereusedtodetectdifferentiallyexpressedgenesandthendifferentiallyexpressedgenesweresequenced.HomologyanalysiswasconductedbycomparingthesegenesequencesbasedonGenBankdatabase.RESULTS:HighefficientlyupregulatedanddownregulatedsubtractivecDNAlibrarieswereconstructedsuccessfully;differentialscreeningandhomologyanalysisidentified6differentiallyexpressedgenesassociatedwithcytoskeletalremodeling,includingslingshot2L(SSH2L),PP1catalyticsubunit,betaisoform(PP1Cβ),dedicatorofcytokinesis8(DOCK8),Homosapiensproteintyrosinephosphatasenonreceptortype6and12(PTPN6,PTPN12),myosinregulatorylightchaininteractingprotein(MIR).CONCLUSION:Thedifferentiallyexpressedgenesassociatedwithcytoskeletalremodelingmayparticipateinexacerbationofasthma.Furtherstudyonthegenesfunctionmayprovidenewgenetargetforasthmatreatment.

【Keywords】suppressionsubtractivehybridization;asthma;eosinophils;cytoskeletalproteins

【摘要】目的：研究外周血嗜酸性粒細胞(EOS)在哮喘發作時與細胞骨架相關基因的差異表達.方法：應用SuperSMARTcDNAsynthesis技術從總RNA合成足量的雙鏈cDNA.經液相雜交消減兩組共同序列，以抑制性PCR方式擴增差異表達序列.構建上調與下調cDNA文庫，菌落PCR擴增差異片段，應用差異篩選技術進一步鑒定差異表達基因并測序，結果通過核酸數據庫進行同源性比較.結果：構建了高效的上調與下調消減cDNA文庫，經鑒定及同源性分析有6個與細胞骨架重建有關，包括上調基因slingshot磷酸酶(SSH2L)，蛋白磷酸酶1β亞型(PP1Cβ)，無功能糖基轉移酶樣蛋白(DOCK8)，蛋白酪氨酸磷酸酶非受體型6(PTPN6)與非受體型12(PTPN12)；下調基因，肌凝蛋白調節輕鏈結合蛋白(MIR).結論：這些骨架重建相關基因的差異表達可能參與了哮喘發作，進一步進行功能研究可能為哮喘治療提供新的作用靶點.

【關鍵詞】抑制性消減雜交技術；哮喘；嗜酸細胞；細胞支架蛋白質類

0引言

哮喘是一種復雜的多基因遺傳病，病理上是以伴隨淋巴細胞與嗜酸性粒細胞（eosinophils,EOS）浸潤為主的慢性炎癥性疾病.有證據表明外周血EOS數目與哮喘的癥狀，一秒用力呼氣量（Forcedexpiratoryvolumeinonesecond,FEV1）及氣道反應性相關，尤其在持續性及重癥哮喘，外周血EOS增多與持續性氣流阻塞顯著、獨立相關［1-2］.細胞骨架重建在細胞黏附，伸展，運動及細胞內眾多信號轉導調控等過程中發揮重要作用［3］.哮喘患者外周血EOS已經被激活或活化，但其真正分子機制遠未清楚，因此我們利用SSH技術研究哮喘患者在發作與緩解時外周血EOS與細胞骨架重建相關基因差異表達，探索其調控分子本質，為哮喘診治提供幫助.

1材料和方法

1.1材料分離哮喘患者外周血EOS的Percoll試劑購自瑞典AmershamPharmacia公司；Trizol總RNA分離試劑購自美國Invitrogen公司；SuperSMARTcDNAsynthesis試劑盒及Chromaspin1000depc水純化柱購自美國Clontech公司.DIG標記和檢測試劑為Roche公司DIGHighPrimeDNALabelingandDetectionStarterKitI；構建文庫的cDNA來自哮喘患者治療前與緩解時外周血EOS總RNA經SuperSMARTcDNAsynthesis技術合成［4］.

1.2方法

1.2.1抑制性消減雜交以治療前后EOScDNA互為檢測子(Tester)和驅動子(Driver).取純化Tester及Driver的雙鏈cDNA各2μg，分別用限制性內切酶RsaⅠ37℃酶切1.5h，酶切完全后鑒定酶切效率.SSH其他過程按照SSH試劑盒說明及參考文獻［5］進行.

1.2.2差異基因片段分離將第二次PCR產物純化并定量，混合1μL(100ng)及3μL(155ng)純化后的PCR產物及1μLPBSTT載體(50mg/L)，在1μLT4DNA連接酶作用下，12℃連接16h.取2μL連接質粒與50μL感受態細胞DH5α混勻，用Cacl2將質粒導入大腸桿菌.取100μL轉化菌液均勻涂布于Xgal,IPTG的氨芐青酶素瓊脂培養板上，37℃過夜培養.隨機挑取100株白斑菌落接種于含100mg/L氨芐青霉素的LB培養基中，置37培養箱中，250r/min振搖過夜，重復實驗直至獲得250株轉化菌.

1.2.3目的基因片段的獲取轉化菌株進一步分別以接頭1和接頭2R的內、外側序列為引物，進行菌落PCR擴增，參數：94℃30s,68℃30s,72℃2min,20循環后電泳分析.

1.2.4差異篩選鑒定差異表達基因采用PCRselect差異篩選技術對目的片段進行雜交鑒定.實驗步驟嚴格按照DIGHighPrimeDNALabelingandDetectionStarterKitI試劑盒說明書進行.

1.2.5測序及同源性分析進一步用巢式PCR確認質粒內差異片段，然后純化質粒，測序由上海博亞公司協助完成，編碼序列提交美國國立醫學圖書館GenBank數據庫進行同源性比較.

2結果

2.1酶切及連接效率酶切后經1.5g/L瓊脂糖/EB凝膠電泳分析，表現為平均大小在0.1~2.0kb之間的條帶，說明cDNA酶切較完全.接頭序列引物與G3PDH3’引物擴增產物的灰度值較G3PDH5’,3’引物所得產物的灰度值比值大于50%，說明連接效率較高.

2.2消減雜交效率用G3PDH基因特異性引物分別擴增兩次消減雜交前后的cDNA產物(圖1)，經消減雜交的cDNA33循環可見擴增產物，而未消減在18循環就可見，說明雜交效率較高.

2.3目的基因片段的電泳以轉化菌株重組質粒為模板行PCR擴增目的基因片段，結果采用1.5g/L瓊脂糖凝膠電泳分析，顯示目的基因片段分子質量分布范圍均在200~800bp，250個菌株擴增獲得陽性目的基因片段228個，陽性率達91.2%.

M:1000bpDNAMarker；1,5:18循環；2,6:23循環；3,7:28循環；4,8:33循環.

圖1消減雜交效率分析（略）

M:1000bpDNAMarker；1,5:18循環；2,6:23循環；3,7:28循環；4,8:33循環.

圖2目的基因片段的電泳分析（略）

2.4序列分析及同源性對確定的12個陽性克隆測序后，通過BLAST進行同源性比較，經查閱文獻共確定6個與細胞骨架重建相關的基因，分別為上調基因SSH2L,PPP1Cβ,DOCK8,PTPN6及PTPN12；下調基因MIR(表1).

表1哮喘治療前后EOS差異cDNA克隆同源性比較（略）

P:上調表達基因；R:下調表達基因.

2.5消減cDNA文庫的篩選采用PCRselect差異篩選技術對72個目的基因(包括45個上調表達克隆與27個下調表達克隆)進行進一步鑒定，根據Clontech公司提供的參考標準確定真正差異表達克隆.

3討論

哮喘的發作和分子病理學過程是由于多種類型細胞特異性基因的表達變化決定的，對常見疾病哮喘進行基因表達的分析，可幫助尋找疾病診斷與療效判斷的分子靶點.本研究應用SuperSMARTcDNAsynthesis技術與SSH技術，經測序、同源性比對及文獻查詢，初步證實了6條在哮喘發作期與EOS細胞骨架重建相關基因差異表達.

細胞骨架在物質運輸、白細胞的遷移及基因表達等方面起著重要作用.肌動蛋白結合蛋白(ADP/confilins)家族是影響肌絲重建的關鍵因素.高度活化的cofilins促進細胞產生片足及可決定細胞運動方向［6］.EOS從外周血向肺組織遷移是過敏性哮喘的重要特點，EOS遷移也依賴于細胞骨架的調節.

我們的初步研究結果提示：

①上調基因SSH2L屬于酪氨酸磷酸酶亞類之一，SSH在cofilins去磷酸化上發揮關鍵作用［7］.本研究SSH2L在EOS表達升高，可加快EOS內肌動蛋白快速組裝，促進細胞遷移，趨化，跨膜運動，可能是EOS內重要的分子調控機制.

②下調基因MIR可以被多種因素所調節，MIR可以通過泛素化作用降低肌球蛋白輕鏈(myosinlightchain,MLC)功能，其在EOS表達的下調可能使其抑制肌球蛋白功能作用下降，從而促進馬達蛋白活性，可能參與EOS的趨化調節.

③蛋白磷酸酶1(PP1)參與調控糖代謝，基因表達，細胞分化等.果蠅PP1β可以調節非肌細胞肌球蛋白，如果缺失PP1β功能會導致MLC磷酸化水平升高及肌動蛋白結構破壞［8］.PP1β在EOS表達的增高可能通過cofilin，肌球蛋白及微管等途徑引起細胞骨架重建.

④DOCk8是一種潛在的鳥嘌呤核苷酸交換因子(GEF),GEF可以激活某些小分子鳥苷三磷酸酶.DOCK8參與細胞內具體作用機制尚不清楚，可能通過介導Rho激酶家族某一成員參與協調細胞骨架運動.

⑤蛋白酪氨酸磷酸酶（proteintyrosinephosphatase,PTPase）是一個多基因家族，主要分為受體和非受體樣PTPase兩類，PTPase參與多種激素（如胰島素等）介導的信號轉導、細胞增殖和促進MHCI類抗原表達.PTPN6屬于PTPase家族成員之一，主要在血細胞發育，增生及受體介導的絲裂原信號轉導通路發揮作用.

⑥PTPN12也是PTPase家族成員之一，PTPN12可以參與蛋白與蛋白相互作用，與細胞內蛋白半衰期有關，可以去磷酸化眾多細胞骨架蛋白及細胞粘附分子，參與控制細胞的形態及運動［9］.

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