纖維素酶范文

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關鍵詞：木質纖維素；纖維素酶；纖維素酶解

DOI：10.16640/ki.37-1222/t.2017.10.185

1 引言

木質纖維素原料來源十分廣泛，是儲量豐富的可再生資源[1]。據統計，全球每年生產該類物質約200×109噸，其中有90%以上是木質纖維素類物質，而它們當中有8～20×109仍具有潛在的可利用性[2]。包括農業廢棄物（秸稈、蔗渣等）如何處理，對環境壓力以及可再生能源的利用具有現實意義。因此，在生物燃料、生物基化學品、分子材料、食品等領域這些廉價及豐富的木質纖維素，都具有廣泛的應用空間。

纖維素的結構單位時D-葡萄糖，其分子式為：（C6H10O5）n，式中n為葡萄糖基數目，稱為聚合度。經長期研究，已證實天然纖維素中D-葡萄糖基以吡喃環的形式存在，并且相互以β-1，4糖苷鍵構成分子鏈，因為這對吡喃式D-葡萄糖具有最低的能態，這也是其二聚物（纖維二糖）及共衍生物的真正形式。由于葡萄糖上帶有多個羥基，因此纖維素分子間容易形成氫鍵，進而使得鏈與鏈之間氫鍵緊密連接易于聚集成結晶性的原纖結構。如圖1所見，大量氫鍵網狀結構中存在著相對規則的結晶區，其阻礙了纖維素分子的進一步利用，故纖維素水解前需進行預處理，破壞它的氫鍵及結晶區，以便更好地水解纖維素，從而增加它的酶可及面積。

2 纖維素酶作用機理

纖維素酶是指能夠水解纖維素β-1，4-糖苷鍵，進而生成葡萄糖的一類酶的總稱，它是由幾種酶共同協同作用，而不是單一的酶，其中主要包括外切葡聚糖酶（CBH，C1）、內切葡聚糖酶（EG，Cx）和β-葡萄糖苷酶（CB，纖維二糖酶）。長期的研究表明，結晶纖維素的徹底降解至少需要這3組纖維素酶的協同作用，如圖2所示，Cx能容易地降解接近類型的纖維素或衍生物，Cx只有和C1組分結合時才可以利用晶形式的纖維素。C1酶首先作用于結晶纖維素表面，使其形成結晶構的纖維素鍵斷開，長鏈分子末端游離，從而其轉化成可被Cx酶作用的形式，Cx酶水解非結晶或纖維素、可溶性纖維素轉化為纖維二糖，最后由β-葡萄糖苷酶將纖維二糖、三水解為葡萄糖。

3 單一纖維素組分作用機理

（1）內切葡聚糖酶（EG或Cx）。Cx酶作用于纖維素的β-1，4葡萄糖苷鍵，隨機切割，產生大量纖維素的還原性末端。測定Cx酶活力方法較多，通用的方法是利用羧甲基纖維素鈉（CMC）作為底物測其酶活，由于它是一種高聚合度的可溶性纖維素衍生物，還原性所占比例較少，纖維素酶易于作用β-1，4葡萄糖苷鍵。

（2）外切葡聚糖酶（CBH，C1）。C1酶是指切割有Cx酶所產生的纖維素分子還原性末端，能夠是纖維素長鏈釋放出葡萄糖及小分子的寡糖。

有研究表明，已知外切葡聚糖酶具有2個獨立的活性結構域：其一是指具有催化纖維素功能的結構域CD，其二是指具有結合纖維素功能的結合于CBD，二者由高度糖基化鏈相連接。查閱大量文獻指出，C1對纖維素結晶區破壞作用極大，能夠產生纖維二糖。其原因是首先是利用CBD把C1吸附在纖維素結晶區表面，其次再由單根葡聚糖鏈（纖維素）快速準確地進入CD中帶底物結合和催化部位的“隧道”，纖維二糖被準確地從葡聚糖鏈上切割下來并被釋放出來的同時，C1分子沿著葡聚糖鏈向前滑動2個葡萄糖單位[3]。

（3）β-葡萄糖苷酶（CB，纖維二糖）。CB酶又稱β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，它能夠作用于結合在末端非還原性的β-D-葡萄糖苷鍵，水解生成部分β-D-葡萄糖以及相應的配基。在水相系統中，CB酶能水解纖維二糖及一些聚合度小于6的纖維糊精為葡萄糖，隨著聚合度的增加，水解效果顯著下降。

4 總結

木質纖維素廣泛的來源，如農業廢棄物、餐廚垃圾以及部分工業殘余物等，可通過預處理和水解發酵轉化為能源物質。在此基礎上，需要在理論研究做出深入解釋，以便更好的應用于實踐。

參考文獻：

[1]Sánchez J & Cardona CA. Trends in biotechnological production of fuel ethanol from different feedstocks. Bioresource Technology 2008（99）：5270-5295.

[2]Lin Y & Tanaka S.Ethanol fermentation from biomass resources：current state and prospects.Applied Microbiology & Biotechnology 2006（69）：627-642.

篇2

關鍵詞 米曲霉；固態發酵；纖維素酶活

中圖分類號 S147.4 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2016）08-0197-02

Abstract The culture conditions affected the production of cellulose enzyme by Aspergillus oryzae，such as carbon source，nitrogen source，initial pH，water content，culture temperature，culture time，etc.The results showed that when the carbon source was bran，nitrogen source was powder of bean cake，initial pH value was 6.5，moisture content was 50%，culture temperature was 30 ℃，training time was 60 h，the cellulose enzyme activity produced by Aspergillus oryzae was the highest.

Key words Aspergillus oryzae；solid-state fermentation；cellulose enzyme activity

我國農作物秸稈的利用率普遍很低，多數作物秸稈都作焚燒處理，對環境的污染很大。作物秸稈中含有豐富的有機質、氮、磷、鉀等作物生長所需的營養元素，如果能得到合理的利用，將會為人類帶來巨大的收益。作物秸稈的處理方式有物理、化學、生物方法，其中生物降解具有污染少、能耗低等優點[1]。作物秸稈中含有豐富的纖維素，纖維素在纖維素酶的作用下可以水解生成單糖被作物和微生物利用，但纖維素不易被降解，幾十年來，人們對于纖維素的預處理及酶水解過程進行了大量研究，其中纖維素酶的使用大大提高了纖維素的降解率[2]。

米曲霉屬半知菌亞門絲孢綱絲孢目從梗孢科曲霉屬真菌中的一個常見種。米曲霉（Aspergillus oryzae）是纖維素酶的主要生產菌種之一。工業用米曲霉菌種所產的酶系較多、酶系組成較復雜[3]，國內對該菌株的相關研究并不多，對其酶系在工業發酵過程中受到的影響因素及其作用機理并不十分了解，從而導致在工業生產過程中不能夠十分精確地控制米曲霉的產酶過程，限制了這一傳統的食用菌株在工業應用領域的進一步拓展[4]。本試驗對米曲霉M1102產纖維素酶在固體發酵過程中所受的影響及活性變化進行了研究，以期為米曲霉產纖維素酶的工業化生產提供相關的理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 菌種。米曲霉菌株M1102，來自中國菌種保藏中心。

1.1.2 培養基與主要試劑。斜面培養基：土豆培養基（PDA）；液體種子培養基：豆餅粉5 g/L，蛋白胨5 g/L，蔗糖10 g/L，MgSO4 0.3 g/L，K2HPO4 0.3 g/L，調節pH值至7.0；營養鹽溶液：NaCl 2 g/L、KH2PO4 1.5 g/L、CaCO3 0.5 g/L、MgSO4 0.5 g/L，調節 pH值至7.0；固體培養基：木質纖維素培養基；主要試劑：麩皮、稻殼粉、玉米粉、玉米芯粉、葡萄糖、蔗糖、豆餅粉、干酪素、蛋白胨、硫酸銨、尿素。

1.1.3 儀器設備。酒精燈、接種環、超凈工作臺、高壓蒸汽滅菌鍋、pH測定儀、紫外分光光度計、水浴鍋、恒溫培養箱、電子天平、控溫搖床。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養方法。一是米曲霉種子液制備：將米曲霉接種于PDA斜面上進行活化，用接種環挑取一環接種于250 mL三角瓶的種子液中，裝液量為50 mL，30 ℃，180 r/min，培養24 h。二是固體培養：在250 mL三角瓶中加入10 g風干后過篩的木質纖維原料和5 mL營養鹽溶液，拌勻，121 ℃滅菌30 min，冷卻后將種子液以3%的接種量接種于固體培養基中，32 ℃下培養60 h，測定其產纖維素酶活[5]。粗酶液的制備：每1g固態培養物加入磷酸緩沖溶液5.0 mL（pH值 7.2），室溫下浸提1 h，10 000 r/min離心10 min，上清液即為粗酶液。

1.2.2 培養條件的優化。一是碳源對纖維素酶活的影響：分別用3%含量的麩皮、稻殼粉、玉米粉、玉米芯粉、葡萄糖、蔗糖作為培養基的碳源，其他成分同初始培養基，培養結束后測定其纖維素酶含量[6]。二是氮源對纖維素酶活的影響：分別以2%的豆餅粉、干酪素、蛋白胨、硫酸銨、尿素作為培養基的氮源，其他成分同初始培養基，培養結束后測定培養基中纖維素酶含量[6]。三是發酵條件優化：采用優化后的最佳發酵培養基，在固定其他發酵條件的基礎上，逐一對發酵培養的初始pH值、培養基含水量、培養時間、發酵溫度等培養條件進行優化。

1.2.3 纖維素酶活的測定方法。采用GB-羧甲基纖維素法（CMC法）。

2 結果與分析

2.1 培養基碳源對纖維素酶活力的影響

酶誘導物和酶蛋白質前體同時對纖維素酶的合成有調控作用，酶誘導物一般為可利用的碳源，纖維素作為酶誘導物對纖維素酶的產生有重要作用。從圖1可以看出，在培養基其他基礎營養成分不變的前提下，改變碳源含量后，米曲霉產纖維素酶活發生顯著變化，其中碳源為麩皮時纖維素酶活最高；稻殼粉和玉米芯粉次之，為最高酶活的72%和68%；玉米粉和蔗糖為最高酶活的60%和37%；碳源為葡萄糖時纖維素酶活最低，僅為最高酶活的30%。當碳源中纖維素含量豐富時，米曲霉產纖維素酶活力高，這是由于纖維素作為酶誘導物能刺激纖維素酶的產生，將其分解為可利用的單糖，而葡萄糖和蔗糖作為碳源時，米曲霉能直接利用其作為碳源，所以抑制了纖維素酶的產生。

2.2 培養基氮源對纖維素酶活力影響

氮源是酶蛋白質前體的主要來源，因此氮源的類型和性質同樣會影響纖維素酶的合成和分泌。選擇不同氮源作為單一氮源進行發酵試驗，來考察其對米曲霉產酶的影響。

從圖2可以看出，在試驗選用的5種有機和無機氮源中，以豆餅粉作為氮源時米曲霉所產纖維素酶活性最高；干酪素和蛋白胨次之，纖維素酶活是豆餅粉作為單一氮源時活性的96%和81%；當分別以硫酸銨和尿素為單一氮源時，米曲霉所產纖維素酶活性僅為最高酶活性的70%和68%。由此表明，有機氮源對纖維素酶活的影響大于無機氮源，這可能與有機氮源中營養成分含量多元化有關。

2.3 培養基初始pH值對纖維素酶活力的影響

微生物在生長繁殖和代謝過程中，由于營養物質被分解利用和代謝產物的形成與積累，導致培養基pH值發生變化，而培養基初始pH值不僅影響微生物的生長繁殖，且對其產酶情況有顯著的影響。在優化培養基碳氮源基礎上，調節初始pH值為4.0～9.0來考察米曲霉產酶活性的變化。從圖3 可以看出，米曲霉產生纖維素酶的最佳初始pH 值為6.0～7.5，當培養基初始pH值為5.5，米曲霉仍能產生相對于最高活性 72%的纖維素酶；而當培養基初始pH值調至8.0 時，米曲霉產生纖維素酶活性則迅速下降至最高酶活性的34%。試驗表明米曲霉產纖維素酶的pH值適應范圍較寬，但過酸或過堿的環境不利于纖維素酶的生產。這可能是由于過酸或過堿的環境不利于米曲霉生長或破壞了纖維素酶活力。

2.4 培養基含水量對纖維素酶活力的影響

水分是微生物生長代謝的重要物質，在固體發酵中，水分對微生物活性有重要影響。從圖4可以看出，隨著培養基中含水量的增加，米曲霉產纖維素酶活呈現先增高后降低的趨勢，當培養基含水量為50%時，纖維素酶活最高。所以含水量過高或過低都會抑制米曲霉生長，這可能是由于低水分使米曲霉培養基中的營養物質溶解性降低，抑制了米曲霉生長；當水分含量過高時，培養基過于黏稠，破壞了培養基的多孔結構，降低了其透氣性，而米曲霉是耗氧微生物，低氧環境不利于其生長。

2.5 培養溫度對纖維素酶活力的影響

微生物最適宜的溫度范圍一般為16～30 ℃，最高溫度在37～43 ℃，溫度過高或過低均不利于米曲霉生長。從圖5可以看出，在30～35 ℃時，纖維素酶活最高，溫度過低或過高都會降低纖維素酶活。這是由于，當溫度過低時，米曲霉生

長緩慢導致產生纖維素酶少，而且低溫環境會降低酶活力；當溫度過高時，米曲霉會由于高溫而出現老化現象，抑制了纖維素酶產生，并且高溫容易使纖維素酶失活。

2.6 培養時間對纖維素酶活力的影響

微生物處于不同的生長期時，其相應的生長代謝機理也不同。從圖6可以看出，隨著培養時間的延長，米曲霉產纖維素酶活呈先升高后降低的趨勢。當培養至60 h時，纖維素

酶活最高。這是由于培養初期米曲霉處于繁殖階段，產生孢子數量有限，故分泌的纖維素酶少；而在培養后期，由于米曲霉出現老化，導致纖維素酶分泌量減少。

3 結論

本試驗研究了米曲霉菌株M1102在不同固體發酵條件下產纖維素酶的變化。結果表明：當碳源為麩皮，氮源為豆餅粉，初始pH值為6.5，含水量為50%，培養溫度為30 ℃，培養時間為60 h時，米曲霉產纖維素酶活力最高。為了深入了解米曲霉固體發酵產纖維素酶的影響因素，還需要對纖維素酶的生產條件和作用機理做更深一步的研究。

4 參考文獻

[1] 袁喜慶.秸稈生物降解技術的效應[J].現代農業科技，2011（4）：261.

[2] 湯鳴強，鄭 挺，曾小芳，等.釀造醬油米曲霉產中性蛋白酶提取與酶學性質研究[J].中國調味品，2008（348）：38-40.

[3] 高曉梅，李楊，劉曉輝，等.固態發酵法生產大豆多肽的初步研究[J].山東農業科學，2014（7）：78-81.

[4] 孫春華，燕磊，常維山，等.不同碳源和氮源對米曲霉產酶影響的研究[J].西南農業學報，2007，20（5）：986-990.

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1.1葡萄糖內切酶

該酶作用于纖維素分子內的非結晶區，隨機水解β-1，4-糖甘鍵，截短長鏈纖維素分子，產生許多帶有非還原性末端的小分子纖維素，但不能單獨作用于結晶的纖維素。同時它也能水解小分子的纖維寡糖。

1.2葡萄糖外切酶

這類酶作用于纖維素分子的末端，依次切下纖維素分子中的纖維二糖，可作用于纖維素分子內的結晶區、無定形區和羧甲基纖維素。

1.3β-葡萄糖苷酶

也稱纖維二糖酶，是一種可將纖維二糖、纖維三糖和纖維六糖等水解為葡萄糖的非專一性酶；在水解過程中低聚糖對外切酶和內切酶的產物產生抑制作用，這種酶的存在可以顯著降低抑制作用，提高水解效率。

2食品工業纖維素酶的來源

纖維素酶的來源非常廣泛，昆蟲、動物體、微生物（細菌、放線菌、真菌、酵母）等都能產生纖維素酶。由于動物體和放線菌的纖維素酶產量極低，所以很少研究。細菌所產生的酶是胞內酶，或者吸附在菌壁上，很少能分泌到細胞外，提取純化的難度大。而且產量也不高，主要是中性和堿性的葡萄糖內切酶。因其多數對結晶纖維素沒有活性，所以主要用于棉織品水洗整理工藝及洗滌劑工業中，在食品工業中應用也較少[4]。目前，報道較多的是真菌，其產生的纖維素酶通常是胞外酶，酶一般被分泌到培養基中，用過濾和離心等方法就可較容易地得到無細胞酶制品。絲狀真菌產生的纖維素酶一般在酸性或中性偏酸性條件下水解纖維素底物，其中木霉纖維素酶產量高、酶系全，故而被廣泛應用，尤其是里氏木霉、綠色木霉的研究較多。

2.1產纖維素酶里氏木霉的研究進展

由于里氏木霉產纖維素酶量高、穩定性好、適應性強，便于生產和管理，因此具有突出的研究和利用價值。目前，在菌株選育上普遍采用人工誘變和基因工程改造兩種方案獲得高效分解纖維素的菌株。誘變的方法一般是傳統的物理誘變(紫外線)和化學誘變(亞硝基胍)。IKEM等以里氏木霉ATCC66589為出發菌株，經紫外線誘變，獲得兩株突變菌株M2-1和M3-1。其濾紙酶活分別達到257U和281U。張素敏等利用紫外線誘變里氏木霉T306，得到突變菌株的CMCA活力達到64.2U/mL[5]。在化學誘變劑中，烷化劑可與巰基、氨基和羧基等直接反應，故更易誘發基因突變。DURANDH等用亞硝基胍誘變里氏木霉QM9414，得到一株穩定性較好的突變菌株CL847，FPA酶活最高達到5.2U/mL，較出發菌株提高了4倍[6]。也有紫外線與亞硝酸鈉、亞硝基胍等化學試劑復合誘變的研究，取得了較好的效果。這些研究對里氏木霉高產纖維素酶菌株的選育及其工業化應用具有顯著意義。基因工程改造可以從不同產纖維素酶菌株中篩選出比活力高、酶學性質穩定的基因重組在一起并高效表達，具有定向性，是選育出高產纖維素酶菌株的有效途徑。目前已成功在里氏木霉中克隆表達的基因有纖維二糖酶基因、celEn、pBGL1、af211、Neg[7]。

2.2產纖維素酶綠色木霉的研究進展

綠色木霉酶活較大，是目前公認較好的纖維素酶生產菌。目前的研究主要集中于綠色木霉產纖維素酶生產工藝的研究。陳莉等采用固態發酵方法研究了不同條件對其產纖維素酶活的影響。得出綠色木霉固態產酶發酵的最優條件是培養溫度30℃，培養時間5d，接種量5%，含水量250%。在實際發酵過程中，不同的酶組分達到最大酶活的時間也有不同，例如FPA酶活在發酵2d后達到最高值,Cx酶活在發酵3d后達到最高值。以蛋白胨為唯一氮源時，纖維素酶活力最高，以尿素為唯一氮源時，纖維素酶活力最低。綠色木霉分泌的酶系偏酸性,發酵液初始pH值為4.5時，FPA酶活和Cx酶活都出現最高值。因此在實際應用中也可以根據需要來調整不同酶組分的含量，以及合適的氮源，適宜的pH值等[8-9]。黃發等人對綠色木霉產β-葡聚糖酶的工藝條件研究也得出了類似的結果[10]。

3纖維素酶在食品工業的應用

3.1在果蔬加工中的應用

在果蔬的加工過程中,為了使得植物組織快速軟化和膨潤,常常采用加熱蒸煮或酸堿處理等方法。這樣一來就使得蔬菜、果實的香味和維生素等損失很大。通過使用纖維素酶來進行蔬菜的軟化可以避免這一缺點。除此以外,通過采用纖維素酶對蔬菜和果實進行分解,可以使加工的果醬口感增加;還可以用纖維素酶來分解蘑菇,制造一種很好的調味料;在糖果品加工工藝中也可以采用纖維素酶來縮短砂糖進入果實當中的時間，以更快地達到浸透效果[11]。朱莉莉等研究了羊棲菜汁浸提工藝條件,通過研究最適范圍各個單因素發現，在復合酶酶解提取羊棲菜汁的最佳浸提方案中,添加纖維素酶與果膠酶配比3:2可以大大提高浸提率[12]。

3.2在大豆加工中的應用

纖維素酶用于對大豆的處理,可以促使其大豆快速脫皮,與此同時,由于纖維素酶可以破壞其細胞壁,從而使得包含在細胞中的油脂和蛋白質完全的分離開來,導致大豆和豆餅中提取優質的水溶性蛋白質和油脂的得率明顯增加，不但降低了生產成本，而且還顯著地縮短了生產時間,更是提高了生產產品的品質。

3.3在茶葉加工中的應用

隨著茶飲料工業的快速發展，茶水飲料生產的方式漸漸地由最初飲料廠的全程生產方式向由原料廠商只是生產茶濃縮汁這一方式過度,這就使得我國的茶葉濃縮汁、速溶茶等生產發展快速。隨著近現代生物技術的快速發展,外源的生物酶在茶葉提取、加工中得到充分的應用。酶法提取的原理為利用其纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶等水解酶分解茶葉的細胞壁,使得細胞結構破壞,導致茶葉中的有效成分快速擴散與浸出,有利于提高固形物的溶出和浸提率。在茶葉提取生產的過程中，纖維素酶可以提升其可溶性糖類的含量以及水浸出物得率，并且還可以促進氨基酸、茶多酚、咖啡堿等物質的溶出，有利于釋放出芳香性物質，有顯著的增香效果[13]。

4纖維素酶在釀造、發酵工業中的應用

4.1在醬油、食醋釀造中的應用

醬油釀造主要是利用蛋白酶及淀粉酶等酶類對原料進行相應的酶解，而在該過程中如果添加使用纖維素酶，就可以使大豆等原料的細胞膜軟化、膨脹等細胞破壞作用更加明顯，使得包藏在細胞中的碳水化合物、蛋白質等順利釋放，從而縮短釀造時間，并且可以顯著提高產率及品質，使醬油中的還原糖和色度明顯增加，風味得到明顯改善[14]。在食醋釀造過程中，通過纖維素酶與糖化酶混合使用，可以顯著提升原料利用率及出品率。郝建新等以綠原酸為評價指標，進行了添加纖維素酶發酵醋的工藝研究。結果發現，利用纖維素酶等酶后，得到的發酵醋色澤澄清，并具備醋特有的香氣，口感也很柔和，而且具有比較好的體外抗氧化的效果[15]。

4.2在啤酒加工過程中的應用

把纖維素酶利用在啤酒工業的麥芽生產當中，可以增加麥粒等的溶解性，減少糖化液中R-葡萄糖的含量，明顯提高過濾性能。張麟等對啤酒糟進行了研究，發現預處理過程中添加纖維素酶水解比只用機械處理得到的可溶性糖含量有明顯提高[16]。

4.3在飲料中的應用

馮丹等用新鮮的豆渣為原材料，利用纖維素酶對原料進行酶解，可以獲得其水溶性膳食纖維等提取液，添加輔料可混合調配成一類酸甜適口，體系均一，滋味純正，并且具有一定保健功能的膳食纖維類飲料。且研究發現其具有較好的穩定性[17]。

4.4在酒精發酵中的應用

通過在原料中添加纖維素酶來釀酒，可以增加出酒量，節約糧食20%左右，而且釀出的酒酒味醇香，雜醇油含量低。尤其是白酒當中，添加纖維素酶以后，可以同時將淀粉和纖維素轉化為可發酵性的糖，再經過酵母分解而全部轉化為酒精，提高出酒率且酒的品質純正。在實際生產中應用纖維素酶，不僅可以提高發酵產率，而且能夠顯著縮短發酵時間[1]。此外，利用纖維素酶水解木質素生產乙醇用于化工、能源等方面對于目前的全球資源短缺現狀的緩解也具有重要意義。

5纖維素酶在纖維廢渣回收利用方面的應用

利用其纖維素酶或微生物,把農副產品、城市廢料中的纖維素進一步轉化成為酒精、葡萄糖和單細胞蛋白質等產品,這對于開辟食品工業的原材料來源、提供新型能源和變廢為寶等方面具有十分重要的價值和意義。例如纖維素酶應用于動物飼料的添加劑、紡織、造紙、醫藥保健、石油開采、新型能源、環保等領域都具有很大的潛力。

6展望

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關鍵詞：木聚糖酶（DSB）；甘露聚糖酶ManA；畢赤酵母（Pichia pastoris）；共表達

中圖分類號：Q19 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）10-1971-02

DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2017.10.043

Co-expression of Two Hemicellulases in Pichia pastoris

YANG Qing1，ZHANG Li1，ZHANG Hua-shan2，XIONG Hai-rong1

（1.College of Life Science，South-central University for Nationalities，Wuhan430074，China；2.Key Laboratory of Fermentation Engineering，Ministry of Education，Hubei University of Technology，Wuhan 430068，China）

Abstract：Based on the directional modification of xylanase（DSB） and mannan（ManA） synthase genes in our laboratory，the co-expression of these two hemicellulases was successfully achieved in a Pichia cell by different integration sites and resistance markers. And the recombinant strain GS115/DSB-ManA was obtained. The thermal stability test showed that the DSB and ManA produced by the co-expressed strain had high thermal stability. The successful expression of the two enzymes of the recombinant strain laid a foundation for the research and production of the complex enzyme preparation.

Key words：xylanase （DSB）； mannanase （ManA）； Pichia pastoris； co-expression

β-木聚糖酶（EC 3.2.1.8）和β-甘露聚糖酶（EC 3.2.1.78）均屬于半纖維素酶，分別水解半纖維素中的β-1，4-木糖苷鍵和β-1，4-甘露糖苷鍵。木聚糖為半纖維素中最豐富的一類[1]，在木聚糖酶的作用下可被降解為國際市場上急需的低聚木糖和木糖。甘露聚糖作為半纖維素第二大組分[2]，廣泛存在于木材以及植物的塊莖和種子中。

隨著對半纖維素酶的深入研究，其應用領域也在不斷的擴展，并擁有一個廣泛的工業酶應用市場，包括食品和飼料、咖啡萃取、生物乙醇生產、殺黏菌劑、制藥、紡織、洗滌、造紙、石油、天然氣工業及生物技術等領域[3，4]。工業生產中，不僅需要高活力的酶，還需要酶在酸性環境、堿性環境或高溫條件下保持穩定的酶學特性[5]，同時也希望減低生產成本而提高效益。本試驗研究了木聚糖酶與甘露聚糖酶的共表達，實現了這兩種酶在畢赤酵母中的穩定共表達，使工業生產中有效地減少生產成本及相關處理環節。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種與質粒 大腸桿菌Top10細胞、表達載體pAO815hr為中南民族大學生命科學學院實驗室保藏與構建。畢赤酵母GS115和表達載體pPICZαA為中國農業科學院飼料研究所惠贈。

1.1.2 工具酶及試劑限制性內切酶 T4 DNA連接酶等工具酶和DNA Marker購自寶生物工程（大連）有限公司；燕麥木聚糖和角豆膠購自Sigma公司；Tryptone、Yeast Extract購自于Oxoid公司；無氨基酵母氮源（YNB）、D-sorbitol、Agar購自Biosharp公司；其他試劑均為國產或進口分析純。

1.1.3 培養基和抗生素 畢赤酵母抗性選擇平板YPDSZ（含終濃度100 μg/mL Zeocin），畢赤酵母組氨酸缺陷型選擇平板MD，畢赤酵母生長/誘導培養基BMGY/BMMY，大腸桿菌生長培養基LB/LBL，畢赤酵母生長培養基YPD等培養基配方見Invitrogen公司畢赤酵母操作手冊。氨芐青霉素（Ampicillin Sodium Salt）購自Biosharp公司；博來霉素（Zeocin）購自Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 木聚糖酶DSB與甘露聚糖酶ManA重組表達質粒的構建及篩選 采用限制性內切酶EcoRⅠ和NotⅠ分別雙酶切木聚糖酶DSB基因和表達載體pAO815hr，連接后轉化，涂布于含有氨芐青霉素的LB固體平板上；同樣用EcoRⅠ和NotⅠ分別雙酶切甘露聚糖酶ManA基因和表達載體pPICZαA，連接后轉化，涂布于含有博來霉素的LB固體平板上。菌落PCR驗證后雙酶切鑒定篩選出陽性克隆菌株DSB-pAO815hr-Top10和ManA-pPICZαA-Top10。

1.2.2 木聚糖酶與甘露聚糖酶共表達重組菌的構建及篩選

1）GS115/pAO815hr-DSB重組菌的構建及篩選。采用SalⅠ線性化重組質粒DSB-pAO815hr，電擊轉化畢赤酵母GS115感受態細胞，挑取100個該共表達重組菌的單菌落使用BMGY/BMMY誘導產酶，使用DNS法[6]檢測酶活力，依據酶活力高低篩選出酶活力較高的重組菌株GS115/pAO815hr-DSB。

2）共表達重組菌GS115/DSB-ManA的構建及篩選。采用SacⅠ線性化重組質粒ManA-pPICZαA，電擊轉化GS115/pAO815hr-DSB感受態細胞[7]，按上述方法篩選出共表達重組菌株GS115/DSB-ManA。

1.2.3 GS115/DSB-ManA產甘露聚糖酶與木聚糖酶熱穩定性的檢測 將發酵上清液在不同溫度下準確處理30 min，迅速置于冰上冷卻，分別在DSB最適溫度（75 ℃）與 pH（6.5）下與木聚糖底物反應和在ManA最適溫度（75 ℃）與 pH（6.0）下與角豆膠底物反應，使用分光光度計檢測OD540 nm，以每種酶最高酶活力為100%，計算各酶在其他溫度處理后的相對殘余酶活力，每組試驗均重復3次，取平均值作為最終結果。

1.2.4 SDS-PAGE電泳 發酵結束后，取GS115/DSB-ManA與兩種酶單一表達菌株的上清液進行SDS-PAGE電泳分析，具體操作方法參考《分子克隆實驗指南》第二版。

2 結果與分析

2.1 木聚糖酶（DSB）與甘露聚糖酶（ManA）重組表達質粒的構建

將DSB基因片段連接到pAO815hr上，獲得表達質粒pAO815hr-DSB；將ManA基因片段連接到pPICZαA上，獲得表達質粒pPICZαA-ManA，物理圖譜如圖1所示，雙酶切驗證以上重組質粒構建成功。

2.2 熱穩定性分析

如圖2所示，GS115/DSB-ManA中木聚糖酶在45～70 ℃下處理30 min能夠保持85%以上相對酶活力，但經過70 ℃以上溫度處理后，相對酶活力降低較為明顯；甘露聚糖酶在45～75 ℃下處理30 min后仍能保持90%以上相對酶活力，但經過75 ℃以上溫度處理后，相對酶活力降低較為顯著。

2.3 SDS-PAGE分析

結果（圖3）表明，GS115/DSB-ManA發酵上清液中出現兩條電泳條帶，分別與單一表達DSB和ManA發酵上清液對比。GS115/DSB-ManA能夠同時表達出兩種半纖維素酶蛋白，且產物雜、蛋白的分泌量偏低。GS115/DSB-ManA分泌木聚糖酶蛋白較分泌甘露聚糖酶蛋白量高。

3 討論

目前木聚糖酶與甘露聚糖酶已成功應用于工業農業生產的諸多領域，且通常是木聚糖酶和甘露聚糖酶聯合使用從而達到協同增效。pPIC9K和 pPICZαA質粒同屬于畢赤酵母分泌型表達質粒，本試驗通過不同的整合位點和抗性標記實現了DSB和ManA在同一宿主中的整合與篩選，成功構建了共表達菌株GS115/DSB-ManA，實現了目標酶的共同生產，同時檢測出其分泌的兩種半纖維素酶有較高的熱穩定性，為進一步工業化生產復合酶奠定了基礎。

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篇5

關鍵詞：阿拉伯/木糖苷酶；木聚糖酶；pET-20b（+）；多功能半纖維素酶；克隆；表達

中圖分類號：Q785 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）17-4205-03

Cloning and Expression of a Trifunctional Hemicellulase Using pET-20b in Escherichia coli

PENG Jing-jing

（College of Biology and Enology， Taishan University， Taian 271021， Shandong， China）

Abstract： The structure gene from Thermoanaerobacter ethanolicus JW200 encoding arabinosidase-xylosidase XarB gene was amplified and ligated into pET-20b（+）， resulting in pET-20b-xarB. The structure gene from Thermomyces lanuginosus DSM 5826 encoding xylanase（XynA） was amplified and ligated into pET-20b-xarB， resulting in pET-20b-xarB-xynA. The trifunctional enzyme （XarB-XynA） was obtained after expression pET-20b-xarB-xynA in Escherichia coli JM109（DE3）. SDS-PAGE analysis showed that the molecular mass of the expressed recombinant XarB-XynA was about 108 kDa， the same as the predicted size.

Key words： arabinosidase-xylosidase； xylanase； pET-20b（+）；XarB-XynA； cloning； expression

農業廢棄物是指農業生產和農副產品加工后的剩余物，主要包括農作物或果樹的秸稈或枝條、果實外殼、玉米芯、甘蔗渣等，其主要化學成分是纖維素、半纖維素、木質素等，是亟待開發的重要可再生資源。我國每年秸稈產量達6億t左右，目前大部分秸稈用于燃燒或者被廢棄[1]。秸稈中半纖維素的含量占總干重的25%～50%，其化學結構較纖維素復雜，其徹底降解的產物主要是木糖和少量阿拉伯糖、葡萄糖醛酸，可以用作基本碳源生產有機酸、氨基酸、單細胞蛋白、糖醇、工業酶類溶劑或燃劑。

來自嗜熱厭氧乙醇菌（Thermoanaerobacter ethanolicus，JW200）的阿拉伯/木糖苷酶，以人工底物進行測試，其木糖苷酶活性和阿拉伯糖苷酶活性分別為每毫克蛋白質180和1 000 U，高于其他木糖苷酶或阿拉伯糖苷酶的活性[2]。疏棉狀嗜熱絲孢菌（T. lanuginosus DSM 5826）所產生的木聚糖酶A（XynA）屬于G/11家族，具有較好的熱穩定性，在高溫和堿性條件下有效且穩定，沒有纖維素活性，具有工業化應用前景，且研究發現，該木聚糖酶優先降解高聚合度的木聚糖鏈，產物是不同聚合度的低聚木糖，不產生木單糖，這對于生產低聚木糖具有很好的應用價值[3]。同時使用多種克隆的特異水解某一多糖結構的水解酶來降解木聚糖，清潔高效，但工序復雜，成本高。在不改變酶自身優良性質的條件下，如果將有關的水解酶融合串聯成一個具有多種水解酶活性的多功能酶，或通過融合標簽回收重復利用酶，來提高融合酶的綜合效率，這將大大簡化工序并降低成本[4-6]。

本研究采用帶有T7強啟動子的pET系列表達載體，將嗜熱厭氧乙醇菌的雙活性阿拉伯/木糖苷酶（XarB）和來源于疏棉狀嗜熱絲孢菌木聚糖酶A（XynA）進行基因融合，得到多功能酶的融合表達質粒pET-20b-xarB-xynA。通過蛋白質工程構建多功能半纖維素酶（XarB-XynA）來促進生物轉化，為酶法降解半纖維素的工業化生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株：E. coli DH10B、E. coli JM109（DE3）（購自Promega公司）。

Luria-Bertani（LB）培養基：胰蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，NaCl 10 g/L。固體培養基添加終濃度為2%的瓊脂粉。

含有雙活性阿拉伯/木糖苷酶（XarB）的重組質粒pHsh-xarB、含有疏棉狀嗜熱絲孢菌 （T. lanuginosus DSM 5826）木聚糖酶A（XynA）基因的質粒pHsh-xynA2由本實驗早期構建并保存。質粒pET-20b（+） （購自Novagen 公司）。

1.2 方法

1.2.1 基因組提取 DNA 操作采用分子克隆技術標準方法進行。質粒轉化采用電轉化方法進行，質粒和PCR產物采用Qiagen plasmid kit 和PCR purification kit（Qiagen USA）進行純化。

1.2.2 基因克隆 根據GenBank中嗜熱厭氧乙醇菌（JW200）雙活性阿拉伯/木糖苷酶（XarB）的基因序列（GenBank登錄號AF135015）設計引物xarB-N和xarB-C。xarB-N ： 5’- CCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGAAGCCATTATATTTAGAT-3’，下劃線為 XbaⅠ酶切位點。xarB-C：5’- CCCGATATC TTTATTCTCTACCCTTACTTCC -3’，下劃線為 EcoR V酶切位點。以提取的重組質粒pHsh-xarB為模板， 利用相應的上下游引物擴增雙活性阿拉伯/木糖苷酶基因xarB，為提高所擴增片段的保真性，用Pyrobest DNA 酶對模板進行擴增。具體方法見參考文獻[2，3]。所得質粒命名為pET-20b-xarB，雙酶切驗證正確的質粒送上海美吉生物技術公司測序。

根據GenBank中疏棉狀嗜熱絲孢菌（DSM 5826）木聚糖酶A（XynA）基因序列（GenBank 登錄號U35436）以及本試驗優化的pHsh-XynA2的木聚糖酶A（XynA）基因序列，以重組質粒pHsh-xynA2為模板，設計引物xynA-N和xynA-C。xynA-N： 5’-CCCGATATCATGCAGACTACCCCGA-3’，下劃線為EcoR V酶切位點。xynA-C：5’-CCGCTCGAGGCCAACGTCAGCAACA-3’，下劃線為為 XhoⅠ酶切位點。

以pHsh-xynA2為模板，利用相應的上下游引物擴增基因xynA，為提高所擴增片段的保真性，用Pyrobest DNA 酶對模板進行擴增。具體方法見參考文獻[2，3]。PCR擴增產物電泳檢測正確后純化，將pET-20b-xarB質粒和PCR擴增純化后的DN段分別用EcoR V和XhoⅠ雙酶切，割膠回收DN段和載體酶切產物，乙醇沉淀濃縮，16 ℃下連接6～12 h。連接液轉化至E.coli DH10B，挑取陽性克隆，提取質粒用EcoR V和XhoⅠ內切酶酶切驗證，得到重組質粒pET-20b-xarB-xynA，雙酶切驗證正確的質粒送上海美吉生物技術公司測序。

1.2.3 重組蛋白的表達與純化 重組質粒pET-20b-xarB-xynA電轉化到宿主細胞E. coli JM109 （DE3）中，挑取重組單菌落接種于含100 μg/mL的氨芐青霉素的 LB 培養液中培養，至OD600 nm為0.6～0.8，加IPTG至濃度為0.8 mmol/L，繼續培養6 h后，離心收集菌體。用50 mmol/L pH為7.5的 Tris-HCl 緩沖液洗滌細胞2次，并用相同緩沖液重懸細胞，置于冰水浴中用超聲波破碎儀破碎細胞， 超聲條件為50 Hz×15 s×8， 細胞碎片于12 000 r/min 離心10 min，去除上清液即為粗酶液。將粗酶液在60 ℃熱處理30 min后，4 ℃ 12 000 r/min 離心30 min去除變性蛋白。

2 結果與分析

2.1 重組質粒pET-20b-xarB的構建

根據GenBank中嗜熱厭氧乙醇菌（JW200）雙活性阿拉伯/木糖苷酶基因xarB的序列，以重組質粒pHsh-xarB為模板，用引物xarB-N和xarB-C進行PCR擴增，結果如圖1A所示，擴增出來的片段與基因實際大小2 355 bp是相符的。

PCR產物驗證正確后過柱純化，并用XbaⅠ和EcoR V進行雙酶切，酶切后的pET-20b（+）質粒進行連接，得到重組質粒pET-20b-xarB。重組質粒經EcoR V單酶切后釋放出6 000 bp大小的條帶，經XbaⅠ和EcoR V雙酶切后，釋放出2 300 bp大小的條帶，與基因大小一致，同時在3 700 bp處有一條帶和pET-20b（+）載體酶切后條帶大小一致，結果如圖1B所示，測序結果表明基因xarB序列與公布的序列完全一致。

2.2 重組質粒pET-20b-xarB-xynA的構建

以重組質粒pHsh-xynA2為模板，以xynA-N和xynA-C為引物進行PCR擴增，將純化后的DN段與pET-20b-xarB分別用EcoR V和XhoⅠ進行

雙酶切，連接后挑選陽性克隆，得到重組質粒pET-20b-xarB-xynA。重組質粒經XhoⅠ單酶切后釋放出6 600 bp大小的條帶，經XbaⅠ和XhoⅠ雙酶切后，釋放出2 955 bp大小的條帶，與基因（xarB+xynA）大小一致，同時在3 700 bp處有一條帶和pET-20b（+）載體酶切后條帶大小一致，酶切結果如圖2所示。

2.3 重組多功能半纖維素酶的表達及檢測

將重組質粒pET-20b-xarB-xynA電轉化到宿主細胞E. coli JM109（DE3）中，挑取重組單菌落接種于含100 g/mL 的氨芐青霉素的 LB 培養液中培養至OD600 nm為0.6～0.8，加IPTG至濃度為0.8 mmol/L，繼續培養6 h 后，離心收集菌體。以pET-20b（+）轉化產物為對照，SDS-PAGE分析結果表明，重組菌均能產生約108 kDa的特異條帶，結果如圖3所示，與預期的蛋白質相對分子量大小一致。

3 討論

雖然已有多種木聚糖酶被提純或基因克隆，并且這些酶在底物特異性熱穩定性及酶反應的底物范圍等性能方面都各有優勢，但是相對于半纖維素結構及其降解的復雜特點，僅靠自然菌種所產酶的單一優良性質仍不能實現農業廢棄物的高效利用，也不能滿足工業生產的需要。重組酶XarB這個雙重活性的酶可與木聚糖酶協同作用徹底降解阿拉伯木聚糖，是工業酶制劑的理想酶源，從而為構建多功能半纖維素融合酶提供一個很好的酶材料。

本研究將來源于嗜熱厭氧乙醇菌雙活性阿拉伯/木糖苷酶（XarB）和來源于疏棉狀嗜熱絲孢菌木聚糖酶A（XynA）同時構建到pET-20b（+）上，得到融合酶表達質粒pET-20b-xarB-xynA，并且在大腸桿菌里面成功表達。雙活性阿拉伯/木糖苷酶（XarB）和木聚糖酶（XynA）融合后所得的雜合酶在降解農業廢棄物方面有著明顯的優勢，將有助于提高農業廢棄物的降解效率。

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篇6

關鍵詞： 褐色高溫單孢菌 纖維素酶 固定化

一、前言

在化工資源貯藏量不斷減少的今天，通過可再生纖維素資源的生物轉化生產葡萄糖和乙醇已成為當前研究的熱點[1]-[2]。纖維素酶是降解纖維素生成葡萄糖的一組酶的總稱，其最大的潛在用途是把纖維素類物質酶法水解成葡萄糖。迄今為止，已有很多關于纖維素酶生產菌株的研究報道[3]-[4]，但其中多數以真菌如黑曲霉（Aspergillusniger）和木霉（Trichodermareesei）等為研究對象。由細菌、放線菌所產生的中性纖維素酶和堿性纖維素酶，在洗滌劑工業中的應用已引起人們的高度重視[5]-[6]。有關褐色高溫單孢菌PE-211（Thermomonospora fusca PE-211）產纖維素酶的性質，黎海彬等[7]-[8]已做了研究，但對該酶的固定化未見有報道。本研究對發酵的粗酶液進行了純化，再制備成固定化酶，然后對其最適反應溫度、pH值、耐熱性及米氏常數等進行了研究，望能為其在工業、農業、輕工業等方面的應用提供一定的理論依據。

二、材料和方法

1.實驗材料

（1）菌種

褐色高溫單孢菌PE-211（Thermomonospora fusca PE-211）[7]。

（2）試劑

分離介質SephadexG-100（德國Phamacia）；羧甲基纖維素鈉（美國Sigma）；牛血清白蛋白為進口分裝；其余均為國產分析純或化學純。

（3）儀器

高速冷凍離心機（美國貝克曼公司）；紫外可見分光光度計（上海第三分析儀器廠）；核酸蛋白檢測儀、梯度儀、恒流泵、自動部分收集儀（上海滬西分析儀器廠）等。

（4）搖瓶產酶培養基

在Hagerdal Medium[3]中加入質量分數為1.0%的微晶纖維素作為碳源。

2.實驗方法

（1）蛋白質含量測定

采用Folin-酚法測定蛋白質含量[9]，以牛血清白蛋白（BSA）做標準曲線。

（2）SDS-PAGE[10]

采用垂直板式不連續系統電泳，分離膠濃度10%，濃縮膠濃度4%，用0.25%（W/V）考馬斯亮藍G-250染色。

（3）殼聚糖的制備[11]-[12]

將蝦皮洗凈，然后去掉殘余的蝦肉，用3～4倍量體積的4%的稀鹽酸和10%的NaOH反復處理4～5次，每次8～10h，用水洗至中性。所得的白色幾丁質加入50%的NaOH，于80℃～100℃下保溫處理6～7h后，再水洗至中性，曬干粉碎，過40目篩即得。

（4）粗酶的制備[8]

在裝有100ml產酶培養基的500mL三角瓶中接入10ml種子液，于55℃、200r/min下培養24～48h，取培養液以4000r/min的速度離心20min，所得上清液即為粗酶液。

（5）粗酶液的純化

①硫酸銨沉淀和透析。取粗酶液，加入硫酸銨至30%飽和度，在4℃，10000r/min下離心10min，收集沉淀物，再溶于少量磷酸緩沖液中，透析除鹽，制得經硫酸銨沉淀的純化酶液。

②葡聚糖凝膠層析。葡聚糖凝膠SephadexG-100經充分溶脹后上柱，柱子經0.10mol/L的pH6.0的磷酸緩沖液充分平衡后上樣，每6min收集一管，分別測定各管的纖維素酶活。

（6）纖維素酶的固定化[13]-[14]

取一定量的殼聚糖于6%的戊二醛中攪拌2.5h，4℃過夜，然后洗去殘余的戊二醛，在交聯后的殼聚糖中加入纖維素酶液，室溫下攪拌2.0h，于4℃靜置過夜，再洗去游離酶，即得固定化酶。

（7）纖維素酶（CMCase）活力的測定及定義[15]

酶活力的測定以羧甲基纖維素鈉鹽（CMC-Na）作底物，經纖維素酶水解后生成還原糖，然后用DNS（二硝基水楊酸）法測定還原糖的含量，由還原糖的量來求得酶活力的大小。

取0.5ml適當稀釋的酶液，與1.5ml質量分數為0.7%的CMC-Na溶液混合，在65℃下反應30min，取出加入3mlDNS顯色液，然后煮沸5min，停止反應，冷卻，于分光光度計上530nm處比色（空白試驗中除酶液事先滅活外，其余條件不變）。

一個酶活單位被定義為在1min內轉化底物產生1μmol還原糖（按葡萄糖計）所需的酶量。

（8）固定化酶的動力學

分別在不同的pH及溫度下，測定其對酶反應速度的影響，并在不同的底物濃度下測定固定化酶的米氏常數K和V。

三、結果

1.硫酸銨沉淀

發酵粗酶液經離心去除菌體和殘渣后，在其上清液中緩慢加入硫酸銨至30%的飽和度，4℃過夜，離心、去除雜蛋白。于上清液中緩慢補加入硫酸銨至80%飽和度，4℃過夜，離心收集沉淀，沉淀物溶于檸檬酸緩沖液中。透析檢查無銨離子后，計算其收率為65.73%。

2.第一次SephadexG-100柱層析

經硫酸銨鹽析后的透析液加到平衡好的SephadexG-100柱上，再用同樣的緩沖液洗脫，洗脫曲線為三個峰（峰Ⅰ、峰Ⅱ、峰Ⅲ），經檢測主要的纖維素酶活力包括在峰Ⅲ中，但SDS-PAGE結果表明還有雜蛋白存在，其純化倍數為30.87，結果見表1。

3.第二次SephadexG-100柱層析

將第一次洗脫峰Ⅲ合并，進行第二輪SephadexG-100柱層析，纖維素酶活都包括在峰Ⅲ中，SDS-PAGE結果表明酶的純度很高。將具有纖維素酶活的峰Ⅲ合并，測定每一步純化操作中的蛋白濃度和酶活力，計算比活力，結果見表1。結果表明，經過SephadexG-100柱純化后，酶的比活力為54.15IU/mg，提純倍數為47.50。

4.不同酶量對固定化酶活力的影響

取7份1.5g殼聚糖與戊二醛的交聯物，分別加入2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、7ml、8ml的酶液，固定化后測定其酶活力，結果見圖1。

5.固定化纖維素酶的最適pH

取一定量的固定化酶，分別在pH為5、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0下測定其酶活力，結果發現固定化酶在pH為8.5時，酶的活力最高，如圖2所示。

6.固定化纖維素酶的最適溫度

取一定量的固定化酶，分別在35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃下測定其酶活，結果發現固定化酶在溫度為70℃時，酶的活力最高。

7.固定化纖維素酶的耐熱性實驗

取10份固定化酶和原酶，分別置于70℃的水浴中，每間隔10min取出一管，按上述方法測定其酶活力，連續進行100min，結果如圖4所示。

8.固定化酶的米氏常數

用等量的固定化酶與不同的底物濃度于65℃下反應15min，測定其吸收值，用雙倒數作圖法作圖，測定酶的米氏常數和最大反應速度，結果見表2。由雙倒數作圖可知，以CMC-Na為底物，固定化纖維素酶的Km為7.19mg/ml，Vmax為0.132mg/ml·min，而原酶液的Km為7.27mg/ml。

四、討論

圖1結果表明，隨著加入酶量的增加，其酶活力隨著增大，但當加入的酶量增加到一定程度時，酶活力增加變得緩慢，這可能是由于在酶的固定化過程中，一定量交聯后的載體，其活性基團是一定的，結合位點未被飽和之前，固定化酶的活力會隨加入酶量的增加而增大，一旦結合位點被飽和后，再增加加入的酶量卻不能增加酶活力。

如圖2所示，原酶的最適pH值為9.0，可能由于殼聚糖是陽離子型載體，因而固定化酶的最適pH值比原酶要低。

如圖3所示，而且固定化酶的熱穩定性較原酶高，在60℃～80℃時酶活力都較高。這表明纖維素酶經固定化后，對熱的穩定性明顯提高。

圖4的結果表明，褐色高溫單孢菌纖維素酶的耐熱性很強，保溫100min后，固定化酶的酶活基本保持不變，而且固定化酶比原酶具有較高的熱穩定性，由此可以看出，固定化酶的適應性更強，可廣泛應用于工業、農業、輕工業等各個方面。

表2結果表明該纖維素酶在固定化后，其米氏常數略有減小，說明纖維素酶經固定化后，與底物的親和力有所增加。

五、結語

褐色高溫單孢菌PE-211纖維素酶經硫酸銨鹽析和SephadexG-100柱純化后，粗酶液被純化47.5倍，比活力為54.15IU/mg。酶動力學研究表明，固定化酶的最適pH為8.5，最適溫度為70℃，且固定化酶在60℃～80℃活力較高；該酶的耐熱性強，而固定化酶的熱穩定性比原酶強；以羧甲基纖維素鈉為底物，固定化酶的K為7.19mg/ml，V為0.132mg/ml·min。

有關褐色高溫單孢菌PE-211固定化纖維素酶在解決能源危機及可再生資源利用等方面有待進一步研究。

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篇7

先鋒霉素是頭孢類抗菌素，于70年代進入醫院。它的抗菌范圍很廣，最初用于治療金黃色葡萄球菌感染，良好的療效使之初露鋒芒。到了80年代，可以口服的先鋒4號(頭孢氨芐)和先鋒6號(頭孢拉定)先后用于臨床。于是它被廣泛使用，處處充當抗菌的“先鋒”，簡直大紅大紫起來。

實際上，先鋒霉素是個“大家族”。這個家族共有三代成員：第一代：頭孢噻吩(先鋒1號)、頭抱噻啶(2號)、頭抱氨芐(4號)、頭抱唑啉(5號)、頭抱拉定(6號)、頭孢硫咪(8號)；第二代：頭孢孟多、頭抱呋新；第三代：頭抱噻肟、頭孢哌酮(先鋒必)、頭孢三嗪、頭抱他啶。

臨床上應用的品種比以上介紹的還要多，但主要作用同第一代品種大同小異。第一代頭抱菌素主要適用于革蘭氏陽性菌。特別是耐藥的金黃色葡萄球菌；第二代頭孢菌素的抗菌范圍較第一代，對革蘭氏陰性桿菌的效果比第一代好，而對陽性菌的效果不如第一代；第三代頭抱菌素的抗菌范圍更廣，對陰性桿菌的作用更強。尤其是可作為綠膿桿菌的克星來使用，但對球菌的作用不如第一代、第二代。弄清了頭抱菌素每一代成員和它們不同的作用。在使用時才可以“量材錄用”而不致濫用。

篇8

中圖分類號:R965.3

文獻標識碼：A

【摘要】 目的：研究紫草素的提取工藝。方法 用纖維素酶酶解紫草，丙酮液浸提，紫外分光光度法測定其吸收度。采用L9（34）正交設計法進行實驗設計。結果 最佳提取工藝: 在pH值5， 1‰的纖維素酶條件下，在35℃酶解紫草12h ，用丙酮液提取3次。結論 工藝合理、可行，質量可控。

關鍵詞：紫草素 紫草 酶解法 正交試驗

Study on Extracting Technigue of Shikonin from Arnebia Euchroma Johnst Optimized by orthogonal design

ABSTRACT:Aim To study a optimum preperation method of Shikonin by extraction from Arnebia Euchroma Johnst.Method Skikonin was extracted by acetone from enzyme decomposed mixture ，determination the absorption in UV .The test are arranged by orthogonal desige with L9（34）. Result The best prepering process is: pH 5，and consistency of the enzymeis 1‰，the enzyme decomposed temperature is 35℃,reaction times 12h, by acetone extraction 3 times .Conclusion The experiment results showed that the preperation method is possible and the quality of the product can be controled.

[Key words]: Arnebia Euchroma Johnst; Skikonin; enzyme ; orthogonal desige

紫草為紫草科植物新疆紫草Arnebia euchroma(Royle) Johnst, 紫草Lithos permumerythrorbizon Sieb et Zucc, 或內蒙紫草Amebia guttata Bunge的干燥根[1],具有涼血、活血、解毒、透疹之功能。而從紫草的根中所提取的紫草色素（萘醌系色素），是一種天然食用色素，還可用于印染、制藥、化妝品等工業，近期研究發現其有顯著的抗癌作用[2]，有著廣闊的研究和開發前景。

大部分中藥材的細胞壁是由纖維素構成，植物的有效成分往往包裹在細胞壁內[3]。纖維素則是?-D-葡萄糖鍵以1，4-?-葡萄糖苷鍵連接，用纖維素酶酶解可破壞-D-葡萄糖苷鍵，從而破壞其細胞壁，進而有利于有效成分的提取[4，5]。根據這一原理，選用纖維素酶酶解紫草，并用丙酮提取紫草色素，紫外分光光度法測定其吸收度，采用正交試驗，選擇酶解溫度、酶解時間、酶解時所需pH值、酶的濃度四個因素，每個因素三個水平，用L9（34）正交表進行實驗設計（表1），得出最佳酶解條件。這對提高中藥材的利用率，減少浪費，減少藥渣的處理和降低生產成本都具有較大的現實意義。

1、實驗材料及儀器

1.1 材料：纖維素酶Cellulase(FEINBIOCHEMICA GMBH&CO.廣東省藥品檢驗所提供)

紫草干燥的紫色根狀物（深圳市醫藥公司提供）

丙酮（化學試劑CP.級）

1.2 儀器：電子天平AE240 （METTLER）

電熱恒溫水浴鍋 HH.S11-2 （北京長安科學儀器廠）

紫外分光光度計UV-2201 SPECTRO PHOTOMETER （日本島津）

2、實驗方法

2.1 預試驗

取碎紫草1g，加丙酮10ml在室溫（28℃，以下相同）下浸提取24h，濾過，殘渣繼續用等量丙酮浸提直至濾液無色，水浴蒸干紫草加入1‰的纖維素酶及10ml蒸餾水，測得pH7，在45℃條件下水浴酶解24h，濾過，所得紫草殘渣水浴蒸干，用丙酮10ml浸提24h，濾過，濾液呈淺紫色。

此試驗表明，紫草經酶解后提取可提高其提取率，即纖維素酶酶解紫草提高其有效成分的提取率試驗具有可行性。

2.2 酶解

取碎紫草500g，分成10份，每份50g編號1～9，置于1000ml燒杯中，按正交表（表2）各加入適量的纖維素酶和蒸餾水550ml，用HCL溶液或NaOH溶液調節適當的pH值，于不同溫度下酶解適當時間后濾過，紫草殘渣水溶蒸干，同時做一陰性對照試驗（實驗號為0）。

2.3 提取

將各試驗號干紫草分別轉移至2000ml的錐形瓶中，各加入丙酮1000ml，密封搖勻，在室溫常壓下浸提24h，濾過，濾液取樣待測。

2.4 檢測

2.4.1 量取4號樣品0.2ml，用丙酮稀釋50倍，用UV-2201紫外分光光度計掃描，測得其吸收峰兩個，波長分別為489.3nm和517.3nm，其中最大吸收波長為517.3nm。

2.4.2 按編號各取樣0.2ml，用丙酮稀釋50倍，丙酮作空白，在室溫及λmax=517.3nm下測其吸收度A值。

3、實驗結果

3.1 由A=E*C*L（A為吸收度，E為吸光系數，C為被測物濃度，L為吸收池厚度，E、L為定值，即A與C成正比，A值的大小可反映出濃度即提取率的大小），從表2與陰性試驗對比可看出，經纖維素酶酶解后紫草色素的提取率有明顯提高，即用酶解法酶解紫草提高紫草素的提取率的方案是可行的。

3.2 通過測定，可以初步確定酶解紫草的最佳酶解條件為A2B1C1D1，即T=35℃，t=12h，C=1‰為最佳酶解條件。

3.3 從各個水平的均數極差R看（R的大小反映對指標影響的大小），因素的主次順序為D－A－C－B，即C因素為主要因素，其它因素則可根據對成本、時間、收益等的綜合考慮選取適當的水平，經考慮，決定A2B1C1D1為最佳酶解方案。

3.4 紫草素的最佳提取工藝為在1‰的纖維素酶條件下，控制pH值為5，在35℃酶解紫草12h ，用丙酮液提取3次。經試驗，紫草素的提取率達0.9%以上。

4、討論

4.1 由于纖維素酶是一組多酶體的復合酶，可以切斷纖維素中的1.4－β-葡萄糖苷鍵，使大分子的纖維素降解成分子量較小的纖維二糖和葡萄糖分子，破壞植物細胞壁，使細胞內含物質得以充分釋放，因而可以提高紫草色素的提取率。

4.2 在提取過程中，酶解后的紫草均水浴蒸干后再提取，因紫草素具揮發性，在酶解過程中的紫草，紫草素揮發損失可能多于陰性試驗中的紫草，這可能造成實驗誤差。

4.3 在紫草素的提取過程中，對于如何減少紫草素的耗損還有待于進一步探討。

參考文獻

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篇9

翻開一棟木質的老式建筑的橫梁，幾只肥碩的白蟻正趴在上面大快朵頤。而不久，這棟年代感十足的建筑，也許就會傾塌在這些白蟻的利嘴之下。

但是，這種在2億年前的二疊紀就出現的生物，也許不久的將來，能為人類在新能源的探索上幫上大忙。廣東省昆蟲研究所的研究人員正在進行一項“纖維素乙醇白蟻仿生技術研究”，試圖通過復制白蟻的特殊基因，將木質纖維素轉化為酒精。而酒精（乙醇）是石油等不可再生資源的最佳替代物，有望在未來成為清潔能源的主力軍。

木質纖維素可轉化為乙醇

廣東省昆蟲研究所研究員鐘俊鴻告訴記者，木質纖維素是太陽能極為重要的貯存形式。地球上每年光合作用可產生1000多億噸的植物干物質，其中一半以上是纖維素和半纖維素。另外，人類活動產生的廢棄物如農業廢物，比如稻草、稻殼、麥稈、玉米芯、棉籽殼、甘蔗渣等；食品加工廢物，如果皮、果渣等；木材廢物，如木屑、樹皮等都含有大量的纖維素。

而我國每年產生木質纖維素生物資源的總量約13.92億噸。其中，農作物秸稈年產生量約7 億噸；森林采伐剩余物生物量1.09 億噸；木材加工產出剩余物約 0.418 億噸；木材制品拋棄物約 0.60 億噸；灌木林的生物量約為 1.81 億噸。但是每年如此多的木質纖維素卻被白白地浪費掉了。

目前，我國每年汽車年耗油約8000萬噸，只需把每年產生的木質纖維素的一半轉化為乙醇，其數量就可以超過我國汽油消費總量的2倍以上。雖然現在利用人工的方法也能制造出酒精，但是由于木質纖維素通常被難以降解的木質素包裹，所以轉化效率很低。

白蟻可分解木質纖維素

而這一難題在白蟻面前卻不值得一提，鐘俊鴻說，就像人以五谷雜糧為食一樣，白蟻主要以木質纖維素為食。

白蟻腸道的消化功能比大型食草動物還要高效，它就像一座小型的生物反應器――由研磨器（稱為咀嚼組織的下顎和前胃）、反應池（消化道）、酶和微生物區系組成。在白蟻的長期進化過程中，它的消化系統已經演變出一套能夠高效降解纖維素的腸道微生物群。在白蟻小小的腸道中，它自身產生的纖維素酶與來自微生物產生的纖維素酶高效配合，成為了消化木質纖維素的利器。在一些熱帶干旱地區，白蟻能消耗掉超過90%的干木，它就像是森林的清道夫一樣，是熱帶地區木質纖維素的重要降解者。

白蟻能夠高效地消化木質纖維素，但是它并不能直接產生出酒精。鐘俊鴻說，但是如果將白蟻降解木質素的基因，以及白蟻腸道中微生物降解木質素的基因提取出來，移植到工程菌（采用現代生物工程技術加工出來的新型微生物）上，那么，這些纖維素消化酶就能將木質纖維素降解成單糖，再經生物發酵就能產生乙醇。

找到能力超強白蟻

而目前的重點就是在種類繁多的白蟻中，找到擁有超強“消化”基因的種類，并將這些基因提取出來，通過生物技術增強效能后，再移植到工程菌的身上。鐘俊鴻說，為了找到擁有超強消化基因的白蟻，研究室內常年飼養著種類繁多的白蟻，還在室內飼養了100多個白蟻巢，其中有3個巢的年齡已經超過了19歲。此外，研究所還擁有多達3萬件白蟻標本。

通過對白蟻進行基因測序，研究人員慢慢找到了白蟻纖維素酶基因性能超強的白蟻種類。研究小組發現，乳白蟻和散白蟻兩個屬種的白蟻，它們體內白蟻纖維素酶的活性比其他白蟻種類都要出眾。

接下來，研究小組開始研究提高白蟻纖維素酶的活性的方法。因為白蟻雖然具有超強的消化木質纖維素的能力，但是在實際應用時，酶的活性越高，產出的效率也越高。經過反復的試驗，研究人員找到了提高酶活的竅門――在適當的溫度、濕度以及食物的培育下，白蟻纖維素酶的活性會變得更高。而且通過放射線的照射，這些白蟻纖維素酶的活性還能進一步提高。

篇10

1.“狼煙”的危害。①造成環境污染，危害人體健康。夏收、秋收時節，田間“狼煙四起”，城郊煙霧彌漫，對人類的呼吸道及心血管都會造成很大損害。②降低空氣的能見度，影響交通安全。秸稈燃燒起來會生成大量的白色固體煙霧，由于固體極小，所以呈粉末狀飄散，極大地降低了高速公路、機場等地方的能見度，影響交通安全。③引起火災。農田秸稈焚燒時一旦出現大火，火勢將很難控制，極容易造成巨大的經濟損失。④導致耕地生產力下降。焚燒農田秸稈會使土壤中的微生物死亡，有機質變少、板結，給農業的可持續性發展造成巨大的障礙。

2.“狼煙”屢禁不止的原因。我國《大氣污染防治法》早已禁止露天焚燒秸稈，但部分地區人們違法焚燒秸稈的情況仍然屢禁不止，我們通過在蘇北的農村調研得知，人們之所以違法焚燒秸稈主要有以下幾個原因：①隨著農村機械化程度的提高，牲畜的需要量大大減少，秸稈飼料的需求也大幅降低。②近年來農村生活水平有所提高，許多農民采用液化氣和電等清潔的生活能源，導致農作物秸稈成為“徹底的廢棄物”。③秸稈分布零散、體積蓬松，收集運輸成本高，產業化程度不高。④秸稈蠟質層較厚，“秸稈還田”后若沒有降雨，入土后無法及時腐爛分解，給后續農作物管理造成障礙。

3.廢變寶把醇產。以禁為主的措施不能從根本上解決“狼煙”問題，“狼煙”既是環境污染問題，也是資源浪費的問題。秸稈禁燒工作應當由“以禁為主”轉變為“疏禁結合”，為秸稈謀出路才是解決問題的根本辦法。

秸稈的主要成分為難以降解的纖維素、半纖維素和木質素。纖維素中的六碳糖和玉米淀粉中含有的葡萄糖一樣，可以用傳統的酵母發酵成乙醇。而半纖維素中含有的糖主要為五碳糖，傳統的酵母無法經濟地將其轉化為乙醇。纖維素乙醇技術正是利用纖維素質生物原料（如秸稈）生產乙醇燃料，這種燃料可以直接替代汽油等化石燃料，還能避免糧食作物生產的大量損耗，所以說，隨著化石資源的逐漸枯竭和環境的日益惡化，大力推廣這種可再生能源技術已經成為許多國家發展戰略的重要組成部分。

目前限制纖維素質生物原料生產纖維素乙醇的主要障礙是纖維素酶發酵活力較低、成本較高。纖維素酶是一類能夠將纖維素降解為葡萄糖的多組分酶的總稱，可催化秸稈發酵產生纖維素乙醇。為了降低酶的生產成本，美國能源局2002年為諾維信和杰能科提供資金，開發新型纖維素酶。2012年作為全球生物燃料生產用酶的最大供應商丹麥諾維信推出最新酶制劑產品Cellic CTec3（纖維素酶），最大限度地提高了纖維素酶的發酵活力，降低了成本，確保工廠以最低的總成本生產纖維素乙醇。

作為新型清潔燃料，纖維素乙醇由于能替代傳統的以糧食作物為原料的生物乙醇技術，緩解能源危機、保護環境而已得到世界各國政府、企業及研究機構的關注。自上世紀80年代中期，加拿大就開始資助纖維素乙醇研究和開發，logen公司利用麥稈、玉米稈生產纖維素乙醇。美國對纖維素乙醇項目給予政策及資金上的支持，2007年立法指令“要求到2022年每年必須提供160億加侖（美制加侖：1加侖=3.785 412 L；英制加侖：1加侖=4.546 092 L）的纖維素乙醇”，2008年“農場法案”更是為纖維單質生物燃料的發展提供了強有力的支持。意大利的M&G集團開發的一體化纖維素乙醇生產技術，在歐洲已建成年產4萬噸的纖維素乙醇的工業化示范裝置。

我國在“863計劃”中將纖維素乙醇列為研究課題。中糧集團生化能源（肇東）公司，系統地研究了玉米秸稈為原料的纖維素乙醇生產工藝，并在2006年4月在黑龍江建成了一套年產500 t的纖維素乙醇試驗裝置。該試驗裝置以玉米秸稈為原料，采用丹麥諾維信公司的纖維素酶制劑，成功地生產出纖維素乙醇。山東澤生生物科技有限公司與中國科學院過程工程研究所建立了年產3 000 t的纖維素乙醇示范工程。河南天冠燃料乙醇有限公司以玉米秸稈為原料，生產纖維素乙醇，年產量已達30萬噸。