細胞膜范文

時間:2023-04-05 20:39:53

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細胞膜

篇1

1、細胞膜是細胞表面的一層薄膜,細胞膜呈液態(tài),可以流動。

2、細胞膜的功能主要是維持細胞的一定形態(tài),對細胞起保護作用,活的細胞不斷進行新陳代謝,既可以從周圍環(huán)境當中攝入必須的營養(yǎng)物質(zhì)以及氧氣,又可以排出代謝產(chǎn)物,細胞內(nèi)外的物質(zhì)交換必須通過細胞膜。

3、細胞膜在顯微鏡下是非常清晰的,是脂質(zhì)雙層的結(jié)構(gòu),細胞膜有選擇性的讓物質(zhì)通過,它可以使某些小分子物質(zhì)透過,而對一些有害的物質(zhì)或大分子物質(zhì)限制通過,保持細胞內(nèi)物質(zhì)的穩(wěn)定。

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篇2

【摘要】 目的: 研究γ射線輻照對β淀粉樣肽(Aβ)誘導的紅細胞膜損害的保護作用. 方法: 紅細胞經(jīng)50 Gy和100 Gy γ射線照射后,再用Aβ處理,分別用分光光度法測定紅細胞溶血率和滲透脆性;掃描電鏡觀察細胞形態(tài);1,6二苯基1,3,5己三烯(DPH)熒光探針標記檢測細胞膜流動性. 結(jié)果: γ射線輻照可抑制紅細胞的自然溶血和Aβ導致的溶血,但只有100 Gy輻照的差異具有統(tǒng)計學意義(P

【關(guān)鍵詞】 γ射線; 淀粉樣β蛋白; 紅細胞; 溶血; 膜流動性

0引言

低劑量γ射線輻照(

1材料和方法

1.1材料新鮮全血取自健康志愿者,枸醛酸抗凝;Aβ和熒光探針1,6二苯基1,3,5己三烯(diphenylhexatriene, DPH)(美國SigmaAldrich公司);其它試劑均為國產(chǎn)分析純. 1240型紫外可見分光光度計 (日本島津公司);LS55型熒光分光光度計(美國PerkinElmer公司);3k30型冷凍離心機(美國Sigma公司);Gammacell R 1000型血液輻照儀 (加拿大Nordian公司);Quanta 200型環(huán)境掃描電鏡(荷蘭PhilipsFEI公司).

1.2方法

1.2.1紅細胞的制備和輻照處理取新鮮全血750 g,4℃離心10 min,吸去上層血漿和白細胞,并用等滲PBS(150 mmol/L NaCl,2.7 mmol/L KCl,10 mmol/L Na2HPO4,2 mmol/L NaH2PO4,pH 7.4)洗滌3次,制備成200 mL/L細胞懸液,然后用γ射線照射,照射劑量分別為0,50和100 Gy.

1.2.2紅細胞溶血率的檢測照射過后的紅細胞懸液用等滲PBS稀釋至20 mL/L,加入Aβ使其終濃度為5 mg/L,37℃水浴30 min后取出,750 g,4℃離心10 min,取上清, 540 nm處測出吸光度值A(chǔ)1;沉積紅細胞用蒸餾水全溶血后離心,用同樣方法測得吸光度值A(chǔ)2. 按下式計算溶血率:溶血率(%) = A1/(A1+A2)× 100%.

1.2.3掃描電鏡觀察紅細胞形態(tài)處理過的紅細胞經(jīng)終濃度為10 g/L戊二醛固定,用500,700,900,1000 mL/L丙酮系列脫水,噴金后進行掃描電鏡觀察.

1.2.4紅細胞的滲透脆性測定紅細胞分為未照射組,50 Gy照射組和100 Gy照射組. 配制不同滲透壓的PBS,其中NaCl的濃度為0~135 mmol/L,在上述PBS中分別加入各組紅細胞懸液,細胞終濃度為2 mL/L,37℃水浴30 min,取出后以1.3.2中的方法分別測溶血率,以NaCl濃度分別為135 mmol/L和0 mmol/L的PBS為對照和全溶血對照,計算50%溶血時的NaCl濃度.

1.2.5紅細胞膜流動性的檢測用四氫呋喃作溶劑配制2×10-3mol/L的DPH儲存液,于棕色瓶中4℃低溫保存. 工作液濃度為5×10-5mol/L,臨用前用等滲PBS稀釋. 紅細胞用等滲PBS稀釋至2 mL/L濃度,與DPH工作液等體積混合,于37℃水浴孵育45 min后,檢測偏振熒光(激發(fā)光波長為362 nm,發(fā)射光波長為450 nm).

統(tǒng)計學處理: 用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進行處理,實驗數(shù)據(jù)以x±s表示,多個樣本均數(shù)比較采用方差分析及t檢驗.

2結(jié)果

2.1紅細胞的溶血率在未經(jīng)輻照處理的情況下,等同實驗操作可使紅細胞發(fā)生少量溶血(溶血率

2.2紅細胞形態(tài)未經(jīng)γ射線輻照的紅細胞,Aβ處理后形態(tài)發(fā)生明顯改變,部分細胞出現(xiàn)棘突,并伴隨有細胞的輕度聚集;經(jīng)過γ射線照射后,Aβ處理的紅細胞中變形的細胞比例減小,聚集程度相對降低,形態(tài)維持較好. 說明γ射線照射對紅細胞維持正常形態(tài)有一定的作用(圖1).

A: 對照組; B: 未加入Aβ,輻照劑量為50 Gy; C: 未加入Aβ,輻照劑量為100 Gy; D: 未經(jīng)輻照處理的RBC加入Aβ; E: 加入Aβ,輻照劑量為50 Gy; F: 加入Aβ,輻照劑量為100 Gy.

圖1紅細胞形態(tài)的掃描電鏡觀察×2000(略)

2.3紅細胞的滲透脆性紅細胞的滲透脆性反映了細胞對低滲溶液的耐受性. 經(jīng)過γ射線照射的紅細胞與未照射組相比較,細胞膜的滲透脆性有下降趨勢,未照射組,50 Gy和100 Gy照射組在50%溶血時對應(yīng)的NaCl濃度分別為82.3 mmol/L,80.7 mmol/L和78.9 mmol/L,說明紅細胞在這一滲透壓范圍內(nèi)隨著照射劑量的升高,其低滲耐受性有所提高,細胞膜在低滲環(huán)境下的穩(wěn)定性增加.

2.4紅細胞膜流動性偏振條件下DPH熒光的各向異性值可反映細胞膜的流動性,各向異性值越低,其膜的流動性越高. 實驗結(jié)果顯示,加入Aβ后各向異性值變化很小(P>0.05 ),說明Aβ幾乎不影響細胞膜的流動性. 紅細胞經(jīng)50 Gy和100 Gy γ射線照射后,DPH熒光的各向異性值降低,50 Gy和100 Gy照射組與對照組(0.36±0.02)相比較分別降低至(0.29±0.01)和(0.26±0.01),細胞膜流動性有所提高(P

3討論

γ射線的生物學效應(yīng)與其劑量有關(guān). 在本研究的實驗條件下,經(jīng)50 Gy和100 Gy兩個劑量的γ輻照處理之后,紅細胞的自身溶血作用和Aβ誘導的溶血作用均有所降低,說明該劑量范圍的γ輻射具有穩(wěn)定細胞膜的作用. 細胞正常形態(tài)的維持依賴于細胞膜及膜骨架的支持,因此細胞形態(tài)可以反映細胞膜的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性的變化. Aβ作用于紅細胞后,部分紅細胞發(fā)生棘突,形態(tài)改變,增加了膜融合和形成非專一性離子通道的可能性. 這提示Aβ的溶血作用與細胞膜的損害有關(guān). 而γ輻射能夠降低這種損害作用,使紅細胞維持正常的形態(tài),減小了Aβ的溶血作用. 我們認為,γ輻射的這種作用除了與膜蛋白的構(gòu)象變化有關(guān)以外,還在一定程度上與細胞膜的流動性增加有關(guān). 已有研究[6]表明,Aβ的細胞毒性的分子機制之一是Aβ通過在膜上的自聚集而形成非專一性離子通道,從而破壞細胞膜結(jié)構(gòu). 當膜的流動性降低時,如增加膜中的膽固醇含量或者減少不飽和脂肪酸的比例等,Aβ對細胞膜的損害會增強[7]. 這與本研究中γ輻照增加細胞膜流動性,同時降低Aβ誘導的膜損害的結(jié)果是一致的. 值得指出的是,經(jīng)γ輻射處理的紅細胞,僅在數(shù)小時內(nèi)具有抑制Aβ溶血的作用.

綜上所述,在一定的劑量范圍內(nèi)(30 Gy~100 Gy)的γ輻射能夠降低Aβ導致的紅細胞損傷. 通過對50 Gy和100 Gy兩個輻照劑量的比較發(fā)現(xiàn),100 Gy輻照的保護作用更強. 這兩個劑量的輻照能夠提高細胞膜的流動性,使細胞維持正常形態(tài). 這些結(jié)果為進一步研究Aβ的細胞毒性機制和γ輻射對細胞的作用提供了依據(jù).

【參考文獻】

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篇3

細胞膜上鈉泵活動的生理意義是建立起一種勢能貯備、保持滲透壓。鈉鉀泵又稱“鈉泵”或“鈉鉀ATP酶”,使細胞外的NA+濃度高于細胞內(nèi),當NA+順著濃度差進入細胞時,會經(jīng)由本體蛋白質(zhì)的運載體將不易通過細胞膜的物質(zhì)以共同運輸?shù)姆绞綆爰毎?/p>

鈉鉀泵(也稱鈉鉀轉(zhuǎn)運體),為蛋白質(zhì)分子,進行鈉離子和鉀離子之間的交換。每消耗一個ATP分子,逆電化學梯度泵出三個鈉離子和泵入兩個鉀離子。保持膜內(nèi)高鉀膜外高鈉的不均勻離子分布。鈉鉀泵的一個特性是他對離子的轉(zhuǎn)運循環(huán)依賴自磷酸化過程,與之相類似的還有鈣泵和質(zhì)子泵,它們組成了功能與結(jié)構(gòu)相似的一個蛋白質(zhì)家族。

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篇4

目的: 探討低濃度α生育酚對神經(jīng)元細胞膜的保護作用. 方法: 培養(yǎng)SD胎鼠皮層神經(jīng)元細胞作為實驗對象. 將神經(jīng)元細胞進行分組:正常對照組、氧自由基損傷組和不同濃度α生育酚處理組(10,20,40和80 mg/L). 用Fenton反應(yīng)對神經(jīng)元細胞膜造成損傷. 在損傷后1及2 h分別對各組神經(jīng)元進行PI染色,利用激光共聚焦顯微鏡觀察神經(jīng)元細胞膜的損傷情況,并用TBA法檢測神經(jīng)元細胞外液中丙二醛(MDA)生成量. 結(jié)果: 80 mg/L濃度α生育酚可減少氧自由基對神經(jīng)元細胞膜的損傷, 且可減少MDA生成量. 結(jié)論: 80 mg/L濃度α生育酚可以有效對抗氧自由基對神經(jīng)元細胞膜的損傷.

【關(guān)鍵詞】 α生育酚 神經(jīng)元 細胞膜 低濃度

0引言

氧自由基是引起顱腦損傷等多種中樞神經(jīng)疾病繼發(fā)損傷的重要因素. 而維生素E是一種天然的抗氧自由基物質(zhì). 維生素E共包括8種分子,其中α生育酚為公認抗氧自由基最有效的[1]. 在近年的研究中,已證實α生育酚可阻止氧自由基對細胞膜中多不飽和脂肪酸及膜蛋白的攻擊,防止細胞膜功能的喪失[2]. 然而國內(nèi)外學者對應(yīng)用多大濃度的α生育酚才可有效保護細胞膜有很大分歧. 本實驗我們利用Fenton反應(yīng)形成氧自由基對胚胎大鼠皮層神經(jīng)元的損傷,觀察低濃度α生育酚對神經(jīng)元細胞膜的保護作用.

1材料和方法

1.1材料α生育酚、碘化吡啶(PI)染料(Sigma公司,美國);2.5 g/L胰蛋白酶、0.2 mol/L EDTA、各種細胞培養(yǎng)液(GibcoBRL公司,美國);MDA檢測盒,購于南京建成生物公司;300 mL/L雙氧水,硫酸亞鐵,維生素C和無水乙醇,均為國產(chǎn)分析純. 孕14 d的SD大鼠2只,購自中國軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心. TE200E型激光共聚焦顯微鏡觀察( NIKON公司, 日本);TG150型二氧化碳培養(yǎng)箱(Jouan公司,法國);CR22G型離心機(日立公司,日本);UV240型紫外分光光度計(島津公司,日本).

1.2方法

1.2.1α生育酚水溶液配制取α生育酚10 mg溶于1 mL無水乙醇中,將無水乙醇緩慢滴入49 mL 30℃去離子水中,制成200 mg/L α生育酚水溶液母液備用. 碘化吡啶染料配制:將碘化吡啶粉末以去離子水溶解為終濃度為1 mg/L工作液.

1.2.2SD大鼠皮層神經(jīng)元分離及培養(yǎng)將實驗大鼠斷頸處死,取胚胎腦皮層組織,剪碎,用2.5 g/L胰蛋白酶和0.2 mmol/L EDTA,令其分散成單細胞懸液,過200目不銹鋼網(wǎng),于37℃, 50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng). 隔日換液. 培養(yǎng)到第4日,細胞懸液于離心機中以1000 r/min速度離心10 min,去沉淀細胞,加入神經(jīng)元培養(yǎng)液,接種于涂有鼠尾膠原的25 cm×25 cm細胞培養(yǎng)瓶中,使干細胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元,隔天換藥一次,第6日使用.

1.2.3實驗分組將所有神經(jīng)元培養(yǎng)瓶進行分組,共分為:正常對照組;氧自由基損傷組;不同濃度α生育酚處理組(10, 20, 40和80 mg/L亞組,與神經(jīng)元作用1 h后備用).

1.2.4利用Fenton反應(yīng)造成神經(jīng)元氧自由基損傷按照Yamazaki等[3]方法,在培養(yǎng)皿中加入硫酸亞鐵、維生素C和300 mL/L雙氧水,使溶液中硫酸亞鐵終濃度為0.2 mmol/L,維生素C終濃度為0.2 mmol/L,雙氧水終濃度為0.4 mmol/L,制作氧自由基損傷模型.

1.2.5PI染色按照袁蘭等[4]方法,將PI粉末以去離子水溶解為終濃度1 mg/L工作液. 將氧自由基損傷組及α生育酚處理組及正常組培養(yǎng)瓶中加入試劑后,立即開始計時,并取反應(yīng)開始后1和2 h培養(yǎng)瓶中的神經(jīng)元進行PI染色,將PI工作液100 μL均勻滴在神經(jīng)元細胞上,置于暗室中染色15 min,用pH 7.0 PBS液沖洗3遍.

1.2.6激光共聚焦顯微鏡觀察細胞形態(tài)激光共聚焦顯微鏡熒光激發(fā)波長為567 nm,發(fā)射光波長大于590 nm,偽彩色采用紅色,在保證信噪比的情況下盡量增大檢測的pinhole和PMT. 選定5個圖像清晰的視野,在200倍鏡下觀察. 細胞紅染者為細胞膜損傷細胞,未染色者為正常細胞[4]. 每個視野隨機計數(shù)100個神經(jīng)元,記錄其中有細胞膜損傷的神經(jīng)元數(shù),共記錄5個視野內(nèi)神經(jīng)元,計算平均值.

1.2.7MDA測定采用MDA檢測盒,結(jié)合紫外分光光度計,按照TBA法分別檢測各組神經(jīng)元培養(yǎng)瓶中溶液的MDA濃度. 每一次取0.1 mL溶液檢測,每瓶測值為該瓶溶液的MDA濃度.

統(tǒng)計學處理:所有數(shù)據(jù)以x±s表示,多個樣本間均數(shù)比較用方差分析,用StudentNewmanKeuls(SNK)法進行多組間兩兩比較. P

2結(jié)果

2.1神經(jīng)元細胞膜損傷分析正常對照組只有極少熒光染色陽性細胞,而損傷組和α生育酚處理組均有熒光染色陽性細胞(圖1,2). α生育酚濃度為正常生理濃度10 mg/L時,不能有效消除Fenton反應(yīng)所造成的氧自由基損傷. 而當α生育酚達到80 mg/L時,細胞膜損傷的神經(jīng)元總數(shù)減少,有統(tǒng)計學意義.

2.2MDA結(jié)果分析80 mg/L α生育酚處理組MDA產(chǎn)生量低于單純氧自由基損傷組(表2),但仍高于正常對照組.表1碘化吡啶染色結(jié)果比較表2不同處理組的MDA值比較

3討論

氧自由基對于細胞膜有很多的損害[5],所以,抗氧自由基治療是減少顱腦損傷等病理狀況下神經(jīng)元損傷的重要手段.

α生育酚與氧自由基反應(yīng)后,生成α生育醌,減少氧自由基與其他分子反應(yīng)[2]. α生育酚為脂溶性,血漿濃度為5~10 mg/L. 在細胞膜中,維生素E與不飽和脂肪酸的比例為1∶1000,可以有效地消除正常生理狀況產(chǎn)生的氧自由基對細胞膜的損傷. 在病理情況下,氧自由基大量產(chǎn)生,5 min內(nèi)即可使血漿內(nèi)的α生育酚濃度大幅下降,不能有效的對抗氧自由基的損傷[6]. 因此,早期補充α生育酚減少氧自由基對細胞的損傷,成為人們較感興趣的治療策略.

De Jesus Ferreira等[7]主張保護細胞膜的α生育酚濃度應(yīng)達到1 g/L,才能有效對抗氧自由基的破壞作用. Sperling等[8] 甚至提出可用100 g/L濃度的α生育酚進行神經(jīng)元保護是可行的方案. 賈麗紅等[9]在對神經(jīng)膠質(zhì)細胞試驗中,認為50 mg/L α生育酚即可起到抗氧化的保護作用. 而國內(nèi)尚少有低濃度α生育酚對神經(jīng)元保護作用的報道. 從本試驗可以看出,正常血漿濃度8~10倍的α生育酚即可產(chǎn)生較為明顯的神經(jīng)元細胞膜保護作用,細胞膜脂質(zhì)多不飽和脂肪酸氧化產(chǎn)物MDA也小于單純氧自由基損傷組. 而且,80 mg/L α生育酚組在損傷后2 h存在細胞膜損傷的神經(jīng)元為(41.5±5.9)個,少于損傷后1 h存在細胞膜損害的神經(jīng)元(66.0±7.3)個. 這種現(xiàn)象是否意味著α生育酚可促使損傷細胞膜發(fā)生自我修復改變,尚需深入研究. 低濃度α生育酚的治療作用對于臨床應(yīng)用較有意義. 因為現(xiàn)今應(yīng)用α生育酚進行動物試驗,多采用口服及腹腔注射兩種方法. 而生物體內(nèi)的α生育酚主要存在于肝臟,不能自由穿過血腦屏障,所以這兩種方法均不能使腦組織中的α生育酚濃度達到很高濃度. Naziroglu等[10]采用口服800 mg,僅能使血漿中α生育酚達到21 mg/L,腹腔注射160 mg/kg α生育酚后,血漿中α生育酚可達到類似結(jié)果. Cherdyntseva等[11]在研究中發(fā)現(xiàn),給與SD大鼠標準腹腔注射量α生育酚(600 mg/kg)每天進行腹腔注射,只能使血漿中α生育酚濃度達到80 mg/L. 高濃度的α生育酚在以往的實驗中顯示可以使氧自由基對神經(jīng)元損傷減少到較低的程度[8-9]. 但在當今條件下,臨床無法達到使腦組織和血漿中α生育酚達到至1 g/L的水平,而且,如此高濃度的α生育酚在腦組織中是否會引起不良反應(yīng)尚無定論. 相反,在顱腦損傷等情況下,血腦屏障受到損傷,則可很容易地使傷區(qū)腦組織中α生育酚濃度達到接近80 mg/L的水平,從而達到治療目的. 這使臨床應(yīng)用α生育酚治療顱腦損傷等神經(jīng)系統(tǒng)疾病成為可能.

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篇5

[關(guān)鍵詞] 植物細胞膜穩(wěn)態(tài)劑;抗病能力;水稻產(chǎn)量;經(jīng)濟效益

植物細胞膜是一層有選擇性通透作用的薄膜,它使細胞能從外部環(huán)境不斷地取得所需要的水分、無機鹽和其他必須的物質(zhì),而又阻止有害物質(zhì)的進入;該產(chǎn)品能增強植物細胞膜的穩(wěn)定性,提高農(nóng)作物抗病能力,有效控制由細菌、真菌和病毒引起的多種農(nóng)作物病害。對于干旱、低溫、鹽堿等逆境因子對農(nóng)作物造成的不利影響有抵御作用,改善品質(zhì),增加產(chǎn)量和經(jīng)濟效益。

一、試驗區(qū)概況及試驗方法

1.試驗區(qū)概況

試驗區(qū)位于遼寧省盤山縣壩墻子鎮(zhèn)。土壤為粘質(zhì)鹽漬型水稻土,氣候?qū)倥瘻貛Т箨懶园霛駶櫦撅L氣候區(qū),年平均氣溫8.9℃,≥5℃活動積溫3551度,≥10℃活動積溫3509度,年降水量633.6 mm,蒸發(fā)量1551.7 mm,無霜期171d。全年太陽能總輻射量137.9kcal/cm2,生理輻射量69.6 kcal/cm2,其中作物生育期(4月~9月)生理輻射量43.9kcal/cm2。

2.試材

試區(qū)土壤為粘質(zhì)鹽漬型水稻土,耕層有機質(zhì)含量15.4g/㎏,全氮(N)0.101g/㎏,堿解氮60.037mg/㎏,有效磷(P)9.2 mg/㎏,有效鉀(K)85.8mg/㎏,pH值8.25。供試水稻品種為遼星1號;肥料為土圈糞(0.2—0.18—0.70),尿素,遼寧津大肥業(yè)有限公司生產(chǎn)的“津大盛源”牌一次性螯合肥(16-14-10),山東天達生物制藥股份有限公司生產(chǎn)的天達2116植物細胞膜穩(wěn)態(tài)劑(簡稱天達2116)。

3.試驗內(nèi)容

試驗設(shè)水稻葉面噴施天達2116和對照(CK)2個處理,4次重復,單行式順序排列,秧田小區(qū)面積為1.5㎡,本田小區(qū)面積為66.7㎡。小區(qū)間筑田埂,設(shè)保護行,實行單排單灌。水稻葉面噴施天達2116處理于秧田2葉1心時用天達2116(壯苗靈)600倍液葉面噴霧1次,本田分蘗始期用天達2116(壯苗靈)600倍液葉面噴霧1次,拔節(jié)期、乳熟期各用天達2116(糧食專用型)600倍液葉面噴霧1次;對照秧、本田水稻噴清水。

4.水稻栽培

2009年4月17日水稻薄膜保溫隔離層旱育苗,6月3日插秧,密度為29.7㎝×13.2㎝,每穴3株~4株。插秧時田間保持水層3cm~5cm;插后至分蘗期保持5cm~6㎝左右;分蘗至成熟期根據(jù)稻株高度確定每次灌水深度在6cm~8cm,灌后自然滲漏至田面呈現(xiàn)花泥水再灌下一次水,后水不見前水,循環(huán)交替補水;水稻成熟后自然落干。

5.調(diào)查、考種及測產(chǎn)

5月27日秧田每小區(qū)隨機取20株,調(diào)查秧苗素質(zhì)。10月10日本田每小區(qū)用對角線法取2點,每點1㎡,考種、測產(chǎn),同時調(diào)查稻曲病發(fā)生株數(shù)。

二、結(jié)果與分析

1.秧苗素質(zhì)分析

水稻秧苗素質(zhì)調(diào)查、測定結(jié)果:秧田期葉面噴施天達2116(壯苗靈),株高比對照增加1.3㎝,葉齡增加0.4片,葉寬增加1.4㎜,白根數(shù)增加3.7條,莖基寬增加1.1㎜,百株干重增加2.7g,充實度增加1.3(mg/㎝),株高變異系數(shù)降低1.34,秧苗長勢好。

2.稻曲病調(diào)查分析

稻曲病調(diào)查調(diào)查結(jié)果:水稻秧、本田葉面噴施天達2116,稻曲病發(fā)生率為0.5‰,比對照1.0‰降低0.5‰。

3.水稻經(jīng)經(jīng)濟性狀及產(chǎn)量分析

水稻經(jīng)濟性狀及產(chǎn)量分析結(jié)果:水稻秧、本田葉面噴施天達2116,每㎡穗數(shù)比對照增加11穗,每穗成粒數(shù)增加7粒,水稻產(chǎn)量增加56.3㎏/667㎡,增產(chǎn)9.3%(表1)。

水稻葉面噴施天達2116和對照兩個處理小區(qū)平均產(chǎn)量差異顯著性檢驗結(jié)果:自由度=6,t(2.83)>t0.05(2.45),處理間差異顯著。表明水稻葉面噴施天達2116有增產(chǎn)作用。

4.經(jīng)濟效益分析

天達2116按2.50元/25g和水稻2.20元/㎏計算經(jīng)濟效益,水稻葉面噴施天達2116比對照增加經(jīng)濟效益116.36元/667㎡(表2)。

篇6

對于血瘀證研究而言,雖然有關(guān)中醫(yī)宏觀辨證和西醫(yī)微觀辨證的沖突方面的爭論一直存在,但不可否認的是作為目前中西醫(yī)研究銜接較好的證候,有關(guān)血瘀證在血液流變學、微循環(huán)、血液動力學方面的異常已得到公認。因此,以氣虛血瘀大鼠模型,從血液流變學及紅細胞膜組分變化探討少腹逐瘀湯改善氣虛血瘀的作用機制,為血瘀證相應(yīng)方藥藥理作用及作用機制的研究提供更為客觀的依據(jù)。

材料

1. 動物 清潔級雄性Wistar老齡大鼠40只,雌雄各半,體質(zhì)量(27519)g,由黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供[動物合格證號SCXK(黑)2008004]。

2. 藥物 少腹逐瘀湯由當歸9g,赤芍6g,川芎6g,延胡索3g,蒲黃9g,干姜3g,肉桂3g,小茴香1.5g,沒藥3g,五靈脂6g 組成,上述十味藥,加10倍量水浸泡0.5h,加熱回流煎煮2次,第1次1.5h,第2次1.0h,合并煎煮液,濃縮成濃度為4.8g/kg的少腹逐瘀湯備用。

3. 儀器 Anthos 2010酶標儀(鄭州博賽生物工程有限責任公司),BECKMAN低溫超速離心機(美國貝克曼庫爾特有限公司),LBY-N6B型血液黏度儀(北京普利生儀器有限公司),LBY-BX型紅細胞變形儀(北京普利生儀器有限公司),TGL-16G型高速臺式離心機(上海醫(yī)用分析儀器廠),Waters 2695高效液相色譜儀(美國Waters公司),蒸發(fā)光散射檢測器ELSD2000(美國Alltech公司),LBY-XC全自動動態(tài)血沉測試儀(北京普利生儀器有限公司)。

4 . 試 劑 巰 基(南 京 建 成 生物工程研 究 所,批號20120503);唾液酸(由南京建成生物工程研究所,批號20120503);丙二醛(malonaldehyde, MDA)(南京建成生物工程研究所,批號20120423);Na+-K+-ATP酶(南京建成生物工程研究所,批號20120428)。

方法

1. 分組及給藥 40只大鼠按體質(zhì)量隨機分為4組,即少腹逐瘀湯高劑量組(4.8g生藥/kg)、少腹逐瘀湯低劑量組(1.2g生藥/kg)、模型組(蒸餾水)和空白組(蒸餾水)。其中除空白組給予正常飲食飲水外,正式造模前1d禁食不禁水,之后每天置于水深(301)cm,水溫(402)℃水槽中,力竭游泳。當大鼠出現(xiàn)自然下沉(頭沒入水面超過5s)為終止信號,將大鼠取出烘干。每天力竭游泳后再給正常飲食量的1/3飼養(yǎng),每天每只大鼠按照40g/kg喂食,每日1次,連續(xù)14d。末次造模后禁食不禁水12h。

2. 紅細胞膜的制備 取新鮮肝素抗凝血2mL以及枸櫞酸鈉抗凝血6mL。其中枸櫞酸鈉抗凝血以3 000r/min離心10min,棄上清液,除去中間的白細胞和血小板層,再以1∶3比例加入等滲pH值7.4 PBS,3 000r/min離心10min,棄上清液,反復洗滌3次,最終得到干凈的紅細胞。按照1∶80比例向紅細胞中加入預(yù)冷的5mmol/L pH值7.4 Tris-HCl溶液,同時加入0.1mmol/L蛋白酶抑制劑PMSF(對甲苯磺酰氟),超聲15min(80Hz,20℃),放入4℃冰箱過夜使其充分溶血。紅細胞溶血液以15 000r/min離心10min,棄上清液,加入5mmol/L pH值7.4 Tris-HCl溶液以15 000r/min離心10min,反復洗滌3次,最后得到乳白色膜,將其1∶1懸浮在PBS溶液中,膜蛋白定量后置于低溫冰箱備用。

3. 血液流變學指標檢測

3.1 全血黏度的測定:取肝素抗凝血1mL,用LBY-N6B型血液黏度儀測定全血黏度。

3.2 血漿黏度的測定:取肝素抗凝血1mL離心(3 000r/min,10min),取血漿用于血漿黏度測定。

3.3 紅細胞變形性的測定:取肝素抗凝血20L,加入15%PVP懸浮液1mL中混勻,吸取500L采用LBY-BX型紅細胞變形儀進行測定,剪切參數(shù)分別為600、800、1000s-1。

4. 紅細胞膜組分變化

4.1 紅細胞膜膽固醇含量測定 取制備好的紅細胞膜液0.5mL,加入2.5mL提取液(氯仿∶甲醇=2∶1),向膜液中每加入0.5mL渦旋振蕩器劇烈振蕩混勻,直至全部加完后,避光室溫靜置2h,取下層有機層2mL,作為供試品溶液。

4.2 紅細胞膜Na+-K+-ATP酶活性測定 采用比色法測定紅細胞膜上Na+-K+-ATP酶活性。

4.3 紅細胞膜唾液酸及巰基含量測定 根據(jù)試劑盒說明書檢測紅細胞膜上唾液酸及巰基含量。

4.4 紅細胞膜MDA水平檢測 根據(jù)試劑盒說明書檢測紅細胞膜上MDA水平。

5. 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 16.0軟件處理所得數(shù)據(jù),選用One-way ANOVA進行統(tǒng)計分析,數(shù)據(jù)以x-s表示。以P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

1. 造模前后大鼠身體表征及體質(zhì)量變化 見表1。造模后,模型組大鼠體質(zhì)量顯著下降,毛色暗淡無光易脫落,倦怠,便溏。與自身造模前比較,模型組及給藥組體質(zhì)量均明顯下降(P0.01);空白組體質(zhì)量顯著上升(P0.01)。

2. 對氣虛血瘀大鼠血液流變學指標的影響 見表2。與空白組比較,模型組大鼠全血黏度及血漿黏度顯著升高(P0.05,P0.01),紅細胞變形指數(shù)顯著降低(P0.01)。少腹逐瘀湯高劑量能夠顯著降低3s-1、30s-1和200s-1切變率下全血黏度(P0.01,P0.05),降低血漿年度(P0.01)。

3. 紅細胞膜組分變化 結(jié)果見表3。與空白組比較,氣虛血瘀組Na+-K+-ATP酶活力、唾液酸含量及巰基含量均顯著降低(P0.05,P0.01),MDA含量和膜膽固醇含量均顯著升高(P0.05);與模型組比較,少腹逐瘀湯高劑量組可顯著升高Na+-K+-ATP酶活力、唾液酸含量以及巰基含量(P0.05),低劑量組顯著降低MDA含量(P0.01)。

討論

篇7

目的探討健脾活血方對2型糖尿病胰島素抵抗(insulin resistance,ir)大鼠肝細胞膜胰島素受體(insulin receptor,insr)mrna表達的改善作用及機理。方法取wistar大鼠60只,雌雄各半,采用鏈脲佐菌素(streptozotocin,stz)加高脂飲食造成2型糖尿病胰島素抵抗大鼠模型。設(shè)空白組、模型組、健脾活血方低劑量組、健脾活血方高劑量組和羅格列酮組,以rt-pcr法檢測大鼠肝細胞膜insr mrna的表達。結(jié)果健脾活血方高劑量組大鼠肝臟insr mrna的表達與羅格列酮組相當,與模型組比有顯著性差異(p<0.01)。結(jié)論健脾活血方能夠上調(diào)大鼠肝細胞膜insr mrna的表達,從而改善胰島素抵抗。

【關(guān)鍵詞】   健脾活血方 2型糖尿病大鼠 肝細胞膜insr

abstract:objectiveto explore the effect of strengthening spleen and activating blood prescription on expressions of insulin receptor gene in the liver membrane of type 2 diabetes mellitus rats and its mechanism.methods60 wistar rats ,half male and half female, were randomly devided into five groups: normal control group,model group, strengthening spleen and activating blood prescription lowdose group and highdose group, and rosiglitazone group. the model of insulin resistance of type 2 diabetebes mellitus was established by stz injection and high-fat diet. expression of insulin receptor gene in liver membrane was detected.resultsthe expressions of liver insulin receptor gene in strengthening spleen and activating blood prescription high dose group was the same with rosiglitazone group. there were significant differences compared with model group (p<0.01). conclusionstrengthening spleen and activating blood prescription can up-regulate the expressions of liver insulin receptor gene in type 2 diabetic rats, and improve insulin resistance.

key words:strengthening spleen and activating blood prescription;  type 2 diabetes mellitus rats;  liver membrane insulin receptor;  experimental research

    目前普遍認為,ir與ins分泌缺陷是2型糖尿病的發(fā)病基礎(chǔ),其中ir是貫穿于2型糖尿病發(fā)生、 發(fā)展 的全過程的重要因素,ir被認為是基因與環(huán)境間相互作用的結(jié)果[1~3],已經(jīng)證實有不同種族的許多基因與2型糖尿病的發(fā)生有關(guān)聯(lián),這些后選基因包括:胰島素基因、insr基因等[4,5] 。它們通過影響胰島素信號傳遞和葡萄糖利用等機制在ir的發(fā)生發(fā)展中起作用[6]。本研究將從分子水平探討健脾活血方對肝細胞膜insr mrna表達的改善作用和機理。

1    材料與儀器

1.1    動物wistar大鼠60只,雌雄各半,體重220~240 g,清潔級,由黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。

1.2  藥物健脾活血方由人參、黃芪、三七、丹參、生地等組成。飲片購自哈爾濱世一堂制藥廠。將以上中藥按配方煎成200%的藥液(即每毫升藥液含2 g原生藥材煎出物),冷卻后密封,4℃保存?zhèn)溆茫涣_格列酮:太極涪陵制藥有限公司,批號0511020。試驗動物用藥0.20 g/kg,臨用前將羅格列酮用蒸餾水配制成混懸液,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3  試劑抗胰島素受體 β亞單位抗體和抗 β-actin抗體:博士德公司;rt-pcr試劑盒:美國 promega公司;上、下游引物來源于美國生物信息中心(ncbi),引物設(shè)計使用primer5.0軟件設(shè)計,上海捷倍思基因技術(shù)公司合成;胰島素放射免疫分析藥盒(fr-fj-021):北京市福瑞生物工程公司;stz:sigma公司;β-actin (長度540 bp)5'-gtcacccacactgtgcccatc-3';肝細胞膜insr上游引物(長度370bp) 5'-ccggcgtggc gtgctctgat-3';肝細胞膜insr下游引物 (長度370bp) 5'-atgatcacagactacctgct-3'。

1.4  儀器數(shù)字凝膠成像系統(tǒng)chemi imager4000(algpha innotech corporation):美國安來公司 ;du640核酸分析儀:美國生產(chǎn);電泳凝膠圖象分析系統(tǒng) :backman公司;血糖儀及試紙:美國強生公司。

2  方法

2.1    動物分組與處理造模參照 文獻 方法[7]加以改造,將60只 wistar大鼠給予基礎(chǔ)飼料及自來水適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。第2周,將大鼠隨機分為兩組。空白組12只給予基礎(chǔ)飼料,飲用自來水;造模組48只喂高脂飼料,飲用自來水。兩組鼠分別喂養(yǎng)8周。第10周開始,造模組按體重25 mg/kg一次性腹腔注射0.25% stz(溶于0.1 mmol/l檸檬酸緩沖溶液,ph4.4);空白組腹腔注射等體積0.lmmol/l、ph4.4枸椽酸鹽緩沖液。禁食12 h。除空白組12只鼠外,造模組斷尾采血,挑選空腹血糖≥11.1 mmol/l的大鼠,共有40只大鼠進入實驗。造模組根據(jù)體重隨機分為4組,即模型組、中藥高劑量組、中藥低劑量組、羅格列酮組。空白組大鼠和模型組大鼠灌胃給予蒸餾水;高劑量組和低劑量組給予健脾活血方,分別為16 g/kg和8 g/kg,羅格列酮組按0.20 g/kg的劑量灌胃羅格列酮組混懸液,連續(xù)給藥2周后,處死大鼠,取出肝臟,于低溫冰箱(mdf-u50v型)中保存?zhèn)溆谩U麄€實驗過程中,模型組大鼠死亡2只,中藥低劑量組大鼠死亡1只。

2.2  檢測指標及方法

2.2.1    空腹血糖(fbg)測定給藥前及給藥2周后,大鼠禁食12 h,斷尾采血。用血糖儀測定血糖。

2.2.2    空腹胰島素(fins)測定給藥前及給藥2周后,大鼠禁食12 h,眼眶靜脈叢取血5 ml,用lg-10a 離心機37℃恒溫離心(2 500 r/min,10 min)15 min,取血清,采用放射免疫雙抗體法測定。

2.2.3    胰島素敏感性指數(shù)(isi)isi=ln[1/(fins×fbg)][8]

2.2.4   肝細胞膜 insr mrna的表達rt-pcr法檢測。

2.2.5  統(tǒng)計方法數(shù)值以±s表示,用stata 7.0軟件 計算 。p﹤0.01,p﹤0.05為差異具有顯著性。

3  結(jié)果

3.1  對大鼠fbg,fins,isi的影響結(jié)果顯示,造模后,各組大鼠fbg、fins顯著升高,isi顯著下降,與空白組相比,有顯著性差異(p<0.01),說明造模成功。給藥后,各組大鼠血糖下降,其中以羅格列酮組療效最顯著,與模型組比,有顯著性差異(p<0.01);健脾活血方組與模型組比有明顯差異(p<0.05),且健脾活血方高劑量組較低劑量組療效顯著,但其降血糖作用不及羅格列酮。經(jīng) 治療 后,各組大鼠fins均下降,isi提高,其中以中藥高劑量組和羅格列酮組改善最為顯著,與模型組比有顯著性差異(p<0.01),中藥高劑量組與羅格列酮組比較無統(tǒng)計學意義。見表1~2。表1  給藥前大鼠fbg,fins,isi(略)表2  給藥后大鼠fbg,fins,isi(略)與模型組比較,﹡﹡p<0.01,﹡p<0.05

3.2  對大鼠肝臟細胞膜insr mrna表達的影響rt-pcr產(chǎn)物在瓊脂糖電泳凝膠紫外燈下均可見:各β-actin電泳條帶亮度一致,擴增片段均為300bp。肝臟insr mrna的500bp片段,但各組電泳條帶亮度有明顯差異,模型組大鼠insr mrna的表達減弱,與空白組比較有顯著性差異(p<0.01);各治療組大鼠肝臟insr mrna的表達增強,以羅格列酮組和健脾活血方高劑量組的改善最為明顯,與模型組比較有顯著性差異(p<0.01);健脾活血方低劑量組與模型組比亦有明顯差異(p<0.05)。健脾活血方高劑量組與羅格列酮組比較無統(tǒng)計學意義。見圖1~2和表3。表3  對大鼠肝臟insr/β-actin mrna rt-pcr電泳產(chǎn)物灰度掃描比值的影響(略)與模型組比較,﹡﹡p<0.01,﹡p<0.05

4  討論

        

insr廣泛分布于全身各組織細胞膜,每個細胞約有l(wèi)×103~105個受體。insr是由2個-α亞基及2個-β亞基構(gòu)成。α亞基肽鏈n端及富含半胱氨酸殘基的結(jié)構(gòu)域是胰島素的結(jié)合位點[6]。β亞基跨膜存在于胞質(zhì),具有酪氨酸蛋白激酶活性,它又可分為三區(qū):胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)及胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域又由含酪氨酸的三個區(qū)域構(gòu)成:即近膜結(jié)構(gòu)域、酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域及c末端結(jié)構(gòu)域[6]。近膜結(jié)構(gòu)域為insr β亞基與胞質(zhì)內(nèi)insr底物結(jié)合所必需,在胰島素信號的傳遞上發(fā)揮關(guān)鍵作用。酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域具有三磷酸腺苷結(jié)合部位。insr β亞基c末端兩個酪氨酸磷酸化部位與信息傳遞蛋白grb10結(jié)合,參與細胞增殖[9]。insr數(shù)目異常及功能缺陷均可影響胰島素的信號轉(zhuǎn)導。 

    已知胰島素是通過細胞膜上的insr起作用的,其作用受細胞上受體密度和親和力的變化調(diào)節(jié)。多項研究證明stz糖尿病大鼠的肝臟、肌肉細胞膜insr數(shù)目受血中胰島素濃度的影響,即血胰島素濃度對insr量呈負向調(diào)節(jié):胰島素濃度升高,受體數(shù)目降低,反之則受體數(shù)目升高[10]。本實驗表明,模型組大鼠肝臟insr mrna表達減少,可能與血中胰島素濃度升高引起的insr數(shù)量減少有關(guān)。雖然其胰島素濃度升高,但是血糖仍然不降,表明胰島素效應(yīng)不全,存在細胞內(nèi)限速反應(yīng),即insr的抵抗。健脾活血方可以上調(diào)大鼠肝臟insr mrna的表達,結(jié)合大鼠給藥前和給藥后isi說明健脾活血方對insr抵抗有治療作用。

【 參考 文獻 】

 

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[8]李光偉. 胰島素敏感性評估及其在臨床研究中的應(yīng)用[j]. 中華內(nèi)分泌代謝雜志,2000,3(16):115.

篇8

[關(guān)鍵詞] 膽固醇代謝紊亂;P-糖蛋白;肝臟;內(nèi)分泌

[中圖分類號] R259 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616(2017)07-09-04

Parallel control analysis of Biological pump glycoprotein expression of SD rat liver cell membrane with cholesterol metabolism disorder

YU Jingxi

Department of General Surgery,the Third People's Hospital of Huizhou,Huizhou 516002,China

[Abstract] Objective To analyze the difference of Biological pump glycoprotein (Pgp) of SD rat liver cell membrane with cholesterol metabolism disorder and its related biochemical indexes and the normal rats. Methods 30 SD rats were selected and randomly divided into observation group and control group,15 rats in each group.The rats in observation group fed with high fat diet were prepared for the disorder of cholesterol metabolism in model,and rats of control group fed healthy.Immunohistochemical method was used to analyze the expression of Pgp in two groups of rats. And they were compared.The related biochemical indexes of rat liver homogenate of the two groups were also compared. Results The average Pgp value of rat liver of control group was (1.01±0.13),the liver index was (1.69±0.68).The average Pgp value of rat liver of observation group was (5.36±1.21),the liver index was (3.35±0.37).The average Pgp value of rat liver and liver index in observation group group were significantly higher than those of control group (P

[Key words] Cholesterol metabolism disorder;P-glycoprotein;Liver;Endocrine

肝臟是人體代謝膽固醇的主要臟器,也是唯一具有大規(guī)模清除膽固醇的臟器[1-3]。多數(shù)高脂血癥的患者通常合并有肝內(nèi)的脂肪沉淀積聚,可對患者的肝功能造成損傷,從而進一步加劇膽固醇代謝的紊亂程度。Pgp為ATP結(jié)合盒超系列成員,于肝細胞膜上可見高表達,并參與至膽汁酸的形成與轉(zhuǎn)運過程當中[4-6]。本研究旨在通過動物模式觀察膽固醇代謝紊亂大鼠的Pgp蛋白的表達變化以及肝細胞脂肪的病變情況,以為膽固醇代謝紊亂的防治提供新的依據(jù)。現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2015年3月自中山大學實驗用動物中心購買SD雄性大鼠30只,隨機分為對照組與觀察組,每組各15只。兩組大鼠月齡均為8~12個月,兩組大鼠的年齡結(jié)構(gòu)等無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。具有可比性。適應(yīng)性喂養(yǎng)時全部大鼠均食水自由,自然光照,室溫控制在18~25℃,相對濕度保持在40%~50%,每日上午加水、喂食并更換墊料。對照組大鼠給予嚙齒類動物標準飼料,確保大鼠健康,在足夠范圍內(nèi)自由活動。觀察組大鼠給予高脂飼料喂養(yǎng),高脂飼料由嚙齒類動物標準飼料86.3%、豬油5%、蛋黃粉8%、膽酸鈉0.2%、膽固醇0.5%組成,縮小大鼠活動范圍盡量減少大鼠運動。兩組均喂養(yǎng)4周。

1.2 觀察方法

采集兩組大鼠眼底靜脈血樣3mL;立即處死,剖取肝臟,放入冷生理鹽水當中充分漂洗,以濾紙完全吸干,以肉眼觀察大鼠的外觀并稱取質(zhì)量,依肝質(zhì)量(g)/體質(zhì)量(g)×100%公式計算肝指數(shù)。⒏臥嚳治兩部分,其中一部分肝臟以甲醇-氯仿以1∶1比例制備為100g/L的肝臟組織勻漿,使用離心機以2000r/min速度離心后取得上層上清液待檢;另一部分肝臟組織以100g/L甲醛溶液完全固定,使用石蠟包埋制作切片。所制作的石蠟切片以HE染色后于光鏡下觀測肝臟脂肪的變程度,以肝小葉中的含脂滴細胞數(shù)量/總細胞數(shù)量計算的結(jié)果作為判斷肝細胞脂肪病變的程度,以0為-、以2/3為+++。

檢測并比較對照組與觀察組大鼠肝組織當中Pgp的表達水平,使用免疫組化測定,一抗使用羊抗鼠Pgp單克隆抗體(Invitrogen公司出品),免疫組化樣品為DAB染色,以蘇木素對全部樣本的細胞核進行復染。使用Imagepro plus-6.0分析軟件分析Pgp顯色的強度,獲取單個組織區(qū)域面積的平均光度值。

將對照組與觀察組大鼠血樣進行生化分析并比較,將血樣以離心機離心取得上層血清,使用全自動型生化分析儀檢測血清中各項肝功能相關(guān)指標包括:谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、膽紅素(BIL)、總膽汁酸(TBA),脂質(zhì)相關(guān)指標包括總?cè)8视停═G)、總膽固醇(Tch),肝組織勻漿中的Tch、TG及TBA水平。分析肝細胞脂肪病變的程度與Pgp表達水平的相關(guān)性。

1.3 統(tǒng)計學方法

研究相關(guān)數(shù)據(jù)均以手工輸入方式錄入至SPSS20.0軟件,一人錄入、一人復核。全部數(shù)據(jù)中的計量資料均采取獨立樣本均數(shù)t檢驗,相關(guān)性采取Spearman等級相關(guān)分析,等級資料采取Mann-Whitney U秩和檢驗,P

2 結(jié)果

2.1 兩組肝臟Pgp光度值與肝指數(shù)比較

對照組大鼠肝臟Pgp平均光度值為(1.01±0.13),肝指數(shù)為(1.69±0.68)%;觀察組大鼠肝臟Pgp平均光度值為(5.36±1.21),肝指數(shù)(3.35±0.37)%;觀察組肝臟Pgp平均光度值與肝指數(shù)均顯著高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P

2.2 肝臟脂肪病變

觀察組肝臟脂肪病變+++的發(fā)生率為53.33%,對照組無+++級別肝臟脂肪病變發(fā)生,觀察組整體肝臟脂肪病變程度較對照組嚴重,差異有統(tǒng)計學意義(P

2.3 血清與肝勻漿生化指標及體質(zhì)量

觀察組與對照組大鼠初始體質(zhì)量、肝勻漿比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);觀察組與對照組大鼠血清Tch、肝勻漿TBA比較,差異有統(tǒng)計學意義(P

2.4 相關(guān)性分析

經(jīng)Spearman等級相關(guān)分析,肝臟脂肪病變程度與肝臟Pgp光度值呈顯著高度正相關(guān)性,r=0.996,0.8

3 討論

肝臟是人體脂肪代謝的一個主要器官[7-9]。肝細胞所合成的膽固醇于酯化作用后在27羥化酶與7α羥化酶的共同催化作用下生成膽汁酸,通過主動排泌到達膽管腔內(nèi),從而參與到膽汁形成的過程當中,這一過程是人體膽固醇清除的一項主要渠道。多數(shù)高脂血癥的患者可合并有明顯的肝內(nèi)脂肪異常聚積[10-12],對于肝臟功能可形成持續(xù)性損傷,并可進一步加重膽固醇代謝的紊亂[13-15]。Pgp糖蛋白以主動形式將肝細胞所合成的膽汁酸轉(zhuǎn)運入毛細膽管腔當中,促使其參與至肝細胞對于膽固醇的代謝過程。Pgp非選擇性的抑制類藥物能夠有效的控制膽固醇的酯化與合成,分析其主要機理為抑制劑將膽固醇由細胞膜至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的這一轉(zhuǎn)運過程完全或部分阻滯而形成的。細胞水平的相關(guān)研究表明Pgp的表達可致使細胞內(nèi)的膽固醇總量升高。提示了Pgp的異常表達對于膽固醇的代謝紊亂形成與發(fā)展以及肝內(nèi)脂肪發(fā)生沉積的過程發(fā)揮了促進作用。

本研究通過高脂飼料喂養(yǎng)的方法建立了膽固醇代謝紊亂的大鼠模型,建模后觀察組肝臟脂肪病變+++的發(fā)生率為53.33%,對照組無+++級別肝臟脂肪病變發(fā)生,觀察組整體肝臟脂肪病變程度較對照組嚴重,差異具有統(tǒng)計學意義(P

綜上所述,膽固醇代謝紊亂SD大鼠的肝細胞膜生物泵糖蛋白較正常健康SD大鼠顯著升高,提示Pgp蛋白在膽固醇代謝紊亂的形成與演進過程中均發(fā)揮著重要的促進作用,這一研究結(jié)果希望能夠為臨床防治及相關(guān)藥物研究提供新的參考與思路。

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篇9

【關(guān)鍵詞】 糖尿病;組織因子;血栓形成;單核細胞;血小板

2型糖尿病(T2DM)患者有血栓形成傾向,在血管病變的形成和發(fā)展中起著相當重要的作用。新近研究表明,血栓性疾病不僅在組織水平,而且在細胞水平已處于高凝狀態(tài)〔1〕,組織因子(TF)是凝血過程的始動因子,以往認為主要來源于血管內(nèi)皮,而現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)外周血細胞中單核細胞能自身合成的TF,血小板亦含有TF〔2〕,后兩種細胞含有的TF在T2DM患者血栓形成中的作用,目前國內(nèi)外研究不多。本文檢測了T2DM患者外周血單核細胞和血小板膜表面TF表達情況及活性,探討其在DM發(fā)病機制中的作用。

1 對象與方法

1.1 對象

按WHO DM診斷標準〔3〕確診的T2DM患者42例,男26例,女16例,年齡55~78〔平均(61.12±10.41)〕歲。根據(jù)白蛋白排泄率將其分為單純性DM組(DM組,22例)和DM合并微血管病變組(DN組,20例)。正常對照22例,男性12例,女性10例,年齡56~77歲〔平均(63.52±11.21)〕歲,排除了血栓性疾病及抽血2 w前使用過阿司匹林、肝素等抗凝藥物者。

1.2 方法

流式細胞儀型號:FACS Calibur,美國 BectonDickinson 公司,CD62PPE-Cy5、CD61-PE、CD14PE以及同型對照IgG2a均購自BD Pharmingen公司。TFFITC 同型對照IgG1及Spectrozyme FXa購自American Diagnostica Inc。因子Ⅶa和因子Ⅹ購自上海船夫生物科技有限公司。①標本準備 單核細胞熒光標記技術(shù):取Falcon管若干支順序編號,每管加入枸櫞酸鈉抗凝外周血100 μl及CD14PE、TFFITC單克隆抗體10 μl,另外在對照管中加入同型對照抗體,低速渦流混勻后室溫下避光孵育20 min,加入FACS Lysing Solution(1×)溶血素2 ml,混勻后室溫暗處反應(yīng)6~10 min,1 500 r/min離心5 min,棄上清液;加生理鹽水2 ml,低速渦流混勻后1 500 r/min離心5 min,棄上清液,加1%多聚甲醛液500 μl,低速渦流混勻后上機檢測。血小板熒光標記技術(shù):取Falcon管若干支順序編號,每管加入枸櫞酸鈉抗凝外周血5 μl及TF FITC、CD62PPECy5、CD61PE單克隆抗體各10 μl,另外在對照管中加入同型對照抗體,低速渦流混勻后室溫下避光孵育20 min,加1%多聚甲醛液500 μl,低速渦流混勻避光保存30 min以上,24 h內(nèi)上機檢測。②單核細胞膜表面TF活性的測定:外周血單個核細胞(MNC)包括單核細胞和淋巴細胞,但淋巴細胞不表達TF,可采用MNC來研究單核細胞TF活性,MNC分離采用密度梯度法,肝素抗凝血經(jīng)Hank氏液稀釋,加入裝有淋巴細胞分離液的試管中,2 000 r/min離心30 min,用毛細吸管吸出MNC,顯微鏡下確定單核細胞百分率,調(diào)單核細胞濃度為3×104/ml。根據(jù)TF/Ⅶa復合物可以使因子Ⅹ轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨蜃英鷄的原理,利用發(fā)色底物Spectrozyme FXa,測定反應(yīng)體系因子Ⅹa的生成量,判斷單核細胞表面TF活性。在體外分離培養(yǎng)的血液單核細胞(2×104/孔),用HEPES緩沖液〔含CaCl2(5 mmol/L)0.1%BSA〕洗滌細胞2次,分別加入因子Ⅶa (100 pmol/L)和因子X(135 nmol/L),37℃孵育30 min,最后在反應(yīng)體系中加入Spectrozyme FXa(0.5 mmol/L)底物,以405 nm波長測定反應(yīng)物的吸光度,換算成FXa生成量(nmol/L)。FXa的生成量與單核細胞表面TF活性成正比。血小板膜表面TF活性的測定:外周血用ACD抗凝,經(jīng)1 000 r/min離心10 min獲得富血小板血漿,用PBS調(diào)血小板濃度為2×109/ml,利用發(fā)色底物法測定FXa生成,方法同上。

1.3 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)以x±s表示,采用SPSS11.0軟件,組間比較采用t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 T2DM患者單核細胞和血小板膜表面TF的表達

正常對照組血小板膜表面CD62P、TF陽性表達率及單核細胞膜表面TF表達率很低,而DM患者均明顯增高(P<0.01),而DN組較DM組明顯增高(P<0.05),見表1。表1 T2DM患者單核細胞和血小板膜表面TF的表達(略)

2.2 T2DM患者單核細胞和血小板膜表面TF的活性

正常對照組血小板及單核細胞膜表面TF活性很低,而DM組較正常對照明顯增高(P<0.01),而DN組較DM組明顯增高(P<0.05),見表2。表2 T2DM患者單核細胞和血小板膜表面TF的活性(略)

2.3 血小板膜表面TF與CD62P表達相關(guān)分析

TF的表達與CD62P表達呈明顯正相關(guān)(r=0.685,P<0.001),提示二者變化是一致的。

3 討 論

T2DM患者血栓形成的傾向在各個環(huán)節(jié)均有體現(xiàn)〔4〕,主要有血管內(nèi)皮細胞的損害、血小板的激活、凝血纖溶系統(tǒng)的異常和血液流變學的改變,這些變化在伴有血管病變者更明顯,提示兩者之間存在密切聯(lián)系,TF是凝血的啟動因子,亦在病理血栓形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用。既往研究認為TF主要由血管內(nèi)皮細胞受損后產(chǎn)生,而新近的研究發(fā)現(xiàn),一些血細胞成分:如單核細胞、血小板亦能在活化狀態(tài)下釋放TF參與凝血過程〔5〕,在血栓性疾病中(包括DM)血小板含有TF蛋白水平較正常人高〔6〕,這提示在DM患者中,單核細胞、血小板不僅可以通過已知的方式(如單核細胞釋放CD14、血小板黏附聚集釋放凝血因子)參與病理血栓形成,還可能以釋放TF而獨立啟動凝血過程及血栓形成。

基于一系列血細胞如單核細胞、血小板、中性粒細胞上TF的發(fā)現(xiàn),人們提出了細胞水平的止血模式〔5〕,該模式認為凝血途徑可不依賴于血管內(nèi)皮細胞釋放的TF來啟動,在一定條件下這些血細胞釋放的TF亦可獨立啟動凝血過程。這一模式是經(jīng)典凝血途徑的補充。由于在正常情況下,血細胞如單核細胞、血小板是處于靜息狀態(tài),不釋放TF,只有在病理情況下單核細胞、血小板活化,TF才可釋放出來,故血細胞來源的TF在血栓性疾病中的意義可能更大。

TF與DM發(fā)病緊密相關(guān),DM血管病變者患者外周血單個核細胞中TF mRNA水平、TF 活性及外周血TF蛋白水平較單純DM患者明顯增高,并有研究認為血漿中可溶性TF水平是DM合并血管病變患者疾病進展的一個標志〔7〕。本研究在國內(nèi)首次采用流式細胞術(shù)檢測了DM患者體內(nèi)血小板、 單核細胞膜表面TF的表達及活性,證實DM患者較正常對照明顯增高,而DM合并血管病變者增高更明顯,并且血小板膜表面TF的表達與血小板活化標志物CD62P表達成正比。這提示DM患者血細胞釋放的TF亦可能參與了其發(fā)病過程中高凝狀態(tài)的形成及病理血栓的生成。研究表明,DM患者體內(nèi)高血糖,高胰島素血癥、高滲透壓可激活體內(nèi)單核細胞和血小板〔8〕,并能促進單核細胞合成及釋放TF,而單核細胞又可以含TF微粒的形式將TF傳遞給血小板,后者攝取后可將TF貯存至a顆粒中,活化時可將其釋放出來;血小板的活化又可進一步促進單核細胞TF活性,它們之間的作用主要是通過血小板膜CD62P介導的,這種相互作用,互為影響可形成惡性循環(huán),促進血栓形成。

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篇10

關(guān)鍵詞 液基薄層細胞涂片法 免疫細胞化學 細胞學診斷

材料與方法

2005年9月~2007年11月收治患者73例漿膜腔積液標本,其中胸水32例,腹水35例,心包積液6例。男43例,女30例,年齡16~84歲,中位年齡52歲。經(jīng)形態(tài)學及免疫細胞化學確定,腺癌42例,23例為反應(yīng)性間皮細胞。42例腺癌中來源于肺癌6例、乳腺癌2例、卵巢癌12例、胃腺癌12例、腸腺癌6例,另4例來源不明;5例鱗狀細胞癌和1例小細胞癌來源于肺;淋巴瘤2例。上述結(jié)果經(jīng)活檢或手術(shù)切除標本病理證實。

結(jié)果判斷:CEA、EA、Ca1、CK和CD68陽性均定位于細胞質(zhì),細胞質(zhì)出現(xiàn)黃色即為陽性著色;CD56和LCA陽性定位于細胞膜,細胞膜出現(xiàn)黃色即為陽性著色。MC染色胞膜線狀著色為陽性。

統(tǒng)計學處理:經(jīng)SPSS軟件采用卡方檢驗。

結(jié) 果

惡性腫瘤細胞及反應(yīng)性間皮細胞病例免疫細胞化學結(jié)果:73份漿膜腔積液標本,細胞學涂片病理檢出惡性腫瘤細胞38例,可疑惡性腫瘤細胞12例。經(jīng)TP免疫細胞化學確定腺癌42例、鱗癌5例、淋巴瘤2例、小細胞癌1例。

腺癌及反應(yīng)性間皮細胞病例免疫細胞化學結(jié)果:在惡性腫瘤中腺癌最多共42例,CEA、EA染色在腺癌細胞胞質(zhì)可見均勻棕黃色。腺癌中90.5%CEA表達陽性,95.2%EA表達陽性,4.8%MC表達陽性,兩組之間有非常顯著的差異(P<0.01)。在23例反應(yīng)性間皮細胞中,反應(yīng)性間皮細胞CEA和EA全部呈陰性表達,91.3%MC表達陽性,87.0%Cal表達陽性,兩組之間有非常顯著的差異(P<0.01)。2例淋巴瘤中100%(2/2)LCA表達陽性,CD68表達陰性。

CEA、EA、MC、和Ca1在腺癌及反應(yīng)性間皮細胞中表達的特異性。CEA和EA在腺癌細胞異性為100%。MC和Cal在良性反應(yīng)性間皮細胞異性為95.2%。見表1。

討 論

免疫細胞化學常用的標本制備方法有4種[1]:直接涂片法(CS)、細胞離心涂片法、細胞塊石蠟包埋法(CB)和液基薄層制片法。本研究結(jié)果顯示:①癌胚抗原及上皮抗原對腺癌的敏感性及特異性均較好,特異性達到了100%,敏感性分別為90.5%、95.2%。②間皮細胞抗體在反應(yīng)性間皮細胞中的敏感性及特異性分別為91.3%、95.2%,另外間皮細胞抗體在惡性積液標本中正常間皮細胞有的也表達。③Cal在反應(yīng)性間皮細胞中的敏感性及特異性分別為87.0%、95.2%。、結(jié)論:癌胚抗原及上皮抗原對上皮細胞的特異性及敏感性較好,間皮細胞抗體、鈣結(jié)合蛋白對上皮細胞的特異性及敏感性較好。薄層細胞涂片法進行免疫細胞化學染色,質(zhì)量優(yōu)良和觀察效果滿意,有效提升了診斷細胞病理學診斷及鑒別診斷的能力。