細(xì)胞生物學(xué)研究進(jìn)展范文

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篇1

與臨床病理學(xué)相比，腫瘤分子生物學(xué)標(biāo)記為腫瘤生物學(xué)行為的分析、治療方式的選擇、臨床預(yù)后的判斷提供了更客觀、更豐富的信息，全文就目前國內(nèi)外對(duì)膀胱移行細(xì)胞癌分子生物學(xué)標(biāo)記物的研究概況作一綜述。

【關(guān)鍵詞】 膀胱移行細(xì)胞癌　標(biāo)志物　分子生物學(xué)　免疫學(xué)

膀胱移行細(xì)胞癌（TCC）的主要特征有多中心性和易復(fù)發(fā)性，腫瘤細(xì)胞易于種植轉(zhuǎn)移，臨床上僅根據(jù)腫瘤病理判斷預(yù)后較為困難。鑒于此，目前對(duì)其分子生物學(xué)標(biāo)記物的研究愈來愈多，如p53、p21、Ki67、bcl?鄄2等。已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道分析了相關(guān)分子生物學(xué)標(biāo)記物與泌尿系統(tǒng)上皮腫瘤的病理分級(jí)、臨床分期、復(fù)發(fā)及生存率的關(guān)系，為診斷腫瘤、制定正確的治療方案及判斷預(yù)后等提供重要的信息，本文就目前已報(bào)道的分子生物學(xué)標(biāo)記物作一綜述。

1　癌基因與抑癌基因

1.1　p53

p53的突變或丟失在膀胱癌的檢出率為50％～60％，Migaldi等[1]分析不同年齡膀胱癌患者的p53表達(dá)，發(fā)現(xiàn)p53異常表達(dá)在小于45歲的膀胱癌患者更為常見。大量研究表明，p53的改變與膀胱癌的分期、分級(jí)、侵襲性有關(guān)，但其是否與膀胱癌的復(fù)發(fā)及生存率相關(guān)仍有爭議。Yeniyol等[2]采用免疫組化檢測(cè)48例膀胱移行細(xì)胞癌標(biāo)本中p53的表達(dá)，p53異常表達(dá)在不同臨床分期和病理分級(jí)間差異顯著，但未發(fā)現(xiàn)p53陽性組與陰性組腫瘤復(fù)發(fā)率和死亡率有明顯差異。Stavropoulos（n＝58）和Ong（n＝64）等[3]也得出類似的結(jié)論。但另有多篇文獻(xiàn)報(bào)道，p53與膀胱癌的復(fù)發(fā)率和死亡率顯著相關(guān)。Sanchez等[4]報(bào)道復(fù)發(fā)的膀胱癌（n＝47）p53的異常表達(dá)明顯高于未復(fù)發(fā)者，p53的異常表達(dá)與膀胱癌的進(jìn)展和生存率相關(guān)。Wolf等報(bào)道p53異常表達(dá)與pT1G3膀胱癌（n＝30）的預(yù)后關(guān)系密切。

p53突變可能與膀胱原位癌（CIS）的生物學(xué)行為有關(guān)，導(dǎo)致CIS的侵襲性增加，Shariat等[5]檢測(cè)47例膀胱CIS的p53及其中39例標(biāo)本的p21表達(dá)，p53/p21聯(lián)合分析顯示出與腫瘤的復(fù)發(fā)、進(jìn)展及生存率之間密切的相關(guān)性，p53（+）/p21（+）患者腫瘤復(fù)發(fā)進(jìn)展和死亡的危險(xiǎn)程度遠(yuǎn)大于p53（+）/p21（-）或p53（－）/p21（－）者。

1.2　p21

關(guān)于p21與膀胱癌的報(bào)道結(jié)果并不統(tǒng)一，Chatterjee等[6]檢測(cè)p53、p21、pRb在164例TCC標(biāo)本中的表達(dá)，結(jié)果顯示p53、p21、pRb可作為判斷TCC復(fù)發(fā)率和5年生存率的獨(dú)立因子，三者聯(lián)合分析顯示出與TCC預(yù)后之間良好的相關(guān)性。Kuczyk MA等也認(rèn)為p21WAF/CIP1可以作為判斷膀胱癌生存率的獨(dú)立預(yù)后因子。Liukkonen等[7]檢測(cè)207例膀胱癌(pTa～pT1)標(biāo)本中p21WAF1/CIP1和細(xì)胞周期素D1的表達(dá)，平均隨訪4.9年，分析其與腫瘤分期、分級(jí)、細(xì)胞增殖率（MIB?鄄1指數(shù)）、p53、bcl?鄄2、生存率的關(guān)系。結(jié)果只有MIB?鄄1指數(shù)與無瘤生存率顯著相關(guān)（P=0.03），腫瘤復(fù)發(fā)率只與腫瘤分級(jí)（P=0.002）和細(xì)胞周期素D1的表達(dá)相關(guān)（P=0.04），提示p21WAF1/CIP1與其他因子相比預(yù)后作用較小，有關(guān)p21WAF1/CIP1在判斷膀胱癌預(yù)后中的意義有待進(jìn)一步闡明。

1.3　p16 /CDKN2A

Hitchings等[8]檢測(cè)78例TCC 標(biāo)本（pTa～pT1） p53、p16、pRb的表達(dá)，多因素分析顯示任何兩者的改變與腫瘤的進(jìn)展密切相關(guān)，p53和 p16同時(shí)表達(dá)異常者腫瘤的進(jìn)展可能性增加14.45 倍，提示p53和 p16可用來判斷pTa～pT1期膀胱腫瘤的進(jìn)展情況。Benedict等發(fā)現(xiàn)腫瘤標(biāo)本中p16/CDKN2A的表達(dá)與Rb的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，Rb強(qiáng)染色的標(biāo)本罕見p16陽性染色，同時(shí)，伴染色體9p21的雜合丟失的腫瘤p16/CDKN2A失表達(dá)，Rb強(qiáng)表達(dá)。Primdahl等發(fā)現(xiàn)初診即為浸潤型膀胱癌p16/CDKN2A的表達(dá)顯著低于繼發(fā)于Ta 或T1的浸潤期腫瘤，有關(guān)進(jìn)一步解釋尚待研究。

1.4　Rb

Sanchez Zalabardo D等[4]隨訪47例浸潤型膀胱癌患者，發(fā)現(xiàn)Rb表達(dá)異常的患者腫瘤進(jìn)展速度、復(fù)發(fā)率顯著升高。Sunanda等檢測(cè)164例TCC標(biāo)本pRb的表達(dá)，得出結(jié)論pRb可作為判斷TCC復(fù)發(fā)和生存率的獨(dú)立預(yù)后因子。另有報(bào)道對(duì)45例T1期膀胱腫瘤患者隨訪發(fā)現(xiàn)Rb基因的丟失與pRb的異常表達(dá)明顯導(dǎo)致患者無瘤生存率降低，此外，多篇文獻(xiàn)報(bào)道Rb在與p21、p16、Ki67、p53等聯(lián)合判斷膀胱癌預(yù)后時(shí)表現(xiàn)出良好的相關(guān)性，可作為較理想預(yù)后因子。

2　細(xì)胞增殖相關(guān)指標(biāo)

細(xì)胞核相關(guān)抗原（Ki67）是增殖性細(xì)胞核的標(biāo)記物，可通過單克隆抗體MIB?鄄1檢測(cè)，其在判斷膀胱癌預(yù)后中的重要意義被越來越多的作者證實(shí)。Migaldi等發(fā)現(xiàn)老年患者膀胱癌標(biāo)本MIB?鄄1指數(shù)高于年輕者，并且與膀胱癌復(fù)發(fā)率、生存率密切相關(guān)[9]。Nakopoulou等(n=94)、Saika等（n=203）、Santos等（n＝159）也研究發(fā)現(xiàn)Ki67是膀胱癌良好的獨(dú)立預(yù)后因子。

Frank等[10]選取伴區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的尿道膀胱腫瘤139例，手術(shù)切除腫瘤并行化療，隨訪分析p53和MIB?鄄1在判斷腫瘤預(yù)后及化療療效中的作用，結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)p53和MIB?鄄1與該類腫瘤患者的預(yù)后具有顯著性相關(guān)，但MIB?鄄1指數(shù)與腫瘤的化療療效呈顯著負(fù)相關(guān)，提示MIB?鄄1可以作為判斷膀胱癌化療療效的指標(biāo)，指導(dǎo)臨床治療。同樣，Matsumoto等對(duì)62例膀胱移行細(xì)胞癌（pT1G3～pT4M0）標(biāo)本進(jìn)行類似研究，平均隨訪34個(gè)月，發(fā)現(xiàn)Ki67的表達(dá)與腫瘤化療完全緩解率顯著性相關(guān)，能較好地判斷療效。

3　細(xì)胞凋亡相關(guān)指標(biāo)

3.1　bcl?鄄2/bax

bcl?鄄2被認(rèn)為是抑制細(xì)胞凋亡的重要的原癌基因。bcl?鄄2、bax屬于凋亡調(diào)控基因bcl?鄄2 基因家族， 分別能夠阻遏和促進(jìn)凋亡， bax?鄄bax同源二聚體促進(jìn)凋亡，bcl?鄄2?鄄bax異聚體阻遏凋亡，突變的p53蛋白可起到與bcl?鄄2蛋白類似的作用，并抑制bax基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而抑制凋亡。

Uchida T等觀察到119例膀胱癌患者中p53的表達(dá)與腫瘤分期分級(jí)相關(guān)，bcl?鄄2表達(dá)與腫瘤臨床病理特征無關(guān)，但p53和bcl?鄄2同時(shí)過表達(dá)提示不良預(yù)后[11]。Wolf、Gazzaniga等也證實(shí)bcl?鄄2的表達(dá)與腫瘤復(fù)發(fā)率和無瘤生存率明顯相關(guān)。但 Asci R等[12]報(bào)道年齡小于40歲患者TCC細(xì)胞漿bcl?鄄2和p53的表達(dá)分別為54%、37%，與腫瘤的進(jìn)展無明顯相關(guān)。同樣，F(xiàn)raile、Stavropoulos等報(bào)道bcl?鄄2的表達(dá)與膀胱癌的分期、分級(jí)及復(fù)發(fā)率無明顯相關(guān)，提示有關(guān)bcl?鄄2的作用仍需進(jìn)一步研究。

3.2　Fas/FasL

Fas與FasL都是跨膜蛋白，分別屬于TNF受體和TNF家族，T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞的活化可導(dǎo)致細(xì)胞表面FasL被激活，與Fas結(jié)合，使表達(dá)Fas的細(xì)胞發(fā)生凋亡。Lee SH等檢測(cè)37例膀胱癌標(biāo)本，F(xiàn)as/FasL的高表達(dá)達(dá)到92％。Lee等報(bào)道43例膀胱腫瘤標(biāo)本28％有Fas基因的突變。目前對(duì)血液中可溶性Fas (sFas)和可溶性FasL (sFasL)研究較多，Mizutani等[13]報(bào)道sFas或sFasL的升高預(yù)示Ta期膀胱癌患者早期復(fù)發(fā)的可能，sFas或sFasL可作為判斷Ta期膀胱癌復(fù)況的預(yù)后因子。

4　血管形成因子

4.1　VEGF

與大多數(shù)實(shí)體瘤一樣，膀胱癌的形成也具有血管形成依賴性，與血管內(nèi)皮生長因子VEGF關(guān)系密切。Vasilios等[14]研究VEGF和低氧誘導(dǎo)因子(HIF?鄄1α)之間的關(guān)系及兩者在TCC中的預(yù)后意義，結(jié)果顯示HIF?鄄1α與腫瘤病理分級(jí)顯著相關(guān)，VEGF和微血管密度（MVD）與腫瘤分級(jí)和臨床分期顯著相關(guān)。HIF?鄄1α與VEGF和MVD顯著相關(guān)，提示VEGF和HIF?鄄1α的升高刺激血管生成，導(dǎo)致腫瘤預(yù)后不良。同樣，Santos（n＝66）也報(bào)道VEGF可作為判斷膀胱上皮腫瘤的預(yù)后因子。

4.2　血栓黏合素?鄄1

血栓黏合素?鄄1(TSP?鄄1) 是細(xì)胞外基質(zhì)中的一種糖蛋白，分子量為430kD。TSP?鄄1被認(rèn)為是惟一抑制腫瘤血管形成的物質(zhì)。Grossfeld等[15]分析了163例TCC標(biāo)本TSP?鄄1、p53的表達(dá)與TCC復(fù)發(fā)生存率之間的關(guān)系，TSP?鄄1表達(dá)與TCC復(fù)發(fā) （P=0.009）和生存率（P=0.023) 顯著相關(guān)，低表達(dá)TSP?鄄1患者腫瘤復(fù)發(fā)率增高，生存率降低。

5　生長因子及受體

5.1　EGFR

EGFR在眾多上皮腫瘤中有較高的陽性表達(dá)，Colquhoun等[16]綜述了近年來有關(guān)EGFR與膀胱癌的研究，得出結(jié)論EGFR的表達(dá)與膀胱癌的分期、分級(jí)、復(fù)發(fā)率、無瘤生存率明顯相關(guān)，EGFR過表達(dá)提示腫瘤預(yù)后不佳，使用抑制EGFR活性的物質(zhì)如ZD 1839等可望成為臨床治療膀胱癌等的新手段。

5.2　TGFα

TGFα在膀胱癌中的表達(dá)顯著高于正常膀胱組織，Ravery等報(bào)道43例膀胱癌中60％存在TGFα高表達(dá)，且與腫瘤死亡率顯著相關(guān)。Ravery等分析28例早期膀胱腫瘤TGFα?鄄mRNA的表達(dá)，隨訪兩年發(fā)現(xiàn)其與腫瘤復(fù)發(fā)顯著相關(guān)，對(duì)判斷早期膀胱腫瘤的預(yù)后有重要價(jià)值。Thogersen等則報(bào)道TGFα與EGFR的表達(dá)相關(guān)，但與患者生存率無明顯相關(guān)，其在判斷膀胱癌預(yù)后中的作用有待研究。

6　細(xì)胞外基質(zhì)與細(xì)胞黏附分子

6.1　MMPs

Hara等[17]分析51例表淺TCC中MMP?鄄2、MMP?鄄9、膜型MMP?鄄1 (MT1?鄄MMP)與腫瘤復(fù)發(fā)率間的關(guān)系，復(fù)發(fā)組MMP?鄄9的表達(dá)是未復(fù)發(fā)組的2.5倍，未發(fā)現(xiàn)MMP?鄄2、MT1?鄄MMP表達(dá)的差異，MMP?鄄9高表達(dá)組無瘤生存率顯著低于正常表達(dá)組。同樣，Ozdemir等檢測(cè)60例膀胱癌MMP?鄄1，MMP?鄄2，MMP?鄄9的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)只有MMP?鄄9的表達(dá)與腫瘤的分期分級(jí)相關(guān)。Papathoma等報(bào)道隨著尿路上皮腫瘤分級(jí)和浸潤程度的升高，MMP?鄄9和MMP?鄄2表達(dá)顯著升高，但兩者與腫瘤的復(fù)發(fā)率無明顯相關(guān)，提示其在判斷膀胱癌轉(zhuǎn)移和預(yù)后中的意義仍有待研究。

6.2　E?鄄鈣黏蛋白

E?鄄鈣黏蛋白的表達(dá)與腫瘤分化、癌細(xì)胞侵襲能力及轉(zhuǎn)移可能相關(guān)。Shahrokh等檢測(cè)53例膀胱CIS標(biāo)本E?鄄鈣黏蛋白的表達(dá)，隨訪131個(gè)月，多因素分析表明E?鄄鈣黏蛋白是與CIS復(fù)發(fā)、進(jìn)展、無瘤生存率顯著相關(guān)的獨(dú)立因素，提示E?鄄鈣黏蛋白異常表達(dá)的腫瘤侵襲性高，需要早期徹底治療。Rao等分析細(xì)胞支架蛋白－肌動(dòng)蛋白（Gelsolin）和E?鄄鈣黏蛋白在判斷膀胱癌預(yù)后中的意義，結(jié)果示Gelsolin與膀胱癌進(jìn)展和復(fù)發(fā)密切相關(guān)，但未發(fā)現(xiàn)E?鄄鈣黏蛋白在判斷膀胱癌預(yù)后中的顯著意義，其在判斷膀胱癌預(yù)后中的意義還有待明確。

與臨床病理學(xué)相比，腫瘤分子生物學(xué)標(biāo)記為腫瘤生物學(xué)行為的分析、治療方式的選擇、臨床預(yù)后的判斷提供了更客觀、更豐富的信息，深入研究此類標(biāo)記十分必要。目前對(duì)泌尿系統(tǒng)上皮腫瘤分子生物學(xué)標(biāo)記物的研究雖已取得進(jìn)展，但除了對(duì)個(gè)別標(biāo)記物Rb、Ki67的意見較為統(tǒng)一外，對(duì)絕大多數(shù)標(biāo)記物在腫瘤中的表達(dá)分布及預(yù)后價(jià)值仍存在爭議，目前的文獻(xiàn)報(bào)道多存在樣本量小的問題，缺少大規(guī)模研究的支持，再加上免疫組化法檢測(cè)蛋白受抗體選擇、陽性結(jié)果判斷、手工操作等外在因素影響的問題，導(dǎo)致研究結(jié)果之間缺乏可比性或?qū)ν愌芯繉?duì)象得出相反的結(jié)論，因此需要將實(shí)驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)化以提高研究的可靠性和可重復(fù)性。此外，由于腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移是涉及多種分子機(jī)制的極其復(fù)雜的過程，僅憑對(duì)單一預(yù)后指標(biāo)的評(píng)估不能全面準(zhǔn)確地反映腫瘤的惡性潛能，腫瘤免疫標(biāo)記物最終的臨床應(yīng)用可能是多個(gè)指標(biāo)的綜合評(píng)估。

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篇2

【關(guān)鍵詞】細(xì)胞生物學(xué)；教學(xué)模式；

【前言】細(xì)胞生物學(xué)是生命科學(xué)中既基礎(chǔ)又前沿的一門學(xué)科，它是我國基礎(chǔ)學(xué)科發(fā)展規(guī)劃中的四大基礎(chǔ)學(xué)科之一[1]。細(xì)胞生物學(xué)是生命科學(xué)各個(gè)分支學(xué)科在細(xì)胞層次上的交匯，它從顯微、亞顯微和分子水平對(duì)細(xì)胞的各種生命活動(dòng)開展研究，進(jìn)而探討人體細(xì)胞結(jié)構(gòu)、功能、發(fā)生、發(fā)展、衰老和死亡的生命活動(dòng)規(guī)律及發(fā)病機(jī)理，是高等醫(yī)學(xué)院校的核心主干課程之一。

進(jìn)入21世紀(jì)以來，細(xì)胞生物學(xué)的研究發(fā)展迅猛，新知識(shí)、新方法、新成果層出不窮，傳統(tǒng)的以教師為主的課堂教學(xué)模式已無法滿足新形勢(shì)下培養(yǎng)高素質(zhì)人才的要求[2]。如何在有限的課堂教學(xué)學(xué)時(shí)內(nèi)，切實(shí)提高教學(xué)質(zhì)量與效果，讓學(xué)生在完整系統(tǒng)地掌握細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)知識(shí)的同時(shí)，及時(shí)了解細(xì)胞生物學(xué)的最新研究進(jìn)展及其在臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用，是目前亟待解決的問題。因此，對(duì)現(xiàn)有的教學(xué)手段和方法進(jìn)行優(yōu)化與改革，探索出符合時(shí)代要求的新的細(xì)胞生物學(xué)教學(xué)模式勢(shì)在必行。

1、高等醫(yī)學(xué)院校細(xì)胞生物學(xué)的教學(xué)現(xiàn)況

目前，大多數(shù)醫(yī)學(xué)院校的細(xì)胞生物學(xué)理論教學(xué)存在兩個(gè)主要問題：一是學(xué)時(shí)少，二是內(nèi)容繁雜、抽象、枯燥且知識(shí)點(diǎn)瑣碎。作為醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)的必修課程，我校的細(xì)胞生物學(xué)安排在大學(xué)一年級(jí)的第二學(xué)期，理論授課采用大班（130人左右）傳統(tǒng)的講授式教學(xué)法（LectureBasedLearning，LBL），即以教師為中心，以系統(tǒng)授課為導(dǎo)向的教學(xué)方法，這一方式雖可以系統(tǒng)講解基礎(chǔ)知識(shí)，但不利于學(xué)生自主學(xué)習(xí)能力的培養(yǎng)[3-4]。而病例教學(xué)法（CaseBasedLearning，CBL）是以典型病例為先導(dǎo)，將臨床與相關(guān)基礎(chǔ)問題相結(jié)合，以學(xué)生為主體的啟發(fā)式教學(xué)方法[5-6]。這種教學(xué)方式雖能克服LBL的不足，提高學(xué)生的學(xué)習(xí)主動(dòng)性和積極性，但是否適合在超過百人的大班授課過程中實(shí)施，仍有待商榷。針對(duì)我校現(xiàn)存的細(xì)胞生物學(xué)的教學(xué)現(xiàn)狀，我們采用CBL與LBL相結(jié)合的教學(xué)方法，以期探索出適合我校的切實(shí)可行的細(xì)胞生物學(xué)教學(xué)模式。

2、引入臨床案例，提高學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣

我校臨床醫(yī)療專業(yè)的細(xì)胞生物學(xué)理論教學(xué)只有28學(xué)時(shí)，學(xué)時(shí)相對(duì)緊張，因此我們?cè)谑谡n方式上采用靈活多變的教學(xué)模式。對(duì)于教材中理論性較強(qiáng)，通俗易懂的知識(shí)，仍采用傳統(tǒng)的LBL方式講授，而對(duì)于一些難點(diǎn)、重點(diǎn)且與臨床結(jié)合緊密的知識(shí)點(diǎn)則采用CBL模式。在CBL教學(xué)過程中，案例的選擇與問題的設(shè)計(jì)是關(guān)鍵。教師在備課過程中，搜集與授課章節(jié)密切相關(guān)的常見病例，查閱文獻(xiàn)資料，對(duì)病例進(jìn)行適當(dāng)?shù)男薷暮脱a(bǔ)充，進(jìn)而編寫成教學(xué)病例，并設(shè)計(jì)相關(guān)問題。例如在講授細(xì)胞膜物質(zhì)運(yùn)輸時(shí)，引入“家族性高膽固醇血癥”，引導(dǎo)學(xué)生學(xué)習(xí)受體介導(dǎo)的胞吞作用；利用“矽肺”病例，講解溶酶體膜穩(wěn)定性的重要；通過囊性纖維化（CysticFibrosis，CF）病例分析，引導(dǎo)學(xué)生學(xué)習(xí)蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中正確折疊的重要性。CBL改變了傳統(tǒng)的教師講、學(xué)生聽的教學(xué)模式，學(xué)生成為案例分析和課堂討論環(huán)節(jié)中的主體。學(xué)生通過學(xué)習(xí)、研究案例來掌握基礎(chǔ)理論知識(shí)，變抽象為具體，而不再是死記硬背單一的知識(shí)點(diǎn)，這充分調(diào)動(dòng)了學(xué)生學(xué)習(xí)的主觀能動(dòng)性，提高了學(xué)生的邏輯推理能力，同時(shí)也促進(jìn)了其分析問題、解決問題能力的逐步提升，對(duì)學(xué)生綜合素質(zhì)的培養(yǎng)及日后從事臨床工作頗有益處。

3、多媒體教學(xué)和網(wǎng)絡(luò)學(xué)習(xí)相結(jié)合

醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)的某些理論知識(shí)相對(duì)抽象、晦澀，因此在以LBL為主進(jìn)行授課時(shí)，PPT課件的制作至關(guān)重要。我們力求在每一章節(jié)的授課過程中將圖片、動(dòng)畫與視頻相結(jié)合，圖文并茂，充分調(diào)動(dòng)學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣，從不同的角度吸引學(xué)生的注意力。在充分利用多媒體這一教學(xué)手段的同時(shí)，我們還利用學(xué)校覆蓋全面的無線網(wǎng)絡(luò)，將教學(xué)過程延展到校園的每一個(gè)角落。目前，我校的細(xì)胞生物學(xué)已成功獲批遼寧省精品資源共享課，課程建設(shè)已順利完成。因此，教師可以將教學(xué)網(wǎng)站提供給學(xué)生，方便學(xué)生及時(shí)查閱PPT課件、課后自測(cè)習(xí)題、拓展學(xué)習(xí)等教學(xué)相關(guān)資料。同時(shí)，我們的SPOC網(wǎng)絡(luò)教學(xué)平臺(tái)也于2018年3月建設(shè)完成并投入使用，該平臺(tái)的應(yīng)用進(jìn)一步夯實(shí)了網(wǎng)絡(luò)教學(xué)基礎(chǔ)，也在一定程度上解決了課堂教學(xué)學(xué)時(shí)緊張的問題。另外，我們還建立了細(xì)胞生物學(xué)教研室的教學(xué)公眾號(hào)，定期推送細(xì)胞生物學(xué)研究的最新進(jìn)展，課后教師和學(xué)生還可以利用微信群和QQ群進(jìn)行交流與學(xué)習(xí)的互動(dòng)。

4、優(yōu)化理論教學(xué)內(nèi)容，拓展研究型課堂

作為醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)課程，細(xì)胞生物學(xué)與生物化學(xué)、生理學(xué)等其他課程的內(nèi)容有部分的重疊和交叉，為了避免不必要的重復(fù)，保證細(xì)胞生物學(xué)與其他課程知識(shí)的緊密銜接，教研室與相關(guān)課程的授課教師進(jìn)行溝通，刪減醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)與其他學(xué)科的部分重復(fù)內(nèi)容，合理安排教學(xué)章節(jié)。同時(shí)，在教學(xué)過程中有選擇地補(bǔ)充了與本課程密切相關(guān)的科研進(jìn)展，引導(dǎo)學(xué)生利用課外時(shí)間查閱相關(guān)文獻(xiàn)，了解本學(xué)科最新的相關(guān)研究進(jìn)展，逐步深化、拓展研究型教學(xué)，提高他們自主學(xué)習(xí)的積極性和主動(dòng)性。

5、反饋與評(píng)價(jià)

在2017年、2018年學(xué)期末課程結(jié)束后，我們連續(xù)兩年分別在2016級(jí)和2017級(jí)臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)的260名學(xué)生中發(fā)放調(diào)查問卷，對(duì)教學(xué)過程和教學(xué)效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。問卷發(fā)放260份，收回有效問卷254份，有效回收率為97.7%。通過對(duì)問卷進(jìn)行整理分析，得出以下調(diào)查結(jié)果：95.8%的學(xué)生認(rèn)為開設(shè)細(xì)胞生物學(xué)課程非常必要或有必要；95.5%的學(xué)生認(rèn)為非常必要或有必要建立網(wǎng)絡(luò)教學(xué)平臺(tái)；98%的學(xué)生認(rèn)為在教學(xué)中介紹臨床相關(guān)知識(shí)非常必要或有必要；97.4%的學(xué)生認(rèn)為非常必要或有必要在教學(xué)中介紹相關(guān)的研究進(jìn)展和熱點(diǎn)問題；87.7%的學(xué)生喜歡并接受CBL與LBL相結(jié)合的教學(xué)模式，其中有92%的學(xué)生認(rèn)為這種教學(xué)模式可以充分激發(fā)自己的學(xué)習(xí)興趣，但有21.4%的學(xué)生認(rèn)為這種教學(xué)模式在對(duì)基礎(chǔ)知識(shí)的系統(tǒng)掌握和理解方面無顯著促進(jìn)作用；87%的學(xué)生認(rèn)為CBL與LBL相結(jié)合的教學(xué)模式可以明顯提高或提高自學(xué)能力在調(diào)查中，學(xué)生還結(jié)合自己的體驗(yàn)對(duì)細(xì)胞生物學(xué)的教學(xué)提出了一些建議和意見，也在一定程度上反映了我們?cè)诮虒W(xué)方面存在的不足和問題。

綜合分析調(diào)查結(jié)果和學(xué)生提出的合理化建議、意見，我們將采取下列改進(jìn)措施：由于授課對(duì)象是大一學(xué)生，學(xué)生相關(guān)的專業(yè)知識(shí)儲(chǔ)備不足，因此在選擇課堂教學(xué)案例時(shí)，應(yīng)盡量選擇典型而淺顯的病例，并請(qǐng)教臨床的醫(yī)生，進(jìn)行更為準(zhǔn)確的描述，重新撰寫案例分析，結(jié)合實(shí)際教學(xué)情況完善教學(xué)案例素材；課堂教學(xué)及時(shí)補(bǔ)充與案例相關(guān)的知識(shí)點(diǎn)，逐步提升學(xué)生自主學(xué)習(xí)的主動(dòng)性和積極性；進(jìn)一步完善網(wǎng)絡(luò)教學(xué)平臺(tái)建設(shè)，并配備專業(yè)人員進(jìn)行平臺(tái)監(jiān)管，真正實(shí)現(xiàn)師生時(shí)時(shí)互動(dòng)，充分發(fā)揮網(wǎng)絡(luò)資源的空間延展性。

總之，教無定法，因材施教。教學(xué)工作就是一個(gè)不斷優(yōu)化的過程。在與學(xué)生的交流和互動(dòng)過程中，我們將不斷總結(jié)反思，探索前行，選擇真正適合學(xué)生的教學(xué)模式，不斷完善教學(xué)過程，切實(shí)提高教學(xué)質(zhì)量，培養(yǎng)學(xué)生成為符合時(shí)展需要的新型醫(yī)學(xué)人才。

【生物博士論文參考文獻(xiàn)】

[1]付燕燕，陳彥，吳健，等.醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革的幾點(diǎn)思考[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)教育，2015，17（2）：135-136.

[2]楊利艷，王祎玲，馬娜.細(xì)胞生物學(xué)研究性教學(xué)模式的探索與實(shí)踐[J].教學(xué)研究，2013，36（6）：65-67，77.

[3]劉鴻業(yè).CBL聯(lián)合LBL教學(xué)模式在普通外科護(hù)理學(xué)教學(xué)中的應(yīng)用[J].衛(wèi)生職業(yè)教育，2015，33（2）：85-86.

篇3

關(guān)鍵詞：研究生；創(chuàng)新能力；細(xì)胞生物學(xué)

中圖分類號(hào)：G643 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1674-9324（2015）26-0265-02

人類社會(huì)已經(jīng)步入創(chuàng)新不斷涌現(xiàn)和競爭不斷加劇的重要時(shí)期。在知識(shí)經(jīng)濟(jì)時(shí)代，科學(xué)技術(shù)創(chuàng)新是國家發(fā)展的決定性因素，是國家競爭力的核心，而科學(xué)技術(shù)創(chuàng)新離不開具有創(chuàng)新能力的高素質(zhì)人才。高等學(xué)校擔(dān)負(fù)著全面推進(jìn)素質(zhì)教育，培養(yǎng)高素質(zhì)的創(chuàng)新型人才的歷史使命，更新教育觀念，深化教育改革，構(gòu)建高校創(chuàng)新型人才培養(yǎng)模式成為第一要?jiǎng)?wù)。教育觀念的更新，首要更新的是高等教育體系中龐大的師資隊(duì)伍，他們是教學(xué)改革的執(zhí)行者，是課堂和實(shí)驗(yàn)教學(xué)的組織者，是學(xué)生創(chuàng)新能力培養(yǎng)和素質(zhì)提高中最有力的影響者，畢竟學(xué)生創(chuàng)新能力的提高是多學(xué)科、多層面長期共同努力的結(jié)果。

細(xì)胞生物學(xué)被列為生命科學(xué)的四大基礎(chǔ)學(xué)科之一，是在生命科學(xué)領(lǐng)域和高等教育體系中均占有重要位置的前沿學(xué)科。醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的許多重大發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展創(chuàng)新有著密不可分的關(guān)系，掌握細(xì)胞生物學(xué)的基本理論和實(shí)驗(yàn)技術(shù)對(duì)醫(yī)學(xué)院校的碩士研究生培養(yǎng)而言意義日益突出。在醫(yī)學(xué)研究生課程體系中開設(shè)的細(xì)胞生物學(xué)課程，在有助于幫助學(xué)生掌握基本技能、培養(yǎng)科研思維的同時(shí)，如何利用課程授課的機(jī)會(huì)，培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新能力，做好創(chuàng)新能力培養(yǎng)的關(guān)鍵一環(huán)，是我們當(dāng)前面對(duì)的教育課題之一。我們?cè)谘芯可?xì)胞生物學(xué)教學(xué)中更有針對(duì)性地加強(qiáng)創(chuàng)新能力和實(shí)踐能力的培養(yǎng)，在教學(xué)內(nèi)容、教學(xué)方法和考核方式等方面進(jìn)行改革探索，在教學(xué)改革的實(shí)踐中對(duì)改革的迫切性、系統(tǒng)性有了更深的體會(huì)。

一、更新教育觀念，加強(qiáng)師資隊(duì)伍建設(shè)

1.教育觀念更新是前提。我們?cè)诮虒W(xué)實(shí)踐中也認(rèn)識(shí)到忽視能力培養(yǎng)是制約創(chuàng)新型人才成長的主要原因，具體表現(xiàn)在三個(gè)方面：一是忽視實(shí)踐能力的培養(yǎng)，按著教學(xué)計(jì)劃和教科書一章一節(jié)地向?qū)W生講授，學(xué)生熟背理論而與實(shí)踐脫節(jié)。二是忽視自主能力的培養(yǎng)，限定領(lǐng)域不考慮學(xué)生的興趣和愛好，不主張學(xué)生的自主發(fā)揮，學(xué)生理解書本但不會(huì)思考。三是忽視學(xué)生探索能力的培養(yǎng)，只學(xué)習(xí)已有結(jié)論和經(jīng)驗(yàn)，忽視未知領(lǐng)域的大膽探索和形成結(jié)論的深入研究[1]。在實(shí)現(xiàn)碩士研究生創(chuàng)新能力培養(yǎng)的過程中，導(dǎo)師及教學(xué)團(tuán)隊(duì)的教學(xué)觀念的更新是前提，也是基礎(chǔ)。各指導(dǎo)教師的創(chuàng)新力的保持和對(duì)教育教學(xué)先進(jìn)理念和技術(shù)的不斷學(xué)習(xí)有助于保持教學(xué)的生命力。

2.師資隊(duì)伍加強(qiáng)是保障。國務(wù)院學(xué)位委員會(huì)辦公室主任、中科院院士楊玉良曾說過：“改革研究生培養(yǎng)機(jī)制、不斷提高研究生教育質(zhì)量，加速培養(yǎng)創(chuàng)新型人才，是一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng)工程，不僅要重視提高研究生本身的質(zhì)量，更要重視提高研究生導(dǎo)師的質(zhì)量。”[2]研究生和導(dǎo)師之間關(guān)系的滿意度調(diào)查顯示師生雙方的總體滿意度較高，但依然存在一定的問題，并認(rèn)為導(dǎo)師的學(xué)術(shù)素質(zhì)是影響研究生培養(yǎng)的關(guān)鍵因素之一[3-4]。我們的師資隊(duì)伍建設(shè)目標(biāo)是業(yè)務(wù)精湛、勇于創(chuàng)新、師德高尚、教風(fēng)嚴(yán)謹(jǐn)，梯隊(duì)合理。搭建技術(shù)力量雄厚的師資成為高素質(zhì)創(chuàng)新人才培養(yǎng)的強(qiáng)有力的保障。我們?cè)趲熧Y隊(duì)伍的建設(shè)中，重引進(jìn)也更重培養(yǎng)，引進(jìn)看學(xué)歷、選專業(yè)、重學(xué)緣，培養(yǎng)分批次、重堅(jiān)持，力求優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)；在日常工作中，我們以小型的學(xué)術(shù)報(bào)告會(huì)的形式加強(qiáng)交流，互助共進(jìn)；在梯隊(duì)建設(shè)上，看重專家教授的經(jīng)驗(yàn)，也注意吸納思維活躍的中青年學(xué)者；并依據(jù)多學(xué)科交叉和融合，學(xué)生的興趣主導(dǎo)，確立了雙導(dǎo)師制，并注意雙師型教師的培養(yǎng)。

二、深化課堂改革，推行創(chuàng)新課堂

1.課程設(shè)置合理化。研究生課程體系的設(shè)置做到適時(shí)調(diào)整，豐富選課資源的同時(shí)，加強(qiáng)學(xué)生選課的自主性，充分考慮學(xué)生的個(gè)性化培養(yǎng)的需求。

2.優(yōu)化教學(xué)內(nèi)容。創(chuàng)新型人才培養(yǎng)模式改革首要是課程改革，而課程改革首先要解決的問題是教學(xué)內(nèi)容的優(yōu)化。研究生創(chuàng)新能力的培養(yǎng)應(yīng)該是建立在知識(shí)、能力、素質(zhì)的辯證統(tǒng)一的基礎(chǔ)上。知識(shí)作為能力和素質(zhì)的載體，是不可或缺的重要一環(huán)，研究生階段知識(shí)的獲取不應(yīng)該局限于本科階段的某一本教材的重復(fù)拓展。我們?cè)谡n堂設(shè)計(jì)中集思廣益，打破教材的局限，以學(xué)生興趣為出發(fā)點(diǎn)，設(shè)置了十個(gè)小的專題題目，專題內(nèi)容涉及細(xì)胞生物學(xué)的基本技術(shù)及其創(chuàng)新、前沿知識(shí)、熱點(diǎn)領(lǐng)域，并充分考慮細(xì)胞生物學(xué)與醫(yī)學(xué)的密切關(guān)系。如細(xì)胞通訊、細(xì)胞信號(hào)跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)及其與疾病的關(guān)系，端粒、端粒酶和腫瘤的關(guān)系及其研究進(jìn)展，細(xì)胞骨架與運(yùn)動(dòng)和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的關(guān)系舉例（原因分析、分子細(xì)胞學(xué)調(diào)整、研究進(jìn)展）等。學(xué)生既能從中鞏固提煉的基本理論框架，又能獲得豐富的前沿信息，在學(xué)習(xí)中還有助于科研方向的確立和科研思維的培養(yǎng)。

3.改革教學(xué)方法。我們?cè)谇皫啄甑慕虒W(xué)中留心對(duì)研究生的理論基礎(chǔ)、能力水平和喜歡的教學(xué)模式做了問卷調(diào)查，相對(duì)于本科生研究生階段學(xué)生的特點(diǎn)突出表現(xiàn)為：已經(jīng)具有比較廣泛、系統(tǒng)的理論知識(shí)基礎(chǔ)，并具備一定的分析問題的能力，更向往自由的思維和互動(dòng)表達(dá)。綜合研究生的特點(diǎn)和現(xiàn)代教育技術(shù)的發(fā)展，我們?cè)谡n堂教學(xué)中試行教學(xué)方法改革，徹底改變教師灌輸知識(shí)的單一模式，更多地讓學(xué)生自主學(xué)習(xí)，教師擔(dān)負(fù)引導(dǎo)、組織實(shí)施、總結(jié)和考評(píng)的職責(zé)，更多的時(shí)候也是討論和爭論的主體之一，變師徒關(guān)系為伙伴關(guān)系。具體實(shí)施是依據(jù)學(xué)生興趣分組，3～4人/組，組內(nèi)分工協(xié)作，依據(jù)自己所選的感興趣的專題查閱資料，開展討論并推舉一人以PPT文稿的形式圖文結(jié)合在課堂上匯報(bào)講解，同學(xué)可以自由提問，教師做針對(duì)性的點(diǎn)評(píng)、補(bǔ)充。創(chuàng)新的課堂組織從學(xué)生的興趣出發(fā)保障了自主學(xué)習(xí)的效率，協(xié)作中鍛煉了學(xué)生的團(tuán)隊(duì)意識(shí)和合作能力，課堂表達(dá)和提問互動(dòng)有效地活躍了學(xué)習(xí)氣氛，調(diào)動(dòng)了學(xué)習(xí)的積極性，并提高了學(xué)生綜述及表達(dá)能力。此種形式受到了選課學(xué)生的一致好評(píng)，也吸引了更多的研究生加入我們的學(xué)習(xí)隊(duì)伍中。

4.考評(píng)手段合理化。在轉(zhuǎn)變教師單向傳授知識(shí)模式的同時(shí)，打破以考試分?jǐn)?shù)作為衡量教育成果的唯一標(biāo)準(zhǔn)的劃一呆板的考評(píng)制度。對(duì)學(xué)生學(xué)習(xí)的評(píng)價(jià)主要是課堂表現(xiàn)和實(shí)踐實(shí)訓(xùn)，各占50%。課堂表現(xiàn)的評(píng)價(jià)中以小組匯報(bào)講解中的綜合能力表現(xiàn)作為主要的考評(píng)指標(biāo)，并逐步完善了評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，簡介如下：基本原理簡明扼要、切中要點(diǎn)、通俗易懂；研究應(yīng)用舉例典型、兼顧多方面；重視結(jié)果分析（盡量使用圖表）；重視技術(shù)發(fā)展的進(jìn)展和研究理論進(jìn)展（突出新意）。除了陳述者有獎(jiǎng)勵(lì)分之外，課堂提問及回答者都有酌情加分，極大地調(diào)動(dòng)了學(xué)生的積極性。學(xué)生課前準(zhǔn)備、課堂提問、課后總結(jié)的學(xué)習(xí)資料都可以組織建立個(gè)人學(xué)習(xí)檔案，學(xué)習(xí)檔案也可作為酌情加分的因素。

三、反饋與思考

教學(xué)內(nèi)容、教學(xué)方法及新的考評(píng)方法改革的突出優(yōu)勢(shì)在于愛護(hù)和培養(yǎng)學(xué)生的好奇心、求知欲，幫助學(xué)生自主學(xué)習(xí)，獨(dú)立思考，保護(hù)學(xué)生的探索精神、創(chuàng)新思維，營造崇尚真知、追求真理的氛圍，為學(xué)生的稟賦和潛能的充分開發(fā)創(chuàng)造一種寬松的環(huán)境。讓學(xué)生感受、理解知識(shí)產(chǎn)生和發(fā)展的過程，培養(yǎng)學(xué)生的科學(xué)精神和創(chuàng)新思維，重視培養(yǎng)學(xué)生收集處理信息的能力，獲取新知識(shí)的能力，分析問題和解決問題的能力，語言文字表達(dá)以及團(tuán)結(jié)協(xié)作能力。

但在試行新的教學(xué)方法的同時(shí)，我們也發(fā)現(xiàn)了一些有待于改進(jìn)的問題。在課程體系的設(shè)置中需要合理調(diào)研，依據(jù)社會(huì)、培養(yǎng)目標(biāo)和學(xué)生主體的需求做出調(diào)整，充分適應(yīng)多學(xué)科交叉融合的需求。在教學(xué)內(nèi)容的優(yōu)化上，學(xué)生更注重研究進(jìn)展的討論和熱點(diǎn)文獻(xiàn)的分析，教學(xué)內(nèi)容需要每年更新，不能一成不變。在教學(xué)方法改革中，試行討論式課堂的問題反應(yīng)在四個(gè)方面：個(gè)別小組成員因自制力不強(qiáng)、計(jì)算機(jī)水平限制、口頭表達(dá)能力欠缺等原因?qū)λx專題的基本理論或研究進(jìn)展陳述不清楚，會(huì)一定程度上影響其他同學(xué)對(duì)該專題領(lǐng)域的學(xué)習(xí)。在課堂匯報(bào)環(huán)節(jié)，受部分同學(xué)表達(dá)能力的影響，學(xué)生的注意力不容易集中，課堂進(jìn)展的節(jié)奏會(huì)略顯拖沓。在教學(xué)過程中容易出現(xiàn)兩極分化的現(xiàn)象，部分學(xué)生的主動(dòng)性得到了很好的發(fā)揮，綜合能力得到了比較充分的鍛煉，也有個(gè)別學(xué)生在混學(xué)分，并沒有進(jìn)行真正的自主學(xué)習(xí)。且教師對(duì)新的教學(xué)方法的理解和掌握的程度也一定程度上影響了學(xué)生的學(xué)習(xí)效果。在評(píng)價(jià)體系中，給學(xué)生公正、全面、合理的評(píng)價(jià)影響著學(xué)生的學(xué)習(xí)態(tài)度和熱情，但其過程是相當(dāng)煩瑣的，需要教師團(tuán)隊(duì)比較多的精力投入，適當(dāng)?shù)募?lì)機(jī)制能更好地配合教學(xué)改革的推進(jìn)。

四、展望

創(chuàng)新能力是科技發(fā)展的核心動(dòng)力，碩士研究生培養(yǎng)作為高等教育的重要一環(huán)，更需要?jiǎng)?chuàng)新能力。碩士研究生創(chuàng)新能力的培養(yǎng)需要更多體現(xiàn)在實(shí)踐實(shí)訓(xùn)中，是一個(gè)循序漸進(jìn)的過程，需要學(xué)校、學(xué)院、導(dǎo)師和學(xué)生等多個(gè)主體的重視和參與，但基礎(chǔ)是作為碩士研究生培養(yǎng)的導(dǎo)師或?qū)焾F(tuán)隊(duì)中的每一位教師，都能保持教育改革的熱情，及時(shí)地發(fā)現(xiàn)現(xiàn)代教育中存在的問題，并能擁有足夠的改革的勇氣和決心。教師的教育理念的轉(zhuǎn)變和教學(xué)技術(shù)、方法的不斷提高完善，才能真正推動(dòng)碩士研究生創(chuàng)新能力的培養(yǎng)。

參考文獻(xiàn)：

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[2]周晉，王樹葉，劉述川.醫(yī)學(xué)研究生教育的發(fā)展與創(chuàng)新[J].西北醫(yī)學(xué)教育，2007，15（5）：787-789.

篇4

學(xué)時(shí)最少的維生素相關(guān)內(nèi)容卻是目前社區(qū)衛(wèi)生院臨床醫(yī)師最常用的知識(shí)點(diǎn)(圖1)。經(jīng)典的三大代謝不僅常用也是臨床工作者希望詳細(xì)了解的知識(shí)點(diǎn)。社區(qū)醫(yī)院最大的患者群是退休的老年患者,患者群中糖尿病發(fā)病率居高不下,所以糖代謝、脂代謝等基本原理在社區(qū)臨床應(yīng)用中占很大比重。其次常用的是與生理相關(guān)的水電代謝及酸堿平衡,與生理學(xué)內(nèi)容有交叉與重復(fù)。癌基因與抑癌基因是醫(yī)學(xué)專業(yè)工作者目前最希望了解的知識(shí)點(diǎn)。腫瘤的高發(fā),腫瘤標(biāo)志物檢驗(yàn)技術(shù)在社區(qū)衛(wèi)生院的普及與開展,使臨床工作者迫切希望學(xué)習(xí)癌基因、抑癌基因這方面的知識(shí),這也表明在教材編寫過程中要與時(shí)俱進(jìn),及時(shí)編入最新的醫(yī)學(xué)研究進(jìn)展。

免疫及病原生物學(xué)知識(shí)點(diǎn)需求。

抗感染免疫是社區(qū)醫(yī)生最常用到的知識(shí)點(diǎn)(圖2)。社區(qū)醫(yī)院處于傳染病、地域性疾病、突發(fā)疫情的前沿陣地,對(duì)傳染病和突發(fā)疫情早發(fā)現(xiàn)、早隔離、早治療,對(duì)地域性疾病進(jìn)行篩檢和治療,是其重要職責(zé)之一。而比較出乎教師意外的是即使是在農(nóng)村,由于目前生活水平的穩(wěn)步提高,寄生蟲學(xué)這一章節(jié)臨床醫(yī)生并不常用,對(duì)其要求不高。抗體與補(bǔ)體是臨床醫(yī)生最希望詳細(xì)了解的知識(shí)點(diǎn)。臨床上不少檢測(cè)手段都需要用到免疫學(xué)的基本概念和原理,由此免疫學(xué)的應(yīng)用和技術(shù)需要做些概括性的講解,使學(xué)生在實(shí)際工作中遇到相關(guān)問題不至于太茫然。

細(xì)胞生物學(xué)知識(shí)點(diǎn)需求。

細(xì)胞生物學(xué)最常用的和希望了解的知識(shí)點(diǎn)均集中在細(xì)胞的活動(dòng)上,即細(xì)胞水平的增殖、分化、衰老、壞死和凋亡。這些知識(shí)點(diǎn)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸密切相關(guān),也與不少藥物的作用機(jī)制相關(guān)。總體而言細(xì)胞生物學(xué)與基層的醫(yī)學(xué)工作者并不是很密切。

課程整合初步大綱。

根據(jù)社區(qū)衛(wèi)生院臨床醫(yī)師對(duì)生物化學(xué)、病原生物學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)知識(shí)點(diǎn)的實(shí)際應(yīng)用情況和知識(shí)點(diǎn)的需求量,我們擬針對(duì)臨床專業(yè)(社區(qū)醫(yī)學(xué)方向)學(xué)生開設(shè)實(shí)用醫(yī)學(xué)生命科學(xué)課程,涵蓋以上學(xué)科部分知識(shí)點(diǎn),力求達(dá)到在有限的學(xué)時(shí)內(nèi),傳授綜合性強(qiáng),實(shí)用性強(qiáng)的知識(shí)點(diǎn)。

傳統(tǒng)的課程結(jié)構(gòu)將臨床專業(yè)的課程分為公共基礎(chǔ)課、專業(yè)基礎(chǔ)課和專業(yè)課。這一模式系統(tǒng)性強(qiáng),但各課程各自強(qiáng)調(diào)系統(tǒng)性、完整性,彼此之間缺乏聯(lián)系。由于面向農(nóng)村社區(qū)臨床醫(yī)學(xué)人才培養(yǎng)不要求學(xué)生有十分寬廣的基礎(chǔ)理論知識(shí),根據(jù)夠用、適度的原則,需要調(diào)整專業(yè)基礎(chǔ)課程,如細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)的設(shè)置。目前的趨勢(shì)是社區(qū)醫(yī)生的培養(yǎng)重點(diǎn)在于大力發(fā)展全科醫(yī)學(xué)教育,這就要求教師在教學(xué)過程中將不同學(xué)科的知識(shí)點(diǎn)融會(huì)貫通,進(jìn)行課程的重組,整合。江西醫(yī)學(xué)院上饒分院推行面向農(nóng)村社區(qū)全科醫(yī)學(xué)教育改革,其專業(yè)基礎(chǔ)課程模塊中對(duì)課時(shí)進(jìn)行了調(diào)整:生物化學(xué)與分子生物學(xué)占67學(xué)時(shí)(理論55+實(shí)驗(yàn)17學(xué)時(shí))、病原生物學(xué)與免疫學(xué)占66學(xué)時(shí)(理論54+實(shí)驗(yàn)12學(xué)時(shí))、細(xì)胞生物學(xué)占20學(xué)時(shí)(理論14+實(shí)驗(yàn)6學(xué)時(shí));遺傳學(xué)內(nèi)容作為選修課程。目前,我校臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)生物化學(xué)72學(xué)時(shí),病原生物學(xué)與免疫學(xué)81學(xué)時(shí),細(xì)胞生物學(xué)未開課。由此,我們?cè)谏鐓^(qū)醫(yī)學(xué)專業(yè)課程設(shè)置上,擬將這三門課程進(jìn)行整合并適當(dāng)增加遺傳學(xué)的內(nèi)容,形成一門貫穿一學(xué)年的153學(xué)時(shí)的實(shí)用醫(yī)學(xué)生命科學(xué)。

從而有效避免各課程為了強(qiáng)調(diào)自身學(xué)科的系統(tǒng)性和完整性而導(dǎo)致課程之間內(nèi)容重復(fù),相互重復(fù)的內(nèi)容可統(tǒng)一在某一課程中單獨(dú)講述。除了課程結(jié)構(gòu)上進(jìn)行改革,還要根據(jù)培養(yǎng)目標(biāo)重新編寫教學(xué)大綱和教材,刪除或弱化課程中對(duì)基層社區(qū)衛(wèi)生工作無太大實(shí)際意義的內(nèi)容,如本次課程整合過程中,弱化生物化學(xué)相關(guān)的蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)、等電點(diǎn)等,加強(qiáng)三大代謝的講授力度;即強(qiáng)調(diào)基本概念、生理意義等,而不是代謝步驟和調(diào)控。

同時(shí)增設(shè)代謝相關(guān)疾病的檢測(cè)等臨床實(shí)用操作實(shí)訓(xùn)課,強(qiáng)調(diào)農(nóng)村常見病、多發(fā)病的診斷。其次,不能一刀切地取消分子生物學(xué)和遺傳學(xué)課程,或者只作為選修課,而是在生物化學(xué)教學(xué)中融入這些內(nèi)容,比如在蛋白代謝章節(jié)中強(qiáng)化分子病。有研究表明88.1%的人認(rèn)為,社區(qū)醫(yī)院的診療水平值得改進(jìn),提高社區(qū)醫(yī)生的疾病診斷和大病發(fā)現(xiàn)能力尤為重要。

篇5

關(guān)鍵詞：細(xì)胞生物學(xué)；教學(xué)效果；探索

目前，我國正大力推進(jìn)研究生教育綜合改革，研究生教育已從規(guī)模化發(fā)展全面進(jìn)入以質(zhì)量為核心的內(nèi)涵發(fā)展。重視課程學(xué)習(xí)、提高課程質(zhì)量是保障研究生質(zhì)量的重要環(huán)節(jié)，也是當(dāng)前研究生教育改革的一個(gè)重點(diǎn)。然而，調(diào)查發(fā)現(xiàn)，目前研究生課程教學(xué)普遍存在一些問題，如學(xué)校對(duì)教學(xué)不夠重視、教學(xué)內(nèi)容不當(dāng)、教學(xué)手段單一、考核方式不靈活等問題[1]。細(xì)胞生物學(xué)是研究并揭示細(xì)胞基本生命活動(dòng)規(guī)律的科學(xué)。著名的細(xì)胞生物學(xué)家威爾遜（E.B.Wilson）講到“每一個(gè)生物科學(xué)問題的答案都必須在細(xì)胞中尋找”[2]。細(xì)胞研究涉及到生命科學(xué)的各個(gè)層次和領(lǐng)域，細(xì)胞生物學(xué)已成為生命科學(xué)的四大基礎(chǔ)學(xué)科之一。目前，各個(gè)高校生物學(xué)研究生均開設(shè)有細(xì)胞生物學(xué)課程，但同樣存在以上問題，教學(xué)效果不容樂觀。為了更好地保障和提高研究生細(xì)胞生物學(xué)教學(xué)質(zhì)量，筆者從課程的教學(xué)內(nèi)容、教學(xué)方法和手段、課程考核方法等方面進(jìn)行了一些探索與實(shí)踐，取得了較好的教學(xué)效果。

一優(yōu)化課程內(nèi)容，融入最新科研動(dòng)態(tài)

知己知彼方能百戰(zhàn)不殆，要想教好細(xì)胞生物學(xué)這門課，必須充分掌握課程及授課對(duì)象的特點(diǎn)。研究生理論課的課時(shí)一般較本科生少，更加注重前沿性和綜合性，生源來自不同本科院校，學(xué)生的專業(yè)理論基礎(chǔ)和背景也稍顯參差不齊。細(xì)胞生物學(xué)涉及的內(nèi)容極為廣泛，與多門課程內(nèi)容之間有相互交叉與聯(lián)系。若想在有限的課時(shí)內(nèi)，適應(yīng)不同生源，拓寬學(xué)生的知識(shí)面，開闊學(xué)生視野，對(duì)提高教學(xué)效果起到事半功倍的效果，必須調(diào)整和優(yōu)化課程內(nèi)容。

（一）調(diào)整課程內(nèi)容，避免重復(fù)和遺漏

細(xì)胞生物學(xué)課程與分子生物學(xué)、微生物學(xué)、遺傳學(xué)等多門課程內(nèi)容之間有交叉[3]。因此，需要各門課程負(fù)責(zé)老師就各自的講授內(nèi)容進(jìn)行研討，確定核心授課內(nèi)容，避免教學(xué)重復(fù)。目前，越來越多的交叉學(xué)科出現(xiàn)并發(fā)揮出重要作用，多學(xué)科交叉融合是高校學(xué)科發(fā)展的必然趨勢(shì)。細(xì)胞生物學(xué)的生源也由單純的生物背景轉(zhuǎn)變?yōu)橛缮飳W(xué)、化學(xué)、食品科學(xué)、材料學(xué)等多種背景。為適應(yīng)不同的生源，教師需要充分掌握學(xué)生的專業(yè)基礎(chǔ)。如在開課前設(shè)計(jì)問卷，將課程知識(shí)點(diǎn)細(xì)化，每個(gè)知識(shí)點(diǎn)都分成熟悉、了解、陌生三個(gè)級(jí)別。統(tǒng)計(jì)出哪些知識(shí)點(diǎn)是學(xué)生都熟悉的，可以簡單概括講解甚至忽略，對(duì)多數(shù)人只是了解或完全陌生的內(nèi)容需要詳細(xì)或重點(diǎn)講解，從而避免教學(xué)遺漏。

（二）優(yōu)化課程內(nèi)容，增強(qiáng)新穎性

教學(xué)內(nèi)容在很大程度上決定了學(xué)生的知識(shí)結(jié)構(gòu)和能力形成，因此，教學(xué)內(nèi)容的新穎性對(duì)提高教學(xué)質(zhì)量有重要作用。細(xì)胞生物學(xué)是當(dāng)今發(fā)展最快的基礎(chǔ)學(xué)科之一，知識(shí)更新快，信息量增長迅速。教師應(yīng)與時(shí)俱進(jìn)，掌握本學(xué)科的最新發(fā)展動(dòng)態(tài)，引導(dǎo)學(xué)生關(guān)注、跟蹤科研的發(fā)展動(dòng)向。可以摒棄固有教材，加大前沿領(lǐng)域理論、技術(shù)及相關(guān)知識(shí)的內(nèi)容比例，以增強(qiáng)課程內(nèi)容的新穎性，激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣，拓寬眼界，活躍學(xué)生的科研思維。

二豐富教學(xué)手段，引入先進(jìn)教學(xué)方法

傳統(tǒng)的教學(xué)模式是講授式，以教為中心，注重知識(shí)的傳輸，忽視了學(xué)生個(gè)性和能力的培養(yǎng)。為了讓學(xué)生能夠更加積極、主動(dòng)地參與到教學(xué)過程中，應(yīng)采用多樣化的教學(xué)方法，注重啟發(fā)式、研究式、討論式等多種教學(xué)手段的綜合運(yùn)用。

（一）進(jìn)行專題學(xué)習(xí)

專題學(xué)習(xí)就是結(jié)合該學(xué)科發(fā)展現(xiàn)狀，精選具有代表性的關(guān)鍵內(nèi)容，就某項(xiàng)專題進(jìn)行學(xué)習(xí)，引導(dǎo)學(xué)生討論與思考，讓學(xué)生對(duì)該問題有更全面更深入認(rèn)識(shí)的教學(xué)方式。細(xì)胞生物學(xué)課程專題的選擇可參考國內(nèi)或國際細(xì)胞生物學(xué)會(huì)議論文集。也可以是當(dāng)前領(lǐng)域的熱點(diǎn)問題，如誘導(dǎo)多能干細(xì)胞是十年來細(xì)胞研究的一個(gè)熱點(diǎn)，在學(xué)習(xí)細(xì)胞分化這部分內(nèi)容時(shí)，即可選擇多能干細(xì)胞的誘導(dǎo)這一專題，既有干細(xì)胞的內(nèi)容與教學(xué)內(nèi)容相連貫，又涉及到新的干細(xì)胞類型作為課程內(nèi)容的延伸。

（二）采用雙語教學(xué)

隨著國際化交流的日益增多，開展雙語教學(xué)已成為必然趨勢(shì)，教育部也提出了在高校開展雙語教學(xué)的要求，研究生階段開展雙語教學(xué)尤為需要。近年來，細(xì)胞生物學(xué)發(fā)展迅猛，重大成果不斷涌現(xiàn)。然而，據(jù)統(tǒng)計(jì)細(xì)胞生物學(xué)90%以上的新發(fā)現(xiàn)都以英語方式報(bào)道、傳播。中文版教材存在知識(shí)滯后性及新專業(yè)術(shù)語定義模糊等弊端。為了讓研究生準(zhǔn)確把握細(xì)胞生物學(xué)的前沿知識(shí)，實(shí)行雙語教學(xué)勢(shì)在必行。實(shí)行雙語教學(xué)對(duì)教師素質(zhì)有很高要求，青年教師一般具備較好的英語應(yīng)用能力，豐富的知識(shí)技能儲(chǔ)備以及充沛的精力保證，可作為重點(diǎn)對(duì)象進(jìn)行培養(yǎng)。在進(jìn)行雙語教學(xué)的過程中，教師應(yīng)注意教材的選擇要合適、采取滲透式雙語教學(xué)方式，循序漸進(jìn)，并應(yīng)加強(qiáng)與學(xué)生溝通，重視學(xué)生反饋，以提高學(xué)生專業(yè)英語水平，提高學(xué)生興趣為目的，同時(shí)，又不能給學(xué)生帶來過多的學(xué)業(yè)壓力。

三完善考評(píng)體系，建立綜合考核機(jī)制

傳統(tǒng)的考評(píng)即為試卷考試，難以真正反映學(xué)生的學(xué)習(xí)態(tài)度，無法充分調(diào)動(dòng)學(xué)生的積極性。為了讓所有學(xué)生真正做到主動(dòng)學(xué)習(xí)，參與到整個(gè)教學(xué)過程當(dāng)中，必須摒棄傳統(tǒng)的單一考核方式，建立新的課程綜合考核體系。如實(shí)行注重多元化的考核方式，將課程考核分為3部分，分別為理論考核（占30%）、文獻(xiàn)學(xué)習(xí)討論（占30%）、專題匯報(bào)（占40%）。其中每部分都側(cè)重對(duì)學(xué)生綜合能力的測(cè)評(píng)。即使在理論考核部分，除了涉及基礎(chǔ)理論知識(shí)，還要涉及最新的研究進(jìn)展和科研動(dòng)態(tài)，以及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)環(huán)節(jié)，以綜合考察學(xué)生學(xué)習(xí)的深度、廣度及靈活運(yùn)用能力。這樣的命題方法改變了傳統(tǒng)死記硬背的考試方式，可防止學(xué)時(shí)考前臨陣磨槍，臨時(shí)抱佛腳，督促學(xué)生注重加強(qiáng)平時(shí)的理論學(xué)習(xí)。文獻(xiàn)學(xué)習(xí)方面，要求學(xué)生之間、師生之間進(jìn)行互動(dòng)交流，會(huì)促使學(xué)生積極思考，能夠提出問題并找到解決問題的方法，相應(yīng)地學(xué)生就必須查閱大量相關(guān)文獻(xiàn)，可考查學(xué)生檢索文獻(xiàn)和匯報(bào)文獻(xiàn)的能力。專題匯報(bào)部分，要求學(xué)生凝練出一個(gè)科學(xué)問題，圍繞專題背景、熱點(diǎn)、難點(diǎn)、常規(guī)及最新研究技術(shù)方法等展開講述。通過學(xué)生的發(fā)言情況，了解學(xué)生對(duì)專題知識(shí)的掌握情況及學(xué)生對(duì)專題活動(dòng)的參與程度。

四重視教學(xué)能力，提高教師教學(xué)水平

近年來，很多高校學(xué)校定位發(fā)生變化，以建設(shè)研究型大學(xué)為發(fā)展目標(biāo)，以高水平科研工作為重點(diǎn)中心任務(wù)，對(duì)教學(xué)工作重視不夠[4]。重科研、輕教學(xué)已成為高校普遍存在的嚴(yán)重問題，許多教師尤其是年輕教師由于剛到工作崗位，缺乏教學(xué)經(jīng)驗(yàn)，教學(xué)能力明顯不足。對(duì)此，高校應(yīng)加強(qiáng)青年教師教學(xué)能力培養(yǎng)，可以采取以下措施。

（一）舉辦教學(xué)基本功競賽

一般情況下教學(xué)基本功競賽會(huì)對(duì)選題、備課、制作課件、上課等各個(gè)環(huán)節(jié)制定嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)，并優(yōu)選教學(xué)名師做評(píng)委。通過親歷比賽過程，年輕教師能夠較快的掌握教學(xué)各環(huán)節(jié)要點(diǎn)。有些老師可能存在某些小問題，平時(shí)自己卻沒有意識(shí)到，通過比賽，有經(jīng)驗(yàn)的評(píng)委老師很容易發(fā)現(xiàn)，并針對(duì)性幫助其解決、改進(jìn)。另外，學(xué)校應(yīng)重視教學(xué)，如加大教學(xué)成果在工作考核、職稱評(píng)定中的比例，以激發(fā)教師教學(xué)積極性，促進(jìn)教師教學(xué)能力的快速提升。

（二）建立“老中青傳幫帶”機(jī)制

建立專業(yè)教研室，充分發(fā)揮老教師對(duì)青年教師的傳幫帶作用。鼓勵(lì)青年教師先助課、多聽課，多參加教學(xué)研討活動(dòng)。加強(qiáng)學(xué)校教學(xué)指導(dǎo)委員會(huì)的督導(dǎo)和指導(dǎo)作用。教學(xué)指導(dǎo)委員會(huì)成員一般都是學(xué)校統(tǒng)一組織選舉的有責(zé)任心、師德高尚、專業(yè)知識(shí)淵博、教學(xué)經(jīng)驗(yàn)特別豐富的優(yōu)秀教師。教學(xué)指導(dǎo)委員會(huì)可以不定時(shí)去聽課，或針對(duì)特定教師進(jìn)行跟蹤聽課，可以起到一定督促作用，同時(shí)幫助他們解決教學(xué)過程中遇到的各種問題。

（三）加強(qiáng)網(wǎng)絡(luò)精品課程學(xué)習(xí)

現(xiàn)如今網(wǎng)絡(luò)信息日益發(fā)達(dá)，尤其是教育資源的開放共享已成為一種世界潮流。我國教育部于2003年正式啟動(dòng)中國精品課程建設(shè)項(xiàng)目，擬建成數(shù)千門覆蓋各學(xué)科領(lǐng)域，面向本科、研究生等不同層次的精品課程，而且免費(fèi)面向公眾，以實(shí)現(xiàn)優(yōu)質(zhì)教學(xué)資源網(wǎng)絡(luò)共享。如中山大學(xué)、北京大學(xué)、清華大學(xué)等知名高校都有細(xì)胞生物學(xué)的資源共享課。課程計(jì)劃、重點(diǎn)難點(diǎn)、課件、課后題以及教學(xué)案例都可供免費(fèi)參考和學(xué)習(xí)。

參考文獻(xiàn)

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篇6

關(guān)鍵詞：中藥 乳腺增生 細(xì)胞凋亡 表達(dá)

Doi：10.3969/j.issn.1671-8801.2014.02.005

【中圖分類號(hào)】R4 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1671-8801（2014）02-0005-01

細(xì)胞凋亡是在自身基因調(diào)控下，細(xì)胞自主產(chǎn)生程序性死亡的方式，現(xiàn)已成為醫(yī)學(xué)及生物學(xué)的熱點(diǎn)研究之一[1]。它涉及一系列的基因的激活、表達(dá)和調(diào)控的作用，通過這一死亡過程可使機(jī)體能夠更好的適應(yīng)生存環(huán)境，細(xì)胞凋亡已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，通過細(xì)胞凋亡的研究可以導(dǎo)致疾病新療法的出現(xiàn)，特別是細(xì)胞凋亡與腫瘤之間的密切關(guān)系倍受人們重視[2]。乳腺增生作為女性最為常見的疾病，占乳腺疾病的70%以上，乳腺增生與乳腺癌之間關(guān)系密切，全國腫瘤會(huì)議將非典型乳腺增生列為乳腺癌的前期病變。

1 細(xì)胞凋亡的簡述

細(xì)胞凋亡的特性。細(xì)胞凋亡不同于細(xì)胞壞死，它是細(xì)胞在一系列基因的激活、表達(dá)、調(diào)控等有序作用下細(xì)胞自動(dòng)死亡的過程，它不造成自體的損傷[3]。

細(xì)胞凋亡在形態(tài)學(xué)表現(xiàn)為早期變化為超微結(jié)構(gòu)的全部連接消失，微絨毛消失，細(xì)胞密度密度增加，核質(zhì)濃縮，核裂解為碎塊，細(xì)胞被分割數(shù)個(gè)凋亡小體，凋亡小體被鄰近細(xì)胞吞噬，凋亡小體被吞噬后快速降解。除形態(tài)學(xué)改變外，在細(xì)胞凋亡還發(fā)生許多內(nèi)部的變化，包括染色質(zhì)DNA的降解出現(xiàn)180～200bp的DN段、RNA/蛋白質(zhì)大分子的合成、鈣離子濃度的升高、內(nèi)源性核算內(nèi)切酶參與等[4]。

細(xì)胞凋亡的檢測(cè)方法。隨著分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的不斷發(fā)展，對(duì)細(xì)胞凋亡研究也有了更多認(rèn)識(shí)，并且針對(duì)細(xì)胞凋亡特征及機(jī)制而不斷出現(xiàn)新的細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法[5]。目前常見的細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法主要有，細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測(cè)，DNA斷裂/片斷檢測(cè)、磷脂酰絲氨酸外翻檢測(cè)、線粒體膜電位檢測(cè)、細(xì)胞活力檢測(cè)、細(xì)胞膜通透性檢測(cè)、Caspase-3等細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的分析、細(xì)胞內(nèi)DNA含量的分析、細(xì)胞凋亡相關(guān)mRNA水平的分析、細(xì)胞色素C定位檢測(cè)等。

細(xì)胞凋亡的發(fā)生途徑。細(xì)胞凋亡大致可以分為起始階段、整合階段和執(zhí)行階段3個(gè)階段，其過程總結(jié)起來為：接受凋亡信號(hào)凋亡調(diào)控分子間相互作用蛋白水解酶的活化進(jìn)入連續(xù)的反應(yīng)過程。就細(xì)胞凋亡發(fā)生途徑來說，目前可以分為死亡受體信號(hào)途徑、線粒體信號(hào)途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號(hào)途徑3種[6]。

細(xì)胞凋亡的調(diào)控基因。細(xì)胞凋亡是受基因高度調(diào)控的主動(dòng)死亡過程，影響細(xì)胞凋亡的基因按其表達(dá)產(chǎn)物作用不同可分為促進(jìn)細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞凋亡的基因兩大類。

促進(jìn)細(xì)胞凋亡的基因。p53基因是一種重要的抑癌基因，它與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。研究表明[7]，p53基因可以誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入G1期，抑制細(xì)胞增殖，直到DNA損傷得到修復(fù)，如修復(fù)失敗，突變型p53（mt p53）就誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Bax接到死亡信息后，由胞質(zhì)移位并插入到線粒體膜中，形成Bax通道，促進(jìn)細(xì)胞色素c釋放并進(jìn)入胞質(zhì)，使Bcl-2與apaf-1分離，后者可激活Caspase，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。此外，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的基因還有c-myc、Smac、Bak、Bok、Bax-xs、PUMA等。

抑制細(xì)胞凋亡的基因。Bcl-2被證實(shí)是最重要的有明顯抑制細(xì)胞凋亡作用的基因[8]，Bcl-2的亞細(xì)胞定位已經(jīng)明確，它在不同的細(xì)胞類型可以定位于線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以及核膜上，并通過阻止線粒體細(xì)胞色素C的釋放而發(fā)揮抗凋亡作用。IAP主要通過直接抑制Caspase或pro-caspase，阻斷 caspase家族成員介導(dǎo)的蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而抑制凋亡的進(jìn)程。IAP家族主要成員：survivin、livin和XIAP等。此外抑制細(xì)胞凋亡的基因還有C-myc、C-abl、Ras、V-src、Bcl-xL、Bcl-w、Mcl-1等。

2 中藥干預(yù)對(duì)乳腺增生組織細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

乳腺增生占乳腺疾病的70%以上，在育齡期女性最為常見，且發(fā)病年齡呈現(xiàn)出低齡化趨勢(shì)[9]。目前，主要采用藥物及手術(shù)治療乳腺增生。西醫(yī)采用性激素類藥物和碘制劑，如三苯氧胺、甲狀腺激素等；中醫(yī)治療乳腺增生的藥物有逍遙散、乳癖消I號(hào)等。手術(shù)只能切除局部病變，并不能起到完全根除的效果，其他部位仍可能發(fā)生或繼續(xù)生長。乳腺組織的細(xì)胞凋亡在乳腺增生疾病中普遍存在，在乳腺組織的生理、病理發(fā)展過程中以及維持乳腺組織正常形態(tài)結(jié)構(gòu)方面具有重要作用。近年來中藥對(duì)于乳腺組織細(xì)胞凋亡的干預(yù)治療研究在不斷的進(jìn)展。細(xì)胞凋亡研究對(duì)闡述發(fā)病機(jī)制具有推動(dòng)作用，通過研究乳腺增生細(xì)胞凋亡表現(xiàn)和基因調(diào)控情況，將有助于探討乳腺增生發(fā)生的基本規(guī)律，為尋找乳腺增生病因和闡明發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)，同時(shí)也會(huì)為治療乳腺增生和預(yù)防乳腺癌提供有力的幫助。

劉運(yùn)江等[10]采用免疫組化SP法檢測(cè)25例乳腺正常組織、25例乳腺腺病、35例乳腺不典型增生、13例乳腺增生惡變和12例浸潤性乳腺癌的乳腺組織中的skp2和p21的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，在乳腺正常組織、乳腺腺病中skp2和p21的表達(dá)為陰性，在乳腺不典型增生、乳腺增生惡變和浸潤性乳腺癌組織中的skp2和p21的表達(dá)陽性，Skp2和 P21均為乳腺增生惡變的危險(xiǎn)因素，結(jié)論是Skp2和 P21可作為診斷乳腺增生惡變及判斷乳腺不典型增生預(yù)后的指標(biāo)。

劉少杰、關(guān)健等[11，12]通過免疫組化SP檢測(cè)乳腺組織中凋亡抑制蛋白survivin的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，普通性導(dǎo)管增生、非典型性導(dǎo)管增生和導(dǎo)管內(nèi)癌的survivin表達(dá)水平依次增高，浸潤性乳腺癌組織survivin高表達(dá)率為53.0%。乳腺非典型性導(dǎo)管增生、導(dǎo)管內(nèi)癌和浸潤性癌組織的survivin表達(dá)水平高于癌旁正常乳腺組織。

張霞等[13]通過采用免疫組化SP法檢測(cè)41例乳腺良性增生，20例乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌，91例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌（有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移61例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30例），對(duì)乳腺良、惡性病變組織中l(wèi)ivin和Smac的表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)，正常乳腺、乳腺良性增生、乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌和乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中l(wèi)ivin的陽性率依次增高；乳腺良性增生、乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌、乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中中Smac的表達(dá)下降，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中Smac蛋白陽性率低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，TNM分期越高，乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中Smac蛋白陽性率越低，結(jié)論 Smac蛋白表達(dá)下降可能與乳癌的惡性發(fā)展有關(guān)。

蘇莎[14]通過溫陽散結(jié)法對(duì)大鼠乳腺增生病治療的研究發(fā)現(xiàn)，正常乳腺Ki67、PCNA幾乎無表達(dá)，Ki67和 PCNA 的表達(dá)水平隨著乳腺增生-癌前病變-乳腺癌病變程度的加重而升高，通過應(yīng)用溫陽散結(jié)法治療大鼠乳腺增生，Ki67和PCNA陽性表達(dá)率逐漸降低（P

王非等[15]通過消癖湯對(duì)肝郁型乳腺增生病大鼠乳腺組織PCNA、BcL-2、VEGF表達(dá)的影響發(fā)現(xiàn)，中藥消癖湯對(duì)乳腺增生大鼠乳腺組織細(xì)胞中的PCNA、BcL-2、VEGF呈抑制作用，能夠降低實(shí)驗(yàn)大鼠乳腺組織PCNA、BcL-2、VEGF的表達(dá)。說明消癖湯能夠通過抑制大鼠乳腺組織細(xì)胞增殖誘導(dǎo)凋亡和抑制腺體新生血管的形成來實(shí)現(xiàn)抑制大鼠乳腺增生的作用。

李湘奇等[16]通過對(duì)疏肝健脾方對(duì)模型大鼠乳腺增生組織細(xì)胞增殖/凋亡的影響研究發(fā)現(xiàn)，疏肝健脾方能夠抑制乳腺組織增生，降低 PCN A 和 Bcl - 2 的表達(dá)活性，增加 Bax的表達(dá)活性和凋亡指數(shù)，抑制乳腺組織細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。得出結(jié)論為疏肝健脾方能夠有效治療大鼠乳腺增生，可以降低大鼠乳腺增生組織中 PCN A 和 Bcl - 2 的表達(dá)，增加 Bax的表達(dá)，通過對(duì)大鼠乳腺增生組織細(xì)胞凋亡增殖/凋亡，阻斷/逆轉(zhuǎn)大鼠乳腺組織增生。

3 展望

乳腺增生嚴(yán)重影響到婦女的身心健康，甚至引發(fā)惡變而威協(xié)到婦女生命，且全國腫瘤會(huì)議已將非典型乳腺增生列為乳腺癌的前期病變。細(xì)胞凋亡的功能表達(dá)和維持個(gè)體正常生理過程具有重要的生物學(xué)意義，細(xì)胞凋亡可以闡明一類疾病的發(fā)病機(jī)制，也可由此產(chǎn)生治愈疾病的新療法。隨著我國中藥對(duì)乳腺增生組織細(xì)胞凋亡的研究不斷深入，使得乳腺增生組織細(xì)胞凋亡研究不斷取得突破性進(jìn)展。通過研究乳腺增生中細(xì)胞凋亡的基本表現(xiàn)、發(fā)生機(jī)理和基因調(diào)控，將有助于進(jìn)一步探討和揭示乳腺生物學(xué)的基本規(guī)律，在乳腺疾病的發(fā)生機(jī)理尋找新的治療藥物和方法人為調(diào)控細(xì)胞凋亡預(yù)防乳腺疾病的發(fā)生等方面均將具有重要的學(xué)術(shù)價(jià)值。

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篇7

【摘要】 目的： 基于側(cè)群（SP）細(xì)胞分選方法，初步鑒定卵巢癌干細(xì)胞（CSC) 表面標(biāo)志，為臨床靶向治療卵巢癌提供靶分子。方法： 檢測(cè)、分離卵巢癌細(xì)胞株A2780中的SP細(xì)胞，并對(duì)SP與NonSP細(xì)胞作細(xì)胞生物學(xué)鑒定，包括克隆形成能力、致瘤能力、耐藥性、定量ATP結(jié)合框蛋白家族G2蛋白 (ABCG2)檢測(cè)等；進(jìn)一步用免疫磁選方法篩出ABCG2+及ABCG2-細(xì)胞，同樣作上述細(xì)胞生物學(xué)鑒定，探討ABCG2分子能否作為卵巢CSC的表面標(biāo)志。結(jié)果： 卵巢癌A2780細(xì)胞株中的SP細(xì)胞在體外強(qiáng)克隆形成能力、裸鼠體內(nèi)的高致瘤性、對(duì)化療藥物長春新堿較強(qiáng)耐受性及高表達(dá)ABCG2分子等生物學(xué)特性基本符合CSC的特征。ABCG2＋細(xì)胞的克隆增殖能力略強(qiáng)于ABCG2-細(xì)胞；ABCG2+細(xì)胞的耐藥性與SP細(xì)胞的耐藥性一致。結(jié)論： A2780細(xì)胞株中的SP細(xì)胞基本符合CSC的生物學(xué)特征，其高表達(dá)的ABCG2分子參與維持SP細(xì)胞表型，特別是多藥耐藥性。ABCG2分子可作為靶向治療CSC的靶分子，逆轉(zhuǎn)腫瘤的多藥耐藥性。

【關(guān)鍵詞】 側(cè)群細(xì)胞　卵巢癌　癌干細(xì)胞　ABCG2分子　靶向治療

Abstract： Objective To explore a target molecule for the clinical targeted therapy of ovarian cancer. Methods The SP cells and non SP cells were isolated respectively from the human ovarian cell 2780 strain by fluorescence activated cell sorting (FACS) and their biological characteristics were identified by analysis of their ability to form colonies in common media， tumorigenicity in Balb/c nude mice， and of their resistance to chemotherapeutic agents vinblastin. The expression of ABCG2 was detected with realtime quantitative RTPCR (qRTPCR). The specific ABCG2 phenotype cells were further isolated from the ovarian cell A2780 strain for the same identification as above by the monoantibody labeled with immune magnetic beads by magnetic activated cell sorting system. Results The SP cells proliferative potency， clone formation ability in the common media， the tumorigenicity in Balb/c nude mice， and resistance to vinblastin in vitro were basically coincident with characteristics of cancer stem cells（CSC）. The ABCG2＋cells proliferative potency and resistance to vinblastin in vitro were higher than those of the ABCG2-cells. Conclusion The SP cells in the ovarian cell 2780 strain possess the traits of ovarial CSC and expressed ABCG2 molecule maintains the SP cells phenotype， especially in multidrug resistance. The ABCG2 molecule may be responsible for target molecule of the targeted therapy of ovarian cancer and for inversion of multidrug resistance in ovarian cancer.

Key words：side population cells; ovarian cancer; cancer stem cells; ABCG2 molecule; target therapy

卵巢癌是女性生殖器官常見腫瘤，發(fā)病率在婦科惡性腫瘤中列居第三，但其致死率卻為各類婦科腫瘤之首［1］，因此，探索治療卵巢癌的新途徑，已成為進(jìn)一步提高卵巢癌患者生存率的關(guān)鍵。隨著干細(xì)胞(stem cells， SC)研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)腫瘤是一種SC疾病。許多證據(jù)表明，大多數(shù)的腫瘤組織中存在著具有SC特征的“起始腫瘤細(xì)胞”(tumor initial cells， TIC)，稱為癌干細(xì)胞(cancer stem cells， CSC)，其是腫瘤增長、耐藥及復(fù)發(fā)的根源［2］。分離與鑒定是CSC研究的第一步，由于CSC缺乏已知的統(tǒng)一特異性標(biāo)記，分離和鑒定成為CSC研究的難點(diǎn)。本研究主要通過側(cè)群（side population，SP）細(xì)胞分選結(jié)合ATP結(jié)合框蛋白家族G2蛋白（ATPbinding cassette G2， ABCG2)等方法初步研究卵巢CSC，其中SP細(xì)胞是指可將熒光染料Hoechst33342泵出細(xì)胞外、表現(xiàn)弱熒光信號(hào)的細(xì)胞群，占總體細(xì)胞的很少部分［3］。在缺乏顯著CSC分子標(biāo)記的情況下，SP細(xì)胞的篩選分析可以作為CSC鑒定的一種實(shí)用而簡易的重要方法［4］。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及細(xì)胞株

Balb/c系的4～6周雌性裸鼠，購于上海動(dòng)物模式中心。人卵巢癌細(xì)胞株A2780購于南京中醫(yī)藥大學(xué)，于加10%新生小牛血清的1640培養(yǎng)液中，在37 ℃、5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 A2780細(xì)胞中SP/NonSP細(xì)胞流式檢測(cè)和分選實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長期的單層培養(yǎng)細(xì)胞，制成單個(gè)細(xì)胞懸液，實(shí)驗(yàn)組加入Hoechst33342至終濃度5 μg·ml-1，對(duì)照組再加入Verapamil至終濃度50 μg·ml-1，37 ℃水浴90 min，重懸于冰冷的含2%小牛血清的PBS中，上流式細(xì)胞分選儀(fluorescenceactivated cell sorting， FACS)檢測(cè)。以355 nm UV激發(fā)光源、610 nm雙色短通反射濾鏡、450 nm和675 nm邊緣長通濾片分別檢測(cè)散射光藍(lán)光及紅光部分，線性模式采集信號(hào)，將細(xì)胞中熒光信號(hào)分為兩個(gè)部分，以Hoechst 紅點(diǎn)為X軸，Hoechst 藍(lán)點(diǎn)為Y軸作二維散點(diǎn)圖，將低Hoechst 紅點(diǎn)及低Hoechst 藍(lán)點(diǎn)且對(duì)照組缺失的區(qū)域設(shè)定為SP細(xì)胞的“門” ［5］，將只加入Hoechst33342的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞分選出SP細(xì)胞及NonSP細(xì)胞。

1.2.2 克隆（集落）形成實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 平皿克隆形成實(shí)驗(yàn)

將分選的SP及NonSP細(xì)胞懸液按每皿含100個(gè)細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中。在37 ℃、5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時(shí)終止培養(yǎng)，甲醇固定，姬姆薩染液染色后計(jì)數(shù)，用肉眼直接計(jì)數(shù)克隆數(shù)，或在顯微鏡下計(jì)數(shù)大于50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)。按公式“克隆形成率=克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%”計(jì)算克隆形成率。

1.2.2.2 軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)

24孔培養(yǎng)板中每孔分別澆入含0.5%低熔點(diǎn)瓊脂的底層瓊脂0.8 ml以及含0.3%瓊脂和一定細(xì)胞密度（分別含有100個(gè)細(xì)胞）的上層瓊脂0.8 ml，置于室溫使瓊脂凝固。在37 ℃、5%CO2及飽和濕度環(huán)境下靜止培養(yǎng)。第10天鏡下計(jì)數(shù)直徑大于75 μm或含50個(gè)細(xì)胞以上的克隆，并計(jì)算克隆形成率。

1.2.3 裸鼠體內(nèi)致瘤實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 SP/NonSP細(xì)胞裸鼠體內(nèi)致瘤實(shí)驗(yàn)

4～6周齡Balb/c系雌裸鼠隨機(jī)分為SP細(xì)胞組及NonSP細(xì)胞組，每組3只裸鼠，背部皮下注射對(duì)應(yīng)的細(xì)胞懸液100 μl 5×104個(gè)細(xì)胞，隨后監(jiān)測(cè)各組小鼠腫瘤生長時(shí)間。

1.2.3.2 ABCG2+/ABCG2-細(xì)胞裸鼠體內(nèi)致瘤實(shí)驗(yàn)

4～6周齡Balb/c系雌性裸鼠隨機(jī)分為ABCG2+細(xì)胞組及ABCG2-細(xì)胞組，每組6只，背部皮下注射對(duì)應(yīng)的細(xì)胞懸液100 μl 5×104個(gè)細(xì)胞，隨后監(jiān)測(cè)各組小鼠腫瘤生長時(shí)間。

1.2.4 MTT法檢測(cè)SP和NonSP細(xì)胞對(duì)長春新堿耐受性

取分選得到的SP/NonSP細(xì)胞接種于96孔板，實(shí)驗(yàn)組加入濃度為10 μg·ml-1的長春新堿溶液10 μl至終濃度0.5 μg·ml-1， 培養(yǎng)72 h后 MTT法檢測(cè)細(xì)胞的存活率。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)SP/NonSP細(xì)胞ABCG2基因表達(dá)

檢測(cè)ABCG2：PCR上游引物5′GGCAGATGCCTT

CTTCGTTATGATG3′，下游引物5′TGGTTGTGAGATT

GACCAACAGACC3′。 檢測(cè)βactin：PCR上游引物5′GGACTTCGAGCAAGAGATGG3′，下游引物5′AGC

ACTGTGTTGGCGTACAG3′。

反應(yīng)體系置入ABI 7300 RealTime PCR儀按如下程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增：94 ℃預(yù)變性4 min，進(jìn)入3步循環(huán)(94 ℃30 s，57 ℃30 s，72 ℃35 s，共45個(gè)循環(huán))，在3步循環(huán)中的每個(gè)反應(yīng)循環(huán)結(jié)束時(shí)，RealTime PCR儀記錄SYBRGreenⅠ釋放的熒光。以逆轉(zhuǎn)錄合成樣品的cDNA產(chǎn)物作為模板，按相同的反應(yīng)體系進(jìn)行目的基因ABCG2和內(nèi)參βactin的Real TimePCR擴(kuò)增反應(yīng)，并以ddH2O為模板設(shè)陰性對(duì)照，電腦采集每個(gè)循環(huán)的數(shù)值。使用7300 System SDS Software進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

1.2.6 利用免疫磁選技術(shù)分離獲取ABCG2+表型細(xì)胞

制備A2780單細(xì)胞懸液，每107 個(gè)細(xì)胞加20 μl一抗，混勻后6～12 ℃孵育10～15 min。每107個(gè)細(xì)胞再加20 μl磁珠二抗，混勻后6～12 ℃孵育15 min或冰育20～30 min。然后用1000 μl緩沖液洗滌細(xì)胞兩次以去除多余的抗體，每107個(gè)細(xì)胞重懸于100 μl Buffer中過柱，在磁場力的作用下，未能標(biāo)記上ABCG2分子抗體的細(xì)胞不會(huì)在磁場中停留，用1500 μl Buffer沖洗柱子。收集陰性細(xì)胞培養(yǎng)，移開分離柱收集陽性細(xì)胞。

1.2.7 ABCG2+/ABCG2-/經(jīng)抗體孵育ABCG2+細(xì)胞對(duì)長春新堿耐受性

取分選得到的ABCG2+/ABCG2-，接種于96孔板，實(shí)驗(yàn)組加入濃度為10 μg·ml-1的長春新堿溶液10 μl至終濃度0.5 μg·ml-1，經(jīng)抗體孵育ABCG2+細(xì)胞組同時(shí)加入ABCG2單抗2 μl·孔-1，培養(yǎng)72 h后MTT法檢測(cè)細(xì)胞的存活率。

2 結(jié) 果

2.1 SP/NonSP細(xì)胞流式檢測(cè)、分選及細(xì)胞生物學(xué)功能的鑒定

FACS檢測(cè)出A2780 細(xì)胞中的SP細(xì)胞比例約為2.6%（B值2.7%減去A值0.1%，圖1）。將圖1B中門區(qū)域的細(xì)胞分選下來，分選所得的SP/NonSP細(xì)胞分別行相關(guān)的細(xì)胞生物學(xué)鑒定。克隆形成實(shí)驗(yàn)是測(cè)定單個(gè)細(xì)胞增殖能力的有效方法之一［6］，常見的方法有平板克隆（圖2A）和軟瓊脂克隆（圖2B）形成實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)顯示，SP細(xì)胞的平板克隆率及軟瓊脂克隆率均明顯高于NonSP細(xì)胞（圖2C），兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。在軟瓊脂克隆實(shí)驗(yàn)中SP細(xì)胞多為克隆球形式存在，而NonSP細(xì)胞則很難形成克隆球，多以散在細(xì)胞存在（圖2B）。裸鼠體內(nèi)致瘤實(shí)驗(yàn)中，2周內(nèi)SP細(xì)胞組2只裸鼠長出了腫瘤(2/3)，NonSP細(xì)胞組在8周后仍無腫瘤生長（0/3），余鼠在10周后均無腫瘤生長(圖2D)。 SP/NonSP細(xì)胞對(duì)長春新堿耐受性實(shí)驗(yàn)中，0.5 μg·ml-1濃度長春新堿作用于這兩種細(xì)胞72 h，用MTT法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，對(duì)SP細(xì)胞的生長抑制作用不明顯，其存活率約為81%，而對(duì)NonSP細(xì)胞的抑制作用明顯，其存活率僅為37%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，圖3）。用定量RTPCR檢測(cè)SP細(xì)胞與NonSP細(xì)胞ABCG2表達(dá)量，結(jié)果顯示，SP細(xì)胞約是NonSP細(xì)胞的5.8倍（圖4）。

2.2 A2780細(xì)胞中ABCG2+/ABCG2-細(xì)胞生物學(xué)鑒定

首先利用免疫磁珠分離技術(shù)獲取A2780細(xì)胞中的ABCG2+表型細(xì)胞，1×107 個(gè)A2780 細(xì)胞可得到約2×105個(gè)ABCG2+細(xì)胞，即A2780細(xì)胞中ABCG2+表型細(xì)胞占2%左右，其含量與SP細(xì)胞的比例相似。將分選所得的ABCG2+/ABCG2-細(xì)胞行相關(guān)的細(xì)胞生物學(xué)特性鑒定，在細(xì)胞體外克隆形成實(shí)驗(yàn)中，ABCG2+細(xì)胞在平板克隆率及軟瓊脂克隆率均略高于ABCG2-細(xì)胞（圖5），但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05)。在裸鼠體內(nèi)致瘤實(shí)驗(yàn)中， ABCG2+細(xì)胞組在細(xì)胞接種后5周時(shí)6只裸鼠中2只長出了肉眼可見的腫瘤(2/6)， ABCG2-細(xì)胞組在細(xì)胞接種后第5周時(shí)6只裸鼠中1只長出了肉眼可見的腫瘤(1/6)，其余鼠在接種后10周始終沒有腫瘤的生長，兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分別將A2780細(xì)胞株分選的ABCG2+/ABCG2-、ABCG2+加抗體孵育的各組細(xì)胞進(jìn)行長春新堿耐受性比較，發(fā)現(xiàn)藥物對(duì)ABCG2+細(xì)胞的生長抑制不明顯，其細(xì)胞存活率約為79%，而對(duì)ABCG2-細(xì)胞組的生長抑制明顯，其細(xì)胞存活率僅為35%，對(duì)ABCG2+細(xì)胞且加入抗ABCG2抗體共同培養(yǎng)組的細(xì)胞生長抑制也很明顯，其細(xì)胞存活率約為38%，較未加抗體組明顯下降，反映了ABCG2分子可能介導(dǎo)了細(xì)胞對(duì)藥物的耐受（圖6）。

3 討 論

分離與鑒定是CSC研究的第一步，由于多數(shù)CSC缺乏明確的特異性標(biāo)記，分離和鑒定成為CSC研究的難點(diǎn)。目前，從形態(tài)學(xué)上很難區(qū)分CSC與腫瘤細(xì)胞間的差異，只能用功能學(xué)方法即從其自我更新能力和分化潛力來鑒定CSC。分離CSC主要有：SP細(xì)胞分選、無血清培養(yǎng)富集干細(xì)胞及通過CSC表面特異性標(biāo)志篩選3種方法［7］。其中SP細(xì)胞是1996年Goodell等［3］在用Hoechst33342染色法研究全骨髓時(shí)，發(fā)現(xiàn)有極少一部分細(xì)胞可以將進(jìn)入細(xì)胞核的熒光染料排出胞外，在熒光顯微鏡下觀察或流式細(xì)胞儀檢測(cè)時(shí)表現(xiàn)為不著色，他們將這類細(xì)胞命名為“SP”細(xì)胞，將這種表型命名為“SP表型”，該表型細(xì)胞還表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志 Sca1+ Linneg/low。現(xiàn)發(fā)現(xiàn)SP細(xì)胞廣泛存在于多種生物的多種正常組織中，并同時(shí)存在于多種腫瘤細(xì)胞系及腫瘤組織中［89］。隨著對(duì)SP細(xì)胞研究的深入，發(fā)現(xiàn)SP細(xì)胞的功能與正常干細(xì)胞相似，如SP細(xì)胞可發(fā)生不對(duì)稱分裂、進(jìn)行自我更新等［10］。多項(xiàng)研究表明，部分腫瘤(乳腺癌、前列腺癌、腦膠質(zhì)瘤等)中SP細(xì)胞具有CSC特性，即表達(dá)干細(xì)胞相關(guān)表面標(biāo)志，具有自我更新、強(qiáng)致瘤能力和高表達(dá)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ABCG2［11］等。研究顯示，在卵巢癌細(xì)胞中存在致瘤性較強(qiáng)的SP細(xì)胞［1213］，因此，我們利用SP細(xì)胞與干細(xì)胞、CSC具有許多共性的特點(diǎn)來探討SP細(xì)胞分選法能否作為卵巢CSC分離鑒定的有效方法，并以此為基礎(chǔ)初步研究卵巢CSC表面特異性標(biāo)志。本研究的結(jié)果顯示，卵巢癌A2780細(xì)胞株中的確有SP細(xì)胞存在，雖然僅占很少部分（約2.6%），但其較強(qiáng)的克隆形成能力、致瘤能力、耐藥性及ABCG2基因表達(dá)顯示，SP細(xì)胞的生物學(xué)特性基本符合CSC 的特征。本研究使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，SP細(xì)胞中ABCG2分子的表達(dá)量明顯高于NonSP細(xì)胞，因此我們推測(cè)ABCG2分子可能是卵巢CSC表面的一個(gè)特異性分子標(biāo)志。ABCG2分子屬ATP結(jié)合框轉(zhuǎn)運(yùn)體(ATPbinding cassette transporter， ABC)家族所介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞多重耐藥分子家族中的一種，屬跨膜藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，是抗腫瘤藥物難以發(fā)揮效應(yīng)的關(guān)鍵耐藥蛋白［1417］。本研究發(fā)現(xiàn)，ABCG2+細(xì)胞的體外克隆能力及裸鼠體內(nèi)致瘤能力僅略高于ABCG2-細(xì)胞，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明ABCG2分子的高表達(dá)與卵巢CSC的強(qiáng)細(xì)胞增殖能力無明顯關(guān)系，維持卵巢CSC高增殖能力的特性可能還有其它分子參與，如其它干細(xì)胞標(biāo)志等還需進(jìn)一步研究。而ABCG2+細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐受能力則明顯高于ABCG2-細(xì)胞，且ABCG2+細(xì)胞加入ABCG2單克隆抗體孵育后能使ABCG2+細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐受性明顯降低，說明ABCG2分子是參與維持卵巢癌細(xì)胞多藥耐藥性的一個(gè)主要分子標(biāo)志。

綜上所述，卵巢癌A2780細(xì)胞株中的SP細(xì)胞符合CSC的特性，分離SP細(xì)胞能夠富集卵巢CSC，這為下一步研究CSC的特異性標(biāo)記奠定了基礎(chǔ)，并為開展對(duì)卵巢CSC藥物防治，尤其是為有效的靶向治療等研究提供了科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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篇8

摘要:概述了植物細(xì)胞分化的模式系統(tǒng)———管狀分子分化實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的建立以及基于該系統(tǒng)的管狀分子分化的生理學(xué)、細(xì)胞學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)等方面的研究進(jìn)展，并對(duì)今后的研究方向進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞:百日草;次生細(xì)胞壁;細(xì)胞分化;管狀分子

管狀分子(TraehearyElements，TEs)是維管植物木質(zhì)部內(nèi)導(dǎo)管和管胞的總稱，皆為長柱狀細(xì)胞，次生壁木質(zhì)化，成熟后均缺乏原生質(zhì)體，其功能是輸導(dǎo)水分、礦質(zhì)元素和機(jī)械支持作用。導(dǎo)管和管胞差別是，管胞無穿孔，管胞間壁僅有具緣紋孔，借以實(shí)現(xiàn)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn);而導(dǎo)管分子間的某些區(qū)域具有穿孔，多個(gè)導(dǎo)管分子通過末端的穿孔連接形成一個(gè)長的管道，即導(dǎo)管，與管胞相比，其輸導(dǎo)能力大大增強(qiáng)。管狀分子來源于形成層，由形成層細(xì)胞經(jīng)過細(xì)胞擴(kuò)增、次生壁沉積、胞內(nèi)物質(zhì)自溶、形成端壁穿孔等步驟而形成。管狀分子分化已被作為植物細(xì)胞分化的模式系統(tǒng)，在形態(tài)結(jié)構(gòu)、生化和分子組成、發(fā)育及生理功能上都具有明顯的特點(diǎn)，是植物解剖學(xué)、發(fā)育生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的研究熱點(diǎn)之一。多年來，各國學(xué)者建立了整體實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)和離體實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，對(duì)管狀分子的形態(tài)解剖學(xué)、生理學(xué)以及分子機(jī)制進(jìn)行了一定的研究。其中，百日草(ZinniaelegansJacq．)葉肉細(xì)胞離體培養(yǎng)系統(tǒng)是目前分化效果最好的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，人們利用該系統(tǒng)開創(chuàng)性地研究了離體條件下管狀分子分化的基本過程，并對(duì)管狀分子分化的細(xì)胞學(xué)、生理學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)進(jìn)行了卓有成效的研究。筆者擬對(duì)30多年來人們利用百日草葉肉細(xì)胞離體培養(yǎng)系統(tǒng)的研究成果進(jìn)行概述，為進(jìn)一步闡明管狀分子分化機(jī)制提供基礎(chǔ)。

1離體實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的建立

因?yàn)楣軤罘肿有螒B(tài)隨著分化進(jìn)程而發(fā)生顯著變化，其中包括環(huán)紋、螺紋和網(wǎng)紋次生細(xì)胞壁(SCW)的形成以及自溶作用。所以，管狀分子分化被認(rèn)為是植物細(xì)胞分化的模式系統(tǒng)。然而，大多數(shù)早期關(guān)于分化的研究，采用的是多細(xì)胞系統(tǒng)，這樣的系統(tǒng)包含幾種作為起始材料的細(xì)胞類型，為追蹤單個(gè)細(xì)胞分化過程帶來了困難。Kohlenbach和Schmidt發(fā)現(xiàn)，以機(jī)械法分離的單個(gè)百日草葉肉細(xì)胞可直接分化為管狀分子，這促使Fukuda和Komamine在此基礎(chǔ)上，建立了一個(gè)有效的、高頻分化的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。該系統(tǒng)已被全世界許多實(shí)驗(yàn)室廣泛應(yīng)用，有時(shí)根據(jù)特定情況僅僅對(duì)一些細(xì)節(jié)進(jìn)行了修改。用液體介質(zhì)浸漬百日草葉片，研磨后，以小網(wǎng)眼篩過濾，液體介質(zhì)反復(fù)漂洗懸浮液，分離得到單個(gè)葉肉細(xì)胞。要注意:(1)材料要適當(dāng)。取幼苗第一對(duì)葉，而非成年植物最嫩的葉片。(2)條件要適當(dāng)。旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為10r/min，0．3～0．4mol/L山梨醇調(diào)節(jié)滲透壓，生長調(diào)節(jié)劑為0．1mg/La-萘乙酸(NAA)和1mg/L6-芐基腺嘌呤(6-BA)，起始細(xì)胞濃度為(0．4～3．8)×108細(xì)胞/L。這樣，幾乎30%分離葉肉細(xì)胞，在適當(dāng)?shù)碾x體培養(yǎng)條件下，可半同步地分化為管狀分子。

2細(xì)胞學(xué)、生理學(xué)和生物化學(xué)方面的研究

百日草實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的建立促進(jìn)了管狀分子分化諸多方面的研究。初步的細(xì)胞學(xué)和生理學(xué)研究表明，細(xì)胞分裂不是管狀分子分化的前提條件，而一些DNA合成在分化中發(fā)揮重要作用;以肌動(dòng)蛋白依賴的微管重組，限定了次生細(xì)胞壁的特有格局;分化過程是動(dòng)態(tài)的，細(xì)胞變化表現(xiàn)在次生細(xì)胞壁沉積前細(xì)胞器數(shù)量的增加，次生細(xì)胞壁沉積開始不久次生細(xì)胞壁木質(zhì)化啟動(dòng)，原生質(zhì)體逐漸自溶，初生壁非木質(zhì)化部分的局部水解，分化過程終止。另外，百日草系統(tǒng)已清晰地證明，管狀分子分化受植物激素諸如生長素、細(xì)胞分裂素、油菜素內(nèi)酯、赤霉素、一氧化氮、乙烯、信號(hào)肽(例如CLE肽、木質(zhì)素、植物磺肽素)的調(diào)控;另外，大量生化和免疫學(xué)研究，揭示了細(xì)胞壁成分諸如纖維素、木聚糖、木質(zhì)素和其他次生壁特有分子的變化，以及自溶過程中的各種事件，諸如蛋白質(zhì)和核酸的降解等。

3相關(guān)基因的鑒定與描述

人們也用分子生物學(xué)方法，進(jìn)一步分析了百日草實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中管狀分子分化的分子機(jī)制。運(yùn)用同源克隆法(例如，核酸酶ZEN1，肉桂醇脫氫酶和過氧物酶，b-微管蛋白，油菜素內(nèi)酯合成酶和Rho/RacsmallGTPases)，差示篩選法(例如，分化標(biāo)記，管狀分子分化相關(guān)的(TED)2-4(Tra-chearyElementDifferentiation-related(TED)2-4)，果膠裂解酶)，消減雜交法(例如，核糖核酸酶及分化標(biāo)記、蛋白酶和木質(zhì)素合成酶)、全面的轉(zhuǎn)錄組分析微陣列和cDNA-AFLP，分別鑒定了許多與編碼管狀分子特定事件相關(guān)蛋白質(zhì)的cDNA，和限定管狀分子分化特定階段的標(biāo)記蛋白。因?yàn)榘偃詹蒉D(zhuǎn)化方法尚不穩(wěn)定，所以其分離基因的功能分析受到很大制約(例如，果膠裂解酶ZePel，TED4，過氧物酶ZPO-C)。然而，最近，通過基因槍法和電穿孔轉(zhuǎn)染法，瞬間將基因或雙鏈RNAs導(dǎo)入百日草細(xì)胞，成功地描述了其他基因的功能，這可能為管狀分子分化相關(guān)基因功能的分析提供了有益的線索。

4其他植物的研究

在利用百日草實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，研究管狀分子分化調(diào)控的基礎(chǔ)上，建立了擬南芥人工培養(yǎng)細(xì)胞的管狀分子分化系統(tǒng)，該系統(tǒng)在油菜素內(nèi)酯調(diào)控下，有30%～50%繼代細(xì)胞分化為管狀分子。后續(xù)的基因芯片分析表明，多數(shù)擬南芥基因在管狀分子分化期間特異表達(dá)，這些基因包括編碼植物特定NAC-do-main轉(zhuǎn)錄因子VND1-7的基因家族，借以最終揭示長久以來尋找的管狀分子分化的轉(zhuǎn)錄開關(guān)。在某些植物和人工培養(yǎng)細(xì)胞中，VND基因被作為管狀分子異常分化的有效誘導(dǎo)物。

5待解決的問題和未來研究展望

管狀分子分化百日草葉肉細(xì)胞離體實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的研究在草本植物中廣泛展開。該系統(tǒng)為誘導(dǎo)和促進(jìn)管狀分子分化的研究建立了有效的平臺(tái)，并獲得了一些關(guān)鍵基因和調(diào)節(jié)因子，初步揭示了管狀分子分化的機(jī)制，為在單細(xì)胞水平上認(rèn)識(shí)細(xì)胞分化和轉(zhuǎn)分化途徑、分化過程影響因素提供了可能，但復(fù)雜、精確的分子機(jī)制的構(gòu)建仍需進(jìn)一步研究。

(1)管狀分子分化具有復(fù)雜的時(shí)空特異性，調(diào)控網(wǎng)絡(luò)綜合而龐大，雖然生長素和細(xì)胞分裂素是管狀分子分化的基本調(diào)節(jié)激素，已有學(xué)者對(duì)2者進(jìn)行了大量研究并取得一定的成果，但是其他激素諸如赤霉素、乙烯、脫落酸、油菜素內(nèi)酯等作用效果研究資料極少，所以，植物激素作用機(jī)制的研究尚未明確。

(2)管狀分子分化是植物細(xì)胞凋亡的典型例子，成熟的管狀分子喪失了細(xì)胞核和細(xì)胞內(nèi)容物，成為死的、中空的管狀細(xì)胞。目前對(duì)管狀分子細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑知之甚少，需要進(jìn)一步探索。

(3)以草本植物百日草，甚至擬南芥為材料得到的管狀分子分化的初步機(jī)制，是否適合木本植物，尚需驗(yàn)證。

(4)雖然百日草系統(tǒng)較為成熟，管狀分子分化率和同步性較高，但隨著研究的深入，仍需進(jìn)一步改進(jìn)和優(yōu)化游離單細(xì)胞的離體培養(yǎng)方法，摸索分化的最佳條件，提高分化率和同步性。

篇9

【關(guān)鍵詞】 鼻息肉；致病因素；研究進(jìn)展

鼻息肉是由于鼻黏膜長期炎性反應(yīng)所引起的組織水腫，是耳鼻喉科常見的疾病，其發(fā)生與發(fā)展與全身疾病相關(guān)。鼻息肉多來源于中鼻道竇口，鼻道復(fù)合體與篩竇，高度水腫的鼻黏膜常經(jīng)由中鼻道、竇口向鼻腔內(nèi)膨出下垂，從而形成鼻息肉，由于其病因具有多元性且術(shù)后易于復(fù)發(fā)，是目前鼻科疾病中較為棘手的問題。近年來，隨著免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)等學(xué)科研究的進(jìn)展使鼻息肉在致病因素研究方面取得了較大的進(jìn)展[1]。目前臨床上普遍認(rèn)為該病多因素共同作用下黏膜慢性持續(xù)性炎癥所引起的，相關(guān)致病因素在其發(fā)生與發(fā)展過程中有著至關(guān)重要的作用。現(xiàn)根據(jù)相關(guān)資料對(duì)鼻息肉致病因素做一綜述，進(jìn)一步探討其研究進(jìn)展。

1 感染性因素

目前臨床研究領(lǐng)域?qū)Ρ窍⑷獾陌l(fā)生機(jī)制多認(rèn)為是由多種致病因素作用，導(dǎo)致黏膜的持續(xù)炎性反應(yīng)，不同患者的致病因素也不盡相同。感染性因素是指由細(xì)菌、真菌、病毒等引起黏膜的慢性持續(xù)性炎癥，其始終是鼻息肉發(fā)病機(jī)制研究的重點(diǎn)。國內(nèi)外許多學(xué)者在研究鼻息肉發(fā)病機(jī)制時(shí)紛紛提出了金葡萄菌腸毒素不能夠促使淋巴細(xì)胞與嗜酸粒細(xì)胞的大量聚集和黏膜浸潤，分析可能是導(dǎo)致鼻息肉發(fā)生的原始因素[2]。部分報(bào)道中還指出，在接近50%的鼻息肉患者組織標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)了金葡萄菌腸毒素，在正常人的組織標(biāo)本中則未發(fā)現(xiàn)。大量臨床研究表明，鼻息肉的發(fā)生與發(fā)展與機(jī)體抗感染免疫因素有密切關(guān)系，在鼻息肉患者中Tool樣受體2與TLR-4均呈現(xiàn)高表達(dá)，進(jìn)一步證明了感染性因素在鼻息肉發(fā)生過程中的重要性[3]與此同時(shí)，感染性因素在鼻息肉發(fā)病中的重要地位從呼吸道感染患者鼻息肉發(fā)病較高這一點(diǎn)也可以得到佐證

2 變態(tài)反應(yīng)因素

在現(xiàn)階段的臨床研究中，認(rèn)為EOS浸潤是大多數(shù)鼻息肉患者病理組織學(xué)表現(xiàn)的重要特點(diǎn)之一，傳統(tǒng)學(xué)術(shù)觀點(diǎn)認(rèn)為，變態(tài)反應(yīng)因素在鼻息肉的發(fā)生及發(fā)展中起到了關(guān)鍵作用。然而仍有研究表明以EOS浸潤為主要病理組織學(xué)表現(xiàn)的鼻息肉患者，與局部IgE增高和過敏疾病史的關(guān)系并不密切。在青年及兒童鼻息肉患者中合并特應(yīng)性鼻炎、外源性哮喘、枯草熱等存在確定變應(yīng)原的病例并不多見，而在中年內(nèi)源性哮喘患者中鼻息肉卻比較常見，因此，有部分學(xué)者認(rèn)為鼻息肉在非特應(yīng)性疾病患者中的高發(fā)病率說明了鼻息肉患者組織中EOS增多與變態(tài)反應(yīng)并無密切聯(lián)系，可能是同時(shí)發(fā)生，并不具備因果關(guān)系。王鴻等研究中指出慢性鼻竇炎鼻息肉患者中大多數(shù)患者伴有不同程度的變應(yīng)性癥狀及體征，部分患者合并變應(yīng)性鼻炎，少數(shù)患者合并支氣管哮喘。研究發(fā)現(xiàn)在存在既往手術(shù)史的慢性鼻竇炎鼻息肉患者中，38.3%的患者鼻息肉的發(fā)生與變態(tài)反應(yīng)因素有關(guān)。此外，在慢性鼻竇炎鼻息肉合并變應(yīng)性鼻炎的患者中，58.7%的患者存在前期手術(shù)史[4]。進(jìn)一步說明了在鼻息肉的發(fā)生及發(fā)展中，變態(tài)反應(yīng)因素雖然不能全面揭示鼻息肉的發(fā)生機(jī)制，但變應(yīng)性因素卻與鼻息肉的發(fā)生、發(fā)展，以及術(shù)后復(fù)發(fā)有著十分密切的聯(lián)系

3 過敏性因素

在目前的臨床研究中過敏因素也被認(rèn)為是鼻息肉發(fā)生的潛在因素之一，關(guān)于鼻息肉發(fā)病機(jī)制的大量研究認(rèn)為鼻息肉的發(fā)生與局部微環(huán)境中以EOS為主的炎性細(xì)胞因子與細(xì)胞因子調(diào)控自身延續(xù)所行程的慢性炎癥性腫塊。許多研究表明鼻黏膜局部所發(fā)生的由TGE介導(dǎo)引起的變態(tài)反應(yīng)，能夠釋放出大量白三烯、組胺及炎性細(xì)胞趨化因子，導(dǎo)致病變周圍局部血管擴(kuò)張、水腫、滲出增加、腺體增生等病理組織學(xué)變化。目前也有研究提示，變應(yīng)性鼻炎尤其是長期變應(yīng)性鼻炎可能促進(jìn)鼻竇炎鼻息肉的發(fā)生和發(fā)展進(jìn)程。分析其作用機(jī)制與過敏性因素導(dǎo)致的竇口鼻道復(fù)合體區(qū)域的鼻粘膜和鼻竇黏膜持續(xù)腫脹有關(guān)[5]。還有研究表明，過敏性鼻炎患者的鼻息肉根蒂部與其他部位想比較，可分泌大量活化的炎性細(xì)胞因子，分析這也與鼻息肉的發(fā)病機(jī)制和術(shù)后復(fù)發(fā)緊密相關(guān)[6]。

4 相關(guān)細(xì)胞因子

目前許多學(xué)者認(rèn)為，炎癥中的多種細(xì)胞因子的高表達(dá)是鼻息肉發(fā)生發(fā)展中的重要環(huán)節(jié)。因此，對(duì)于相關(guān)細(xì)胞因子與鼻息肉之間關(guān)系的深入探討，能夠幫助我們更好的了解鼻息肉的發(fā)生與復(fù)發(fā)機(jī)制。已有研究表明，參與鼻息肉發(fā)生和發(fā)展進(jìn)程的相關(guān)細(xì)胞因子多達(dá)上百種，不同細(xì)胞因子對(duì)鼻息肉的產(chǎn)生都呈現(xiàn)出特定的作用，但眾多細(xì)胞因子中，哪一種細(xì)胞因子最為重要，現(xiàn)階段臨床研究領(lǐng)域仍未形成統(tǒng)一說法，普遍認(rèn)為鼻息肉的形成是各種細(xì)胞因子協(xié)同作用所導(dǎo)致的[7]。近年來，臨床研究較多的細(xì)胞因子主要有嗜酸性粒細(xì)胞、白細(xì)胞介素8、干擾素γ、Th2型主要細(xì)胞因子、核因子-κB、血管內(nèi)皮生長因子。上述細(xì)胞因子均為免疫細(xì)胞所產(chǎn)生的小分子蛋白質(zhì)，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞的重要功能，其增殖與分化在機(jī)體防御中起到重要作用[8]。

目前許多研究表明細(xì)胞因子的高表達(dá)與鼻息肉的發(fā)展進(jìn)程有一定聯(lián)系，嗜酸性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞作為上述細(xì)胞因子的主要來源，嗜酸性粒細(xì)胞對(duì)變應(yīng)原所引起的炎性反應(yīng)和致炎因子的作用極為重要。當(dāng)嗜酸性粒細(xì)胞在組織中被激活，能夠黏附于血管內(nèi)皮細(xì)胞壁，穿過皮層滲透到組織間隙，同時(shí)釋放出大量的白三烯、堿性蛋白和嗜酸性粒細(xì)胞陽離子蛋白等過氧化酶及活性物質(zhì)，這些物質(zhì)對(duì)于鼻息肉的致病原、寄生物、周圍組織均可發(fā)揮出毒性作用和破壞作用，從而增加了血管的滲透性及超氧化物調(diào)節(jié)的組織破壞，造成上皮組織損傷，因此嗜酸性粒細(xì)胞也是炎癥進(jìn)程中的關(guān)鍵因素之一

參考文獻(xiàn)

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[5] 滕霞娟：鼻息肉的組織細(xì)胞學(xué)變化和形成機(jī)制探討[J].上海第二醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，21（2）：165-167.

[6] 趙鄰蘭：變應(yīng)性真菌性鼻竇炎研究進(jìn)展[J].耳鼻咽喉頭頸外科，2002，（9）：1842-1871.

篇10

【摘要】16S rRNA分析的實(shí)驗(yàn)技術(shù)為微生物生態(tài)學(xué)的研究提供了新的研究方法，因此越來越多的學(xué)者利用16S rRNA進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)的研究并取得了驕人的成績。本文對(duì)16S rRNA基因的獲得做一簡單介紹，重點(diǎn)介紹16S rRNA基因的應(yīng)用。16S rRNA在細(xì)菌菌種鑒定、環(huán)境保護(hù)、疾病診斷等方面都取得了很好的研究進(jìn)展，不久的將來16S rRNA基因?qū)?huì)為人類做出更大的貢獻(xiàn)。

【關(guān)鍵詞】16S rRNA；菌種鑒定；疾病診斷；環(huán)境保護(hù)

前 言

隨著遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)等學(xué)科的迅速發(fā)展，越來越多的新方法和新技術(shù)被應(yīng)用于分子水平研究領(lǐng)域。在這樣的背景下，16S rRNA基因的研究無論在廣度和深度上都取得了顯著的成就，16S rRNA基因技術(shù)的應(yīng)用在微生物多樣性、微生物種群分析、重要基因的發(fā)現(xiàn)、以及遺傳物質(zhì)在微生物之間或微生物與非生物環(huán)境之間相互關(guān)系等方面均做出了巨大的貢獻(xiàn)，并開辟了微生物生態(tài)學(xué)研究新的領(lǐng)域。關(guān)于16S rRNA基因方面的綜合性論述尚未見報(bào)道，本文將為該領(lǐng)域的進(jìn)一步研究提供必要的綜合信息。

1 16S rRNA基因的簡介:細(xì)菌rRNA按沉降系數(shù)分為3種，分別為5S、16S和23S rRNA。其中位于原核細(xì)胞核糖體小亞基上的16S rRNA長約1540bp，結(jié)構(gòu)和堿基排列復(fù)雜度適中，較易于進(jìn)行序列測(cè)定和分析比較。16S rDNA是細(xì)菌染色體上編碼16S rRNA相對(duì)應(yīng)的DNA序列，存在于所有細(xì)菌染色體基因中，它的內(nèi)部結(jié)構(gòu)由保守區(qū)及可變區(qū)兩部分組成，因此可用PCR擴(kuò)增其相應(yīng)的rDN斷，來快速、靈敏地檢測(cè)樣品中是否存在某些細(xì)菌或致病菌，或進(jìn)行細(xì)菌多樣性分析。

2 16S rRNA基因在細(xì)菌菌種鑒定中的應(yīng)用:1977年C.Woese通過對(duì)各種生物的rRNA進(jìn)行分析，認(rèn)為16S rRNA基因及其類似的rRNA基因序列作為生物系統(tǒng)發(fā)育指標(biāo)最為合適，提出了可將自然界的生命分為細(xì)菌、古菌和真核生物三域（domain），揭示了各生物之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，使微生物學(xué)進(jìn)入到成熟時(shí)期，因此許多研究采用測(cè)16S rRNA基因部分序列的方法進(jìn)行多樣性分析。Funke等測(cè)定從人體分離到的棒桿菌依賴補(bǔ)體細(xì)胞毒性Ⅰ組及其類似棒桿菌的16S rRNA序列，通過對(duì)這些序列的比較發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)棒桿菌組都屬于放線菌屬，再結(jié)合其它的分子實(shí)驗(yàn)結(jié)果及以前的生化試驗(yàn)結(jié)果，提出其為放線菌一個(gè)新種，即鈕氏放線菌。Gaydos等通過對(duì)肺炎衣原體的1554bp 16S rRNA序列與鸚鵡熱衣原體及砂眼衣原體的16S rRNA序列進(jìn)行同源性比較并繪制了系統(tǒng)進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)肺炎衣原體與后二者的同源性分別為96%和94%，證實(shí)了以前根據(jù)其它方法研究所得出的結(jié)論，同時(shí)說明從遺傳進(jìn)化角度來看，肺炎衣原體與鸚鵡熱衣原體的進(jìn)化關(guān)系比與砂眼衣原體的關(guān)系更近。

隨著大部分細(xì)菌的16S rRNA序列的獲得以及核酸擴(kuò)增16S rRNA序列測(cè)定自動(dòng)化分析系統(tǒng)的問世，必將引起細(xì)菌分類的一次重大變革，它可以使人們進(jìn)一步了解細(xì)菌的進(jìn)化關(guān)系，從而產(chǎn)生以16S rRNA序列分析為主體的所有細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹。

3 16S rRNA基因在疾病的診斷方面的應(yīng)用:目前，幾乎所有病原菌的16S rRNA基因測(cè)序均已完成，因此被選為細(xì)菌病原體PCR擴(kuò)增部分或全部序列的目標(biāo)。16S rRNA序列分析為基礎(chǔ)的細(xì)菌檢測(cè)法在目前識(shí)別異常細(xì)菌引起的疾病上扮演著重要的角色。Relman等利用16S rRNA 序列中的保守區(qū)段設(shè)計(jì)了寡核苷酸引物，用來擴(kuò)增桿菌性血管瘤病人的靶DNA序列。他們還發(fā)現(xiàn)現(xiàn)在具有一定病癥的病人的組織污染物中已發(fā)現(xiàn)有細(xì)菌形成，但并沒有培養(yǎng)出致病菌。近幾年，人歐利希氏病、腸原性脂肪代謝障和少菌性骨髓炎的致病因子也是通過PCR擴(kuò)增 16S rRNA 進(jìn)行序列分析發(fā)現(xiàn)的；同樣，疏螺旋體的不同區(qū)域分離物根據(jù)此法也已被鑒定。

由于細(xì)菌種間16S rRNA基因序列間隔區(qū)在長度、序列上具有相對(duì)多變性，所以利用保守區(qū)的基因作為引物，對(duì)間隔區(qū)進(jìn)行克隆和分析，就能為病原微生物的各菌株、種、屬的鑒定、分型提供依據(jù)。該檢測(cè)技術(shù)目前已被成功的運(yùn)用到了病原菌的種、屬以及家族種類的鑒定中。

4 16S rRNA基因在環(huán)境的保護(hù)中的應(yīng)用:16S rRNA序列分析隨著微生物核糖體數(shù)據(jù)庫日益完善已應(yīng)用于海洋、湖泊、土壤、大氣等環(huán)境微生物多樣性分析。不少學(xué)者利用16S rRNA基因序列分析技術(shù)研究了多種環(huán)境的微生物多樣性，并得到了一些有意義的結(jié)果。如Glovanoni等研究了Sargasso海洋中浮游細(xì)菌的遺傳多樣性，因此提高了海洋微生物中致病菌的檢測(cè)速度，對(duì)于提高海產(chǎn)品質(zhì)量，維護(hù)人類身體健康有重要的實(shí)際意義；Tanner等發(fā)現(xiàn)不同污染物對(duì)細(xì)菌群落多樣性有顯著的作用；Oureas等發(fā)現(xiàn)農(nóng)業(yè)土壤微生物群落顯著生理活性差異及其多樣性；Nuble等發(fā)現(xiàn)氧化光能利用菌群落16S rRNA基因的豐度與其形態(tài)型顯著相關(guān)。吳春篤教授等對(duì)鎮(zhèn)江城市污水中微生物的16S rRNA進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)污水中細(xì)菌16S rRNA基因主要來自變形細(xì)菌(proteobacte-ria)的各亞族，占總檢序列的86.3%，還有脫鐵桿菌門(Deferribacteres)、厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)等類群，該發(fā)現(xiàn)為制定治理城市污水生物性污染的措施提供了科學(xué)依據(jù)。隨著各種學(xué)科的不斷發(fā)展和學(xué)科間的交叉應(yīng)用16S rRNA基因?qū)?huì)在環(huán)境保護(hù)中發(fā)揮更大的作用。

參考文獻(xiàn)

［1］ 劉文強(qiáng)，賈玉萍，趙宏坤. 16S rRNA在細(xì)菌分類鑒定研究中的應(yīng)用［J］. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2006，27（11）：15-18.

［2］ 王鳳蘭，王曉東. 分子微生物生態(tài)學(xué)技術(shù)在中國油田開發(fā)中的應(yīng)用［J］. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2007，13（4）：597-600.