消化系統非癌組織細胞突變的意義

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【摘要】體細胞突變隨著機體衰老而不斷積累，進而驅動癌癥的發生發展，而慢性炎癥、誘變劑暴露等因素則大大加速該過程。描繪并理解非癌組織細胞如何累積和選擇這些突變，對于認識癌癥的發生發展過程至關重要，但目前人們在這方面的認識仍非常有限。借助近年來快速發展的高通量高深度二代測序技術，人們得以逐漸清晰地認識非癌組織細胞中的突變累積及克隆演進動力學。非癌組織細胞中的突變具有廣泛性、克隆性、選擇性，既有可能影響腫瘤發生，也有部分突變利于組織修復及再生。這些研究成果加深了人們對非癌組織細胞突變導致組織穩態失衡及腫瘤發生的認識，為探究癌癥的起源提供了新的方向和思路。在此，本文對更新活躍、易于突變累積的消化系統器官(食管、結直腸、肝臟組織)在本領域的研究進展進行綜述，以豐富本問題的認知。

【關鍵詞】體細胞突變;非癌組織;食管;結直腸;肝臟

突變是指生物體、病毒基因組核苷酸序列的改變。造成突變的可能原因包括染色體重組、DNA錯誤復制、DNA修復機制缺陷、誘變劑暴露、病毒感染等。突變通過核苷酸替換、片段插入或缺失、染色體重排和拷貝數變化等方式，在一級結構上改變DNA序列，進而導致編碼蛋白量和質的變化［1］。一方面，突變是自然選擇的最初來源，是生物進化的動力;另一方面，經典理論認為，關鍵癌基因、抑癌基因或其調控序列上發生的突變則是導致腫瘤發生的重要原因:突變將賦予早期腫瘤細胞克隆擴增優勢，以及不受控制的生長、組織侵襲破壞、血管生成和逃避凋亡等能力。上述機制不斷驅動基因在腫瘤細胞中正向選擇，并造成腫瘤細胞克隆擴增，最終形成腫瘤演進過程中的正反饋，促進腫瘤形成和發展［2-3］。然而，在形態正常的細胞中，突變是如何選擇與累積的，細胞的生物學行為又是如何受其影響的，人們在這方面的認識尚較為有限。

1發現非癌組織細胞突變的測序技術

從測序通量與準確性上來說，一代測序(Sanger測序法)雖是鑒定DNA序列改變的“金標準”，但其通量低、操作繁瑣費時的弊端限制了人們對突變基因集的整體認識［4］。如今，以Illumina等公司為代表的二代測序技術利用橋式擴增及多片段拼接原理，則可對DNA進行高通量突變檢測，比如全基因組測序(wholegenomesequencing，WGS)及全外顯子測序技術(wholeexomesequencing，WES)。在二代測序平臺上，WGS可對生物體整個基因組序列進行測序，以獲得完整的基因組信息;WES可以檢測基因組上編碼區的突變情況，能夠發現直接影響蛋白質氨基酸序列的遺傳變異，目標性更強，測序成本也相對低廉，測序后數據的分析也相對簡單［5］。對于非癌組織細胞來說，突變往往僅存在于分散且數量有限的克隆之中［6］，因此，識別非惡性組織中的體細胞突變，需要通過足夠深度的測序才有可能得以實現［7-8］。近年來，隨著高通量深度測序技術的發展，人們在非癌組織中發現了越來越多的突變累積，比例甚至高達37%。也就是說，在100個非癌形態和/或非癌生物學行為的“正常”細胞中，有近40%帶有不同程度的基因突變［9-10］。這些帶有突變的細胞群以小克隆的形式存在，在組織發育及細胞命運決定方面發揮著未被認識的新功能。目前，已在食管［11-13］、結直腸［14-16］、肝臟［17-19］、皮膚［20］、支氣管［21］、子宮內膜［22-23］、尿路上皮［24-25］、血液［26-28］等多種類型的非癌組織中發現有體細胞突變的存在。其中，食管、結直腸上皮黏膜及肝臟是人體更新最為活躍的部位之一，此處的非癌組織突變易于產生“放大效應”，因此，本文主要就前三種消化系統器官組織的非癌細胞突變作一概述。

2非癌組織細胞突變的發現及其意義

借助超深度的測序技術，人們得以在非癌組織中探究體細胞突變情況。在某些情況下，部分發生突變的基因呈現聚類趨勢，稱為突變特征(mutationalsigna-ture，MS)。目前，人們已發現一百多種不同的MS，包括由紫外線照射或吸煙等外部因素引起的MS、由DNA修復機制缺陷等內在因素引起的MS兩大類。MS的發現揭示了癌癥發生中突變過程的多樣性，對理解癌癥的病因、提出新的治療和預防措施均具有重要意義［1，29-31］。

2．1食管

食管是人體中最容易接觸外源物質的器官之一，食管上皮細胞直接接觸多種外源性刺激物，大大增加了突變的發生概率。Martincorena等［11］對9名20～75歲的志愿者的食管上皮樣本進行了平均覆蓋率為37×的全基因組測序以及74個癌基因的超深度(870×)靶向測序，鑒定出了8919個體細胞編碼突變，并發現突變數量及突變克隆的大小隨著志愿者年齡的增長而增加，為突變累積學說提供了確切證據。對突變基因的分析結果顯示:在角質形成細胞分化中起關鍵作用的信號通路相關分子(NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、TP63、AJUBA)、細胞氧化應激相關分子(NFE2L2、TP53)、細胞周期蛋白(CCND1)、蛋白質修飾分子(PIK3CA、CUL3)、表觀調控分子(KMT2D)均存在不同程度的突變累積，其中至少有11個基因與食管鱗狀細胞癌(esophagealsquamouscarcinoma，ESCC)的發生密切相關。有趣的是，該研究還發現NOTCH1在食管非癌細胞中的突變頻率遠超癌變細胞。除NOTCH1基因外，Yokoyama等［13］在不同年齡、不同生活方式的139例ESCC患者中發現，非癌組織的PPM1D、NOTCH2、ZFP36L2、FAT1、NOTCH3、CHEK2和PAX9的突變頻率均顯著高于ESCC。這些以往被歸為促癌基因的分子在非癌組織中的突變累積更高，提示這些癌基因仍為野生型的食管上皮更易發生腫瘤，刷新了人們的認識。此外，研究者在非癌食管組織的樣本中總結了與重度吸煙、酗酒等生活方式相關的MS，并發現了與載脂蛋白BmRNA編輯酶催化多肽家族(apolioproteinBmRNA-editingenzymecatalyticpolypeptide，APOBEC)等酶活性相關的MS，提示對于已出現酶活性MS的潛在ESCC患者來說，改善生活習慣可能為其帶來更大的獲益［32］。衰老通過累積突變使組織細胞獲得多克隆性，是腫瘤發生的重要機制之一［33-34］。上述研究均發現衰老食管上皮中累積的突變與腫瘤中存在的突變存在部分重合，這提示ESCC發生后，細胞獲得突變的速率及頻率大大增加，可能是腫瘤演進的關鍵原因。進一步了解非癌食管組織中的突變情況，借此篩選出癌組織中的獨有突變，這有助于發現并鑒定更多的癌基因，從而為腫瘤早期診斷和靶向治療提供重要指導。

2．2結直腸

結直腸癌在全球發病率排名第三，死亡率排名第二［35］。不良的生活行為如高脂飲食、長期吸煙及酗酒均是結直腸癌發生的高危因素［36-37］。腸壁中廣泛分布的三級淋巴器官、腸腔中高豐富度的腸菌生態與外源物質、腸道上皮黏膜高度活躍的更新周期，這些特點使結直腸更易于受到急慢性炎癥攻擊。Lee-Six等［14］利用顯微切割及WES技術，在11～78歲志愿者的2035個非癌結腸隱窩中發現了可能驅動腫瘤發生的突變集，其中包括抑癌基因如AXIN2、STAG2及具有典型錯義突變的癌癥基因如PIK3CA、ERBB2、ERBB3、FBXW7等。研究者進一步發現，正常結直腸上皮、腺瘤、結直腸癌細胞中基因突變的相對頻率也各不相同，例如:結直腸癌中APC、KRAS、TP53的突變非常普遍，但在非癌隱窩中非常稀少;而ERBB2、ERBB3等驅動突變在非癌隱窩中普遍存在，但在結直腸癌細胞中則較為少見。就這一點來說，結直腸上皮非癌性細胞與癌性細胞的突變模式是與以往認識相吻合的。潰瘍性結腸炎(ulcerativecolitis，UC)是結直腸癌發生的高危因素。與健康個體相比，UC患者結腸上皮細胞處于慢性炎癥微環境中，較多的炎癥因子及自由基分子使得細胞可能出現較高頻率的基因突變［38］。Kakiuchi等［15］對健康人及UC患者的腸道隱窩分別進行全外顯子測序，發現UC患者中存在多克隆性的隱窩重塑。在這些由NFKBIZ、TRAF3IP2、ZC3H12A、PIGR、HNRNPF等基因突變而被正向選擇的克隆中，上皮間質細胞中IL-17和其他促炎信號均處于明顯下調狀態，提示上述正常隱窩中的基因突變兼有降低免疫反應的功能。一方面可能是慢性炎癥過程中的適應性改變，對機體有益;但另一方面，帶有突變的克隆間質處于免疫抑制狀態，也可能為腫瘤發生過程中的免疫逃逸現象提供了分子基礎。在長期慢性炎癥狀態下，血液中的PBMC也可能存在突變［26-27］。為排除這種因素的干擾，Nanki等［16］在除去免疫細胞中可能存在的突變后，利用人結直腸類器官模型及WES，進一步驗證了NFKBIZ、ZC3H12A和PIGR在UC患者中處于突變狀態。但UC患者腸上皮細胞中普遍存在的NFKBIZ突變卻較少出現在UC相關性結直腸癌中，這提示結直腸癌發生過程中存在針對NFKBIZ突變細胞的負向選擇機制，NFKBIZ突變不利于結直腸癌發生。這個推測在NobuyukiKakiuchi的NFKBIZKO突變小鼠模型中得以驗證:研究人員發現帶有該突變的小鼠在誘變劑的處理下，結直腸腫瘤發生比例也顯著降低，這可能與NFKBIZ突變不利于結直腸上皮細胞生存有關［16］。上述研究不僅描述了結直腸癌發生過程中隱窩攜帶驅動突變，并在腫瘤演進過程中逐漸建立選擇優勢的路徑;也同時展示了結直腸癌突變克隆的范圍、驅動突變頻率等演進動力學指標，有助于深化人們對腫瘤發生發展過程的理解。

2．3肝臟

肝臟是人體重要代謝器官，大多數的藥物及毒物均在肝臟中進行分解代謝，而部分代謝產物具有比原形更活躍的促突變能力，這一特點使肝臟更易暴露于促突變物質中。另一方面，肝臟是一個易于受到炎癥、缺血缺氧等內部因素打擊的器官。同時，肝炎病毒、酗酒等因素是導致肝臟慢性損傷的重要原因［39-41］，也是突變產生的重要因素。這些特點使肝癌的發生率占據所有惡性腫瘤的第五位［35］。為揭示肝癌發生的遺傳學基礎，Kim等［18］研究了肝癌高危病變—肝硬化中再生結節(regenerativenodule，RN)組分細胞的突變情況。對205個肝硬化RN進行了30個腫瘤相關基因的深度靶向測序，在其中47個RN中檢測到陽性結果:HCV相關RN中含有ARID1A、ARID2和TP53的體細胞突變;HBV相關RN中發現了NCOR1、TSC1和CDKN1A的體細胞突變;提示病毒感染相關的RN可以獲得具有癌癥相關基因突變的細胞亞群，為研究肝炎－癌轉化的機制提供了分子基礎。令人意外的是，這205個RN中均未檢測到端粒酶逆轉錄酶(telomerasereversetranscriptase，TERT)啟動子突變，提示TERT激活可能是肝硬化RN發展為肝細胞癌的關鍵因素。除此之外，Brunner等［17］通過對482個正常肝組織和肝硬化組織的顯微切割樣本進行70×WGS，發現在正常肝細胞存在1%～5%的突變驅動克隆;在正常肝組織和肝硬化樣本的突變數據中，均包含抑癌基因ACVR2A、ARID2、ARID1A、TSC2等基因的失活突變，但腫瘤中的差異突變則只剩下ACVR2A，并帶有較多ALB突變。ALB編碼白蛋白，在正常肝組織中具有較高的轉錄頻率，在該項研究中由于插入缺失突變而失活。這似乎提示插入缺失突變可能優先發生在多次轉錄的模板基因中。高轉錄活性的基因為何易于發生插入缺失突變，這同樣是一個值得深入探究的科學問題。有意思的是，Zhu等［19］通過CRISPR技術建立小鼠基因突變模型，對測序結果突變頻率較高的PKD1、KMT2D、ARID1A等基因進行了體內水平的驗證，發現這些突變在一定程度上能促進肝組織再生。這提示并不是所有的突變均只是單方面的有害突變，有些還可能有助于增加肝細胞的適度再生，有益于肝臟功能。肝臟具有的MS集合有助于解釋其從慢性肝病到肝癌的復雜轉變過程。慢性肝病組織比正常肝臟脂質存在更多高度動態變化的克隆，這些克隆被纖維化帶所隔離，具有顯著區域性特征。值得注意的是，肝臟非癌組織帶有的部分突變既可能促進肝組織再生，也可具有促進腫瘤的潛能。這些突變如何在損傷修復－腫瘤發生過程中“博弈”?其綜合效應為何?可能更大程度上依賴于突變特征以及克隆規模，尚有待于進一步研究。

3展望

由于很難捕捉到非癌組織“突破”至早期腫瘤的節點，因此大多數非癌細胞累積突變的研究樣本只能取自已經發生腫瘤的手術患者。對處于腫瘤發生最起始階段細胞的突變研究仍非常有限，造成我們對腫瘤起源細胞的性質、突變時空節點、所涉及的遺傳事件和分子機制以及這些事件如何受到微環境或接觸致癌物的影響等，至今仍知之甚少。另一方面，基因突變頻率也并不是腫瘤發生與否的唯一決定因素，發生突變的基因對細胞發育的影響程度也同樣重要。這就要求后續研究不僅要發現更多、更早期的突變，且更需要在患者長期隨訪或轉基因動物模型中對突變基因功能進行驗證，以為腫瘤發生提供更為堅實的證據。這個過程可能艱難而漫長，但也許將會帶來上世紀七八十年代后癌基因發現的另一個高峰。通過超深度測序技術對非癌組織進行的深入研究，可能會取得意料之外的收獲。前文已述，出現在一些慢性疾病(如慢性肝病)組織細胞中的突變可能會通過促進組織再生發揮對機體保護作用，這種現象在未來可能會成為解決一些慢性疾病治療的關鍵，同樣值得深入研究。

作者：喻博 崔紅娟 陳東風 王濤 陸軍 單位：軍醫大學大坪醫院消化內科 西南大學醫學研究院癌癥研究中心