細胞凋亡范文

導語：如何才能寫好一篇細胞凋亡，這就需要搜集整理更多的資料和文獻，歡迎閱讀由公務員之家整理的十篇范文，供你借鑒。

篇1

論文摘要：就近年來中藥抑制細胞調亡的文獻進行整理，從中藥調控細胞凋亡途徑、影響凋亡信號傳導、調控凋亡相關基因表達、調控細胞因子4個方面進行系統綜述。認為中藥在抑制細胞凋亡方面有較好的作用。

細胞凋亡(apoptosis)是一種細胞生理性死亡的形式，是多細胞有機體為保持身體組織穩定、調控自身細胞增殖和死亡之間的平衡、由基因控制的細胞自動性死亡過程，在機體的生長發育、衰老、免疫調節、內環境穩定以及腫瘤、感染、自身免疫性疾病等生理病理過程中均有重要意義。機體通過凋亡過程來清除體內不需要或有害細胞，或通過抗凋亡過程維持細胞功能。抑制凋亡在維護生命個體的穩定、抗衰老等過程中有很重要的作用。近年來有關中藥抑制細胞凋亡的研究日漸增多，研究涉及缺氧、缺血等因素導致的神經系統、心腦血管、胃腸功能損傷的保護、腫瘤治療(放、化療)后骨髓、免疫功能損傷的防治等方面。中醫藥可對細胞凋亡過程的不同環節進行調節，進而抑制細胞凋亡，維持機體內平衡，阻止組織病理過程的惡化。

1通過調控細胞凋亡途徑抑制凋亡

機體內存在多條細胞凋亡的信號轉導途徑，其中內源性的線粒體細胞色素C途徑和外源性的死亡受體途徑所介導細胞凋亡是目前研究較多的途徑。

1．1通過調控線粒體細胞色素C途徑抑制凋亡許多研究結果均表明，線粒體在細胞凋亡過程中起著“主開關”作用，是最重要的途徑之一，其通過Cyt－C途徑誘導細胞凋亡。在細胞凋亡信號的刺激下，會使caspases激活，胞質Ca2+水平升高，產生ceramide，諸如此類的改變會直接或間接地引發線粒體通透性轉變孔道(PTP)開放，使能量產生中斷，線粒體內膜跨膜電位(ψm)的下降，并導致外膜破裂，釋放出Cyt－C等各種活性蛋白，Cyt－C從線粒體內釋放是關鍵的一步。胞漿內的Cyt－C在dA7P存在下，與凋亡蛋白酶活化因子－1(Apaf－1)結合，誘導caspase－9前體的寡聚化，并形成凋亡體。凋亡體的形成可激活caspase－9，繼而活化Caspase－3，啟動Caspase的級聯反應，引起細胞凋亡。

有研究以缺氧／缺糖再給氧為模型，觀察清開靈注射液對神經細胞線粒體膜電位的保護作用。結果發現清開靈注射液能顯著降低細胞內Ca2+濃度，抑制細胞凋亡，提高線粒體膜電位和活性，認為清開靈注射液可抑制缺氧一缺糖再給氧損傷所致的線粒體膜電位的降低、抑制神經細胞內鈣超載與抑制細胞凋亡有關。

1．2通過調控死亡受體途徑抑制凋亡凋亡還可以通過死亡受體通路介導，現知死亡受體途徑主要包括Fas／FasL途徑和TNFa／TNFR途徑。死亡受體家族成員包括7NFRl、TNFR2、Fas／CD95、TRAlL－Rs等，當死亡受體與其相應的配基(死亡配體)特異性結合后，將凋亡信號由胞外傳人胞內，在連接分子的媒介下，激活Caspase，導致細胞凋亡。1．2．1通過調控Fas／FasL途徑抑制凋亡中藥可以通過調控Fas／FasL的表達，抑制受損細胞的凋亡。參附注射液對培養的乳鼠心肌細胞缺氧及缺氧／復氧時凋亡相關基因Fas／FasL蛋白表達影響研究發現，結果缺氧4.5h及10.5h后，心肌細胞Fas／FasL蛋白的陽性表達指數(positiveexpressionindex，PEI)參附注射液組明顯低于缺氧組；參附注射液可通過下調Fas／FasL蛋白表達，參附注射液組還見到caspase-3活性下降，提示參附注射液抑制乳鼠心肌細胞凋亡是通過Fas／FasL-caspase-3途徑實現的。

1．2．2通過調控TNFa／TNFR途徑抑制凋亡研究還發現中藥通過調控7NFa／TNFR途徑抑制細胞凋亡。枸杞多糖對老年大鼠T細胞過度凋亡及相關基因表達研究發現，枸杞多糖可以下調促凋亡的TNFRl基因mRNA表達并上調抗凋亡的Bcl-2基因mRNA表達，降低老年大鼠T細胞的過度凋亡，從而改善老年大鼠T細胞過度凋亡的狀態。

2通過影響凋亡信號傳導抑制凋亡

細胞抗凋亡的信號轉導是在內外生存因子的刺激下，激活多種信號偶聯途徑的信號轉導過程。常見的凋亡信號傳導途徑有磷脂酰肌醇－3－激酶(P13K)／蛋白激酶B(PKB或稱為AKT)途徑，RAS－MAPK途徑，NF－κB途徑，N()途徑等。2．1P13K／PKB途徑P13K是一種胞內磷脂酰肌醇激酶，PKB是P13K的靶蛋白之一，P13K與PKB是促進凋亡作用的重要調節因子；其過量表達可抑制細胞的凋亡。黃芪多糖(APS)對2型糖尿病大鼠腎組織胰島素信號分子表達的研究發現，認為黃芪多糖降低2型糖尿病大鼠血糖水平的機制可能與提高糖尿病大鼠腎組織中胰島素受體(InsR)、胰島素受體底物－1(IRS－1)、P13K水平，增加組織對胰島素的敏感性，改善胰島素信號轉導有關。

2．2RAS－MAPK途徑絲裂原活化蛋白激酶家族(MAPKS)參與細胞凋亡的信號轉導過程。MAPKS級聯反應包括MAPKKK，MAPKK與MAPK等3個順序的活化過程。每一種激酶又由不同成分組成。MAPK包括ERK，jNK／SAPK，P38。有研究探討肝星狀細胞絲裂原活化蛋白激酶(HSCsMAPK)通路中ERK、JNK的活化情況，以及丹參藥物血清對磷酸化細胞外信號調節蛋白激酶(P－ERK)、磷酸化氨基末端蛋白激酶(P－JNK)表達，肝纖維化大鼠經丹參藥物血清干預后較對照組均顯著降低，正常大鼠經丹參藥物血清干預后較正常大鼠對照組也均顯著減少。表明活化的HSCs中ERK、JNK保持著較高的磷酸化水平，兩者介導的信號轉導通路是HSCs活化和增殖的重要途徑之一；阻斷MAPK信號通路可能是丹參治療肝纖維化的重要作用途徑之一。

2．3NF－κB途徑在大多數細胞類型中，NF－κB在胞漿中與抑制亞單位lκB結合形成無活性的復合物。在TNF誘導的細胞凋亡過程中，可刺激lκB的磷酸化作用及降解作用。使NF－κB能從復合物中釋放并活化，活化的NF-κB迅速轉位進入胞核，繼而作用于靶基因，誘導基因表達，編碼前炎性蛋白，如IFN，細胞因子，生長因子，細胞黏附因子，紅細胞生成素與MHC－I類分子等，抑制NOS的生成，并誘導編碼凋亡抑制蛋白C－IAPl，C－IAP2基因表達，誘導抗凋亡基因Bcl－2，Bcl－x1的表達。探討人參皂甙對心血管疾病的保健和防治機制的研究發現，結果顯示內毒素脂多糖(LPS)促使HUVECNF－κB向細胞核內轉移，人參皂甙則能阻止LPS誘導的NF－κB核內轉移；能完全阻止LPS致內皮細胞核提取物NF－κBDNA結合活性；IJs能使HUVl3CPAl－1蛋白及mRNA表達顯著增強，人參皂甙則使LPS的這種作用明顯減弱。認為人參皂甙對心血管疾病的防治機制之一可能是通過NF－κB途徑拮抗LPS致HUVECPAI－1的表達。

2．4NO途徑NO對細胞的增殖與存活有雙重效應。它可以通過多種機制誘導細胞的凋亡，但在一些特定環境中，NO又可在一些細胞類型中作為凋亡的潛在抑制劑。川芎嗪對多巴胺誘導PCI2細胞凋亡的保護作用的研究發現，認為川芎嗪可抑制DA引起的PCI2細胞凋亡，此作用可能與降低NO生成有關。NO的抗凋亡作用還與caspase水平有關。在死亡配體依賴與配體非依賴的凋亡中，NO均能抑制caspase的活性。黃芪、當歸注射液可通過促進NO的生成、誘導caspase3表達促進體外培養的血管平滑肌細胞凋亡。同時還可通過上調bcl－2表達而抑制其阻止氧自由基破壞細胞結構，起抗細胞凋亡作用，通過抑制粘著斑激酶的表達，調節其對細胞增殖和凋亡的影響。已發現，NO在某些細胞類型的線粒體中起抗凋亡作用。如在鼠肝線粒體中，生理濃度的NO能可逆性的抑制PTP的開放，機制是通過膜的去極化與Ca2+的積聚作用。2．5其他胞漿中游離的Ca2+作為第二信使在凋亡信號傳遞過程中起關鍵作用；細胞核內鈣離子濃度的持續升高是導致細胞凋亡的主要原因。細胞凋亡時最顯著的變化是DNA的斷裂，鈣離子可直接激活核酸內切酶促進DNA斷裂，也可通過激活蛋白酶、磷酸酶和磷脂酶，導致染色質結構完整性的喪失。葛根素及由紅參和麥冬有效成分制成的參麥注射液對腦缺血／再灌注中神經細胞均有一定的抑制作用。作用機制可能是阻斷Ca2+內流和／或胞內鈣庫的釋放。從抑制神經細胞內鈣超載。

目前發現在某些細胞中，cAMP是引起細胞凋亡的信號。細胞內cAMP濃度的上升可激活cAMP依賴性蛋白激酶，使靶細胞上某些絲氨酸和蘇氨酸磷酸化，從而影響這些蛋白的生物學功能，引起細胞凋亡。黃精多糖對正常小鼠血糖水平無明顯影響；但可顯著降低腎上腺素誘發的高血糖小鼠的血糖值；其機制可能是降低腎上腺素模型小鼠肝臟中cAMP的含量，通過抑制凋亡減輕高血糖肝臟的損害。

3通過調控凋亡相關基因表達抑制凋亡

Bcl－2基因家族是最重要的細胞凋亡調控基因。抗凋亡基因bcl－2和bcl－xL是Bcl－2家族蛋白成員中主要的抗凋亡分子。bax基因是Bcl－2家族中重要的促凋亡基因。另外，p53、c－myc、Fas、c－fos等基因均是參與調控細胞凋亡的重要基因。有研究用黃芪注射液進行治療貧血小鼠，提示黃芪注射液可通過上調抗凋亡蛋白Bcl－XL表達減輕骨髓有核細胞的凋亡，并促進紅系、巨核系造血。丹參對持續性非臥床式腹膜透析(CAPD)相關性腹膜硬化模型大鼠腹膜間皮細胞凋亡有抑制作用，其機理是下調Fas基因的蛋白表達，上調Bcl－2基因的蛋白表達。c－los是一種轉錄調節因子，正常情況下在腦內水平極低。c－fos不適當的過度表達可干預細胞核的修復功能，導致細胞凋亡。有實驗表明。c－fos可能誘導腦缺血一再灌流時海馬CAl區細胞晚期促凋亡基因的表達，共同調控細胞凋亡，而中藥有效成分葛根素可通過下調凋亡相關基因c－fos的表達，減少神經細胞的凋亡，從而具有保護神經的作用。

4通過調控細胞因子抑制凋亡

細胞因子(cytokine，CK)是機體細胞分泌調節細胞增殖、分化與死亡的一大類因子。與凋亡有關的細胞因子有氧自由基、氧化低密度脂蛋白(OX2LDL)及某些細胞因子等。清熱解毒方瀉心湯可顯著降低實驗性AS大鼠血清MAD水平，增強SOD活性，降低OX2LDL及N()水平等，從而抑制血管細胞過度凋亡。細胞因子如TNF(Tumomecrotiefactor)具有多種生物學功能，TNF在體外可誘導腫瘤細胞、樹突狀細胞及大鼠肝細胞出現凋亡，其中TNF-α與凋亡的關系更為密切，能與TNF受體結合，引起細胞內貯存Ca釋放，引起細胞內游離Ca2+濃度升高，從而激活Ca2+依賴性核酸內切酶，引起DN段斷裂和細胞凋亡。此外，與凋亡有關的細胞因子還有IL-2、IFN-γ、TGFβ1，NK細胞、IL-3、IL-4、IL-6、LAF-1(白細胞黏附因子)、CAM-1(細胞內黏附分子)、GM-CSF(粒細胞－巨噬細胞集落刺激因子)、NGF(神經生長因子)、SCF(干細胞因子)、IGF-1(胰島素樣生長因子)、核轉錄因子xu等。黃芪對脂多糖(LPS)致大鼠急性肺損傷(AIJ)后大鼠肺組織細胞有保護作用，其機制是減少促炎因子TNF-α、IL-1β的釋放，抑制肺泡上皮細胞凋亡。地黃飲子對阿爾茨海默病動物模型細胞凋亡抑制的機制，與上調核轉錄因子κB、hsp70mRNA的表達，抑制線粒體釋放細胞色素C，控制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的激活有關。

篇2

【論文摘要】細胞凋亡是通過正常的方式在多細胞生物中消除不需要的、衰老的和受損的細胞，使機體細胞有絲分裂的速度與凋亡的速度相平衡。認識肝病發生、發展中細胞的異常凋亡有重要作用。

細胞凋亡是一個主動過程，是機體在生理或病理條件下受到刺激后，導致細胞產生一系列形態和生化方面的改變而引起的程序性細胞死亡（programmedcelldeath，PCD）。

一、細胞凋亡機制與檢測方法

1.凋亡機制

細胞凋亡的生化特點包括質膜磷脂排列方向改變、細胞內離子環境自穩改變、蛋白酶和核酸內切酶激活分別致細胞蛋白質裂解和DNA斷裂、細胞內產生神經酰胺、線粒體功能障礙、谷胱甘肽耗竭以及轉谷氨酰胺酶激活。參與引發細胞凋亡的蛋白酶有多種，包括半胱氨酰天門冬氨酸特異蛋白酶家族成員和組織蛋白酶等。特別是caspase家族成員與細胞凋亡關系最為密切，至少有14種哺乳動物caspase已獲克隆，但僅對caspase-3和caspase-8的功能有所了解。caspase-8在細胞凋亡中發揮啟動作用；caspase-3在細胞凋亡中發揮效應作用。由于各caspase可相互激活，所以caspase蛋白酶級聯反應是導致細胞凋亡結構改變的主要環節。線粒體功能障礙在細胞凋亡發生機制中起關鍵作用，能促進線粒體功能障礙的因素很多，包括各種有害刺激和信號傳遞過程，其中某些配體/受體相互作用最為重要。配體與靶細胞表面受體相結合，就導致復雜的多蛋白復合物形成，即將凋亡信號傳遞給效應蛋白酶FLICE，FLICE與caspase-8相互反應可激活caspase-8，caspase-8激活后就通過某些不明的機制引發線粒體功能障礙。線粒體功能障礙導致細胞色素C釋放，細胞色素C與凋亡激活因子-2相結合，使caspase-3激活。caspase-3又激活DNA斷裂因子，導致靜息狀態的核酸內切酶激活，最終引起DNA斷裂。從線粒體功能障礙到DNA斷裂，是細胞凋亡生化途徑的共同途徑。在肝細胞凋亡發生機制中，以Fas配體/Fas受體引發凋亡信號級聯反應研究得最多。此外，轉化生長因子β1及其受體、腫瘤壞死因子及其受體在肝細胞凋亡發生機制中均起重要作用。細胞凋亡的主要調節因子是B細胞淋巴瘤/白血病-2蛋白家族的成員。Bcl-2，通過抑制凋亡以延長細胞存活時間，是哺乳類動物細胞凋亡的一種強大抑制因子。與Bcl-2關系密切的同源物是Bcl-x，有兩個RNA拼接變種，長Bcl-X是較大的拼接變種，短Bcl-X是短拼接變種。

2.檢查方法

（1）對細胞凋亡形態學的觀察有HE染色光鏡觀察以及電子顯微鏡、相差顯微鏡、共聚焦激光掃描顯微鏡檢查。

（2）對DNA降解片段的分析有瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA以及SouthernBlotting方法。

（3）熒光標記膜蛋白V的檢測。

（4）流式細胞技術（FCM）可以對活體或已固定的凋亡細胞進行定量分析。（5）末端脫氧核苷酸轉移酶介導的脫氧尿苷三磷酸缺口末端標記術（TUNEL）。（6）免疫組化。

二、肝中的細胞凋亡

近年來研究表明：肝細胞的死亡方式包括壞死和凋亡兩種。凋亡在肝臟疾病發展過程中的重要作用得到了人們的重視，現將有代表性的幾種肝臟疾病中的凋亡現象分述如下。

1.病毒性肝炎。Fas系統介導的細胞凋亡在肝炎發生發展過程中起著重要作用，在不同條件下，穿孔素、顆粒酶、TNF-α、TGF-β等也參與了肝細胞的凋亡。1998年Galle等報道乙型肝炎時肝細胞Fas表達增強，致敏的細胞毒性T細胞（CTL）表達Fas配基（FasL），CTL經過免疫途徑介導肝細胞凋亡，參與病毒的清理和肝炎的病理生理過程。若該反應過強，則可能誘發暴發性肝功能衰竭。

2.肝纖維化。肝纖維化是慢性肝病共有的病理改變，有研究表明各種類型的肝纖維化中都存在凋亡。肝星狀細胞（HSC）的激活是肝纖維化發生的中心環節。1998年Gong等報道HSC向肌成纖維細胞（MFB）的轉變與sFasL介導的凋亡增強相平行，Bcl-2和Bcl-XL在早期HSC上的表達高于晚期HSC和MFB，Bax則相反。這說明調節HSC的凋亡易感性在肝纖維化發生機制中起重要作用。

3.肝硬變。凋亡現象在肝硬變病例的肝細胞、膽管細胞、單核細胞中普遍存在。1999年Frommel等對照研究了正常肝組織、丙型肝炎和肝硬變標本，發現對Bcl-2的表達逐漸增強，肝硬變患者中表達最強，提出了一種解釋肝硬變患者中肝癌高發生率的新機制。

4.肝癌。肝細胞癌形成過程中，不僅癌細胞異常增生，而且突變的細胞凋亡減少，肝癌細胞對凋亡誘導反應明顯缺陷，1998年Jodo等報道肝癌血清中sFas水平升高，切除腫瘤后，sFas水平即下降。一些抑癌劑如:硒、類維生素A、化療藥物等可促進鼠肝的潛在惡性細胞的凋亡，從而降低肝癌的發病率，這從一個側面反映了凋亡在肝癌發病機制中的地位。1997年CrasL等報道在非基因毒性致癌物nafenopin所致的原發性肝癌中，正常肝細胞和肝腫瘤細胞都會受到抑制。當nafenopin的作用消失后，二者的凋亡都增加。后者的增殖率和凋亡率都高于前者。

篇3

【論文摘要】細胞過度凋亡參與了缺血再灌注損傷(Ischimiareperfusioninjury,IRI)的發生。我國傳統中藥丹參可在細胞、分子、基因水平調控IRI時細胞凋亡的發生，從而對IRI具有良好的防治作用。

在肝、腎、腦等器官缺血再灌注損傷(Ischimiareperfusioninjury,IRI)造成的細胞死亡形式中，凋亡也是一種常見而重要的形式[1-4]。組織細胞一旦壞死，目前人們尚無辦法干預；但細胞凋亡是受一系列程序控制的過程，人們有可能通過干預死亡程序加以挽救。丹參經現代實驗技術證實，對IRI時細胞過度凋亡有抑制作用，本文就此方面的內容予以綜述。

1丹參對IRI時細胞凋亡的抑制作用

Wu.W等[5]利用原位細胞凋亡標記(terminaldeoxynucleotidyltransferasemediateduridinenucleotideendlabeling,TUNEL)實驗觀察到：左大腦中動脈結扎后24h大鼠大腦皮層、尾狀核、豆狀核缺血區出現大量凋亡細胞，24~48h達到高峰；預先給予丹參則在相應部位只見到少量凋亡細胞；且與對照組比較，24h時間段組織損傷明顯減輕。提示丹參可能通過減少神經細胞凋亡對腦IRI發揮保護作用。丹參是否對其他器官也有類似作用目前尚未明了。

2丹參抑制IRI時細胞凋亡的作用機制

2．1減少蛋白酶表達

細胞發生凋亡的中心環節是激活以蛋白酶-白介素-1轉化酶(interleukin-1β-convertingenzyme,ICE)組成的級聯反應。ICE可在天冬氨酸殘基之后將33KD的IL-1前體裂解為17．5KD的IL-1β，屬于ICE蛋白酶超家族。

目前已發現13個成員，根據其序列同源性分為3個亞家族：ICE-樣、ICE-1樣和CPP32樣蛋白酶。它們具有保守的底物結合和酶促序列，在天冬氨酸后將底物降解，故該酶現被稱為半胱天冬蛋白酶(cysteineapartate-specificproteinase,caspase)，并把上述三個亞家族分別稱為caspase-1、caspase-2和caspase-3亞家族。它們的過度表達將導致細胞凋亡的發生[6]。

張金濤等[7]利用S-P免疫組化法發現，前腦IRI后1d，大鼠海馬CA1、CA4區出現明顯的ICE免疫陽性反應，第3天達高峰，第5天后明顯減少；腦皮質也呈現出與海馬區類似的現象，ICE免疫陽性反應細胞散在分布。與此相反，丹參組ICE的表達明顯減少，特別是大腦皮層區和海馬CA1區。因此，作者認為ICE在腦缺血中可能發揮重要的凋亡調節作用；丹參能下調腦缺血區ICE表達，從而發揮其神經保護作用。

2．2阻斷誘導細胞凋亡的信號轉導

大多數情況下，來自于細胞外的誘導因素，如自由基、細菌、病毒等作用于細胞后轉化為細胞凋亡信號，并通過胞內不同的信號轉導途徑最終激活細胞死亡程序，導致細胞凋亡。因此，凋亡信號轉導系統是連接凋亡誘導因素與核DN段化斷裂及細胞結構蛋白降解的中間環節[6]。丹參經實驗證實，可干預下列已知的凋亡相關信號轉導通路，從而實現其抗凋亡作用。

2．2．1死亡因子及其受體介導的信號轉導

腫瘤壞死因子(TNF)家族中的TNF、Fas配體、TNF-相關凋亡誘導性配體(TNF-relatedapoptosisinducingligand,TRAIL或Apo2L)和Apo3L能誘導細胞凋亡，因此被稱為死亡因子[6]。介導它們誘導凋亡的受體為死亡受體。在體內，TNF主要由巨噬細胞(Mφ)分泌。大量體內外實驗證明，丹參不僅可有效抑制Mφ分泌TNF-α，還可以在基因水平抑制TNF-α在肝、腎、心等組織中的蛋白表達[8,9,10,18]。所以，丹參可能通過抑制TNF-α的生成和釋放，減少IRI時細胞凋亡。但其具體受體后途徑是抑制NF-κB還是JNF/AP-1則目前尚無文獻報道。

2．2．2第二信使鈣誘導的凋亡

Ca2+是細胞凋亡發生過程中重要的信息分子。［Ca2+］i持續升高可使核酸內切酶激活，DN段化。應用膜聯蛋白熒光素(Annexin-V-Fluos)、碘化丙啶(PI)雙標記及流式細胞術、全細胞膜片鉗放大系統顯微熒光測定術同步觀察H2O2誘導人類肝細胞(LO2細胞)、內皮細胞(EVC304)凋亡時不同時限Ca2+流變化和丹參提取物Rxa的影響時發現：①H2O2作用后0．5h即出現Ca2+躍升現象；當［Ca2+］i>400nmol/L后1h出現典型的細胞凋亡膜翻轉現象，即磷脂酰絲氨酸從細胞膜內層轉移到外層；此后，［Ca2+］i持續升高，早期凋亡細胞(Annexia-V+)、死亡細胞(PI+)指數均上升；熒光顯微鏡下出現大量綠色熒光的早期凋亡細胞和胞漿或胞核紅染的死亡細胞。同時［Ca2+］i上升了一個數量級；②在Rax處理組H2O2作用8h后［Ca2+］i尚未超過400nmol/L，與對照組比較差異顯著(P<0．01)。其余各指標也相應降低，細胞凋亡數減少[11]。這一實驗表明，H2O2誘導的細胞凋亡可能主要是Ca2+依賴性的，且［Ca2+］i>400nmol/L很可能是細胞凋亡啟動的早期信號。Rax有效阻抑了第二信使Ca2+跨膜轉運，由此可能減少其在核內促進凋亡基因信號傳遞中的作用及其后引起的細胞凋亡，減輕細胞損傷。分析其機理可能是：①作為咖啡酰縮酚酸衍生物之一的Rax富含酚羥基，可和H2O2發生氧化反應，接受O-生成羧基-COOH，從而直接減輕H2O2對細胞膜及細胞器膜的損傷，減少Ca2+經細胞膜和內質網滲漏入細胞內；②因肝細胞Ca2+內流由鈣-鈣調蛋白復合物和IP3敏感鈣池共同調節。故Rax對LO2極顯著的Ca2+阻滯作用可能是直接作用于鈣-鈣調節蛋白受體，阻止受體操縱性鈣通道開放所致[11]。

2．2．3由線粒體損傷后啟動的細胞凋亡新近的研究證實，由活性氧(ROS)、細胞內Ca2+超載或缺血缺氧等病理因素也是誘發細胞凋亡的重要觸發機制[11,12]。當這些死亡信號到達線粒體后，首先引起線粒體滲透性轉換并釋放凋亡相關蛋白，包括細胞色素C(cyt-C)及caspase-3等，cyt-C而后參與激活凋亡激活因子與caspase-9的結合及caspase-9的激活，后者繼而激活caspase-3，從而導致細胞凋亡。IRI時ROS生成過多，細胞內Ca2+超載，線粒體受損，誘導細胞過度凋亡[6]。丹參具有強大的清除自由基、減輕鈣超載、保護線粒體結構和功能的完整等作用，因而可切斷上述誘導因素的產生，阻斷了此通路啟動的細胞凋亡[13-15,17]。

2．3調節凋亡相關基因表達

細胞凋亡是級聯式基因表達的結果。目前已知細胞凋亡相關基因多達數十種，根據功能不同分為三類：抑制凋亡基因，如EIB、ZAP、Bcl-2，其中對Bcl-2的研究最為詳細而系統；促進凋亡基因，如Fas、Bax、ICE、P53等；雙向調控基因，如J-myc、Bclk等。正常情況下，促進凋亡基因與抑制凋亡基因處于協調的對立統一狀態，IRI時這種平衡被打破，組織細胞凋亡增多[2]。

張金濤等[7]報道BcL-2在前腦缺血2h就有表達，于6h達高峰，其后減少。此變化以海馬CA1區最為顯著。說明BcI-2主要在細胞凋亡早期發揮作用。丹參在缺血30min給予后，BcL-2的表達明顯增加。趙明中等[15]采用心肌IRI模型，以TUNEL及S-P免疫組化法進一步證實復方丹參滴丸不僅可以使BcL-2蛋白的陽性表達數(PEI)明顯增加，還可使心肌細胞凋亡指數及Fas蛋白PEI下降。且隨著復方丹參滴丸的劑量加大而進一步降低(P<0．05；P<0．01),說明丹參可恢復各凋亡基因之間的平衡，從而發揮其保護作用。

綜上所述，丹參作用廣泛，對IRI細胞凋亡各環節都有調節作用，從細胞、分子及基因水平阻斷了IRI發生發展過程中因細胞凋亡引起的一系列“惡性循環”，從而表現出對IRI顯著的保護作用。因此，丹參對減輕IRI來說是一種十分理想的藥物，在臨床上具有廣闊的應用前景；同時丹參的抗凋亡作用也為臨床上治療因凋亡過度引起的疾病提供了一條新思路。

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篇4

【關鍵詞】 中藥； 腫瘤； 細胞凋亡； 作用機制

1992年英國科學家Hickman 等首次提出將誘導腫瘤細胞凋亡作為以后腫瘤治療研究中的主要目標和手段以來，腫瘤細胞誘導凋亡治療逐漸成為國際腫瘤研究的一個熱點，誘導腫瘤細胞凋亡已成為篩選抗癌藥物的新靶點。研究結果表明，許多中藥的有效成分具有誘導腫瘤細胞凋亡的作用。這不僅為腫瘤的治療提供了新的方法，同時也為中藥的發展開辟了新的途徑。中藥誘導腫瘤細胞凋亡的作用機制主要有以下幾個方面。

1 阻滯腫瘤細胞增殖周期

根椐細胞的增殖特點，每一代細胞分裂都必須經歷G1-S-G2-M 4個周期。在細胞分裂后進行 G1期前存在一個相對靜止期（G0期），此期是決定細胞繼續進行分裂或發生分化的重要階段。許多中藥的有效成份能夠作用于細胞周期的某一環節，從而使細胞增殖周期受阻，誘導其發生凋亡。藤梨根氯仿提取液對細胞周期產生影響，可使G0／G1期細胞數目增多，S期和 G2/M期細胞減少，出現G0/G1期阻滯，提示藤梨根氯仿提取液可抑制腫瘤細胞的有絲分裂［1］。Li等［2］報道小檗堿可以在不影響CyclinB1 mRNA表達的情況下，抑制Cyclin B1蛋白活性，使CDC2 激酶活性降低，細胞進入有絲分裂受阻，停留在G2 期。Iizuka等［3］報道小檗堿可抑制食管癌細胞的增殖，使細胞在G0-G1期聚集，同時，使S期細胞減少，直至細胞全部凋亡。

而有些中藥則是通過阻滯腫瘤細胞S期進入G2/M期而誘發其凋亡。欖香烯對G0/G1期細胞無明顯作用， 主要作用在S期， 阻止細胞由S 期進入G2/M期， 從而抑制腫瘤生長［4］。馬東禮等［5］在研究欖香烯對HeLa細胞的作用時發現，HeLa細胞增殖受到明顯的抑制，細胞的分裂能力降低，絕大多數細胞阻滯在G2/M期。張曼穎等［6］研究發現刺五加葉皂甙能誘導SPC-A-1細胞凋亡，經細胞周期分析，G1和S期細胞百分率明顯降低，G2/M期細胞明顯升高，提示刺五加葉皂甙作用使SPC-A-1細胞阻滯于G2/M期。

2 影響癌基因和抑癌基因的表達

在腫瘤的發生發展過程中，腫瘤細胞表達的凋亡相關基因起重要的調控作用，其中的某些基因發生缺失，突變或過度表達，可導致細胞增殖失控或凋亡受阻。因此，如何調控凋亡相關基因或其相應產物，提高腫瘤細胞對藥物的敏感性，并誘導細胞進入凋亡是腫瘤治療取得成功的關鍵。目前 bcl-2、c-myc、p53是幾個了解較為深入的與凋亡調控有關的基因。

野生型 p53（wtp53） 基因的主要生物學功能為引起細胞周期限滯，誘導細胞凋亡和促進分化，對細胞生長起負調控作用，而因基因缺失或突變產生的突變型 p53（mtp53）蛋白則對細胞的增殖和轉化起促進作用，抑制細胞凋亡，導致腫瘤的發生［7］。p53基因發生突變是許多人類惡性腫瘤中常見的基因改變之一。實驗證明大蒜素通過促進抑癌基因p53和p21的表達可以誘導人早幼粒細胞白血病HL-60細胞的凋亡，還可誘導胃癌BGC-823細胞凋亡［8］。Wilson LC等［9］發現金雀異黃素(genistein)能誘導大腸癌HCT2116細胞的抑癌基因-非甾體抗炎藥活化基因NAG21和p53、p21的表達，并通過誘導p53基因來調節NAG21的表達。而在大腸癌HCT215細胞(p53基因缺失)中NAG21不能被誘導表達，提示金雀異黃索通過調節p53基因而誘導腫瘤細胞凋亡。郭偉劍等［10］采用血清藥理學方法研究健脾理氣藥(黨參、白術、茯苓、八月札等)的體外誘導凋亡效應。結果顯示含中藥血清作用2 d后，誘導肝癌細胞凋亡，使細胞周期阻滯于S期，并上調p53蛋白的表達，提示上調p53蛋白的表達可能為健脾理氣藥誘導肝癌細胞凋亡的分子機制之一。抗癌口服液（由人參、靈芝和白花蛇舌草組成的復方水煎湯劑）作用于人胃癌 MGC-803細胞株，發現其具有明顯抑制增殖和誘導凋亡作用，用藥前后凋亡相關基因p53 有顯著性改變［11］。

原癌基因 bcl-2、c-myc 是主要的凋亡調控基因。bcl-2能抑制細胞凋亡，故bcl-2受抑制可能是細胞凋亡的共同通道［12］。而 bax 基因則傾向于分布在終末分化細胞、退化細胞，在凋亡旺盛的細胞中表達更強。在功能上與bcl-2 相反，其過度表達則觸發凋亡。袁懷波等［13］用RT-PCR和蛋白質免疫印跡技術檢測葛根黃酮提取物、葛根素和大豆甙元處理HL-60后，對bcl-2和bax基因的mRNA和蛋白表達的結果顯示，葛根黃酮提取物、葛根素和大豆甙元處理HL-60細胞后能夠上調bax mRNA表達水平，下調bcl-2蛋白表達和上調Bax蛋白表達。姚保泰等［14］研究發現鹽酸小檗堿可通過下調bcl-2的表達而達到防治胃癌及癌前病變的目的。左小東等［15］研究華蟾素誘導腫瘤細胞凋亡與細胞周期阻斷和抗凋亡基因bcl-2表達之間的關系。結果華蟾素能將腫瘤細胞阻斷在S期，并能抑制bcl-2基因的表達。馬靖等［16］研究表明，c-myc，c-jun和c-fos上調參與甘草誘導腫瘤細胞凋亡的調控。何承偉等［17］研究半邊旗提取物6F對HL-60細胞內c-myc、bcl-2及增殖細胞核抗原(PCNA)表達的影響，發現8-23l nmol/L 6F作用HL-60細胞12 h后c-myc、bcl-2及PCNA蛋白表達水平明顯下降，并呈劑量效應關系。

3 通過提高機體免疫功能

大量研究結果表明，中藥能誘生和增強機體的免疫功能，通過增強機體免疫功能，誘生細胞因子如 IL-2（白介素－2），IFN（干擾素）誘導 LAKC（淋巴細胞激活的殺傷細胞）產生及 NKC（自然殺傷細胞）增殖，從而介導腫瘤細胞發生凋亡或誘生 TNF（腫瘤壞死因子）提高 TNF 活性，誘導腫瘤細胞凋亡。正所謂“扶正固本”達到“祛邪”的目的。戴馨儀等［18］探討中藥復方清金得生片對荷瘤動物的抑瘤作用及其對免疫功能的影響。結果顯示清金得生片能使受抑制的免疫功能提高，從而達到抑制腫瘤生長，阻止癌細胞擴散，誘導癌細胞凋亡的目的。半枝蓮，雄黃，水蛭通過促進機體的細胞免疫功能從而誘導腫瘤細胞凋亡，抑制 DNA 合成［19，20］。某些中藥如黃芪、黨參、靈芝等還可通過誘生干擾素、白介素-2等細胞因子，誘導LAK細胞吞噬和增加TNF誘導調亡的能力［21］。

4 對端粒酶活性的影響

端粒酶可能是目前已知的最為廣譜的惡性腫瘤分子標記物，并且與細胞周期和腫瘤凋亡基因表達關系密切。因此，鑒于端粒酶在腫瘤發生和發展中所扮演的如此重要的角色，端粒酶活性的抑制可能是某些抗癌藥物發揮作用的機制。陳偉忠等［22］實驗證明，肝癌細胞株中大多有端粒酶活性表達，并利用TRAP-ELISA法定性檢測了不同濃度的苦參堿對肝癌細胞HepG-2端粒酶活性的影響。結果顯示苦參堿對HepG-2的端粒酶活性有一定的抑制作用。同時認為苦參堿抗腫瘤的機制可能與抑制hTERT表達、降低端粒酶活性有關。曾建新等［23］的實驗結果發現肝癌HCC-9204細胞中端粒酶活性較高，而當用As2O3 處理48 h后，測得端粒酶活性顯著降低，提示抑制端粒酶活性是As2O3誘導肝癌細胞凋亡的機制之一。黎丹戎等［24］的實驗表明，茶多酚具有誘導BEL-7402細胞分化的作用，并能降低端粒酶活性的表達。同時并沒有發現發生分化的細胞端粒酶活性不下降的情況。這說明端粒酶的活性抑制是細胞分化過程所伴有的，提示茶多酚的抗癌機制可能是通過抑制端粒酶的活性而實現的。李伏娥等［25］用PCR-ELISA法對胃癌細胞端粒酶活性進行檢測，苦參堿在誘導細胞凋亡的同時伴隨端粒酶活性下調，且隨苦參堿濃度增大和時間延長，抑制作用逐漸增強。提示苦參堿誘導細胞凋亡的調控可能與端粒酶表達調控之間存在密切聯系。

5 對凋亡信號傳導的影響

Moragoda［26］報道，姜黃素能抑制胃癌KATO-III和結腸癌HCT-116細胞增殖并誘導凋亡，使HCT2l16細胞的細胞周期停止于G2/M期，免疫印跡結果顯示兩種細胞cyclin D、E水平下降，其誘導凋亡的機理是導致PARP斷裂，激括caspase8活性，啟動Fas凋亡途徑。

Caspase-3是ICE/CED-3家族的重要成員，是細胞凋亡調控的重要因子之一。一般以23 000相對分子質量的無活性前體存在于細胞質中，當細胞進入凋亡時被激活，并可促進ICE家族的其他成員一起促進細胞凋亡。Pan等［27］研究烏龍茶多酚誘導人組織淋巴瘤U937細胞凋亡時發現，烏龍茶多酚可通過釋放細胞色素c，活化Caspase-9、Caspase-3來誘導細胞凋亡。

另外，某些中藥誘導肝癌細胞凋亡的機理還與蛋白激酶(PKC)、cAMP等信息分子有關，PKC可拮抗皮質激素誘導的胸腺細胞凋亡，槲皮素作為PKC的拮抗劑，可逆轉這種作用，增強機體對腫瘤細胞的吞噬能力，誘導細胞發生凋亡。槲皮素能降低PTK活性，抑制cAMP和cGMP的磷酸二酯酶，增加cAMP水平，降低cGMP水平，調節細胞內二者的比值，控制細胞凋亡的蛋白磷酸化，導致腫瘤細胞發生凋亡［28］。

6 調節體內激素水平誘導凋亡

激素可引起某些腫瘤細胞凋亡。某些中藥如人參、刺五加、黨參等可刺激機體分泌腎上腺皮質激素。甘草、甘草甜素等具有分泌糖皮質激素作用。由于上述中藥使體內激素水平升高，推測其有誘導細胞凋亡作用，對治療激素敏感性腫瘤提供了可應用的中藥［29］。

7 結語

隨著研究工作的不斷深入，對細胞凋亡的認識取得了令人矚目的進展，細胞凋亡的研究為腫瘤治療提供了新的思路和靶點。人們已經認識到誘導腫瘤細胞凋亡很可能是腫瘤治療的一個新策略。但是，目前人們對細胞凋亡的概念、生化機制、生理病理意義乃至在生命科學中的應用等諸多方面的認識尚處于初級階段，不僅尚有許多有待開拓的領域，而且在已經涉及的領域中還有很多問題沒有得到很好解決，如迄今尚未完全確立細胞凋亡和細胞壞死的嚴格界限，細胞凋亡發生的確切機制亦尚不完全清楚等。而且在中醫藥與細胞凋亡關系研究領域，相關中醫基礎理論研究明顯滯后于中藥作用機制研究，目前主要限于運用現代醫學手段檢測某些中藥或方劑對腫瘤細胞的誘導凋亡作用，而缺乏對相應中醫理論的探討。因此，如何將傳統中醫基礎理論與現代分子生物學有機地結合，開展“中醫分子生物學”的研究，對中醫藥現代化研究具有十分重要的意義。

總之，通過中藥誘導腫瘤細胞凋亡的研究，既可深入研究抗腫瘤中藥的作用機制，還可在傳統扶正祛邪治療基礎上，賦予新的含義，提出新的治療方案，并與化療藥物配合使用，提高療效，減少毒副作用。 參考文獻

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篇5

【關鍵詞】 肺腫瘤 蛋白質PTEN 細胞凋亡 細胞增殖 免疫組織化學

［ABSTRACT］ObjectiveTo study the expression of PTEN and its relationship with cell proliferation and apoptosis in nonsmallcell lung cancer (NSCLC). MethodsThe immunohistochemistry stain （SABC） method was applied to investigate the expression of PTEN and PCNA in samples of 43 NSCLC and 20 normal adjacent lung tissues. TUNEL method was applied to detect the apoptosis. The apoptosis index (AI) and mitotic index (MI) were defined. ResultsThe positive rate of PTEN was significantly lower in cancer tissues than in their normal adjacent tissue (χ2=13.609，P

［KEY WORDS］ lung neoplasms; protein PTEN; apoptosis; cell proliferation; immunohistochemistry

細胞周期失控是癌變的重要原因。細胞總是處于一種增殖與凋亡的動態平衡中，細胞的增殖和凋亡狀態受一系列基因的調控，當促增殖的基因過度表達，促進凋亡基因突變或缺失均會造成增殖和凋亡動態平衡的打破，導致腫瘤的發生。基因控制增殖與凋亡失衡在肺癌發生發展中起主要作用。本研究對PTEN基因在不同組織類型、分化程度、臨床分期及預后的肺癌組織標本中的表達進行檢測，旨在探討PTEN基因表達及細胞增殖、凋亡在肺癌發生發展中的作用和它們之間的關系。

1 材料與方法

1.1 標本及其來源

43例肺癌、20例癌旁正常肺組織標本均取自我院手術病理證實標本。43例肺癌病人中，男23例，女20例；年齡41～77歲，平均（59.2±9.7）歲。鱗癌17例，腺癌26例；高分化2例，中分化20例，低分化21例。有淋巴結轉移21例，無淋巴結轉移22例。按國際抗癌聯盟（UICC）1997年肺癌國際分期修正標準進行TNM分期：Ⅰ期10例，Ⅱ期10例，Ⅲ期19例，Ⅳ期4例。隨訪3年，存活19例，死亡24例。

1.2 方法

1.2.1 標本處理 標本均經40 g/L甲醛固定，石蠟包埋，按4 μm厚連續切片4張，1張行蘇木精伊紅染色，3張分別行PTEN、PCNA免疫組化染色和TUNEL法染色。

1.2.2 PTEN、增殖細胞核抗原（PCNA）以及TUNEL免疫組化染色 采用SABC免疫組化檢測技術，嚴格按照試劑盒說明書進行操作，以PBS替代一抗作為陰性對照，以已知肺癌陽性切片作為陽性對照。

1.2.3 結果判斷 PTEN蛋白主要分布在胞漿，細胞漿顯示棕黃色顆粒者為陽性。腫瘤細胞核、胞漿均未見棕黃色顆粒為（－）；0～10%癌細胞內可見棕黃色顆粒為（±）；11％～30%癌細胞內可見棕黃色顆粒為（+）；31％～50%癌細胞可見棕黃色顆粒為（）；>50%癌細胞見棕黃色顆粒為（）。以（+）、（）及（）表達作為陽性，以（±）及（－）表達作為陰性。PCNA主要分布在胞核，細胞核出現棕黃色顆粒為增殖細胞。TUNEL染色陽性顆粒位于細胞核內，細胞核出現棕黃色顆粒為凋亡細胞。隨意計數5個以上高倍視野，不少于1 000個細胞，以凋亡細胞與總細胞比值作為凋亡指數（AI），增殖細胞與總細胞的比值作為增殖指數（MI）。

1.3 統計學處理

數據間比較采用四格表χ2檢驗和t檢驗。

2 結

果

2.1 肺癌與癌旁正常肺組織PTEN表達、細胞凋亡和增殖情況

本文43例肺癌組織PTEN陽性20例，陽性率為46.51%；20例癌旁正常肺組織PTEN陽性19例，陽性率為95%，兩者相比較差異有顯著意義（χ2=13.609，P

癌旁正常肺組織AI為（1.250±0.775）%，肺癌組織為（4.126±2.088）%，兩者比較，差異有顯著性(t=8.279，P

癌旁正常肺組織的AI與MI無相關性（r=0.026，P>0.05）。肺癌組織AI與MI比值呈正相關（r=0.622，P

2．2 肺癌組織PTEN蛋白表達、AI、MI與臨床病理的關系

鱗癌與腺癌PTEN表達、AI和MI差異無顯著性，提示肺癌PTEN蛋白表達、AI和MI與組織類型無關。高中分化肺癌與低分化肺癌比較，PTEN蛋白表達和AI差異有顯著性，MI差異無顯著性，提示肺癌PTEN蛋白表達和AI與組織分化程度有關，MI與組織分化程度無關。TNM分期Ⅰ～Ⅱ期與Ⅲ～Ⅳ期比較，PTEN蛋白表達和AI差異無顯著性，MI差異有顯著性，提示肺癌PTEN蛋白表達和AI與TNM分期無關，MI與臨床分期有關。肺癌淋巴結轉移組PTEN表達與淋巴結無轉移組差異有統計學意義，提示肺癌PTEN蛋白表達與淋巴結轉移有關。肺癌淋巴結轉移組AI和MI與淋巴結無轉移組差異無統計學意義，提示肺癌AI與MI與淋巴結轉移無關。肺癌存活組PTEN蛋白表達、AI及MI與死亡組比較有顯著性差異，提示肺癌PTEN蛋白表達、AI及MI與預后有關。見表1。

2.3 肺癌PTEN蛋白表達與細胞凋亡和增殖關系

PTEN陽性的肺癌組織細胞AI為（5.585±1.782）%，陰性者為（2.857±1.399）%，二者比較，差異有顯著性(t=5.525，P

3 討

論

PTEN（或稱MMAC1，TEP1）是1997年由STECK等3個研究小組分別發現并命名的一種新的抑癌基因，是至今為止發現的第一個具有磷酸酶活性的抑癌基因［1］。它在腫瘤細胞浸潤、血管發生以及腫瘤轉移中起重要作用［2］。研究發現，PTEN可去除3，4，5三磷酸磷脂酰肌（PIP3）3′位上的磷酸基團，調節絲蘇氨酸激酶（Akt）的功能， 對細胞增殖分化具有負調節作用［2，3］。丟失PTEN的細胞會失去這種負調節作用，促進腫瘤的進行性生長。在多種人體腫瘤中均發現PTEN基因的突變和雜合性丟失。KIM等［4］報道，42％～70%的小細胞肺癌和27％～50%的非小細胞肺癌有PTEN的雜合性丟失（LOH）。

本實驗結果顯示，肺癌組織中PTEN基因的蛋白表達主要分布在胞漿，在核膜上也有少量著色，癌旁正常肺組織較肺癌組織著色明顯增強，肺癌組織PTEN的蛋白表達顯著低于癌旁正常肺組織，肺癌PTEN表達下調，提示PTEN蛋白的缺失在肺癌的發生中可能起重要作用；PTEN蛋白表達與肺癌的組織類型、臨床分期無關，而與組織的分化程度、淋巴結轉移和病人的預后密切相關。MCMENAMIN等［5］報道，PTEN蛋白在前列腺癌中表達水平越低，腫瘤的惡性程度越高；臨床分期越晚，預后越差。本實驗結果也顯示，低分化肺癌PTEN蛋白表達水平低，說明PTEN蛋白表達水平越低，肺癌惡性程度越高。REIFENBERGER等［6］研究發現，PTEN突變的惡性黑色素瘤較未發生突變的黑色素瘤更易發生淋巴結轉移。本文實驗結果顯示，有淋巴結轉移的肺癌病人PTEN表達水平明顯低于無淋巴結轉移者，提示PTEN蛋白低表達的肺癌病人更容易發生淋巴結轉移，可能是因為PTEN蛋白缺失的肺癌病人失去PTEN對FAK介導細胞浸潤、轉移和生長的抑制作用，從而更容易發生淋巴結轉移。以上結果提示，PTEN的蛋白表達可以抑制腫瘤細胞的浸潤、轉移和生長。PTEN蛋白表達與肺癌病人預后的關系至今未見報道。MCMENAMIN等［5］研究發現，PTEN蛋白的丟失嚴重影響前列腺癌病人的預后。本實驗結果顯示，PTEN蛋白表達與腫瘤的惡性程度及淋巴結轉移密切相關，PTEN蛋白高表達的肺癌病人預后良好，PTEN可以作為判斷肺癌病情和預后的指標。

細胞凋亡是一種不同于細胞壞死的細胞生理性死亡方式，是受基因編碼的細胞主動“自殺”過程，又稱程序性細胞死亡。細胞凋亡在腫瘤發生發展過程中主要起負反饋調控作用，可以阻遏腫瘤細胞的迅速生長。

STAUNTON等［7］研究發現，不同類型的腫瘤有不同的細胞AI，而且與腫瘤分化、分級、進展和腫瘤的生物學行為有關。本文實驗結果與HWANG等［8］報道結果相似。AI與肺癌臨床病理特征之間的關系目前研究較少。本實驗結果顯示，細胞AI與肺癌組織的分化程度密切相關，細胞AI越高，肺癌惡性程度越高。但本實驗結果未顯示細胞AI與肺癌組織類型、TNM分期有關。LANGENDIJK等［9］報道，細胞AI越高的非小細胞肺癌，越容易發生淋巴結及遠處轉移。本組資料雖顯示淋巴結轉移組比非轉移組細胞AI高，但無統計學意義。

細胞AI與肺癌預后的關系報道較少，EEROLA等［10］報道，細胞AI高的手術治療的大細胞肺癌病人的預后差。本實驗資料顯示，肺癌死亡組細胞AI較存活組明顯增高，提示細胞AI可作為判斷肺癌預后的指標。另有文獻報道，行放療肺癌病人中高AI者提示預后良好。提示在臨床上可以通過檢測細胞AI，選擇細胞AI高的肺癌病人行放化療，或通過轉基因技術提高病人對放化療的敏感性。

腫瘤細胞增殖活性是指腫瘤組織的增生狀態，取決于進入細胞周期的增殖細胞及它們在全體腫瘤細胞所占的比例，是用以反映腫瘤良惡性及惡性程度的重要指標。PCNA也稱周期蛋白（cyclin），是存在細胞核內的一種蛋白質，它對細胞由G1期向S期過渡起著重要的調節作用。

有關PCNA與肺癌的關系，國內外學者作了較多研究。本實驗結果與KAWAI等［11］報道的結果相似。目前有關PCNA及MI與肺癌組織類型之間的關系還存在爭論，本實驗結果未發現MI與肺癌組織類型及淋巴結轉移有關，與大多數學者結果一致，認為PCNA的表達僅能反映細胞的增殖狀態，與組織類型無關。

本實驗結果顯示，癌旁正常肺組織細胞MI明顯低于肺癌組織，提示肺癌組織較癌旁正常肺組織細胞增殖明顯活躍，這可能也是肺癌得以發生發展的重要機制。有學者研究表明，PCNA表達與肺癌分期相關，分期越晚，PCNA表達越高［10］。本實驗結果也顯示，PCNA表達與肺癌臨床分期密切相關，臨床分期越晚，PCNA增殖指數越高。PCNA可作為肺癌早期診斷的參考指標。

有研究表明，PCNA表達隨肺癌的惡性程度增高而增高，PCNA及MI與腫瘤分級呈正相關，提示肺癌PCNA的表達可反映肺癌細胞分化的程度，預示腫瘤惡性度的高低。本實驗顯示，高分化肺癌較低分化癌MI低，但無統計學意義。OYAMA等［12］報道，PCNA的表達與非小細胞肺癌的預后密切相關，PCNA的陽性表達越強，病人的預后越差。本實驗結果也顯示，PCNA及MI與肺癌病人的預后密切相關，MI越高，病人的預后越差。PCNA可作為判斷肺癌病人病情及預后的指標。

以往認為腫瘤的發生僅僅是由細胞凋亡減少引起。許多證據證實，在大多數腫瘤，細胞凋亡不是減少了，而是增多了。王潔等［13］報道肺癌組織細胞凋亡較癌旁肺組織明顯增多，且隨著細胞增殖的增加而增加。本實驗結果顯示，肺癌組織細胞增殖和凋亡均較活躍，細胞AI與細胞MI呈正相關。推測其機制可能是肺癌惡性細胞無限度增殖，打破細胞增殖與凋亡的平衡，啟動了凋亡機制。本實驗結果顯示，肺癌組織MI/AI比值為11.97，癌旁正常肺組織為10.96，肺癌組織MI/AI值同癌旁肺組織基本一致，提示細胞凋亡隨細胞增殖的增加而呈比例增加。本實驗結果還顯示，癌旁正常肺組織AI與MI無相關性，而肺癌組織AI與MI呈正相關。這也說明肺癌組織細胞凋亡增加是由于增殖增加引起。但因為增殖細胞在數量上遠遠大于凋亡細胞，凋亡速度不可能跟上增殖的速度，在腫瘤的發生發展過程中所謂細胞凋亡減少是相對過快的細胞增殖而言的，癌細胞過度增殖及凋亡的相對不足在肺癌的發展過程中起重要作用，這可能是腫瘤得以迅速發展的原因之一。

PTEN蛋白與細胞凋亡的關系至今未見報道。本實驗結果顯示，PTEN蛋白陽性表達的肺癌細胞AI明顯增高，MI明顯降低，提示PTEN蛋白在肺癌具有促進細胞凋亡、抑制細胞增殖的雙重作用。在眾多抑癌基因中，具有雙重抑癌作用者是不多見的，已有研究將PTEN作為靶基因用于肺癌基因治療中。因此，PTEN很有可能成為將來肺癌轉基因治療最為有效的基因之一。

PTEN是通過誘導細胞凋亡和抑制癌細胞增殖雙重作用來抑制肺癌發生發展過程的。而細胞增殖與凋亡又是癌細胞周期失控發生癌變的根源。基因治療癌癥是一種新的有效方法。目前主要是難以篩選出一種較為有效的靶基因。PTEN可能成為今后肺癌基因治療最為重要的靶基因。

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篇6

[關鍵詞] 白血病細胞；Ca2+濃度；凋亡；分化

Ca2+廣泛存在于細胞內液與細胞外液中，它作為第二信使，在細胞的生理調控中具有重要的功能，如細胞代謝、分裂、分泌、細胞的歸巢、黏附、聚集、淋巴細胞的變形能力和供氧等。在生理狀態下，胞漿內游離Ca2+濃度大約維持在100nmol/L左右，細胞內的Ca2+主要存在于線粒體和內質網中，細胞外及內質網內的Ca2+濃度比胞漿內要高得多，在mmol/L水平。細胞內外Ca2+穩態的維持是保證細胞能夠進行正常生命活動的重要物質基礎。早期研究表明，Ca2+穩態的破壞是藥物引起細胞死亡的一個普遍的終末事件，然而體內的細胞在內外環境各種因素的作用下，會打破細胞內外Ca2+的穩態，而當細胞內外Ca2+濃度升高或降低時可以分別調節不同的轉錄因子，從而影響細胞的功能。

目前治療白血病的有效機制之一就是誘導白血病細胞的凋亡與分化，大量研究表明，誘導白血病細胞凋亡與分化的過程中都伴隨著細胞內Ca2+濃度的變化，可見細胞內Ca2+濃度對白血病細胞的凋亡和分化有著一定的影響。

1.Ca2+濃度對白血病細胞凋亡的影響

細胞凋亡是細胞基因調控的一種自主性的自殺現象，是為了更好的適應環境而主動采取的一種死亡過程。其生化變化包括DN段化，胞內Ca2+濃度增高以及酶學改變。而細胞凋亡時最早可以檢測到的生化改變就是細胞內Ca2+濃度快速持續的升高。大量文獻報道，在許多因素作用于白血病細胞后都是首先出現細胞內Ca2+濃度的升高然后出現白血病細胞的凋亡，說明細胞內Ca2+濃度異常升高是導致白血病細胞凋亡的重要信號。80年代初，人們發現在用糖皮質激素誘導動物胸腺細胞凋亡的過程中，出現了細胞內Ca2+濃度的持續上升，從此Ca2+信號與細胞凋亡的關系就一直受到人們的關注。

研究表明，當細胞內Ca2+濃度升高后可以通過很多途徑參與細胞凋亡，如誘導凋亡相關基因的活化；激活Caspases蛋白酶；激活轉谷氨酰胺酶等等。但也有文獻報道[1]，細胞內Ca2+濃度的升高又可以通過阻斷MAPK途徑促進白血病TF-1細胞系的生長和增殖。所以隨著研究的細胞類型和處理因素的不同，各項研究對Ca2+在細胞凋亡中的作用機制的報道不一，甚至出現矛盾和分歧。如：在胸腺細胞當細胞內Ca2+增加被抑制時.糖皮質激素引起的細胞凋亡被抑制，而在HL-60細胞使用Ca2+螯合劑EGTA沒有使細胞內Ca2+濃度減少，并且FTY720誘導的細胞凋亡也沒有被抑制，但是當細胞內得Ca2+被去除時，細胞凋亡也被抑制。

2.Ca2+對白血病細胞分化的影響

細胞內外Ca2+濃度的改變與白血病的分化也有著密切的關系。國外有實驗報道，鈣離子載體（CI）可通過細胞信號轉導機制，誘導幼稚的造血細胞進一步分化為成熟的樹突狀細胞（DC）。國內也有報道，利用CI和GM-CSF共同誘導外周血的單核細胞，可以使其分化成具有典型的樹突狀突起的細胞，而且DC的特征性表面標志CD83，CD86，CD54及MHC-Ⅱ表達也上調[2]。當這種CI作用于HL-60細胞時，也可以將其誘導分化成具有活性的DC樣細胞[3]。說明Ca2+在誘導白血病細胞分化中也發揮著重要的調節作用，其機制可能是因為CI可以提高胞漿游離Ca2+濃度，導致Ca2+與鈣調蛋白（CaM）結合，使CaM的構象發生改變，結合各種蛋白受體分子，誘導了依賴Ca2+的相關基因轉錄。劉北忠[4]等在利用苦參堿誘導K652細胞分化的研究中發現，無論是在細胞外有Ca2+還是無Ca2+的情況下，苦參堿都可以使細胞內Ca2+濃度升高，說明Ca2+是苦參堿誘導K562細胞分化早期的一個非常重要的信號，其機制可能與PLC的活化有關。

由上可見，無論是白血病細胞的凋亡還是分化，Ca2+對白血病細胞都有一定的影響，所以以鈣離子為出發點的研究為治療白血病開辟了一個新的途徑。但由于Ca2+調節機制的復雜性，加上細胞類型及處理因素的不同，使實驗出現多種不同的結果，甚至出現矛盾。可見Ca2+在白血病細胞中的作用機制還有待于進一步的研究。

參考文獻：

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篇7

摘　要：電鏡觀察益肺飲誘導肺癌細胞凋亡。鏡下可見：細胞凋亡分為早期階段、中期階段、凋亡小體形成階段和晚期階段(3期4階段)，其超微結構主要可見到細胞形態、胞漿、胞核、染色質的變化，及細胞凋亡的特異性標志――凋亡小體。提示：細胞凋亡多見孤立、分散的癌細胞。益肺飲可謗導肺癌細胞凋亡。

關鍵詞：TEM；益肺飲；細胞凋亡

中圖分類號：11285.5

文獻標識碼：A 文章編號：1673－7717(2007)07－1390－02

研究中藥誘導腫瘤細胞凋亡國內報道不多。筆者應用透射電鏡(TEM)觀察了中藥益肺飲灌胃治療接種Lewis肺癌株小鼠實體瘤，以血清藥理法誘導A549人肺癌細胞株凋亡，現將其超微結構特征結果總結如下。

1　材料與方法

1．1 實體瘤組取瘤組織切成1mm3小塊，投入2.5％戊二醛固定2h以上，漂洗后，1％鋨酸固定1h，乙醇梯度脫水，EponS12樹脂包理，超薄切片，鈾鉛雙染色，TEM觀察。

1．2瘤株組2.5％戊二醛培養瓶內原位固定2h以上，橡皮鏟刮下細胞，放入離心管內，2000r/min離心15min，漂洗后，如上法固定，脫水、包埋、切片、染色、觀察。

2　結　果

2．1 細胞凋亡初期階段凋亡細胞與其周圍細胞的間隙增寬，連接消失，體積縮小，電子密度增強。細胞表面微絨毛明顯減少，胞漿內線粒體腫脹，粗面內質網擴張，表面核糖體脫落。胞核大，異染色質濃縮呈團塊狀，積聚在核的周邊。細胞膜正常。

2．2細胞凋亡中期階段除細胞膜外，其余細胞形態學變化均與初期階段相同。該階段，細胞膜變化尤為明顯。胞膜表面呈數量不一、大小不等、電子密度適中的泡狀膨出(發泡、長芽)。此時，凋亡的細胞從癌巢中脫離，成為孤立

2．3凋亡小體形成階段細胞破裂，形成單個或數個具有細胞凋亡的特異性結構――凋亡小體。

2．4細胞凋亡晚期階段凋亡小體被其周圍的吞噬細胞吞噬。

3　討　論

篇8

【關鍵詞】 超聲;凋亡;形態學

Abstract: Objective To investigate the effect of diagnostic ultrasound exposure on the apoptosis of human embryonic kidney (HEK293) cells. Methods HEK293 cells were exposure to abdominal ultrasound probe for 0， 10， 20 and 30 min， and their apoptosis was detected by Hoechst 33258 staining. Results Compared with control group， apoptotic rate of HEK293 cells increased significantly after 20min exposure (P

Key words:ultrasound; apoptosis; morphology

超聲應用于產科，可以推算胎齡、診斷先天畸型及了解胎兒宮內發育情況，它能為胎兒、胚胎甚至正在發育成熟的卵泡提供一個清晰的圖像，同時也需要更高的超聲輸出功率。隨著孕前卵泡檢測和產前檢查越來越細致和精確，超聲運用的頻率、時間、輸出功率也在不斷增加，敏感的胚胎組織及生殖細胞受到的威脅也隨之加大。人們對超聲使用的安全性也越發關心。有關產科超聲的安全性，目前尚無統一定論，更無具體的輻照劑量可引起哪方面的影響這樣的規律可循，孕期超聲檢查只能盡可能地使用最低劑量。這使超聲的產前檢查安全性的遵循原則帶有盲目性，或者引起因不了解超聲的安全范圍而濫用超聲，為產前檢查帶來隱患。要明確知道產前超聲的安全范圍還需要一個漫長的過程，本實驗擬探討超聲近距離輻照對體外培養細胞凋亡形態學改變的影響，為產前超聲的安全使用提供一定的理論依據。

1 材料和方法

1.1 試劑

Hoechst 33258購自美國Sigma公司，DMEM培養基購自美國Gibco公司，胎牛血清(FBS)購自杭州四季青生物工程公司，胰蛋白酶購自美國Gibco公司，其余試劑為國產分析純。HEK293細胞株由廣東醫學院生化教研室提供。1 mg Hoechst 33258溶解于10mL PBS中，配成100 mg/L的10×Hoechst 33258儲存液，密封避光，4℃短期保存。

1.2 儀器

MCO15A CO2細胞培養箱(日本SANYO公司)，YJ875DA 醫用凈化工作臺(蘇州凈化設備廠)，IMTI型熒光顯微鏡(日本OLYMPUS公司)，Vivid 7彩色多普勒超聲診斷儀(GE公司)。

1.3 細胞培養與處理

HEK293細胞采用常規培養方法，無血清饑餓培養調整細胞周期一致后進行實驗。將細胞分成超聲照射0 、10、20、30 min組，空白組予以假照，腹部探頭產科診斷條件(3.5 MHz、MI 0.8)，介質為細胞培養液(主要成分為DMEM培養基)，輻照距離

1.4 細胞染色與觀察

收集處理后的細胞，PBS洗滌離心2次后取10μL細胞懸液滴于蓋玻片上，加1mL固定液(甲醇∶冰乙酸3∶1)，4℃固定5 min，棄去固定液，用PBS洗兩遍，吸盡液體。加入1mL Hoechst 33258工作液(10 mg/L)，搖床輕搖，染色10 min，棄去染色液，用熒光顯微鏡避光拍照，激發波長350 nm左右，發射波長460 nm左右。

1.5 結果評判

細胞凋亡過程中細胞核染色質的形態學改變分為三期：Ⅰ期的細胞核呈波紋狀或呈折縫樣，部分染色質出現濃縮狀態;Ⅱa期細胞核的染色質高度凝聚、邊緣化;Ⅱb期的細胞核裂解為碎塊，產生凋亡小體。由兩位病理學技術人員對圖片進行分析對照。

1.6 凋亡百分率的計算

把載波片置于24孔板培養細胞，細胞爬片，調整周期及分組照射(方法同1.3)后培養24h，5mg/L的Hoechst 33258避光染色5min，熒光顯微鏡觀察。計算每孔5個高倍(×400)視野平均細胞總數、凋亡細胞數，最終算出細胞凋亡百分率。

1.7 統計學處理

計量數據以(±s)表示，使用SPSS10.0統計軟件進行處理，多個樣本均數的比較采用單因素方差分析及q檢驗。

2 結果

2.1 HEK293細胞體外培養

HEK293體外培養成功，經傳代培養后，待細胞生長疏密適中，于倒置相差顯微鏡下進行放大倍數為600倍拍照，光鏡下HEK293細胞的形態呈多角形，貼壁生長，細胞間有連接，細胞核圓形或橢圓形，大小約占整個細胞的1/3，核內染色質及核仁清晰，部分可見分裂相。

2.2 凋亡細胞Hoechst 33258染色的形態學變化

空白組：超聲處理0 min(假照)，細胞核大小較一致，核膜完整，核內染色質呈小點狀均勻分布，部分可見有絲分裂相，未見異型核，見圖1。

1組：超聲處理10 min，細胞核形態尚規則，核膜完整，未見異形核，但對比空白組，本組細胞核部分出現大小不一，核內染色質聚集的現象，見圖2。

2組：超聲處理20 min，細胞核大小不均，一部分細胞核脹大，染色質邊集，一部分細胞核縮小濃染，呈小顆粒狀，個別細胞核膜不完整，染色質疏松，表現為凋亡Ⅰ期和Ⅱa期改變，見圖3。

3組：超聲處理30 min，細胞核大小不均，部分可見異形核的出現，部分細胞核內染色質濃染邊集，呈小團塊狀，個別核膜破裂染色質疏松分布于胞質中，表現為凋亡Ⅱa期和Ⅱb期改變，見圖4。

圖1圖2圖3圖4

圖1 空白組細胞Hoechst 33258染色結果(×600);圖2 超聲照射10 min組細胞Hoechst 33258染色結果(×600);

圖3 超聲照射20 min組細胞Hoechst 33258染色結 (×600);圖4 超聲照射30 min組細胞Hoechst 33258染色結果(×600)。

2.3 細胞凋亡率比較

詳見表1。

3 討論

細胞凋亡是多細胞有機體為保持自身組織穩定、調控自身細胞的增殖和死亡之間的平衡、由基因控制的細胞主動性死亡過程。細胞凋亡的主要特點為：細胞體積小，染色質濃縮，呈塊狀致密染色區，DNA分子被特異性DNA內切酶在核小體間切斷，核裂解，形成凋亡小體[1]。生殖細胞、受精卵和胚胎組織中，即便是個別細胞出現異常的凋亡，都有可能對其生長發育造成影響。因此超聲對細胞凋亡的影響受到學者們的關注。bcl2是一種重要的凋亡抑制因子，周海燕等[2]研究證明，長時間連續超聲照射可引起胎鼠腎小管上皮表1 不同劑量的超聲作用HEK293細胞凋亡百分率的改變細胞bcl2蛋白表達水平下降。p53基因在誘導神經細胞凋亡時有重要的作用，趙晶等[3]研究表明，超聲輻照時間和劑量的增加可引起p53基因的蛋白表達水平增加。何明生等[4]發現，電壓為10 mV條件下超聲輻照K562細胞10 min以上，輻照組細胞形態變化較大，核染色質濃縮呈斑塊狀，并有核碎裂、凋亡小體出現。有學者發現低頻超聲輻照HL60后細胞膜空隙率增加，這可能是凋亡前的形態學改變[5]。Lagneaux等[6]則認為低頻超聲效應與聲化學機制有關，超聲誘導的聲化學冷光能觸發光敏感性單態氧的產生，從而對細胞產生一個“氧化應激”，繼而啟動細胞凋亡反應。一般以細胞核染色質的形態學改變為指標來評判細胞凋亡的進展情況，常用的DNA特異性染料有Hoechst 33258，它能與DNA非嵌入式結合，主要結合在AT堿基區，紫外光激發時發射明亮的藍色熒光，從而對細胞核進行形態學的觀察。Hoechst 33258凋亡染色法具有直觀，方便的優點，并可通過形態學的變化對其凋亡的早中晚期進行估測。本實驗用Hoechst 33258對空白組和處理組細胞染色后，經熒光顯微鏡觀察，與凋亡形態的標準相符合，其中超聲處理30 min組部分細胞核染色質高度凝聚、邊緣化并產生了凋亡Ⅱb期的形態學改變，部分細胞核呈異形核，細胞核形態改變最明顯，細胞凋亡比例最高(P

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篇9

【關鍵詞】 芹菜素；膀胱癌；細胞增殖；細胞凋亡

【中圖分類號】R285.5 【文獻標志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2016）12-0047-03

Abstract：Objective To study the effects of apigenin on the apoptosis of human bladder cancer cell line 5637. Methods 5637 cells were cultured with different concentrations of apigenin， the MTT assay was used to evaluate the cell inhibition rates. Apoptosis of 5637 cells was observed under a fluorescence microscope using Hoechst 33258 staining， 5637 tumorigenicity was messaured by soft colony formation assay. Results Apigenin causes concentration-dependent inhibition of the proliferation of bladder cancer 5637 cells. 5637 cells treated with apigenin showed significant morphological changes of apoptosis， and the cell tumorigenicity was inhibited as apigenin concentration increased. Conclusion Apigenin can inhibit the proliferation and induce apoptosis of 5637 cells.

Keywords：Apigenin； Bladder cancer； Proliferation； Apoptosis

膀胱癌是最常見的泌尿系統腫瘤，其中移行細胞癌（Transitional Cell Carcinoma，TCC）占90%，又稱為尿路上皮癌，其中70%～85%的移行細胞癌為表淺性膀胱癌[1]。臨床中非肌層浸潤性膀胱癌的常用治療方法為經尿道膀胱腫瘤切除術[2]。然而，經尿道膀胱腫瘤切除術后的患者有50%～80%的復發，10%～25%的患者復發后發展為肌層浸潤性膀胱癌[3]。為了抑制膀胱腫瘤的復發及進一步惡化，化療以及免疫治療被廣泛用于淺表性膀胱癌患者的術后治療中。較常用的膀胱內化療及免疫治療的藥物包括順鉑、絲裂霉素 C、卡介苗以及干擾素-α[4-5]。這些方法雖然在一定程度上取得療效，但是通常給患者帶來不可逆轉的系統毒性以及嚴重的膀胱局部刺激，例如出血性膀胱炎等[6]。因此，尋求無毒副作用且有效的膀胱癌治療藥物十分迫切。

芹菜素（5，7，4′-三羥基黃酮，Apigenin， API），又稱芹黃素，是一種廣泛存在于多種水果和蔬菜中的黃酮類化合物，具有多方面的藥理作用[7-8]，以抗腫瘤作用最為突出。實驗證明芹菜素在體外能夠顯著抑制多種類型的癌細胞的生長和誘導其凋亡，包括：宮頸癌[9]、卵巢癌[10]、結腸癌[11]、胃癌[12]等，而在膀胱癌中的作用研究鮮有報道。本實驗觀察了芹菜素對人膀胱癌5637細胞的生長抑制以及誘導凋亡作用。

1 材料與細胞

1.1 試劑 芹菜素（質量分數≥98%，批號：22806）購自阿拉丁公司；MTT，低熔點瓊脂糖、二甲基亞砜（DMSO），蛋白酶抑制劑購自Sigma；Hoechst 33258，購置南京碧云天。RPMI 1640培養基，胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）均購自GIBCO公司；其余試劑均為國產分析純。

1.2 細胞株及細胞培養 人膀胱癌細胞株5637購自中國科學院上海細胞庫；培養于含10% 胎牛血清的RPMI 1640培養液中，于37 ℃、5% CO2、95% O2細胞培養箱內常規傳代培養，取對數生長期細胞用于實驗。

2 實驗方法

2.1 MTT法檢測芹菜素對膀胱癌細胞5637增殖的影響 將5637細胞以3×103/孔接種于96孔板中，細胞貼壁后分別加入不同濃度的芹菜素（20、40、80μmol/L），每孔100μl，每個濃度設4個復孔，同時以不加芹菜素為空白對照組培養72h 后，向每孔中加入5.0g/L的MTT 20μl繼續培養4h，棄上清，向每孔中加入DMSO 200μl溶解結晶體，置于搖床振蕩30min，至藍紫色顆粒完全溶解后，于酶標儀490nm波長處測定每孔吸光度值（A），并計算細胞增殖率（%）=（藥物處理孔A值-空白孔A值）/（對照孔A值-空白孔A值）×100%。實驗重復3次，計算平均值。

2.2 Hoechst 33258 細胞核染色法觀察細胞凋亡的形態學改變 將5637細胞以2×105/孔接種于6孔板中，80μmol/L芹菜素（以不加芹菜素為空白對照組）作用24h后，吸去培養液，用PBS清洗2次，迅即加入4%的多聚甲醛液固定10min后，吸去固定液，以PBS清洗1次，加入5.0mg/L的Hoechst 33258，染色10min，用PBS 清洗3次后，在Zeiss Axio Observer A1熒光倒置顯微鏡下以340nm 激發光觀察細胞凋亡形態并隨機拍照。

2.3 軟瓊脂克隆形成實驗檢測芹菜素對5637克隆形成能力的影響 將1×103個5637細胞懸浮液1ml RPMI 1640 （0.3%低熔點瓊脂糖，10%FBS， 1%雙抗）并加入不同濃度的芹菜素（40、80μmol/L），接種于預處理的6孔板中，同時以不加芹菜素為空白對照組。6孔板預先放入1ml RPMI 1640 （0.6%低熔點瓊脂糖， 10%FBS， 1%雙抗）。培養3周以后，細胞克隆形成，采用0.01%結晶紫染色，觀察計數。實驗重復3次。

2.4 統計學分析 采用SPSS 11.0統計軟件進行數據處理，實驗數據均以均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗，以P< 0.05表示差異具有統計學意義。

3 結果與分析

3.1 芹菜素對5637細胞增殖的抑制作用 不同濃度芹菜素處理的細胞的增殖均受到不同程度的抑制，與空白對照組相比差異有統計學意義（P

3.2 芹菜素對5637細胞克隆形成能力的抑制作用 不同濃度芹菜素處理的細胞克隆形成能力均受到嚴重的抑制，與空白對照組相比差異有統計學意義（P

3.3 芹菜素誘導5637細胞凋亡的形態學變化 采用Hoechst 33258染色的細胞核結果顯示，80μmol/L芹菜素處理后，大量的5637細胞出現核固縮、染色質凝集和核碎片化等典型的細胞凋亡特征；與此相比，對照組的活細胞，細胞核膜完整，核呈圓形或橢圓形，染色質分布較均勻，細胞核為藍色均勻淡染，并未見凋亡細胞（圖3左圖為芹菜素對5637細胞凋亡誘導的細胞核形態觀察；右圖為芹菜素對5637細胞凋亡誘導的統計學分析）。以上實驗結果表明芹菜素可誘導5637細胞凋亡。

4 討論

芹菜素作為一種廣泛存在于植物中的天然黃酮類化合物，近年來已成為研究的熱點[13]，但有關芹菜素抗膀胱癌作用的實驗研究比較少。逃逸了正常細胞增殖的調控體系而自主地無限生長是腫瘤細胞的典型特征。通過MTT實驗實驗結果顯示，20、40、60、80μmol/L芹菜素對人膀胱癌5637細胞的增殖能力具有顯著的抑制的作用，且隨著濃度的增加抑制效果更加明顯，呈現出良好的和量效關系。芹菜素抑制膀胱癌細胞增值的主要機制，可能與其直接抑制5637細胞生長，并誘導5637細胞凋亡等有關。

在有機體中，細胞凋亡是一個復雜的生理和病理過程，腫瘤的增值與凋亡是調控腫瘤的發生、發展的最重要的因素之一。研究腫瘤的發生發展機制，尋找抑制腫瘤細胞增值，增加腫瘤細胞凋亡的分子藥物，是抑制腫瘤生長，阻礙腫瘤發生、發展的一個重要途徑。我們通過Hoechst 33258細胞核染色結果顯示，80μmol/L芹菜素處理人膀胱癌5637細胞，大部分細胞細胞出現核固縮、染色質凝集和核碎片化等典型的細胞凋亡特征。腫瘤的自我更新能力是腫瘤細胞一個重要特征，我們采用軟瓊脂克隆形成實驗檢測芹菜素對膀胱癌5637細胞自我更新能力的影響[14]，結果顯示，40、80μmol/L芹菜素對人膀胱癌5637細胞的克隆形成能力具有顯著的抑制的作用，且隨著濃度的增加抑制效果更加明顯，呈現出良好的和量效關系。

總之，我們的研究發現芹菜素作為一種植物提取的活性成分，能夠抑制人膀胱癌5637細胞的增殖以及克隆形成，并誘導其凋亡，芹菜素有望成為無毒副作用且有效的膀胱癌治療藥物。

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篇10

【關鍵詞】 細胞凋亡; 動脈粥樣硬化; 斑塊穩定性; 綜述

[Abstract] Apoptosis is definied as a mechanism of a lontrolled sequence of events which occurs as a spontaneous programmed cell death in normal phsiological or pathologial condition. When the pathways of apoptosis are out of control， it will lead to related diseases. At present it is considered that apoptosis is an independent risk factors of atherosclerotic lesions. Cellular excessive apoptosis in the atherosclerotic plaques plays an important role in the process of the formation of unstable plaques. The relationship between the apoptosis of vascular endothelial cells， vascular smooth muscle cells and macrophage and the atherosclerosis， and the effects of apoptosis on atherosclerotic plaque stability will be discussed in this review.

[Key words] apoptosis; atherosclerosis; plaque instability; review

細胞凋亡(apoptosis)是機體細胞在正常生理或病理狀態下發生的一種自發的程序化死亡過程。由于細胞縮小而喪失與周圍細胞接觸，染色質固縮在核膜附近，細胞骨架崩解，核膜消失，DNA斷裂成片段，細胞膜起泡，最終細胞解體為許多由細胞膜包裹的凋亡小體，并被周圍的健康細胞或吞噬細胞吞噬。動脈粥樣硬化(atherosclerosis， AS)，是危害人類健康最嚴重的心血管疾病。病變特征是血中脂質在動脈內膜沉積，內膜灶性纖維性增厚及其深部成分的壞死、崩解，形成粥樣物，而使動脈壁變硬、管腔狹窄。主要累及彈力型動脈和彈力肌型動脈(如冠狀動脈、腦動脈)。動脈粥樣硬化的特點是受累動脈的病變從內膜開始，先后有多種病變存在，包括局部有脂質和復合糖類積聚、纖維組織增生和鈣質沉著，并有動脈中層的逐漸退變，繼發性病變尚有斑塊內出血、斑塊破裂及局部血栓形成。隨著分子心血管學的研究深入，越來越多的文獻報道細胞凋亡參與了AS的發生發展過程。本文就細胞凋亡與動脈粥樣硬化的關系及細胞凋亡影響斑塊穩定性的相關證據作一綜述。

1 細胞凋亡的途徑

細胞凋亡主要是通過死亡受體途徑及線粒體途徑激活半胱氨酸天冬氨酸酶(caspase)家族，引起不可逆的蛋白質降解和細胞解體造成凋亡。當細胞內外許多因素相互作用產生凋亡信號，傳遞至caspase，即引發caspase蛋白酶的級聯反應[1]。凋亡途徑有兩種：一是死亡受體途徑，又稱外源性凋亡途徑，指被胞外信號所誘導的細胞凋亡途徑。死亡受體存在于細胞膜表面，主要是腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α， TNFα)受體家族成員。由死亡受體與相應配體結合組裝死亡誘導信號復合物(deathintroducing signal complex， DISC)，誘發caspase8前體活化，導致下游效應者caspase3活化，切割底物使細胞凋亡。二是線粒體途徑，又稱內源性凋亡途徑，可由多種因素誘發，如細胞失去了賴以生存的生長因子或激素的支持、或者脫離了原來的生長環境、或由于DNA損傷等。內源性凋亡途徑的關鍵步驟是Bcl2家族中促凋亡因子使細胞色素C從線粒體膜間隙釋放到細胞漿。細胞色素C與凋亡蛋白酶活化因子1(apoptotic proteaseactivating factor 1， Apaf1)、ATP/dATP形成凋亡體，活化caspase9前體，導致下游效應者caspase3活化，切割底物使細胞凋亡。可見，活性caspase3是級聯反應中關鍵蛋白酶，是多種凋亡途徑的共同下游效應部分，作用底物大多是細胞中功能蛋白質，它們參與DNA修復、mRNA裂解、類固醇合成及細胞骨架重建等過程[2]。

2 動脈粥樣硬化中的細胞凋亡

近年來發現，AS斑塊中存在著多種細胞的凋亡與壞死，如內皮細胞、平滑肌細胞、巨噬細胞，而凋亡占其主導地位[3]。Zeini等[4]研究發現，在組成AS斑塊的不同種類細胞中單核細胞和巨噬細胞與平滑肌細胞和內皮細胞相比更易于發生細胞凋亡。細胞凋亡直接影響粥樣硬化動脈的形態和結構，以及斑塊的穩定性。動脈粥樣硬化斑塊的發生發展取決于細胞凋亡和細胞增殖的平衡。

2.1 AS中血管內皮細胞的凋亡

血管內皮細胞被覆于全身的血管腔面，在維持機體內環境穩定中發揮多種重要生理功能，包括以下幾種主要功能：(1) 具有血液成分與組織間物質交換的屏障作用;(2) 合成多種生物活性物質;(3) 參與機體的多種生理過程等。早期血管內皮細胞凋亡的證據是1991年Robaye等首先提出的，該研究發現炎癥因子TNFα可以誘導血管內皮細胞出現凋亡。此后大量研究陸續證明，一些促動脈粥樣硬化因子，包括氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein， oxLDL)、血管緊張素Ⅱ、過氧化劑、凋亡和細菌毒素脂多糖等，也是血管內皮細胞轉錄因子Foxo3a的誘導劑[5]。一些抗動脈粥樣硬化因子，包括低剪切力、一氧化氮(nitrous oxide，NO)、抗氧化劑和雌激素等可以抑制血管內皮細胞凋亡。Banfi等[6]研究發現，血管內皮細胞凋亡可引發血管調節功能失衡，促進血管平滑肌細胞的增殖、遷移;且認為血管內皮細胞凋亡是動脈粥樣硬化發生的一個始動因素。內皮細胞可選擇性地抑制血液或血漿成分進入血管壁發揮屏障作用。當內皮細胞發生凋亡可使血管通透性增強，血漿中的大分子物質包括血漿脂蛋白易于沉積于血管壁，從而使血管內皮局部的抗凝、纖溶及防止血脂沉積的屏障作用減弱，而且凋亡的內皮細胞釋放出白細胞介素21(interleukin21，IL21)，激活相鄰內皮細胞，使其表達、釋放黏附分子及促炎癥細胞因子，導致進一步的損傷;內皮細胞發生凋亡時，線粒體釋放出細胞色素C致超氧化物合成增加，并和自由擴散的NO形成超氧化物硝酸鹽，直接促進內皮細胞凋亡。綜上可知，這些因素可造成血管內膜損傷及血管壁局部血栓形成，加速AS進展。

2.2 AS中血管平滑肌細胞的凋亡

近年的研究表明，血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell， VSMC)的凋亡是影響動脈粥樣硬化斑塊穩定性的重要因素。體外培養發現，動脈粥樣硬化斑塊來源的平滑肌細胞比正常動脈平滑肌細胞具有更高的凋亡率。Sukhanov等[7]研究發現在離體細胞中，oxLDL通過下調甘油醛3磷酸脫氫酶(glyceraldehyde3phosphate dehydrogenase，GAPDH)消耗細胞內ATP，抑制糖酵解，在VSMC凋亡過程中發揮作用。AS中誘導VSMC凋亡的因素有氧化型低密度脂蛋(oxLDL)、活性氧(reactive oxygen species，ROS)、一氧化氮(NO)、機械應力及細胞成分的影響[8]。這些誘導凋亡的因子或刺激是通過第二信使系統傳導信號的。O2介導細胞增殖，是VSMC的絲裂原，而H2O2、OH則介導其凋亡。NO不僅作為一種細胞因子誘導VSMC凋亡，同時又作為信號傳導分子介導其他細胞因子引發VSMC凋亡。近年研究表明，機械應力直接牽拉細胞膜并改變受體或G蛋白構象，從而啟動信號轉導途徑來誘導細胞凋亡。另外，體外實驗發現巨噬細胞和T淋巴細胞產生的炎癥細胞因子，如γ干擾素(γinterferon，γIFN)、TNFα及IL1等能誘導VSMC凋亡。Leskinen等[9]研究發現，肥大細胞所分泌的糜蛋白酶通過核因子κB(nuclear factorκB，NFκB)介導的生存信號途徑引起VSMC凋亡。總之，VSMC在動脈粥樣硬化斑塊可有多種因素促進及加快其凋亡。在動脈粥樣硬化晚期由于VSMC凋亡，致使粥樣斑塊的纖維帽區和交界區VSMC數目減少、細胞外基質分泌減少及破壞崩解增加，使斑塊不穩定易于破裂且可誘發動脈瘤形成、血栓形成及栓塞等并發癥發生。所以，在動脈粥樣硬化晚期阻止VSMC凋亡對防止動脈粥樣硬化臨床并發癥的發生有積極意義。

2.3 AS中巨噬細胞的凋亡

動脈粥樣硬化的早期病變脂紋由內皮下大量吞噬膽固醇的泡沫細胞聚集而成，此后的粥樣壞死中心的形成與泡沫細胞的聚集和凋亡密切相關。一般認為，病變早期的泡沫細胞多數是來源于血液中的單核細胞，進入內皮下轉變為巨噬細胞，其表面的特異性受體(LDL受體和清道夫受體)可與氧化變性的LDL結合，使之攝取大量的膽固醇成為泡沫細胞。巨噬細胞成簇分布于粥樣病灶內皮下、富含脂質的病灶中心和纖維帽的肩部。巨噬細胞源性泡沫細胞的凋亡主要發生在病變的脂質核心處，較血管平滑肌細胞更易發生凋亡，特別是在脂質核內和脂質核周圍，在脂質核的非細胞部分可發現其凋亡殘留物。斑塊的“肩部”最容易發生破裂，纖維帽薄，含有大量激活的巨噬細胞，并存在凋亡殘體及許多內含凋亡細胞的巨噬細胞和淋巴細胞，凋亡細胞和凋亡殘體對巨噬細胞具有強烈的化學趨化活性，而巨噬細胞本身也遭受細胞凋亡所釋放的細胞因子的影響而發生凋亡[10]。氧化型低密度脂蛋白已被證實在動脈粥樣硬化中是開始和放大的因子，在巨噬細胞和平滑肌細胞轉變為泡沫細胞以及調節細胞增殖、凋亡中起到重要的作用。巨噬細胞攝取各種脂蛋白的過程不受細胞的反饋性抑制，當攝入過量的脂蛋白后，細胞內積聚了大量游離膽固醇對其有細胞毒性作用，它可激活FasL的表達，從而可導致細胞發生Fas介導的凋亡[11]。Hung等[12]認為巨噬細胞中游離膽固醇增多可誘發超氧負離子水平增高，使氧化應激增加，觸發短暫的炎癥反應。可見氧化型低密度脂蛋白和游離膽固醇在巨噬細胞凋亡中有重要的作用。同時被激活的巨噬細胞還可以釋放多種生長因子和細胞因子，促進中膜平滑肌細胞的遷移和增生，促進動脈粥樣硬化損傷的啟動和發展。此外，巨噬細胞凋亡可導致細胞外脂質核的發生和擴大，對斑塊破裂及血栓形成有重要影響。

3 細胞凋亡對AS斑塊穩定性的影響

近年來細胞凋亡對動脈粥樣硬化斑塊穩定性的影響漸成為研究熱點。實驗研究表明，易損斑塊常具有活動性炎癥(大量單核細胞/巨噬細胞以及T細胞浸潤)、大的脂質中心(脂核)、薄的纖維帽(纖維帽的厚度40%)和內皮剝脫伴表面血小板聚集等[13]特點。最常見的不穩定斑塊類型是薄帽纖維粥瘤[14]，其病理特征表現為偏心斑塊、含較大的脂質壞死核心、纖維帽較薄、有大量炎癥細胞浸潤、肩部及基底部有較多新生血管且易發生破裂。斑塊破裂伴血栓形成是造成動脈粥樣硬化臨床急性癥狀的主要原因，凋亡過度是不穩定斑塊的明顯特征，而大量的細胞凋亡直接造成斑塊不穩定[15]。

血管內皮細胞：研究證明，血管內皮細胞的過度凋亡一方面增強組織因子的活性，加強血小板聚集能力，從而促進血液凝固;另一方面促進動脈粥樣硬化斑塊的糜爛，繼發血栓形成[16]。血管平滑肌細胞：Chen等[17]研究證明，晚期斑塊內血管平滑肌細胞較正常血管壁的血管平滑肌細胞的增殖減少且更易凋亡。斑塊內血管平滑肌細胞可直接影響斑塊內的血管重構、炎癥和鈣化等[18]，從而影響斑塊的結構和穩定性。另外，凋亡的平滑肌細胞還可產生凝血酶并增加動脈粥樣硬化局部凝血酶的活性，促進血栓形成;不穩定性心絞痛患者較穩定性心絞痛患者斑塊內血管平滑肌細胞的凋亡率高。巨噬細胞：大量研究表明巨噬細胞凋亡是造成斑塊不穩定的決定因素，有研究證實巨噬細胞較血管平滑肌細胞和內皮細胞更容易發生凋亡[4]。巨噬細胞凋亡可以影響斑塊的組織結構，從而導致動脈粥樣硬化斑塊變得更加易損;尤其是晚期斑塊脂質核心處巨噬細胞凋亡增多，提示巨噬細胞凋亡與斑塊脂質核心增大有關，進而影響斑塊穩定性。此后，Hartung等[19]試驗結果顯示巨噬細胞凋亡減少可能有助于斑塊的穩定。可見各項研究都突出說明巨噬細胞凋亡可能為易損斑塊形成的重要原因之一。

4 結 語

細胞凋亡是機體正常的生理過程，細胞凋亡途徑的失控，會引發相關疾病。目前認為，細胞凋亡是AS病變的獨立危險因素。動脈粥樣硬化斑塊內細胞過度凋亡，在促進不穩定斑塊形成的過程中起著重要的作用。深入了解動脈粥樣硬化斑塊相關細胞的凋亡途徑及影響因素，將為通過調節細胞凋亡而穩定動脈粥樣硬化斑塊以及防治心腦血管疾病提供證據。因此，對于細胞凋亡的深入研究將為探討AS發生機制和臨床治療開拓新領域。隨著細胞凋亡研究的深入和完善，將會對動脈粥樣硬化中細胞的凋亡進行更有利的調控，從而使動脈粥樣硬化有更好更廣闊的臨床治療前景。

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