微生物的純培養步驟范文

導語：如何才能寫好一篇微生物的純培養步驟，這就需要搜集整理更多的資料和文獻，歡迎閱讀由公務員之家整理的十篇范文，供你借鑒。

篇1

關鍵詞：啤酒；生產過程；微生物；控制

中圖分類號：Q93 文獻標識碼：A

前言

純生啤酒的生產過程決定了出產純生啤酒質量控制的重點就是避免和預防具有危害性的微生物對此污染，也就是要從生產的每個過程入手對一切微生物進行嚴格控制和預防，以保證啤酒的安全生產。純生啤酒的無菌是指不會出現真菌和致使啤酒變質的微生物。純生啤酒采用在低溫條件下通過膜濾器來過濾的方式進行生產，這種方式既能夠節約低溫消毒的熱量，又可以避免啤酒在高溫條件下進行處理，降低啤酒中微生物的形成，這樣就可以保證啤酒中沒有其他雜味，口感更佳。

1、純生啤酒的微生物控制重點

通過采用haccp這種控制手段可以看出純生生產過程中的主要控制點是有以下四點：

1.1、純生啤酒的無菌過濾控制

純生啤酒經過膜過濾的方式來達到殺菌的目的。因為用來過濾的膜濾器存在使用期限和極易被污染、洗滌藥物被破壞的因素，會對膜的過濾徑口產生一定的影響，為了保證過濾膜的過濾能力，所以在每次使用前或清理過后進行完整的檢測來確定此膜濾器是否受到損壞。并且為了更好的確保產品是否無菌的情況，可以在過濾過程中或者過濾之后給產品做一個全面的檢測工作。

顯然純生啤酒的無菌控制是不會像普通啤酒那樣在最后一項殺菌工作中來把握啤酒的無菌情況。因為在進行多次的過濾酒液后會殘留很多的微生物，致使膜濾器不通暢，同時造成過濾后的酒液中會存在一些微生物。所以對無菌的控制應該嚴格對每一道工藝工程進行控制，提高啤酒的質量標準和加強膜的使用期限。

1.2、瓶蓋微生物控制

在生產中，可以通過購置無菌瓶蓋或者在瓶蓋槽上安置紫外線殺菌系統來確保瓶蓋的無菌性。并且還要在一定的時間內對裝瓶蓋器具、瓶蓋運輸帶以及理蓋落蓋機進行清洗和除菌，降低微生物的形成可能。

1.3、空瓶微生物控制

如今，在市場上大部分純生啤酒都是使用玻璃瓶來進行包裝的，所以對玻璃瓶進行清理的時候最好是使用有兩個端口的洗瓶機器，防止清洗過的空瓶受到二次污染。洗瓶機器在進行最后一次清洗的時候應該使用無菌水來沖洗，以減少瓶中微生物的數目。洗瓶機器也要在一定的時間內進行清洗和更換洗滌液以保證洗滌效果和降低空瓶中微生物的數目。對于運輸帶要求必須配備防塵罩，并且在一定的時間內進行清洗殺菌。

為了保證空瓶的無菌性，在包裝之前可以運用蒸汽對其進行快速除菌。在生產之前以及生產過程中對空瓶和包裝后的酒液進行抽樣檢測。

1.4、灌裝環境的微生物控制

灌裝環境應該構建百級流層，并且安置空氣噴霧除菌設備。地面上最好使用環氧高聚物。灌裝機應該具有標準作業程序以及比較熱量與能量的裝置，在一定的時間里對相關的機器零件進行清理殺菌。并且最好在一定時間內對灌裝設施的重點角落進行人工清理，避免出現細菌薄膜導致灌裝環境受到破壞。

1.5、人員

無菌室工作人員資格：具用廣泛的技術知識，工作負責，對衛生問題有敏銳觸覺。公司應定期對工作人員進行食品衛生及微生物基本知識、衛生檢查及管理、灌裝線的清潔及殺菌措施和緊急應對措施的培訓，不斷提升員工的素質。工作人員(尤其要強調的是設備維修人員)進出無菌室必須按一定程序換鞋、換無菌服、戴工作帽及手部消毒，無關人員一律不能進入無菌間，以減少外來污染。

1.6、微生物保障體系

成立微生物技術小組，著重對微生物檢測技術改進、微生物檢測計劃和啤酒有害菌危害程度等方面進行研究。同時定期對微生物檢驗員的日常操作和分析能力進行監督考核，全面提高微生物管理意識和操作技能。

2、純生啤酒的微生物管理方法

當擁有了良好的生產設施之后，還應該制定一套有效的管理控制方案，使檢驗出來的結果更加真實、準確、可信，使生產出來的產品能達到微生物的控制標準。

2.1、微生物分析方法的介紹

2.1.1、培養基培養分析法

培養基有很多種類型，不一樣的培養基上生長出來的微生物也就不相同。在準備使用培養基進行培養的時候，應該結合微生物的形態特征來考慮怎樣去選擇，并且還要具備能夠使微生物生長的必要條件。假如沒有選擇合適的培養基，會導致微生物生長遲緩甚至出現不生長的現象，給啤酒質量的分析帶來一定的影響。在普通啤酒的檢驗結果中微生物較為明顯，加之培養基的成本不是很昂貴，其檢測結果具有一定的可信度，所以在對啤酒微生物的分析檢測中還是以培養基分析法為主要方式。

培養基有液態及固態兩種形式，前者在進行培養時微生物與營養物質可以大面積的接觸，所以生長速度較快，可以通過比色法來計算微生物的數目，但是此過程有些繁瑣，采用定性分析法更加實用。而后者培養出的微生物可以通過菌落數的方法來進行計算數目，這種方式采用定量分析法更有效。若與膜過濾的方式相結合還能夠強化檢驗微生物的可信度。

2.1.2、atp分析法

采用atp分析方式得出的結果效率較高，但是因為在操作過程中，相關設備器材的表面也有atp的存在，所以在工作中極易被污染并且工作流程比較復雜，沒有足夠可靠的檢測結果，特別是在檢驗含有極少微生物的時候，可信度更低。

2.1.3、pcr分析法

最為先進科學的一項分析方式就是pcr分析法，因為水中帶金屬的離子會給pcr的擴充帶來一些影響，所以還不能被運用到檢驗酒液中是否存有微生物的方式中。但是，可以用于判定幾種特殊有害物質的方法中。所以現在最主要的分析方式還是培養基培養分析法，其他的方法主要用于幫助。

2.2、微生物管理

微生物的管理不僅是需要有效的檢驗方法，最為重要的是需要合理的管理方案。只憑簡單的檢驗分析不能對微生物進行有效的控制，因為檢驗有一定的延遲性，到檢驗結果公布的時候，被污染的范圍也許已經擴散了，難以分析，并且還要對大量的產品進行再次檢測和確認，因此僅靠分析方法不能達到控制微生物的目的。

唯有通過有效地微生物管理方式才能使微生物得到良好的控制。想要進行有效的微生物管理一開始就要明白微生物有關的主要控制點，了解可能產生的原因、檢測方式以及曾經形成污染的原因。然后要弄清楚各種微生物的特點，明白在哪些控制點會檢驗出哪類微生物，會不會對啤酒產生危害，這有利于污染原因的分析和實行有效的控制方法。最后要常去工作現場，檢查其衛生狀況，觀察機器的工作情況，工作人員的操作步驟，對有可能產生的不良影響，及時進行更正。對實際工作進行了解，既能夠及時檢查出存在的問題，還可以為將來可能產生的污染問題提供解決思路，縮小檢查空間，及時發現問題并進行快速處理。

純生啤酒管理的關鍵地方就是灌裝機，其他的微生物管理可以通過清洗除菌后所獲得的數據和機器工作的情況進行測定，但是在灌裝機的管理方面因為人工清洗有些復雜，為了方便進行管理，最好是在一定時間內對灌裝機的一些重點運作區域進行棉球擦拭形式的微生物分析法，以確定是否要進行清洗殺菌。

3、結束語

要想得到良好的微生物控制，需要相關工作人員積極的配合。只有讓他們充分了解微生物對產品嚴重的危害性，讓他們了解所擬定的生產目的同時激勵他們觀察出問題。由此，才能真正做到有效控制微生物的工作。

參考文獻

[1]尹曙光.純生啤酒罐裝過程的微生物控制.啤酒科技[J]，2010（03）.

[2]黃圣榕.純生啤酒的質量控制.啤酒科技[J]，2011（10）.

篇2

關鍵詞：土壤微生物；多樣性；DNA；提取技術

中圖分類號：S154.3 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2012）23-5253-06

Advances of Total DNA Extraction Technology for Soil Microbial Diversity Research

XIAO Bin，JIANG Dai-hua，LIU Li-long，LIU Quan-dong

（College of Agronomy，Guangxi University，Nanning 530005，China）

Abstract： The influencing factors and application aspects， as well as the potentials and limitations of DNA extraction techniques for microbial diversity analysis were reviewed. Applying appropriate methods to extract microorganism DNA fragment that have right purity and appropriate size from soil were the precondition in soil microbial study on the molecular level， and the subsequent molecular biotechnology operations were all rely on these methods.

Key words： soil microorganism； diversity； DNA； extraction method

土壤微生物多樣性是生物多樣性研究的一個重要領域，是指其在遺傳、種類、結構與生態功能方面的變化，對指示土壤微生物群落的穩定性，在保持土壤質量和生態系統穩定性等方面具有重要意義[1]，是當今國內外關注和研究的熱點問題之一。

長期以來，由于研究方法的限制，傳統的分離純化培養技術僅能獲得土壤中微生物總種群數的1%左右，而絕大部分微生物目前還不能獲得純培養[2]，未能獲得純培養的微生物才是土壤微生物的主體，因此，有關微生物多樣性研究進展不大。

近年來，隨著分子生物學技術的發展和研究手段的更新，基于土壤微生物群落總DNA的現代微生物分子生態學研究方法避免了傳統分離培養方法的缺點，被廣泛應用于土壤微生物群落結構、功能以及動態監測研究[3]。因此作為微生物群落分子分析方法的基礎，最重要的一步就是從土壤樣品中盡量毫無偏差地提取出高質量的、具有代表性的微生物總基因組DNA。關于土壤微生物DNA提取方法的報道很多[4，5]，然而這些方法主要側重于土壤中的細菌群落，很少關注土壤中真菌群落總基因組DNA的提取方法及其提取效果。另外，細胞裂解不完全、DNA分子吸附在樣品基質顆粒的表面、從樣品中同時提取了某些重要酶的活性抑制劑、DNA分子的損耗、降解和破壞等因素也影響著土壤微生物DNA提取的質量，因而提取土壤微生物總DNA在研究中尤為重要[6]。本文主要對DNA提取過程中的主要影響因素、現行各方法的優缺點以及存在的問題作一綜述。

1 基于DNA方法的土壤微生物多樣性研究現狀

傳統微生物學研究方法主要依賴于純培養技術和顯微鏡技術，對土壤微生物多樣性的描述與研究存在一定的局限性。20世紀中后期，隨著土壤微生物多樣性研究向多方面發展，人們嘗試著利用分析微生物細胞中某種指示成分，如磷脂脂肪酸（PLFA）來研究土壤微生物的種群組成，但是這些方法的缺陷是無法保證細胞中某種指示成分在土壤中的穩定性，并且如果某種微生物的PLFA是未知的，則該不可培養微生物仍難以鑒別[7，8]。

1980年，Torsvik等[9]首次建立了從土壤樣品中直接提取細菌DNA的方法，并于1990年將其成功應用于DNA雜交技術，研究發現1 g土壤中有4 000個以上不同的細菌種類，說明土壤中微生物多樣性是極其豐富的。后來研究者發現16S rDNA在原核微生物中普遍存在，并且含有相對保守和可變區域，在不同的個體間16S rDNA基因序列也不會進行基因交換，因此，每一種生物都有自己的獨特序列。1986年，Pace[3]第一次以16S rDNA為基礎確定環境樣品中的微生物，使人們對大量不可培養微生物群體有了全新的認識。此后，基于16S rDNA基因的指紋圖譜分析的現代分子生物學技術得到迅速發展，包括限制性片段長度多態性分析（RFLP）、隨機擴增DNA多態性分析（RAPD）、單鏈構象多態性分析（SSCP）、基因芯片（Microarray）、PCR-DGGE/TGGE 等，為全面揭示土壤微生物種群結構和遺傳多樣性提供了重要手段。其總的技術路線：分離微生物基因組DNA，用特異性引物擴增16S rRNA基因片段，再將該PCR擴增產物進行更深一步分析，從而可在種、屬的水平上研究不同生境中的微生物種群結構及其動態變化[10]。

2 土壤微生物總DNA的提取

從土壤樣品中提取DNA的方法大致可分為2類，即間接提取法和直接提取法。間接提取法首先是對土壤樣品進行反復懸浮和離心，去除土壤等雜質，提取土壤微生物細胞，再采用酶裂解細胞提取微生物總DNA。直接裂解法是不去除土壤等雜質，而是通過物理的、化學的、酶解等手段相結合，直接裂解土壤中的微生物細胞，使其釋放DNA，再進行提取和純化。但不論采用何種方法，都存在一定的缺陷，要想提取較完整的DNA需要具備以下幾個條件： ①土壤微生物能從土壤中充分釋放，尤其是那些緊緊吸附在土壤顆粒，甚至深藏于土壤微穴中的細菌等相對比較難分離的微生物。②對一些比較頑固的微生物，如革蘭氏陽性菌、孢子和小細菌的裂解，需要更劇烈的處理，而這又會造成對裂解敏感的細菌DNA折斷。③采集土壤樣品后應盡快提取DNA，因為土壤在4 ℃儲藏幾周就會造成大分子DNA的降解。

2.1 間接提取土壤微生物總DNA

Torsvik等[11]最先報道了從土壤中提取微生物DNA的間接法，包括以下4個步驟：①分散土壤；②土壤微生物的提取（分離細胞與土壤）；③土壤微生物的純化；④細胞裂解及DNA純化。

2.1.1 土壤分散 土壤微生物一般與土壤顆粒結合，包藏在土壤團聚體內，因此，最大限度地分散土壤是從土壤中分離提取微生物的關鍵。通常采用物理或化學法，或是二者相結合以達到微生物與土粒分離的目的。常用的物理分散技術是使用玻璃珠與土壤懸液一起振蕩，或是使用韋林氏攪拌器（勻漿器、轉子混合器）攪拌分散，或是使用超聲波分散土壤團聚體等。而化學分散法是通過加入化學分散劑以達到促進微生物與土粒分離的目的。最常用的分散劑為0.2%焦磷酸鈉，其他還有Winogradsky鹽溶液、Tris緩沖液、生理鹽水、六偏磷酸鈉、膽酸鈉、脫氧膽酸鈉、純水等[26]。值得注意的是，為有效地分散土壤，分散劑的種類、濃度、加入量、機械作用（振蕩、攪拌和超聲波等）的方式、時間以及容器的大小等均應加以考慮。還可以將化學試劑與機械方法結合來懸浮土壤顆粒。研究發現Chelex100就是一種有效的土壤顆粒懸浮劑。各種分散方法分散效果不同，采用何種分散方法效果最佳目前尚無一致結論，而且防止細胞因物理、化學作用導致破裂提前釋放DNA很重要，處理不當會使DNA降解。常用分離提取土壤微生物的土壤分散方法列入表1。

2.1.2 土壤微生物的提取 土壤微生物的提取通常采用離心分離法，既要使微生物與土壤顆粒分離，又要保證基本不破壞微生物細胞。由于土壤中細菌的平均密度（1.1 μg/cm3）遠小于土壤礦物質的平均密度（2.6 μg/cm3），因此采用離心或淘選法可使細菌與土壤顆粒得到較好的分離。Hopkins等[17]采用密度逐級離心法分離出60%以上的土壤細菌。此外，也有學者提出用過濾法，即將土壤樣品分散處理后，經20 μm或30 μm微孔篩真空抽濾，其濾液中即可能含有絕大多數土壤細菌，此過程操作簡便，提取液中土壤殘留物少，易于純化。

由于土壤中的真菌、放線菌主要以菌絲的形態與土壤顆粒纏繞在一起以及細胞壁結構的特殊性，從土壤樣品中分離提取真菌放線菌要比提取單細胞的細菌相對困難。迄今為止，國內外有關分離提取真菌的研究文獻極少，且這些報道方法所提取的真菌菌絲只占真菌總生物量的極少部分。Vilarino等[21]在前人研究的基礎上提出了分離土壤真菌的原理：新鮮土壤經分散后，土壤懸浮液中的菌絲可附著在慢速轉動的銅絲（直徑150 μm）框上，洗脫后即得提取的土壤真菌。潘力等[22]以曲霉菌為例，采用微波處理菌絲并置于10× TE Buffer中即可得到DNA，建立了一種快速提取絲狀真菌DNA的實驗方法，為高通量快速篩選絲狀真菌轉化子奠定了基礎。吳敏娜等[23]以傳統土壤總DNA提取方法及純菌DNA提取方法為基礎，分別與蝸牛酶、纖維素酶進行組合、優化，得到7種不同的土壤真菌基因組DNA提取方法。分離提取土壤細菌和真菌的流程如圖1所示。

2.1.3 土壤微生物的純化 目前常用兩相分離技術對上述土壤微生物提取液進行純化。兩相分離技術最早為德國化學家Albertsson于20世紀50年代所建立，當時主要用于生物大分子的分離。近些年該技術廣泛應用于生物化學、細胞生物學和生物工程等領域，是一種分離、純化生物大分子、細胞、病毒的方法，該技術也逐步發展成為一種溫和的生物分離方法，相對于原始的純化手段具有過程簡單、純化時間較短等特點，應用領域廣泛[24]。關于其分離機制目前尚不完全清楚，有人認為其分離的原理主要取決于不同組分的親水性差異，也有人認為還與不同組分的電荷性質差異有關。當兩種互不相溶的聚合物以一定濃度溶于水中時，便可形成體積不同的兩相，被分離組分由于其與兩相的親和力不同，分別進入不同相從而達到分離的目的。目前應用最為廣泛的是PEG（聚乙二醇）/Dextran（葡聚糖）系統和PEG/無機鹽（磷酸鹽或硫酸鹽）系統。對于不同的兩相組分，分離時間不盡相同[25]。Smith等[19]研究了應用兩相分離技術從土壤中分離純化非菌絲體微生物的效果，發現經充分混合靜置一定時間后，即可形成上下兩層體積比約為4∶1的兩相分離系統，其中細菌主要富集在上層PEG相，土壤殘存顆粒將進入下層Dextran相，經4次提取純化，富集在上層PEG相的細菌總量約達加入兩相分離系統細菌總量的60%，而上層PEG相中的土壤礦質顆粒總量僅占總加入量的4%以下。李妍等[26]用2%PEG+6%Dextran兩相分離技術（A2PP）純化細菌，測定細菌生物量，研究兩相分離技術在土壤微生物研究領域的可應用性，結果表明采用0.1%膽酸鈉、鈉型離子交換樹脂、玻璃珠與土壤一起在4 ℃下振蕩2 h，能較好地分散、純化土壤細菌。研究表明，兩相分離技術同樣有可能用于分離純化土壤真菌。

2.2 直接提取土壤微生物總DNA

現今的土壤細菌DNA直接提取法是在Ogram等[27]建立的方法基礎上發展起來的，主要包括兩個步驟：①原位細胞裂解；②DNA提取和純化。

2.2.1 原位細胞裂解 直接裂解土壤微生物細胞的方法包括：機械破碎法、化學法、酶解法及3種手段相結合。機械破碎法常用的有凍融法、微波、超聲波法和玻璃微珠震蕩法；化學法常用表面活性劑SDS和SarkosyI、熱酚、高鹽、異硫氰酸胍等；酶解法：裂解酶、溶菌酶、蛋白酶K、鏈霉蛋白酶等。其中溶菌酶不僅可處理革蘭氏陽性菌細胞壁，還可水解糖苷鍵和腐殖酸。2種或多種方法相結合對DNA的提取效果較好。王嘯波等[28]采用PBS緩沖液洗滌土壤樣品，結合SDS裂解微生物細胞的方法，同時提取2種土壤樣品的微生物DNA和RNA，結果表明該法提取的核酸不需要進一步處理，其純度就可以滿足后續的分子生物學試驗，從而避免了由于純化導致的核酸量的降低。熊開容等[29]采用凍融+玻璃珠+溶菌酶+SDS方法提取了活性污泥中微生物DNA，結果表明獲得的DNA適合于酶解和PCR擴增要求。

值得關注的是，土壤中微生物種類繁多，生理狀態不同，革蘭氏陽性和陰性細菌以及細菌與真菌的細胞壁結構和組成亦不相同。為了使提取的DNA具有代表性，就必須保證土壤樣品中所有微生物細胞裂解釋放出核酸，因此必須根據試驗的性質、要求選擇適當裂解方法。研究表明，基于SDS的高鹽提取法會對一些革蘭氏陽性細菌效果不好。張瑞福等[30]采用凍融+溶菌酶+SDS方法提取3種芽孢桿菌（G+）DNA，結果表明經凍融處理的霉狀芽孢桿菌均提取到了DNA，未經凍融處理的霉狀芽孢桿菌未提取到DNA，且凍融處理未對DNA造成大的剪切，提取的DN段還大于23.1 kb。張穎慧等[31]使用優化的CTAB法提取真菌基因組DNA。使用液氮凍融以及玻璃珠振蕩的方法代替了傳統的液氮研磨，實驗結果表明該方法所需菌體量少，且得到的基因組DNA比用傳統的CTAB法得到的基因組DNA產率高、純度好且步驟簡單，適用于一次微量提取多個樣品的基因組DNA，可用于大部分分子生物學基本實驗如PCR和DNA的酶切等。

2.2.2 DNA提取和純化 在已報道的DNA提取和純化方法中，通常采用飽和酚或氯仿和蛋白酶處理，去除DNA樣品中的蛋白質和部分RNA，然后對DNA進行抽提，再用乙醇、異丙醇或聚乙二醇（PEG）沉淀后，經羥基磷灰石柱或氯化銫密度梯度超速離心等進一步純化。其他純化方法有聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）法、色譜法、電泳法、透析和過濾法、試劑盒法等。

Lamontagne等[32]研究結果表明PVP能夠與腐殖酸結合，起到有效去除提取的DNA中腐殖酸雜質、提高DNA純度的作用。李靖宇等[33]采用氯化鈣-SDS-酶法對濕地土壤微生物DNA進行提取，結果表明該方法能高效去除濕地土壤腐殖酸，純度較高，能直接滿足PCR擴增。李鈞敏等[34]用含PVPP的緩沖液預洗DNA樣品，然后添加CaCl2和牛血清白蛋白可去除其中的腐殖酸，用PEG8000沉淀DNA，可提高DNA質量，并證實這是一種簡便有效可直接應用于PCR分析的土壤微生物總DNA的提取方法。蔡劉體等[35]采用 SDS-CTAB法提取煙草病圃土壤微生物總DNA，該方法既可達到裂解效果，還有助于去除腐殖酸，有利于提高所提取DNA 的質量。吳紅萍等[36]采用酚氯仿和柱式腐殖酸去除劑對粗提取的土壤微生物DNA進行純化后，可用于PCR擴增，并以細菌16S rDNA基因引物可擴增到相應的片段。朱立成等[37]采用直接法提取土壤微生物總DNA，然后用Sephadex G-200凝膠離心層析法純化，可得到純度較高的DNA。段學軍等[38]采用稀釋模板及巢式PCR法很好地解決了在DNA提取純化過程中不能完全去除腐殖質的問題。滕應等[39]將BIO101 Systems公司研制的FastPrep多試管核酸提取系統與相應的Fast DNA SPINKit for Soil試劑盒聯用，有效地提取了重金屬復合污染的農田土壤微生物總DNA。

沒有哪種單一的純化步驟可以除去所有污染物，故許多研究者已經將幾種純化步驟結合起來以期獲得最好的純化效果。Smalla等[40]將粗提的DNA進行3步純化：①氯化銫密度梯度超速離心純化；②醋酸鉀沉淀；③Geneclean純化。發現經前2步純化的DNA通過稀釋即可部分被限制性酶切和擴增，但如不經稀釋而進行限制酶切和擴增，則必需進行最后一步純化。

2.2.3 直接法和間接法的比較 研究表明，直接法獲得的DNA較多，但不易去除抑制劑，間接法提取的DNA只占直接法的1/10，但分離的DNA純度較高，而且間接法得到的細菌量只占總菌群的25%～50%，直接法提得的DNA卻可以超過細菌總DNA的60%。因此，要想獲得大量DNA，選擇直接法較好，當所需DNA量不大，而且要排除真核或胞外DNA污染時，可用間接提取法。

直接提取對某些特定樣品用特定的操作方法能獲得較高的提取效率，但是對有些生物量不高的樣品則很難得到足夠的環境總DNA用于后續操作，適合在樣品生物量較大但采樣量不大的情況下采用。間接提取在提取效率上遠小于直接提取，但用間接提取法所得到的環境總DNA純度較高，所有樣品能直接用于PCR擴增，并且能更好地體現樣品中微生物的多樣性，適用于有大量樣品的情況。

2.3 DNA的純度和濃度測定

DNA在260 nm處有吸收峰，腐殖酸在230 nm處有吸收峰，計算OD230/OD260（腐殖酸/DNA）的比值可以確定所提DNA中腐殖酸的污染程度。一般情況下OD230/OD260比值應在0.4～0.5之間為好， OD230/OD260比值越高，腐殖酸污染越嚴重。蛋白質在280 nm處有吸收峰，因此OD260/OD280比值經常被用來指示DNA中蛋白質的污染程度，當OD260/OD280比值為1.8～2.2時，DNA較純，當受蛋白質或其他雜質污染時，OD260/OD280值則較低[41]。此外，還可采用PCR擴增檢測DNA的純化質量，所用擴增引物見文獻[42]。

提取的DNA濃度也可根據測定的OD260值計算，根據公式[dsDNA]=50×OD260×稀釋倍數，計算DNA的濃度（μg/mL），換算出每克干土提取DNA的量[43]；還可采用DyNA Quant 200熒光儀對純化后DNA的濃度進行測定[28]。

3 影響土壤微生物總DNA提取的因子

土壤成分復雜，含有大量的有機及無機等多種生物活性抑制物，如腐殖酸、多酚類化合物、重金屬等，它們的存在可能影響土壤DNA的提取質量，抑制DNA聚合酶的活性從而影響土壤微生物多樣性的分析。研究發現，腐殖酸是土壤DNA提取過程中極難去除的污染物，由于它的分子大小和理化性質與DNA相似，過分注重腐殖酸的去除，勢必會造成DNA的大量損失，因此腐殖酸的有效去除是土壤DNA提取的難點所在。

各種土壤類型、質地和成分的差異，都會影響土壤微生物DNA的提取效果。Zhou等[44]用SDS-CTAB法從8種土壤（包括沃土、沙沃土和沙黏土，其中黏土含量為5%～31%不等）中提取DNA，平均獲得DNA的量為0.5～26.9 μg/g，并發現獲得的DNA量與土壤的有機磷含量有明顯的正相關關系。另外，研究也發現，土壤中細菌的裂解效率與其中黏粒的含量呈明顯的負相關。土壤中各粒級顆粒對細菌的吸附量從大到小的順序為：黏粒、粉粒、細沙粒、粗沙粒，其中黏粒是粉粒的3.7～4.9倍、細沙粒的44.3～89.2倍、粗沙粒的262.0～799.0倍，細菌在粒徑不同的土壤顆粒表面的最大與最小吸附量分別相差389.0和857.0倍，去有機質土壤顆粒對細菌吸附親和力較含有機質土壤顆粒的大[45]。因此，不同的土壤適合于不同的DNA提取方法，在土壤DNA提取過程中，應針對土壤類別選取合適的提取方法，以便進行后續研究。

4 小結

從土壤微生物群體基因組的角度研究其多樣性及功能是可行的方法，并受到廣泛的關注[46]。因而越過分離培養的步驟，直接從土壤中獲得總DNA以分析土壤微生態群落結構，關鍵是如何盡可能全面地提取土壤中微生物的總DNA。土壤本身成分復雜，有許多物質難以預料，對提取較好質量的DNA提出了很高的要求。因此建立一種簡單有效的提取方法顯得非常重要。

間接法提取的微生物DNA純度較高，提取的種類和數量較少；直接提取法直接在土壤中裂解細胞，使其中內含物盡可能地釋放，能夠代表大部分的土壤微生物，但土壤中所含物質種類較復雜，所以提取的DNA質量受到很大的影響，需要進一步純化，而這些處理往往造成部分DNA的喪失，可能使在土壤中本身存在量較少的種類喪失或檢測不到，影響到土壤微生物多樣性的分析。最近，Milko等[47]發現一種Taq DNA聚合酶基因突變型可增加對腐殖酸等PCR抑制物的抗性，不需要對基因組DNA進行純化就可以進行后續的分子生物學分析，因此具有廣泛的應用前景。

絕大多數直接提取法提取的DN段長度不會超過23 kb，而DNA的某些用途如宏基因組文庫構建，需要大片段的DNA，直接提取法對此幾乎無能為力。

在DNA提取產率高即表示其所代表的微生物多樣性高的前提下，DNA直接提取法被認為是較好的方法并被廣泛應用[48]。但近年來有研究表明DNA提取的產率高不等同于微生物的多樣性高，間接提取法又再次被提出并用于相關研究[49]。這就要求在選擇提取方法時不僅要試用直接提取和間接提取這兩類方法，而且在每類方法中也要試用不同的處理組合方式，以使后續操作能順利進行，并得到準確可信的研究結果。

評價一種土壤微生物DNA提取方法是否有效，除了通常要求的提取片段無降解且比較完整外，還需要能夠有效去除土壤中大量存在的影響后續實驗的物質，如腐殖酸、腐殖酸似物、酚類化合物、重金屬離子等；能在單位樣本量中比較徹底地提取出微生物DNA；提取方法應具有普適性，對土壤中大多數微生物能夠有效等[50]，且提取的DNA能更好地代表土壤微生物的真實性和異質性。

5 展望

目前，國內外對土壤微生物總DNA提取方法的報道很多，但每一種方法都存在一定的缺陷。因此，從土壤樣品中提取DNA還沒有通用的最佳方案，需要根據具體的土壤特點、實驗室條件和實驗目的而定。在提取過程中還要兼顧實驗操作是否簡便，方法是否經濟以及樣品量是否充足。另外，將現代分子生物學技術與傳統微生物研究方法結合起來，才能更全面地認識和理解土壤微生物群落多樣性及其相應的生態功能。

參考文獻：

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篇3

【關鍵詞】微生物學；實驗教學；教學改革；創新

微生物學是涉及生命科學、食品科學、醫學、環境科學等眾多領域的一門重要學科。同其它生物學科一樣，微生物學也是一門實踐性很強的學科，實驗技術的發展是微生物學賴以建立和發展的直接基礎[1]。因此，在微生物學的教學過程中，實驗教學是實現其教學目標所必不可少的重要環節，在創新性人才培養和素質教育中起著至關重要的作用。同時，對于學生而言，掌握好微生物學實驗技術既是從事微生物學相關研究的基本保證，也是培養學生縝密思考、細心觀察、嚴格操作的良好習慣的重要途徑，更是未來開發和利用微生物資源的重要手段[2]。

1優化實驗教學內容，激發學生學習興趣

傳統的微生物學實驗多為驗證性實驗。例如，為幫助學生形象地了解不同類群微生物的細胞形態，先后安排了“細菌形態觀察”、“放線菌形態觀察”、“霉菌形態觀察”和“酵母菌形態觀察”4個實驗；為了幫助學生認識細菌細胞的特殊構造，又分別安排了“革蘭氏染色”、“芽孢染色”、“鞭毛染色”和“莢膜染色”4個實驗。這些基礎性實驗，一方面和教師的理論課教學有相當的重復率，另一方面，各相關實驗之間涉及的實驗原理也有一定的相似性。因此，學生在實驗課的學習過程中會覺得內容簡單重復，過于枯燥。為適應教學改革的需要，在保證教學效果的前提下，我們將微生物實驗教學內容認真進行了重新規劃和調整。

1.1壓縮驗證性實驗內容

驗證性實驗重點培養的是學生對基礎知識的掌握和基本操作技能的訓練。在教學改革中，我們依據教學大綱的要求，保留了“顯微鏡的使用”、“微生物制片與染色技術”、“無菌操作技術”、“微生物生長量的測定”、“培養基的制備與滅菌”和“微生物純培養技術”六個基礎項目，其中每項實驗僅挑選一個最具代表性的實驗內容為實驗課教學所采用。比如，“微生物制片與染色技術”中，選取了重要的“革蘭氏染色實驗”，而與之相似的“芽孢染色”、“鞭毛染色”、“莢膜染色”內容則調整到理論課教學中展示，這樣不僅節約了實驗課的教學時間，也能保證教學重點的突出。同時，在驗證性實驗教學中，教師還鼓勵有興趣的同學參與到實驗準備過程中來，增強了學生對微生物實驗的全景式了解，調動了學生的學習積極性。

1.2 增加綜合性實驗和設計性實驗內容

實驗教學改革要求以學生為本，充分體現學生的主體地位[3]。而綜合性實驗和設計性實驗不僅能很好的發揮學生的主觀能動性，還能充分培養他們的創新能力。例如，我校的微生物實驗教學中，開設了《水的細菌學檢查》、《酸奶中乳酸菌的分離及發酵活性研究》等綜合性實驗，要求學生4人一組，在教師的指導下共同完成實驗材料的準備、實驗實施、結果分析和實驗報告。綜合性實驗的開設，幫助學生將分散的理論知識和各項實驗技能有機地結合起來解決實際問題，激發了學生對實驗課的學習興趣和熱情。在此基礎上，進一步開設設計性實驗訓練學生的科研能力和分析能力。學生在教師的指導下選定實驗項目，通過查閱文獻、制定方案、準備材料、完成實驗，最終得出結論，并提交包含上述內容的實驗報告。在設計性實驗中，學生完全作為實驗的主體，教師僅起到了輔助和指導作用，全面培養了學生收集信息、分析問題、歸納整理和科學思維的能力，為未來的科研之路打下了良好的基礎。經過調整，我校微生物學實驗教學中驗證性實驗所占的比例由最初的90%降至50%，綜合性和設計性實驗則由10%上升至50%，教學內容安排日趨合理。

2引入多媒體授課方式，強化教師教學效果

近年來，生命科學相關的各類課程幾乎或多或少都引入了多媒體技術作為重要的教學輔助手段。我校的微生物理論教學也較早采用了多媒體技術，教學效果良好。而實驗課教學中多年來仍沿用板書講解、教師演示這一傳統的教學模式。近兩年，隨著實驗教學條件的日趨完善，教學實驗室內也配備了多媒體設備，多媒體授課方式的引入，不僅改變了原有的授課形式，也使得教學效果有了明顯提高。例如，微生物學“無菌操作技術”實驗中，對于重點的無菌接種操作步驟，教師都要面對學生親自動手示范。由于演示的實驗臺的空間有限，教師操作時，并不能確保全班每一個學生都能清晰地觀察到操作的具體細節，因而學生動手實驗時往往還是會出現操作不規范甚至操作錯誤的現象。采用多媒體教學后，由于可以通過圖片、視頻等直觀地展示并放大實驗操作的細節性內容，不但增強了實驗操作的演示效果，還能保證學生學習的準確性和實驗操作的規范，而這種先進的教學方式，學生也比較樂于接受。

3完善考核評價體系，全面評定學生能力

考核環節是提高實驗課教學質量不可或缺的一部分，直接影響學生的學習動力、學習態度和學習效果，沒有有效的考核機制，教學改革也可能會流于形式[4]。傳統的微生物學實驗考核多是單一的以實驗報告和平時考勤進行評定，容易造成學生只重視實驗報告、忽略實驗操作，重視實驗數據、忽視實驗過程的情況。因此，在教學改革中，我們將實驗課總評成績劃分為平時成績10%（包括實驗預習、課堂考勤、動手操作、安全衛生等）、實驗報告20%和實驗考試70%三個部分。期末的實驗考試重點考核學生的動手操作能力，采用抽簽的方式讓學生隨即抽取一項考試內容，在規定的時間內完成實驗操作得出實驗結果，教師根據學生的實驗操作情況和實驗結果進行評分。這樣的考核機制不但能全面衡量學生的學習效果，而且在平時的課堂實驗中學生的動手積極性也普遍提高，明顯促進了課堂教學。

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篇4

關鍵詞：食品微生物；快速檢測技術

中圖分類號：R194.2文獻標識碼：A

眾所周知，食品是人類賴以生存和發展的基礎，而食品的安全問題的重要性是顯而易見的，目前食品的安全已經得到了全社會甚至全世界的廣泛關注。食品微生物快速檢測技術和傳統的檢測技術相比具有很多的優點，因此得到了越來越廣泛的應用和推廣，通過快速檢測技術的應用，可以實現對食品中各種微生物的快速檢測，避免由于食源性而導致的疾病，保證人類的健康。本文對當前應用的較為廣泛的食品微生物快速檢測技術進行了分析和探討，目的是希望用最快及最準確的方法檢測食源性致病菌，進而保證人們生命的安全。

1免疫學技術

1.1免疫熒光技術

免疫熒光技術（Immunofluorescence　technique　）又稱熒光抗體技術。它是通過抗原抗體反應的高度特異性，在抗體（或抗原）上加入不影響抗原抗體活性的熒光色素標記，當與其相應的抗原（或抗體）結合后，在熒光顯微鏡下呈現一種特異性熒光反應從而實現對細菌的檢測和鑒別的技術。

該技術通常可以按照以下的操作步驟來完成檢測。

1.1.1對接受檢測的樣本中的抗原或者抗體測定出來，使被檢驗的樣本和酶標抗原或者是抗體結合在一起之后，根據相關要求中的步驟使其和固相載體的表面的抗原和抗體發生反應。

1.1.2通過洗滌將位于固相載體表面的抗原抗體分離出來，這時使得接受檢測的樣本的量和位于固相載體表面的酶量會以一定的比例結合在一起，然后在其中加入一定量的酶反應底物，這時經過催化劑的摧毀作用底物將會變成有色物質，有色產物和接受檢測樣本物質的多少之間有著密切的關系，這時就可以根據有色物質的顏色深淺來完成對接受檢測樣本的定量分析。該種檢測方法的靈敏度較高，增菌之后樣本在達到檢出度需要的時間比較短，因此抗原和抗體在很短的時間之內就可以完成結合反應。

1.2酶聯免疫吸附技術

該種技術是放射免疫技術和熒光技術的有機結合，酶聯免疫吸附技術是固相載體通過對抗原和抗體的吸附并完成免疫酶染色，當底物有顏色顯現出來之后然后對定量有色產物的分析進而將接受檢測樣本中的某些物質的具體含量確定出來。當前主要的分類方法有競爭法、捕獲法、間接法以及夾心法。酶聯免疫吸附技術具有很多優點，比如可以實現定量分析、適用范圍廣、反應靈敏準確、簡單方便、檢測費用低、檢測速度高以及分析結果真實可靠等，該種技術可實現對數量較多的樣品進行分析，數量可到上千種，正是因為該種技術具有如此之多的優點，在食品檢測中得到了十分廣泛的應用。

1.3免疫層析技術

免疫層析技術作為一種固相免疫測定技術，它的原理是在膜以便添加的樣品在膜的毛細管的作用下朝另外一邊移動和層析相似，在發生移動的過程當中某些抗原和抗體完成結合之后被固相化，在移動中除了結合物之外的物質將會被分離出來，根據標記物的顏色深淺來完成被測樣本的定量分析。目前應用較為廣泛的是膠體金免疫層技術，其就是通過膠體金來進行標記物的試驗，具有很多的優點，比如準確、快速、簡單以及無污染，可以實現對食品中霍亂弧菌、布氏桿菌、金黃色葡萄糖球菌、沙門氏菌以及大腸桿菌等的檢測和鑒定。

1.4免疫磁珠技術

該種技術通過連接抗體的磁珠將增菌液中的目的捕捉出來之后在平板上將獲得的目的菌進行觀察分析，或亦可通過酶標記或者是熒光抗抗體來完成檢測鑒定。目前可以通過該種技術來完成對大腸桿菌0111、0145、0157以及沙門氏菌的檢測和鑒定。

2分子生物學

2.1基因芯片技術

基因芯片是生物芯片的一種，也就是DNA微探針陣列。基因芯片技術是通過對微電子技術和分子生物學的應用，使得被標記的基因探針和寡核苷酸點雜交之后，使用相關的檢測系統實現對芯片的掃描，進而實現對被測樣本中的微生物進行定量分析和鑒定。該種技術在一次試驗中可以將接受檢驗樣本中所有的潛在致病原以及其遺傳性指標。在施工該種技術的時候，由于芯片檢測的結構在很大程度上會受到樣點自動識別的影響，因此基因芯片在進行處理數據以及提取信息的時候要確保對圖像中所有雜交樣點的準確定位。

2.2基因探針技術

該種技術是在一定的條件下使得2條可以實現互補的2條堿基DNA鏈完成互補之后形成具有穩定性的DNA，其原理是通過對接受檢測的樣品和DNA探針進行觀測，看有沒有雜交分子出現，進而實現對被檢測樣品中是否存在某種微生物的判斷，如果有雜交分子出現即就是存在某種微生物，反之就沒有。該種技術誕生于20個世紀90年代，該種技術在法國和美國等發達國家的食品微生物檢測中已經得到了廣泛的應用，加上現在的DNA指紋圖譜自動分析系統中實現了對化學發光標志物的引進，可以更加簡單方便的對獲得的圖譜和核酸堿基進行分析對比以實現對視頻中微生物的定量分析和鑒定。

3代謝學

3.1阻抗法

阻抗法的原理是微生物在生長時培養基中的碘惰性底物經過代謝成為活性底物，這時培養基中的電導性就會增加以降低培養基中的阻抗，這對培養基中的電阻抗的具體變化情況進行檢查分析就會完成對被檢測樣本微生物的檢測鑒定。該種檢測方法適用的范圍廣，在很多領域都得到了廣泛的應用，其具有很多優點，比如特異性、高敏感性以及反映快速等。

3.2放射法

該種檢測方法是將多種物理和化學診斷方法結合在一起的新的檢測技術，其原理是在細菌生長的過程中通過培養基中的鹽類底物或者是有碳標記的碳水化合物經過代謝之后產生一氧化碳，這時對產生的一氧化碳量進行測量分析，其量在原有碳水化合物的基礎上一氧化碳量有沒有增加來實現對被檢測樣本中的某種微生物細菌進行分析。該種檢測方法具有很多優點，比如準確度高、速度快，更重要的是可以實現自動化檢測。該種檢測技術對各類物品的無菌檢測都是非常適用的。

4干片法

該種方法是對微生物學、高分子學以及化學綜合應用的檢測方法，其原理是通過無毒的高分子材料作為培養基載體進而準確快速的完成對食品中各種微生物的定量分析，該種方法已經成為一種定量的常規方法。該種方法可以保證測定的精確度，對于少量樣品的檢查無需配置試劑，因此操作起來簡單方便、費用低、攜帶方便而且不會受到時間的限制，除此之外該種方法沒有任何廢棄物產生，所以不會給環境帶來污染，由此可見該種方法具有較強的適用范圍，可以在很大程度上減少工作人員的工作量，而且還可以保證檢測的質量。

5PCR技術

該種檢測技術的原理將目的菌高度保守段的具有特異性的DNA進行大量的復制并對這些DNA進行檢測分析，假如在樣品匯總有目的菌存在就將有關特異性的DNA復制出來，對具有特異性DNA復制通過聚合酶鏈反應就是PCR技術。目前PCR技術在食品的微生物檢測中已經得到了廣泛的應用，而且已經形成了標準化，得到很多權威機構的認可，該種檢測技術具有速度快、精度高、污染小、一級自動化程度高等優點，可以實現對單增李斯特菌、大腸桿菌O157、阪崎腸桿菌以及沙門氏菌等1　000多種細菌的檢測鑒定。

6直接表面熒光濾膜計數技術

該種檢測技術可以直接將被測樣本中微生物負荷量測定出來，最開始研究開發該技術是為了對牛奶樣品進行檢測，當前該種檢測方法在肉類制品、乳制品以及飲料等物質的檢測中都得到了廣泛的應用。該技術通過表面熒光顯微鏡以及膜技術的使用時限對樣本的培養之后通過DEFTT來完成計數。通過該中技術可以對5℃和11℃條件下保存的巴氏殺菌乳的質量進行檢測分析，而且完成每一個樣品的檢測不到半個小時的時間，而且檢測需要的費用較少。隨著直接表面熒光濾膜計數技術的不斷發展，目前可以實現對蘋果汁以及蔬菜等的大腸桿菌的檢測和鑒定，此技術不但能通過膜過濾實現對食品中微生物的收集并在膜的表面濃縮，而且能通過表面熒光顯微鏡實現熒光抗體的染色。通過該種方法和別的方法分析的結果是一致的，由此可見該種方法作為李氏桿菌數量測定方法是合理可行的。

7食品微生物快速檢測技術的不足

通過以上的分析和評估，不同的食品微生物檢測技術都有著自己的優點以及使用范圍，很多快速檢測技術對于某種食品檢測性能會比其他食品更加優良，這主要是因為食品自身的成分導致的，有些食品中的一些成分在使用食品微生物快速檢測技術是很麻煩的，需要考慮到很多的因素，食品中的有些成分會直接影響檢測的結果，因此要引起重視，以確保檢測的準確性。

8結束語

綜上所述，由于快速檢測技術具有很多的優點，因此越來越多的應用到了食品的微生物檢測和鑒定當中，這也在很大程度上促進了快速檢測技術的發展和進步。由于每一種檢測技術都有一定的適用性，因此不管是企業還是檢測鑒定中心，在選擇微生物快速檢測技術的時候，要結合多種因素進行考慮，要做到以最少的時間和花費實現對食品微生物的快速檢測和鑒定。這就需要不斷完善科研管理體系，同時要不斷提高檢測隊伍的綜合實力，當然還要保證加大科研經費的投入以確保檢測鑒定儀器的先進性，并能及時掌握國際的先進信息，以便于及時掌握一些先進的檢測鑒定技術，更好的完成對食品微生物的檢測和鑒定，以保證人們生命的安全。

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篇5

一、????概念：

1、細胞壁?2、周質空間?3、菌落?4、莢膜?5、芽孢?6、糖被?7、氣生菌絲體?8、原生質體

9、營養菌絲體?10、細胞膜?11、間體?12、羧化體?13、核質體?14、鞭毛?15、菌毛?16、隱生態?17、球狀體?18、L型細菌?19、肽聚糖?20、溶菌酶?21、磷壁酸?22、伴孢晶體?23、基內菌絲?24、孢子絲?25、支原體?26、衣原體?27、立克次氏體?28、螺旋體?29、螺菌?30、PHB?31、原核微生物

二、????填空：

1、????細菌的形態十分簡單，基本上只有-------、---------、----------三大類。

2、????細菌是以----------方式繁殖，并是一種---------性較強的------核微生物。

3、????量度細菌大小的單位是--------，量度其亞細胞結構則用---------作單位。

4、????細胞壁主要由---------構成，有-------和---------等多種功能，通過--------、----------或----------后再在光學顯微鏡下觀察，可證實細胞壁的存在。

5、????原生質體和球狀體有幾個共同特點，主要是-------，細胞呈-----狀，對-------十分敏感。

6、????基質蛋白使外壁層具有------功能，外壁蛋白是一類-------運送蛋白或受體脂蛋白，作用是使細胞壁的--------牢固地連接在由肽聚糖組成的---------上。

7、????細胞膜是-------和--------組成的，通過---------、--------、--------或--------等方法，可以證明細胞膜的存在，細胞膜的基本成分是由--------整齊地排列而成的。

8、????磷脂雙分子層通常呈--------態，不同的-------和--------可在磷脂雙分子層中作側向運動。

9、????異染粒功能是---------和----------，并可---------。

10、放線菌是一類呈----------，以----------繁殖的革蘭氏-----性細胞。

11、在固體培養基表面，放線菌的細胞有------和-------的分化。

12、細菌革蘭氏染色的主要原理是_。影響染色的主要因素是_和_，革蘭氏染色后為紅色的是_。

13、影響革蘭氏染色結果的因素是___，E.coli屬于_性菌，染色結果為_色。?Bacillus?subtilis屬于_性菌，染色結果為_色。

14、微生物胞內酶作用的最適PH多接近_，而細胞質膜上的酶及胞外膜作用的最適PH則接近--------?。

15、?脂多糖的基本組成為?????，?????，??????，為獲得G-?菌原生質體，可通過加入-----劑去除脂多糖。

16、?影響微生物細胞化學組成的因素有???????，????，???????。

17、肽聚糖單體的雙糖單位是由一個-------與一個-------通過---------鍵連接而成的。

18、肽聚糖單體的多肽尾中的四個氨基酸是按--------方式連接而成的。

19、莢膜的主要成分有---------、-----------、----------，尤以--------居多。

20、細菌的芽孢是----------體，而放線菌的孢子是----------體。

21、雙糖單位中---------鍵很容易被---------酶所水解，從而引起細菌因肽聚糖細胞壁的“散架”而死亡。

22、????目前所知的肽聚糖有--------種，肽聚糖的多樣性變化主要發生在--------上。

三、????簡答題：

1、????革蘭氏陽性細菌與陰性細菌結構單體有何差別？

2、????簡述一下磷壁酸的主要生理功能。

3、????簡述脂多糖的主要生理功能。

4、????細胞膜的功能是什么？

5、????芽孢形成的七個階段是什么？

6、????革蘭氏陰性細菌與革蘭氏陽性細菌的肽聚糖結構有何不同？

7、????細菌芽孢有何特點？

8、????如何理解“菌落特征與菌體細胞結構、生長行為及環境條件有關”？

9、????簡述細菌糖被的類型及其對科學研究、生產實踐的意義。

10、????芽孢的耐熱機制是什么？

11、????莢膜的功能是什么？

12、????細胞壁的功能是什么？

四、????論述題：

1、????試繪出細菌細胞構造的模型圖，注明其一般構造和特殊構造，并扼要注明各部分的生理功能。

2、????研究微生物的形態構造有何重要性？試舉一例說明之。

3、????試圖示革蘭氏陽性細菌和陰性細菌的細胞壁構造，并簡要說明其特點及成分。

4、????試比較細菌的芽孢與孢囊的異同。

5、????產芽孢的細菌有哪幾類？試各舉一例。細菌的芽孢有何實踐的重要性？

6、????比較G+和G-在一系列生物學特性上的差別。

7、????革蘭氏染色中，為什么能把細菌分為G+和G-細菌？什么情況下將會導致實驗結果相反？

8、????論述一下革蘭氏染色的步驟及其染色機理，有何重要意義？

9、????試根據細菌細胞結構的特點，分析并舉例說明為什么它們能在自然界中分布廣泛。

10、????如何理解“放線菌是介于細菌與絲狀真菌間而更接近細菌的一類微生物”？

11、????如何理解“菌落特征與菌體細胞結構、生長行為及環境條件有關”？

第一章b部分練習題

一、????概念：

1、????假菌絲?2、真菌絲?3、基質?4、微體?5、膜邊體?6、子囊果?7、菌絲?8、菌絲體?9、菌絲球?10、芽痕?11、蒂痕?12、單細胞蛋白（SCP）?13、氣生菌絲體?14、營養菌絲體

二、????填空題：

1、????酵母菌的細胞壁的外層為----------，內層為----------，其間夾有一層----------。

2、????維持酵母菌細胞壁強度的物質主要是位于---------層的---------成分。

3、????酵母菌細胞壁上含有少量--------和以----狀形式分布在芽孢周圍的---------。

4、????蝸牛消化酶內含有-------酶、-------酶、-------酶、--------酶、--------酶等30種。

5、????除細胞核外，在酵母的------和------中也含有DNA。

6、????產生擲孢子等無性孢子是在--------細胞上長出的-------上形成的。

7、????營養菌絲體的特化形式有-----------------------------------------------------。

8、????酵母菌是_，其無性繁殖方式是_和_，有性繁殖是_。

9、????霉菌產生的無性孢子有___。

10、????真菌的無性孢子有??????，??????，??????，???????，???????等。

11、????真菌的有性孢子有??????，???????，??????，?????，????。

12、????細菌和放線菌利用--------酶去除細胞壁，而真菌利用-------酶去除細胞壁。

三、????簡答題：

1、????霉菌一般具有哪五點特點？

2、????簡述細胞膜的功能。

3、????簡述芽體的形成過程。

4、????霉菌的營養菌絲和氣生菌絲有何特點？它們可以分化出哪種特殊構造？

5、????如何獲得細菌（G+、G+）、放線菌、酵母菌、霉菌的原生質體？

6、????為什么霉菌菌落的中央邊緣、正面與反面在外形、顏色、構造等方面常有明顯差別？放線菌、細菌和酵母菌呢？

7、????酵母菌有性繁殖的過程是什么？

8、????霉菌的有性繁殖方式的過程是什么？

9、????霉菌有性繁殖方式的特點是什么？

10、????簡述一下酵母菌的生活史。

11、????簡述一下霉菌的生活史。

四、????論述題：

1、????試述真菌與人類的關系。

2、????試論述真菌孢子的特點，并說明其實踐意義。

3、????試列表比較真菌孢子的種類和各自的特點。

4、????放線菌、酵母菌、細菌和霉菌這四大類微生物有何特點？為何有這些特點？掌握這些知識有何實踐意義？

5、????細菌、粘細菌、放線菌、霉菌、酵母在繁殖方式上各有什么特點？

6、????列表比較細菌、放線菌、霉菌、酵母菌細胞結構、群體特征及繁殖方式的異同點。

7、????詳細比較一下真核生物和原核生物的異同？

第二章部分的練習題

一、????概念題：

1、????包涵體?2、噬菌斑?3、烈性噬菌體?4、溫和噬菌體?5、裂解性生活周期?6、效價?7、溶源性?8、溶源噬菌體?9、溶源菌?10、原噬菌體?11、類病毒?12、擬病毒?13、朊病毒?14、病毒?15、一步生長曲線?16、巴斯德效應

二、????填空題：

1、????病毒粒子的包膜由------和-------組成。

2、????包涵體多數位于-------內，具有-------性；少數位于--------內，具有------性；也有-------和-------內都存在的類型。

3、????螺旋對稱病毒的代表是--------，十二面體對稱病毒的代表是--------，附和對稱的病毒代表是--------。

4、????噬菌體的核酸是以-------居多，而真菌病毒則是----------。

5、????噬菌體的裂解是由于水解細胞膜的-------酶和水解細胞壁的-------酶的作用。

6、????溫和噬菌體的存在形式有------、--------和--------。

7、????噬菌體的特點是___，其生長繁殖過程包括_____五個步驟。

8、病毒的主要組成為???和?????。具有????????，?????，???????，?????????等特點。

9、溶原性細菌具有????，??????，??????，????，??????等特點。

10、一步生長曲線的三個重要特性參數是--------、----------、---------。

三、????簡答題：

1、????根據包涵體的特點，可把它們分成哪幾種類型？

2、????病毒核酸的類型可從哪幾點區分？

3、????噬菌體的吸附作用受哪些內外因素的影響？

4、????簡述溫和噬菌體的特點。

5、????簡述溶源菌有哪些顯著的特點。

6、????簡述大腸桿菌l噬菌體在作為遺傳工程載體時具有哪些優點？

7、????病毒學發展可分幾個主要階段？簡述一下各階段的特點及其代表人物。

8、????噬菌體的外形可分哪幾個類型？其相應的核酸屬何類型？

9、????病毒的核酸可分為哪幾個類型？

10、????簡述烈性噬菌體其裂解性的生活史。

11、????測定效價的方法有哪幾種？試簡述之。

四、????論述題：

1、????試介紹噬菌體在基因工程中的應用。

2、????如何判斷發酵罐被噬菌體侵染了？如何預防？怎樣處理？

第三章的練習題

一、????概念

1、營養???2、營養物??3、氨基酸自養型微生物??4、氨基酸異養型微生物

5、生長因子??6、培養基??7、天然培養基???8、組合培養基??9、半組合培養基?????10、固體培養基???12、液體培養基??13、選擇培養基??14、鑒別培養基

15、加富培養基??16、碳源??17、氮源??18、能源??19、水活度

20、自養微生物

二、????填空

1、????生長因子過量合成微生物可作為-------的生產菌。

2、????常用的選擇性培養基幾乎都同時利用了------和------原理。

3、????營養物質進入細胞的方式有-----、------、-------、-------。

4、????在促進擴散過程中，必須借助于膜上的底物--------的參與。

5、????微生物吸收營養物質的主要機制是--------，由它運送的營養物質主要有-------、-------和--------。

6、????基團移位主要用于運送------、--------、--------、--------、--------和-------。

7、????任何培養基都應具備微生物所需的---------，且其間的-------是合適的，一旦配成，必須-------。

8、????EMB培養基除有鑒別不同菌落的作用外，同時還有抑制--------細菌和選擇-------細菌的作用。

9、????最常用的鑒別培養基為----------。

10、最常用的固體培養基凝固劑是----------。

11、微生物的營養類型分為-------、-------、--------、--------、----------。

12、微生物的的六大營養要素有-------------------------------------------。

13、按培養基用途可分為-------、-------、--------、--------、-------。

14、生長因子是___________________________________________，

包括_____，_____，??________，_____等，以生長因子劃分，

微生物的營養類型可分為_______和______兩種。

15、????低培養基氧化還原電勢Eh，可通過_______，_______，?????___，????等手段。

16、培養時，培養皿倒置是為了_______和________。

17、大腸桿菌的定義是______。在食品中檢測大腸菌群的意義是_______。常用________培養基，根據其用途，該培養基屬于________培養基。

三、?????簡答題

1、????選擇和設計培養基的方法是什么？

2、????選用培養基的原則是什么？

3、????簡述一下如何利用鑒別培養基對大腸桿菌進行檢測？

4、????簡述營養物質進入細胞方式的異同。

名稱????擴散????促進擴散????主動運輸

載體

能量

逆濃度運輸

有無選擇性????????????有高度的專一性

5、????天然培養基的優、缺點是什么？組合培養基的優、缺點是什么？

6、????根據固體的性質，可把固體培養基分為幾種類型？

7、????簡述固體培養基在科學研究和生產實踐上有哪些用途？

8、????怎樣利用選擇性培養基，將混合樣品中的數量很少的某種微生物鑒別出？

9、????生長因子包括哪幾類化合物？是否任何微生物都需要生長因子，如何才能滿足微生物對生長因子的需要？

10、活度對微生物的生命活動有何影響？

11、天然、合成、半合成培養基各有哪些應用？

12、試對細菌、放線菌、酵母菌各舉一種合成或半合成、天然培養基。

13、列表比較微生物的四大營養類型。

14、繪圖并簡要說明營養物跨膜運輸的四種類型。

15、析下述培養基各組分的作用，依據其功能推測其所屬培養基的類?型：

A．麥康開培養液：蛋白胨20g,乳糖10g,牛膽酸鹽5g,NaCl?5g,水1000ml,PH7.4??加1%中性紅5ml???分裝與有發酵管的試管0.7kg/km2滅菌15min，用于腸道桿菌培養。

B.檸檬酸鹽培養基：NH4H2PO4??1g，K2HPO4???1g，NaCl??5g，MgSO4??0.2g,檸檬酸鈉2g,瓊脂??18g，水1000ml，PH6.8???加1%溴麝香草酚蘭10ml，1.1Kg/cm2滅菌20分鐘，制成斜面，用于細菌利用檸檬酸鹽試驗。

A????????????????????功能????B??????????????????????功能

蛋白胨????????NH4H2PO4

乳糖????????K2HPO4

NaCl????????NaCl、MgSO4、K2HPO4

牛膽酸鹽????????檸檬酸鈉

PH7.4????????瓊脂

1%中性紅????????1%溴麝香草酚蘭

發酵管????????PH6.8

16、敘述微生物的營養物跨膜輸送方式。

17、試列表比較單純擴散、促進擴散、主動運輸、基團移位四種不同營養物質運送方式。

比較項目????特意性載體蛋白????運送速度????溶質運送方式????平衡時內外濃度????運送分子????能耗????運送前后溶質分子

單純擴散

促進擴散

主動運輸

基團移位

四、????論述題、

1、????選擇性培養基在微生物學工作中有何重要性？試舉一例，并分析其中的選擇性原理。

2、????鑒別性培養基有何重要性？試以EMB為例分析鑒別性培養基的作用原理。

3、????培養基中各種營養要素的含量一般遵循何種順序？試言其理。

4、????在設計一種新培養基前為什么要遵循“目的明確”的原則，你能舉些實例來說明嗎？

5、????試述瓊脂平板培養技術的優點及其在解決一系列微生物學問題中起過的重大歷史作用。

6、微生物由于個體微小一般都是以其群體形式進行研究或利用，這必然就要涉及到對微生物的培養。能否找到一種培養基，使?所有的微生物都能良好地生長？為什么？

7、試結合微生物學實驗課的內容，談談在選擇、配制和使用培養基時應注意哪些方面的內容。你們在實驗中是如何做的？有何體會？

8、試比較營養物質進入微生物細胞的幾種方式的基本特點。

9、如何理解“菌落特征與菌體細胞結構、生長行為及環境條件有關”？

10、寫出微生物以淀粉為碳源其代謝的一般過程，鑒定其代謝產物有何意義？為什么？

11、為什么霉菌菌落的中央邊緣、正面與反面在外形、顏色、構造等方面常有明顯差別？放線菌、細菌和酵母菌呢？

12、營養要素與配置培養基的某一營養物是否同一概念？舉例說明。

第四章部分的練習題

一、????概念

1、新陳代謝??2、生物氧化??3、呼吸鏈??4、無氧呼吸??5、發酵??6、操縱子

7、同型乳酸發酵??8、異型乳酸發酵??9、葡萄糖效應??10、誘導酶

11、同功酶??12、變構酶??13、操縱基因??14、結構基因??15、調節基因

16、阻遏??17、回補順序??18、氧化磷酸化

二、????填空

1、????生物氧化的形式有---------、--------和--------，其過程又可分為------、--------、和--------，功能有-------、-------、和--------。

2、????在真核微生物中，TCA循環的反應在-------內進行，其中的大多數酶定位在------中；在原核微生物（例如，細菌）中，大多數酶都存在在------內。

3、????根據遞氫特別是受氫過程中氫受體性質的不同，可把生物分為氧化區分成-------、--------和-------類型。

4、????在氫或電子傳遞過程中，通過與------反應發生偶聯，就可產生ATP形式的能量。

5、????在硫呼吸過程中，------作為無氧呼吸鏈的最終氫受體，結果硫還原成-------。

6、????碳酸鹽呼吸是一類以-------作為無氧呼吸鏈的末端氫受體的無氧呼吸。

7、????凡能利用-------為唯一的碳源或能源的微生物，都能證明存在著-------循環，這種循環主要是通過-------酶和---------酶實現的。

8、????反饋抑制的類型有---------和--------。

9、????酶活性調節的類型有---------和-------。

10、????操縱子分為------和------兩類。

11、????在谷氨酸發酵生產中，--------的濃度對谷氨酸的積累有著明顯的作用。

12、酵母菌生物氧化在____內進行，而細菌生物氧化部位在____。

13、根據微生物生長與氧的關系，可分為_____、______和_____三大類。枯草芽孢桿菌屬于_____微生物，肉毒芽孢桿菌屬于______微生物，大腸桿菌屬于_____微生物。

14、至今發現的進行固氮的微生物均為_____________微生物。固氮的六個必要條件為________，__________，______，_______，_____，________。

15、在發酵工業上，可通過___________________，_________________，__________等方法獲得大量有用代謝產物。

16、酵母菌進行乙醇發酵時，將葡萄糖經______途徑產生丙酮酸，由丙酮酸生成的乙醛被______成乙醇。

17、微生物胞內酶作用的最適PH多接近________，而細胞質膜上的酶及胞外膜作用的最適PH則接近________。

三、????簡答題

1、????HMP途徑在微生物生命活動中有何重要意義？

2、????簡述ED途徑的特點？

3、????經ED途徑發酵與傳統酵母酒精發酵相比，有哪些優點？

4、????硝酸鹽在微生物生命活動中，具有哪些功能？

5、????葡糖異生作用的生物意義是什么？

6、????簡述代謝調控在發酵工業中的應用。

7、????試述EMP途徑在微生物生命活動中的重要性。

8、????簡述TCA循環在微生物產能和發酵生產中的重要性。

9、????組成呼吸鏈的組分主要有哪幾個，它們各有什么作用。

10、????列表比較呼吸、無氧呼吸和發酵的異同點。

11、????列表比較同型和異性發酵的異同點。

12、????固氮過程需要滿足哪些條件?

13、????酶活性調節與酶合成調節有何不同？它們間有何聯系？

14、????酶的誘導有何特點？意義如何？

15、????列表比較生物氧化與非生物氧化的主要異同點。

16、????繪圖并簡要說明有氧呼吸典型的呼吸鏈。

四、????論述題

1、????試圖示解釋色氨酸的操縱子的末端產物阻遏機制。

2、????試述代謝調控在賴氨酸發酵中的應用。

3、????如何選育抗反饋調節突變株？舉例說明它在發酵生產中的應用。

4、????細胞膜缺陷突變株在發酵生產中有何應用，試舉例說明之。

5、????通過大腸桿菌乳糖操作子示意圖模型及理論，說明葡萄糖效應和二次生長現象。

6、????如何判斷發酵罐被噬菌體侵染？如何預防？如何處理？

7、不同營養類型的微生物在不同條件下?產生ATP和還原力的方式與特點。

8、何為初級代謝、次級代謝？試論二者間的關系。

9、當環境中葡萄糖、山梨醇同時存在時，E.coli生長現象并分析其原因。

10、試述生物素對谷氨酸發酵生產的影響，并簡述其作用機制。

11、如何使微生物合成比自生所需更多的產物？

12、試圖示由EMP途徑的中間代謝物——丙酮酸出發的六種發酵類型及其各自的發酵產物。

13、在工業上“發酵”的含義是什么？試以一個具體的工業發酵實例為例，從微生物代謝角度說明其原理。

14、如何運用代謝調控理論使微生物合成比自身需求量更多的有用代謝產物？舉例說明。

15、當培養基中葡萄糖和乳糖同時存在時，E.coil的生長現象并分析其原因；

16、試設計選育高纖維素酶高產菌的實驗方案，如已知纖維素酶的合成是操縱子的阻遏機制，如何利用這一機理設計有效的篩選方法？

第五章部分的練習題

一、????概念題：

1、????同步生長?2、生長速率常數?3、對數期?4、生長限制因子?5、生長產量常數?6、最適溫度?7、防腐?8、滅菌?9、繁殖?10、生長曲線?11、代時?12、倍增時間?13、連續培養?14、連續發酵?15、恒濁器?16、恒化器?17、抗生素?18、耐藥性?19、選擇毒力?20、生長?21、同步培養

二、????填空題：

1、????平板菌落計數法的原理是在-------或-------中吸有合適的培養基，其中還加有--------。

2、????研究單個細菌個體的變化目前常使用的方法是：一是-------，二是---------。

3、????同步培養技術是指設法使群體中的所有細胞盡可能的都處在-------中，然后分析此群體的各種--------特征，從而了解單個細胞所發生的變化。

4、????獲得細菌同步生長的方法主要有兩類：其一是通過--------；其二是通過----------，它一般可用-------或--------來達到。

5、????營養物的濃度可影響微生物的---------和--------。在---------情況下，營養物的濃度才會影響生長速率，隨著營養物濃度的逐漸增高，生長速率--------，而只影響---------。

6、????指數期的微生物因其整個群體的--------較一致，-------的平衡發展和-------的恒定，故可作為代謝、生理等研究的---------。是增殖噬菌體的最適----------。

7、????在穩定期時，細胞開始貯存--------、----------和--------等貯藏物；多數芽孢桿菌在這時開始形成-------；有的微生物在穩定期時還開始合成---------。

8、????穩定期是以生產-------或---------的代謝產物。

9、????在衰亡期，整個群體呈現出-----生長，在這一時期有的微生物因蛋白水解酶活力的增強，就發生----------。

10、????恒化器是一種通過控制某一營養物的-------，使其始終成為-------的條件下達到的連續培養裝置。

11、????兼性厭氧型在有氧時靠-------產能；在無氧時借---------或-------產能。

12、????微生物作為一個總體來說，其生長的PH值范圍極廣，多數真菌是-------，而多數放線菌是--------。

13、????根據生長和O2的關系，大多數酵母屬于_，大多數霉菌屬于_。

14、????平板菌落計數法結果表達中常用的“clu”的意思是_。

15、????根據微生物生長和氧氣的關系，可分為___三大類型。黑曲酶屬于_，肉毒梭狀芽孢桿菌屬于_，釀酒酵母屬于_，米曲酶屬于_，解脂假絲酵母屬于_，酪酸梭狀芽孢酵母屬于_。

16、????實驗室常用的滅菌方法有___等。

17、????與氧有關的微生物類型有--------、----------、---------、----------、---------。

18、????干熱滅菌的溫度是----------，處理時間為---------。

19、????巴氏滅菌的溫度為----------，處理時間為----------。

20、????生長曲線是以-------為橫坐標，以-------為縱坐標。

21、????根據----------------的不同，把生長曲線分為----------、----------、----------、----------四個階段。

三、????簡答題：

1、????影響延滯期長短的因素有哪些？

2、????延滯期出現的原因是什么？

3、????簡述對數期的特點。

4、????影響指數期微生物增大時間的因素有哪些？

5、????簡述穩定期的特點。

6、????穩定期到來的主要原因有哪些？

7、????列表比較恒濁器與恒化器的區別。

8、????連續發酵有哪些優缺點？

9、????影響微生物生長的主要因素有哪些？

10、????防腐主要有哪些措施？

11、????影響加壓蒸汽滅菌效果的因素有哪些？

12、????計算微生物的繁殖數時，常用哪些方法？比較它們的優缺點？

13、????如何使微生物達到同步生長？

14、????延滯期的特點是什么？如何縮短延滯期？

15、????影響濕熱滅菌效果的主要因素有哪些？

16、????為什么有些物品在滅菌過程中要實施間歇滅菌？

17、????測定微生物的生長量有那些方法？比較優缺點？

18、????從微生物學角度分析低酸性的食品和酸性食品如要長期保存，應分別采取什么溫度殺菌？為什么？

19、????試證明：Z=

四、????論述題：

1、????在微生物培養過程中引起PH值改變的原因有哪些？在實踐中如何保證微生物能處于較穩定和合適的PH環境中？

2、????在實驗室中培養厭氧微生物的主要方法有哪些？其原理如何？哪兩類屬于培養嚴格厭氧菌的技術？

3、????試述生產實踐中微生物培養裝置發展的幾個特點？

4、????試比較殺菌（滅菌）、消毒和防腐的異同。

5、????利用加熱蒸汽對培養基進行滅菌時常會帶來哪些不利的影響？采用哪些對策方可避免？

6、????試比較細菌的生長繁殖與高等動植物的有哪些異同？

7、????結合本章的知識，總結在日常生活中有哪些措施是被用來抑制或殺滅微生物的。

8、????具體說明怎樣利用微生物的生長曲線使發酵工業的效率有所提高。

第六章部分的練習題（*）、

一、????概念

1、????遺傳型??2、表型??3、變異??4、飾變??5、核基因組??6、質粒

7、單倍體??8、雙倍體??9、基因??10、營養缺陷型??11、突變率

12、產量突變率??13、轉座因子??14、倒位??15、易位??16、光復合作用

17、暗修復作用??18、定向培育??19、誘變育種??20、基本培養基

21、完全培養基??22、補充培養基??23、原養型??24、轉化??25、感受態

26、基因重組??27、轉導??28、普遍轉導??29、局限轉導??30、接合

31、有性雜交??32、準性生殖??33、基因工程??34、染色體畸變??35、轉換

36、移碼突變??37、點突變??38、顛換??39、誘變劑??40、野生型

41、轉染??42、溶原轉變??43、流產轉導??44、原生質體融合??45、接合子

46、轉化子??47、回復突變??48、艾姆斯試驗（Ames?test）??49、PCR

二、????填空

1、-------和-------是生物體最本質的屬性之一。

2、在核酸的結構上，絕大多數微生物的DNA是-------鏈的，只有少數病毒

的核酸為------鏈結構的。

3、基因的物質基礎的一個具有特定--------的核酸片段。

4、微生物的基因調控系統是由操縱子和---------組成，操作子又包括三種基

因，即----------、-----------和--------------。

5、質粒的分離大致可包括細菌的---------、蛋白質和DAN的----------和設法使染色體DNA與質粒DNA相-------等幾種步驟，其中以----------步驟為最重要。

6、經分離后的質粒可用-------、--------或----------來鑒定。

7、同一種質粒由于其構象的不同，其---------也不同，因而可進行分離。

8、能夠引起間接置換的誘變劑都是一些---------的類似物。

9、染色體結構上的變化可分為-----和-------兩類。

10、轉座因子主要有三類，即--------、----------、和-------------。

11、自發突變是指在---------下生物體自然發生的突變。

12、---------對紫外線的敏感性要比嘧啶強得多它的光化產物主要是----------，其中了解較清楚的是-----------的形成和消除。

13、紫外線的主要作用是使同鏈DNA的相鄰嘧啶間形成-------結合的---------。

14、在暗修復過程中有四種酶參與，即----------、----------、---------、和---------。

15、一般可通過--------與-----------兩種對突變株進行生產性能的測定。

16、感受態因子是一種---------蛋白，這種蛋白質可能是------上的一種組成，它可以催化--------的吸收或降解---------成分，以讓細胞表面的DNA受體顯露出來；它也可能是一種-------酶。

17、呈--------形式的轉化因子其轉化頻率最高。

18、在--------菌和--------菌中都存在著接合的現象。

19、在F+菌株的細胞中存在著--------態的F因子，在細胞表面還有與F因子數目相當的----------。

20、在F-菌株中不含----------，細胞表面也沒有----------。

21、原核微生物的基因重組的方式有--------、---------、--------、--------。

22、-------和-------是除染色體以外的另外兩類遺傳物質。

23、凡能產生----------的酵母菌和霉菌都能進行有性生殖。

24、真核微生物的基因重組方式有--------和----------。

25、基因工程比其他育種方法更有--------、---------、---------的優點。

26、決定性別的質粒是--------，又稱-----------。

27、轉導可分為--------和--------。

28、普通性轉導可分為-----------和-----------。

29、光復活作用是指____四種情況。

30、染色體畸變是指____四種情況?。

31、影響微生物的抗熱性的因素是_____?。

33、細胞的異常形態有畸形和衰頹形，前者是指由于_而引起的，而后者是指由于_而引起的。

34、在營養缺陷型菌株篩選過程中，常用抗生素法淘汰野生型菌株。其中淘汰野生型菌株細菌加入的抗生素為_，而淘汰酵母菌和霉菌加入的抗生素則為________。

三、????簡答題

1、????微生物有哪些獨特的生物學特性？

2、????突變有哪幾種類型？

3、????簡述突變的特點？

4、????平板影印培養法的基本過程是什么？

5、????自發突變可能的機制有哪些？

6、????如何挑選優良的出發菌株？

7、????轉化的過程可分為幾個階段？

8、????局限轉導有哪些特點？

9、????溶原轉變與轉導有什么不同？

10、????簡述原生質體融合的主要步驟？

11、????準性生殖的主要過程分為幾步？

12、????基因工程的基本操作分為幾步？

13、????如何獲得目的基因？

14、????選擇載體時必須滿足哪些條件？

15、????誘變育種的基本環節有哪些？整個工作環節的關鍵是什么？

16、????簡述影印培養法在育種工作中的應用？

17、????原生質體融合在育種工作中有何重要性/

18、????什么叫菌種衰退？如何區別衰退、飾變與雜菌污染？

19、????現有的微生物保藏法可分為幾類？試列表解之。

20、????列表比較準性生殖與有性生殖的區別。

21、????為什么微生物經紫外線照射后要在暗中培養？

22、????簡述一下誘變育種的原則。

23、????目的基因是如何導入受體細胞的？

24、????處于感受態的細菌細胞有何優點？

25、????如要長期保藏低酸性食品和酸性食品，通常分別采用什么t殺菌？???????????為什么？

26、????什么是影印培養？如何用其來說明基因突變自發性，隨機性？

四、????論述題

1、????歷史上證明核酸是遺傳物質基礎的著名實驗有哪幾個？實驗者是誰？工作發表于何時？你能舉出其中之一來加以說明嗎？

2、????為什么證明核酸是遺傳物質基礎的三個經典試驗都不約而同地選用了微生物作研究對象？

3、????舉例說明在微生物的誘變育種工作中，采用高效的篩選方案和方法的重要性。

4、????試用表解法概括一下篩選營養缺陷型菌株的主要步驟和方法。

5、????試述瓊脂塊培養法的原理、方法及其在育種中的應用。

6、????從野生型和營養缺陷型混合菌液中如何檢出營養缺陷型菌株？試介紹四種方法，并說明其共同原理。

7、????基因工程在哪些領域得到應用及其發展前景如何？

8、????試從供體、載體、受體、工具酶和“工程菌”在生產實踐上發揮經濟效易等方面來討論微生物在發酵遺傳工程中的重要作用。

9、????就方法的簡便與否，保藏效果的好壞，保藏對象的范圍，保藏的基本原理以及保藏期的長短等方面列表比較幾種最常用的菌種保藏法。

10、????使用什么方法可以使個別菌種發生突變？如何選擇？自己設計步驟。

11、????設計一種從自然界中篩選高溫淀粉酶產生菌的試驗方案，并解釋主??要步驟的基本原理。

12、????試設計一種從自然界中篩選果膠酶產生菌的試驗方案，并解釋原理；如果果膠酶作為一種食品工業用酶，則必須考慮其安全性，從那幾個方面著手來保證該酶的安全性？

13、????試述微生物菌種保藏的原理和常用方法，你認為對于Escherichia???coli?和Aspergillus?niger分別采用什么保藏方法為好？請說明理由；

14、????影響微生物抗熱力的因素有哪些？解釋D值、Z值以及D值和Z值得關系。

15、????試設計一個試驗證明基因突變的自發性和不對應性。

16、????試設計選育高纖維素酶高產菌的實驗方案，如已知纖維素酶的合成是操縱子的阻遏機制，如何利用這一機理設計有效的篩選方法？

17、????試述微生物菌種保藏的原理。Lactobacillus?bulgaricus?和Aspergillus?niger若要長期有效的保藏，可分別采用哪些方法？為什么？

18、試用平板影印培養法證明基因突變的自發性和不對應性。

19、設計一種從自然界中篩選酸性蛋白酶產生菌的試驗方案，說明其原理；若該酶作為食品工業用酶，如何保證其安全性？

20、????述艾姆氏（Ames）法檢測致癌劑的理論依據，一般方法和優點。

21、????為什么在進行誘變處理時，要把成團的微生物細胞或孢子制成充分分散的單細胞或孢子懸液？

22、????設計篩選高溫淀粉酶產生菌的方案，指出關鍵步驟。

23、????菌種保藏的基本原理和冷凍干燥保藏法的過程、原理。在檢出缺陷型過程中采用夾層培養法，為什么基本培養基倒成“三明治”？

第七章部分的練習題

一、????概念

1、極端微生物??2、生態??3、區系??4、活性污泥??5、無菌動物??6、純培養

7、悉生動物??8、硝化作用??9、反硝化作用??10、氨化作用??11、互生

12、共生??13、寄生??14、拮抗??15、捕食??16、生物膜??17、單級生態系統

18、雙級生態系統??19、三級生態系統?20、正常菌群

二、????填空題

1、????大腸桿菌的定義是_。在食品中檢測大腸菌群的意義是_。常用_培養基，根據其用途，該培養基屬于_培養基。

2、活性污泥是指_，用活性污泥處理污水的方法又稱_法。

三、????簡答題

1、????在生命科學研究對象中，一般可以分成哪十個水平？

2、????從含菌樣中篩選菌種一般要通過哪幾個環節和方法？

3、????微生物的純種分離法有何重要性？

4、????微生物生態學的任務是什么？

5、????簡述微生物學與人類的關系。

6、????悉生學研究的是什么？

7、????自然界中碳元素是怎樣循環的？

8、????自然界中的硫、碳元素是怎樣循環的，有哪些主要微生物參與？

9、????用微生物學方法處理污水的基本原理是什么？

10、????活性污泥與生物膜在污水處理中各起著什么作用？

11、????微生物引起的劣化有哪幾種？

12、????極端環境下的微生物包括哪幾種？

13、????下列食品如變質，主要是有什么??類型的微生物所引起？Why？1〉市售面包2〉充CO2的果汁；

14、????下列食品如果變質，主要是由什么類型的微生物所引起？Why？1〉市售的米粉2〉肉類罐頭

15、什么是大腸菌群，測檢食品中大腸菌群的意義是什么？常用什么培養基？該培養基中各種成分的主要作用是什么？這是一類什么性質的培養基？

16、引起以下食品變質的微生物類群是什么？為什么？

17、試分析下列現象產生的主要原因是什么？如何防止？

A）????添加有山梨酸鉀防腐劑的面包出現中心發粘變質的情況。

B）????經高溫高壓殺菌的低酸性罐頭出現變質，檢測發現其中有大量的革蘭氏陰性桿菌。

C）????把釀酒酵母接入煮過的糯米中室溫發酵，無法制得酒釀。

四、????論述題

1、????為什么說土壤是微生物的“大本營”或是人類最豐富的“菌種資源庫”？

2、????試討論空氣、塵埃、微生物與微生物間的關系。

3、????檢驗引用水的質量時，微生物要把大腸桿菌數作為重要測定指標？我國衛生部門對自來水的總菌量和大腸桿菌量有何規定？

4、????工農業產品為何會發生霉腐、變質？如何預防？能舉些實例嗎？

5、????為什么說微生物在自然界的氮素循環中起著關鍵的作用？

6、????試述微生物生態知識與工農業生產的關系。

7、沼氣發酵的微生物學原理是什么？試分析沼氣發酵在國民經濟和環境保護中的重大戰略意義。

8、????奶產品經過封口殺菌后，出現部分產品發生變質，是分析是什么原因，如何防止？

9、????什么是微生物的正常菌群？試分析腸道正常菌群和人體的關系。

10、????下述微生物的生態環境如何？設想如何分離。

第八章部分的練習(*)

一、????概念題：

1、????黃原膠?2、一步發酵法?3、兩步發酵法?4、葡萄糖氧化酶?5、明膠?6、蛋白酶

二、????填空題：

1、????面包酵母是一種-------細胞的生物，屬于--------菌類，學名為-----------。

2、????檸檬酸的發酵微生物是----------，蘋果酸的發酵微生物為----------。

3、????谷氨酸的生產菌為--------，其發酵原料為---------質的發酵原料。

4、????黃原膠是由----------菌提取而成的。

三、????簡答題：

1、????列表說明微生物在食品制造方面的作用。

2、????微生物在食品制造方面中菌種擴大培養有哪些共同特點？

3、????在雙歧桿菌酸奶生產中，常用什么特定的工藝路線？

4、????在釀油生產中對生產原料有什么要求？

5、????簡述黃原膠的性質及在食品中的應用情況。

6、????簡述啤酒生產的整個工藝過程。

7、????下列食品如變質，主要是有什么類型的微生物所引起？Why？1〉市售面包2〉充CO2的果汁。

8、????簡述釀造食醋的三套微生物及其主要菌種。

9、????簡述生產酶制劑過程中所需要的條件？

10、????引起以下食品變質的微生物類群是什么？為什么？1）消毒牛奶?2）真空包裝的蜜餞產品?3）面粉?4）充CO?不足的碳酸飲料?5）殺菌不足的肉類罐頭

11、????設計篩選高溫淀粉酶產生菌的方案，指出關鍵步驟。

四、????論述題：

1、????為什么說食醋生產是多種微生物參與的結果？

2、????近年來生產發酵乳制品時在菌種開發方面有哪些進展？

3、????酵母菌在面包制造過程中，起哪些重要作用？

4、????在發酵生產葡萄酒過程中應注意的問題有哪些？

5、????檸檬酸在食品中的作用有哪些？

6、????說明微生物酶制劑在食品加工制造中的應用情況。

7、????設計一種從自然界中篩選高溫淀粉酶產生菌的試驗方案，并解釋主要步驟的基本原理。

8、????試設計一種從自然界中篩選果膠酶產生菌的試驗方案，并解釋原理；如果果膠酶作為一種食品工業用酶，則必須考慮其安全性，從那幾個方面著手來保證該酶的安全性？

9、????果奶產品經過封口殺菌后，出現部分產品發生變質，是分析是什么原因，如何防止？

10、????試設計選育高纖維素酶高產菌的實驗方案，如已知纖維素酶的合成是操縱子的阻遏機制，如何利用這一機理設計有效的篩選方法？

11、????在以消毒奶為原料生產酸奶的過程中，為什么要在盡可能短的時間內達到酸凝？可采取哪些措施？

12、????設計一種從自然界中篩選酸性蛋白酶產生菌的試驗方案，說明其原理；若該酶作為食品工業用酶，如何保證其安全性？

13、????試比較啤酒發酵過程與葡萄酒發酵過程的異同。

14、????據你了解，哪些微生物在食品工業中廣泛應用？試舉一例具體說明。

15、????從微生物角度分析酸奶生產的關鍵及原因。

16、????試分析下列現象產生的主要原因是什么？如何防止？

1）????添加有山梨酸鉀防腐劑的面包出現中心發粘變質的情況。

篇6

關鍵詞：高職高專；生物學；給水排水工程；水處理；教學探討

微生物個體極小，種類繁多，肉眼無法直接觀察，必須借助顯微鏡才能看清其形態和結構，這就使學生缺乏感性認識，感覺微生物知識雜亂，學習難度比較大，學習效果也不好。水處理生物學課程是高等學校給水排水工程專業指導委員會提出的給排水科學與工程學科新課程體系中10門主干課之一，是給水排水工程專業的必修課，是一門原理性，概念性，實踐性強，操作難度大的課程。該課程的理論課程主要包括兩大部分，第一部分為微生物學的基礎知識，第二部分為微生物在給水排水工程中的應用，是水的生物處理工藝的基礎，給水排水專業的學生只有在學好該門課程后才能更好地應用生物法來設計污水和自來水水處理工藝。因此，如何提高水處理生物學的教學質量，取得比較好的教學效果，是從事這門課程教學的教師努力追求的目標，筆者在教學實踐過程中有如下探索。

1.合理組織教學內容

該門課程是給排水專業的主干課程《水質工程學》（包括給水和排水）的前導課程，和其他專業生物教學不同的是要緊密圍繞“水處理和水質控制”為核心實施教學。所以重點介紹水中存在的病毒、細菌、放線菌、真菌等以及在水質凈化中有重要作用的古細菌、原生動物和微型后生動物和水生植物的基本形態和生理特性。在介紹生物對碳元素、氮元素、磷元素等的轉化原理時結合具體的污水處理工藝中的脫氮除磷工藝設計要求講解，使教學內容更具有實際意義，為后續課程教學打下堅實的基礎。在介紹微生物生理和營養時，要密切結合在水處理工藝的好氧處理和厭氧處理，介紹呼吸類型和代謝途徑。

2.應用實例教學，提高學生學習興趣

水處理生物學是一門與生活實踐、工業應用有密切聯系的應用課程，在學習過程中，尤其在講授應用微生物進行污水處理原理部分內容時，應該帶領學生參觀污水生物處理工藝，觀察活性污泥或生物膜的性狀，在參觀中給學生講授污水處理工藝及微生物在其中所起的作用。在講授大型水生植物治理水環境時，引入一些工程實例，以多媒體的形式展示給學生，這樣能使學生帶著興趣深入地理解微生物在處理中的作用。除了教授教材中的基本理論，更要引進工程實踐中一些有影響的或與學生生活比較貼近的實例。

3.引導學生研究型學習

《水處理生物學》教學注重學生不僅要對對水中存在的各種微生物形態與結構的觀察，更重要的是要求學生掌握獨特的研究學習的技能。學生應該在教師指導下的自主性、探索性學習活動。在教學過程中講解藻類這一章節時，正好是春末夏初，學校里的河流斷面中流速緩慢的區域有大量紅色的物質出現，學生很好奇這是什么現象形成的，這時候就引導學生取樣觀察，了解藻類生長的環境條件，藻類的種類和形態特征，加深了學生對水體中藻類的知識的掌握。本學科也是發展中的學科，在生物學領域不斷有新技術、新手段產生，比如說新型的微生物菌種在水處理領域的應用，微生物檢測的新方法PCR-DGGE，在講解到相關章節時就可以引導學生通過圖書館、網絡等途徑了解新技術，新方法。

4.充分利用多媒體教學

進行“水處理生物學”教學時，恰當地運用多媒體技術、合理地設計課件內容，才能制作出高質量的課件；運用多媒體教學，精心組織安排教學過程，才能取得良好的教學效果。微生物形體極微小，看不見，摸不著，為了使學生對微生物有更加感性的認識，提高他們的學習興趣和學習效果，最好采用多媒體教學。例如，講微生物大小時，病毒、細菌、酵母、霉菌等通過色彩鮮明的圖片展現給他們，收到了很好的效果。在講述微生物在水處理工程中的應用時，配以城市污水生物處理工藝中活性污泥和生物膜等的圖片，使學生對微生物的巨大威力和處理效率大為佩服，學生對所學的知識有比較強的感性認識，同時也使得他們認識到掌握微生物知識在給排水專業學習中的重要性。

5.強化實驗教學，強化技能訓練

改革實驗教學，提高教學質量，是高等教育應長期持的一個重要環節，要通過實驗讓學生掌握全面的理論識，還要經過足夠的能力訓練，使其具備適應特定崗位要的綜合工作能力。根據教學大綱要求，學生需要通過4個課時的實驗課掌握光學顯微鏡的結構、光學原理及操作與使用方法，掌握水體中主要微生物的檢驗技能，掌握控制水體微生物生長的方法，以確定水和廢水的生物學性質，了解主要的水處理微生物的個體形態和結構特征，掌握從水體中分離和培養微生物的方法和技能。按照這個要求，經過幾年的實踐和探索，我校制定了完整的實驗計劃，利用光學顯微鏡觀察酵母菌、霉菌、放線菌、活性污泥中的原生動物、后生動物、菌膠團等的形態，在這個過程中不僅能掌握光學顯微鏡的操作，還能完成對各種微生物形態的觀察。在完成觀察任務后，繼續對活性污泥中微生物進行純種分離，接種，培養（任選稀釋平板法或平板劃線法），培養學生操作技能。在培養36小時后觀察培養出來的菌體、菌落，進一步熟悉光學顯微鏡的操作方法。課時少，但是實驗內容比較多，所以實驗前就要做好準備工作，做好酵母菌，霉菌樣本的純培養工作，取曝氣池新鮮活性污泥樣本工作。在實驗指導過程中也要依據教學經驗，對歷屆學生實驗操作時不太注意或易出錯的環節，講解時著重提出來，并且在他們實驗操作過程中時監督檢查，如“顯微鏡的操作和使用”的實中的操作步驟、“無菌操作”實驗是否嚴格無菌操作，提高他們的效率。

以上幾點便是筆者在教學過程中的實踐與思考，當然關于水處理生物學的教學方法還有很多地方需要深入探討，也很多需要進一步改革。總的來說，希望經過不斷的教改反思，能不斷地提高教學質量，培養出適應現代社會發展的合格給水排水工程專業人才。

參考文獻

[1]楊文博.優化微生物學教學[J].微生物學通報.1996，（3）.

篇7

【摘要】

目的 利用一株根霉菌對虎杖苷粗提物進行液態發酵，使虎杖苷轉化成白藜蘆醇。方法采用單因素實驗確定氮源種類及添加量，通過正交實驗法優化發酵條件。結果在10%虎杖苷粗提物中添加1.5%的尿素作為氮源，采用薄層色譜法（TLC）確定在優化發酵條件下轉化時間為26.8 h，通過高效液相色譜法HPLC證明虎杖苷轉化為白藜蘆醇，轉化率95.8%。結論虎杖苷粗提物可以通過微生物發酵得到白藜蘆醇。

【關鍵詞】 虎杖苷；白藜蘆醇；根霉菌；微生物轉化

Abstract:ObjectivePolydatin in Polydatin extraction was transformed to resveratrol in liquid state fermentation by R. nigricans. MethodsThe kind and the append mate of nitrogen source were confirmed by the single factor experiment. The conditions of fermentation were optimized by orthogonal experiment. ResultsCarbamide was the optimum nitrogen source and the append mate was 1.5%. Under the optimized condition the transformation time was 26.8h. It was prooved that Polydatin could be transformed to Resvertrol by high performance liquid chromatography and the transformation rate could reach 95.8%. ConclusionPolydatin in Polydatin extraction can be transformed to resveratrol by microbial transformation.

Key words:Polydatin；Resveratrol；R. nigricans; Microbial trasformation

虎杖為蓼科植物Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.的干燥根莖，別名苦杖根、活血龍、大蟲杖等［1］。其中重要的活性成分為二苯乙烯類的白藜蘆醇（Resveratrol）和白藜蘆醇苷(Polydatin)，也叫虎杖苷。白藜蘆醇是一種活性多酚類物質［2］，具有明顯的降低血脂，預防心腦血管疾病以及抗癌等重要作用，是目前世界上一種最新的藥用保健活性物質，有望發展成為抗癌新藥［3］。目前，該產品國際市場需求量大，具有良好的市場前景。天然白藜蘆醇主要以葡萄糖苷（虎杖苷）的形式存在于虎杖中，虎杖中的白藜蘆醇含量在0.1%～0.2%左右，虎杖苷的含量在2%左右，虎杖苷的含量明顯高于白藜蘆醇。理論上，采取化學法能將虎杖苷轉化為白藜蘆醇，但其工序繁雜并生成大量的異構體，造成分離純化困難，生產成本非常高，不被認可。目前，生物法是直接利用虎杖進行帶渣發酵，通過根霉菌分泌的酶切斷白藜蘆醇苷的糖苷鍵，轉化得到白藜蘆醇（圖1）， 該法存在發酵體積龐大、成本高、發酵濃度無法提高等問題［4］。因此本課題利用虎杖苷粗提物進行發酵，可以提高發酵體系中虎杖苷的含量、縮小發酵體積、提高發酵效率，更易于白藜蘆醇這種醫藥中間體的工業化，為生產白藜蘆醇提供了一種便捷、有效的方法。

1 器材與方法

1.1 儀器與藥品DOINEX高效液相色譜儀；AN0298分析天平（上海民橋精密科學儀器有限公司）；虎杖（湖北省藥材公司）；虎杖苷標準品、白藜蘆醇標準品（成都思科華有限責任公司）；其它試劑均為分析純；無機鹽濃縮液：KH2PO4 0.1%， MgSO4 0.05%，(NH4)2SO4 0.1%；虎杖苷粗提物（粉末狀，虎杖苷含量14.78%）。

1.2 菌種編號T-34，由四川大學生物資源與生態環境教育部重點實驗室提供，從自然界分離篩選得到，經鑒定為一株根霉菌。

1.3 方法

1.3.1 虎杖苷和白藜蘆醇的TLC檢測方法 虎杖苷和白藜蘆醇的TLC法薄層色譜［5］條件，展開劑：醋酸乙酯-丙酮 -醋酸體積比為6∶2∶0.5；顯色劑：3 %磷鉬酸無水乙醇溶液， 110 ℃顯色3 min［5］。

1.3.2 虎杖苷和白藜蘆醇的高效液相色譜法HPLC檢測方法色譜柱C18柱（4.6 mm×150 mm）， 柱溫25 ℃， 流動相甲醇-水為40∶60；流速1 ml/min， 進樣量20 μl，檢測波長305 nm。根據標準樣的峰面積和進樣濃度作回歸曲線，白藜蘆醇的回歸方程為Y = 1.40×108X +1.21×104，相關系數r=0.999 913，在20～100 μg/ml范圍內和峰面積成線性關系；虎杖苷的回歸方程為Y=9.61×107X-1.84×105，相關系數為r＝0.999 82，在20 ～100 μg/ml范圍內和峰面積成線性關系。

1.3.3 氮源的選擇

以10%虎杖苷粗提物添加1%無機鹽濃縮液作為發酵培養基，分別在培養基中添加1%的硝酸銨、氯化銨、大豆粉、酵母膏、硫酸銨、尿素等氮源，180 r/min，30℃培養，通過檢測虎杖苷的完全轉化時間確定添加的氮源種類。

1.3.4 氮源加入量的確定

10%虎杖苷粗提物添加1%無機鹽濃縮液的發酵培養基中，分別添加0%，1%，1.5%，2%，2.5%的尿素，180 r/min，30℃培養，通過檢測虎杖苷的完全轉化時間確定尿素的添加量。

1.3.5 發酵條件的優化

以虎杖苷乙醇粗提物回收乙醇后，烘干，制成虎杖苷粗提物粉末，虎杖苷含量14.78%。按10%的加入量加入發酵培養基中，pH自然，121℃滅菌25 min。將菌種T-34以菌絲體形式接入發酵培養基中，添加1%無機鹽濃度濃縮液，采用正交實驗法優化發酵溫度、裝液量、接種量、轉速等發酵條件。

2 結果與討論

2.1 發酵條件優化實驗

2.1.1 氮源的選擇氮為真菌干重的8%～14%，大量的無機和有機含氮化合物都可用來滿足微生物對這種元素的需求。不同種類的微生物其氮的代謝途徑不盡相同，因此有必要對培養基中添加的氮源進行選擇，結果見表1。表1 不同氮源對苷轉化時間的影響（略）

從實驗結果可知，在選擇硝酸銨、氯化銨、大豆粉、酵母膏、硫酸銨、尿素這6種氮源，利用尿素做氮源時，轉化時間最短，其它5種均大于38個小時，因此從轉化時間上考慮使用尿素作為培養基的氮源物質。

2.1. 2 氮源添加量的確定

微生物的生長及轉化都有一個合適的碳氮比，因此在培養基基質中需要提供與此相當的含氮量，結果見表2。表2 氮源添加量對苷轉化時間的影響（略）

從實驗結果可知，尿素添加量0%～1.5%時，轉化時間隨氮源的增加而縮短；當氮源添加量為1.5%和2.5%時，轉化時間最短，都為30 h。因此，從培養基成本考慮選擇添加量為1.5%。

2.1.3 發酵條件的確定通過正交實驗法來確定最佳的發酵條件，結果見表3。表3 虎杖苷粗提物液態發酵正交優化實驗（略）

通過正交實驗法得出虎杖苷粗提物液態發酵的最佳條件為（A3B1C3D3）：培養溫度32℃，裝液量20%，接種量30%，轉速200 r/min，對實驗結果分析發現，各因素對發酵影響大小順序為：培養溫度>接種量>裝液量>轉速。按最佳的發酵條件進行虎杖苷的液態發酵驗證實驗，經HPLC檢測白藜蘆醇苷粗提物中的虎杖苷在26.8 h轉化95.8%。此結果優于正交表中的9個實驗，證明了該工藝的合理性和穩定性。

2.4 產物的鑒定虎杖苷和白藜蘆醇標準品混合進樣后的HPLC定位，虎杖苷在4.2 min出峰，白藜蘆醇在9.0 min出峰。見圖2～4。

虎杖苷粗提物在4.2 min處有較大峰值，在9.0 min處有一個小峰出現；對應虎杖苷粗提物轉化后在4 min左右沒有明顯的峰值出現，保留峰值基本消失，在9.0 min處有較大峰值。發酵后的產物與白藜蘆醇標準品的出峰時間一致，證明微生物將虎杖苷粗提物中的虎杖苷轉化為白藜蘆醇。

3 結論

利用微生物轉化虎杖苷含量為14.78%的虎杖苷粗提物，在最佳發酵條件：培養溫度32℃，裝液量20%，接種量30%，轉速200 r/min下，經過26.8 h，虎杖苷轉化率可達95.8%。證明利用虎杖苷粗提物進行微生物轉化的方法是可行的、穩定的，此工藝更符合工業化生產，步驟簡單，易于控制，原材料利用率高。 針對白藜蘆醇需求量大，且國內亟待解決并值得深入研究的開發命題包括通過先進工藝獲得高含量天然白藜蘆醇產品，來滿足日益增長的國內外對天然白藜蘆醇的需求。本研究內容還未見報道，為獲得天然白藜蘆醇生產提供了一種可行的創新思路。

參考文獻

篇8

有限儲量的化石燃料在不斷減少、能源需求在不斷增長以及化石燃料燃燒造成的環境污染和溫室效應日益嚴重，21世紀的能源面臨著巨大挑戰。思考未來能源的發展方向，積極尋找化石能源的替代品，許多人把眼光投向了可再生能源——氫氣。

在對新能源的研究中，清潔、高效、廉價一直是研究者所追求的目標。氫是一種理想的清潔能源，它的熱值高，最高達3042cals/m3，熱轉化率也很高，而且能量密度很高，是普通汽油的3倍，這意味著燃料的自重可減輕2/3。但氫能屬于二次能源，在人類生存的地球上，很少有集中的自然氫存在。含氫元素的主要資源有水、化石燃料和生物質[1]。從化石燃料制氫，即以煤、石油及天然氣為原料制取氫氣是當今制氫的主要方法[2]。化石燃料利用帶來的環境污染幾乎無法逆轉，而且資源有限，作為化工的主要原料已消耗掉大量的礦物資源，如通過重油裂解或天然氣蒸汽重整制取氫氣來合成氨或甲醇等。水電解制氫的技術已經成熟，但能耗較高，目前生產每立方米的H2 電耗為4.5～5.5kW·h 左右。電作為另一種高品質的二次能源，由一次能源的轉化效率本來就很低，因而除了在具有廉價的大規模水力發電和電力過剩的情況以外，電解水制氫的成本相當高。與物理化學方法相比，生物氫氣的生產可有效利用生物能源，并可減少有機廢棄物對環境的污染以及對化石燃料的使用，具有高效、節能、成本低等諸多優點而備受關注。生物制氫已成為近年來日本、美國等一些發達工業國關注的熱點研究領域之一。但正在開發和研究的各種生物制氫技術，仍停留在實驗階段。

污泥作為有機廢物產氫近年來備受青睞，污泥產氫，包括直接作為基質產氫以及作為接種物產氫。

2純污泥產氫研究現狀

培養產氫污泥是進行厭氧發酵產氫試驗研究的基礎和關鍵。污泥是多種微生物的混合體，既有產氫微生物又有嗜氫微生物。在厭氧發酵過程中，產氫微生物所產生的氫氣會迅速為嗜氫微生物所利用。但是一些產氫微生物能形成芽孢，其耐受不利環境條件的能力比普通的微生物強。利用這兩類微生物生存條件的差異，通過預處理（如熱處理、酸處理和堿處理等）抑制污泥中的耗氫微生物，達到篩選產氫微生物的目的。另外，在污泥發酵過程中污泥水解是限速步驟[3,4]。污泥中的有機物大部分是微生物物質，為細胞壁所包裹，限制了污泥的厭氧消化。通過采用適當的預處理，也可以破壞微生物細胞壁使有機質融出，改變污泥中有機物的可利用性，提高污泥厭氧消化的效率[5-7]。目前常用的預處理方法主要有熱水解、化學處理、機械破碎、超聲破碎、酶水解等。

陳文花等人[8]研究熱處理方式對污泥產氫的影響。結果表明熱處理具有很好的融胞效果，經處理后，污泥中可溶蛋白質為原污泥的6.4~8.9倍，溶解性糖濃度為原污泥的1.6~7.9倍。該污泥在最佳條件下，累積產氫量、產氫速率和產氫潛能分別為20.19mL、1.22mL/h和3.7mL/gVS，分別較原污泥提高了14倍，11倍和16倍。熱處理污泥厭氧發酵產氫過程有機物的降解主要是蛋白質，其次是糖。

劉常青等人[9]，通過批量試驗系統研究了酸性預處理污泥厭氧發酵產氫情況。研究結果表明：酸性預處理不僅對耗氫菌起到抑制作用，也能起到一定的融胞作用，pH=2.0酸性

* 基金項目：福建省科技廳重點項目（2011Y00181）；福建省環保廳重點項目；福建省教委A類項目（JA08043）。

** 通訊聯系人：張江山（1946~），男，研究員，主要從事環境生態數學模型研究，E-mail:jszhang@fjnu.省略。

預處理污泥中溶解性糖和溶解性蛋白質的濃度分別為原污泥的3.1和9.9倍。最佳的酸性預處理條件為調整原污泥pH=3.0。此外還系統考察了不同初始pH值對酸性預處理污泥厭氧發酵產氫的影響。研究表明[10]，初始pH為11.0時，甲烷菌受到明顯抑制，而產氫菌仍然活躍，總體產氫量最高。

蔡木林[11]等人研究了污泥經堿處理后的產氫潛能。研究結果表明，將污泥經過堿處理或調節較高初始pH值(11.0)的條件下，進行厭氧發酵可以有效抑制產甲烷化過程；堿處理污泥所獲得的產氫率比原污泥高出1倍左右，約為16.9mL/g。

肖本益等[12]利用熱、堿處理污泥產氫，其中堿處理污泥發酵產氫的最佳起始pH值為11.0，其最大產氫率(H2/VS)為14.4mL/g(VS)。在堿處理污泥的發酵產氫過程中，污泥的pH值變化較小，VFA的產生量和組成受污泥起始pH值的影響，乙酸是污泥發酵過程中產生的VFA的主要成分。Wang等[13]利用滅菌和凍融預處理污泥，產氫量(H2/COD)達到115～211mmol/g。.

謝波等[14]研究了Pseudomonas sp.GL1利用多種預處理（滅菌、微波和超聲波）污泥的產氫效果，并對污泥發酵過程中底物性質變化進行探討。產氫菌Pseudomonas sp.GL1發酵各預處理污泥過程中均只有H2和CO2產生，無CH4。3種不同預處理的污泥在同等條件下發酵，滅菌污泥的產氫效果最佳，氫氣含量高達81.45 %，產氫率為30.07mL/g。不同預處理污泥方式對產氫延遲時間有一定的影響：超聲波處理污泥產氫延遲時間最短，為3h；滅菌污泥最長，為15h；微波預處理污泥居中，為12h。發酵過程對污泥中營養物質的利用主要是乙酸和丁酸，滅菌污泥發酵產生的VFA只有乙酸和丁酸，各占VFA總量的66.1%和33.9%；微波預處理污泥中，乙酸、丁酸占VFA總量的88.1%和5.3%；超聲波預處理污泥中，乙酸、丁酸分別占VFA總量的74.4 %和12.7%。可見乙酸和丁酸均是VFA的主要組成成分，屬于丁酸型發酵，但又與碳水化合物(如葡萄糖、糖蜜等)發酵產氫時丁酸為VFA主要成分不同[15,16]。這主要是由于預處理污泥發酵產氫時底物是復雜的混合物，其中含有多種有機物，如蛋白質碳水化合物和脂類。這一結果與Cai等[16]研究一致。

污泥經過各種預處理后有機物質含量有所提高，增加的這部分有機質提高了產氫能力，但還是遠遠低于其他基質的產氫能力，純污泥進行厭氧消化在工程上是行不通的。但據大量的研究證明，污泥與其他基質聯合后產氫能力大大增強。

3以污泥作為接種物的產氫研究現狀

早期生物制氫的研究主要集中在利用純菌發酵制氫上。利用純菌產氫，底物和反應器都需要高溫消毒滅菌，配制培養基還需要大量昂貴的營養物質；為保證連續流產氫反應器內較高的細菌濃度，通常需要大量的載體和固定劑，而且固定化技術復雜，固定化后的細菌傳質阻力增大，對產氫有一定的影響；純菌在不斷產氫過程中，比較容易發生變種，甚至被污染，出現產氫能力逐漸降低，需要定期更換新的細茵，同時需要配套的純菌的分離、鑒定和擴大培養等設備，生產成本很高。進入20世紀90年代中期，人們逐漸把生物制氫的熱點由利用純菌的厭氧發酵轉移到利用混合菌的厭氧發酵上來，其中以污泥作為接種污泥更是成為研究的主流。

一般來說，可用于生物發酵產氫的基質應具備以下幾項特點：(1)碳水化合物的含量較高；(2)資源豐富且廉價；(3)具有較高的能量轉化率等。目前，生物發酵產氫的研究中所利用的基質非常廣泛，主要包括：①單純的糖類，如葡萄糖、蔗糖、木糖、阿拉伯糖以及麥芽糖，淀粉等；②有機廢水，如糖蜜廢水、蔗糖生產廢水、釀酒廢水以及淀粉生產廢水等；③有機固體廢棄物，如城市固體有機垃圾、餐廚垃圾、柑橘皮、豆腐生產殘渣、食品加工的邊角料污水廠剩余活性污泥等[17]。

近十年來世界各國對發酵法生物產氫的研究日益增多，研究者對各種具有生物產氫潛力的基質更是進行了大量的研究。

3.1 純基質的研究概況

目前，對利用純物質作為產氫基質的研究較多，其目的主要是研究各種產氫菌的特性、最佳產氫條件以及探討產氫的機理。

Lin等[18]以厭氧的恒化反應器進行連續流產氫實驗，細菌為用活性污泥經馴化的厭氧產氫污泥，葡萄糖為實驗用底物。實驗結果表明：在最佳條件pH 5.7，污泥停留時間(SAT) 0.25d、有機負荷為416 mmol-glucose/L/d時，發酵1mol葡萄糖可產生1.7mol氫氣。

Osamu等以葡萄糖為基質，利用混合菌產氫，比產氫率為1.43mol(H2)/mol(葡萄糖) [19]，Fang等2.1mol(H2)/mol(葡萄糖) [20]，樊耀亭等以蔗糖為基質，厭氧活性污泥發酵產氫，其比產氫率為2.23mol(H2)/mol(葡萄糖) [21]。這些研究基質的質量濃度一般在5～30g/L。吳薛明等人以高濃度蔗糖為基質模擬有機廢水，通過對活性污泥的梯度馴化，提高活性污泥對高糖溶液的代謝能力與產氫能力。優化后的活性污泥平均產氫速率達到565mLH2·L-1·h-1，比優化前提高了223%，比產氫率為3.04mol(H2)/mol(葡萄糖)，比優化前提高了30%。由此得到的處理高基質濃度的活性污泥，其處理能力為一般水平的2.5倍以上[22]。

3.2 有機廢水的研究概況

隨著人們對環境的重視以及一次性能源的逐漸減少，各種廢棄生物質資源的處理處置逐漸轉向資源化，利用富含生物質的廢水或固體廢棄物的厭氧發酵處理產氫越來越受到重視，并逐漸成為當今生物產氫領域的研究熱點。

任南琪課題組[23]采用連續流厭氧發酵法研究了糖蜜廢水、淀粉廢水與牛奶廢水生物制氫。結果表明，糖蜜廢水與淀粉廢水都是較好的厭氧發酵法生物產氫底物；在3大類有機物中，碳水化合物是目前技術條件下最具有可能性的原材料。在碳水化合物中，溶解性好的糖比溶解性差的淀粉在目前的技術條件下具有生物產氫可行性，而淀粉比溶解性糖更具有產氫前景。不同底物厭氧生物制氫的生態位范圍有所不同，對于溶解性好的糖，穩定運行的工程控制參數為pH4.5±0.3，而溶解性較差的淀粉廢水為pH4.0±0.2；厭氧發酵產氫的ORP值總體必須低于-220mV，并隨著底物的不同而不同，在-220mV～-300mV左右時較好。研究結果表明，牛奶廢水不適用于作為CSTR反應器中發酵法生物制氫底物。

Lin等[15]成功地用熱處理污泥發酵污泥堿水解物產氫，其氫產率(H2/TCOD)達到117g·kg-1。Ueno等[24]人利用制糖廠廢水厭氧發酵產氫，分別獲得的產氫速率為198mmol/L·d-1和34mmol/L·d-1。Lay[25]利用人工配制的淀粉廢水發酵產氫，以3L的厭氧發酵反應器在控制37℃，pH5.2，HRT為17h，進水負荷6kg淀粉/m·d的優化條件時，最大產氫速率為1600L/m3·d，最大產氫率為1.29L/g淀粉。Yu[26]等人采用3.0 L上流式厭氧反應器處理釀酒廢水產氫，分別考察了幾個關鍵運行參數：當溫度為55℃，pH5.5，HRT為2h，進水COD為34g/L時，產氫速率最大，為9.33L/gVSS·d，氫氣產率為1.37～2.14mol/mol己糖。湯桂蘭等人[28]在批式厭氧反應器中，以厭氧消化污泥作為天然產氫菌源，通過養殖場廢水的厭氧發酵生產氫氣。以上研究都還只停留在實驗室小試的探索階段。

任南琪課題組[27]在小試的基礎上完成了發酵糖蜜廢水產氫的中試研究，裝置總體積為2m3，有效體積為1.48m3。中試結果表明，將運行參數控制在35℃，pH4.0～4.5，HRT為4～6h，ORP為-100～-125 mV，進水堿度300～500mg/L，容積35～55kgCOD/m3·d范圍時，反應器最大持續產氫能力可達5.7m3/m3·d，其中去除1kg COD可獲得26 mol的產氫量。

3.3 有機廢物的研究概況

樊耀亭等人[29]在批式培養實驗中以有機廢棄物為原料，通過厭氧生物發酵制備生物氫氣。以活性污泥為菌種來源，以淀粉為底物，在30L改進的UASB反應器中進行了放大實驗，生物氣中氫氣濃度達40%～51%，CO2濃度為49%～60%，且沒有檢測到甲烷氣體，生物氣經堿液吸收后氫氣純度大于97%，持續產氫時間超過120d。

周俊虎等人[30]以厭氧活性污泥為接種物，以麥稈、稻草和濾紙為發酵底料，采用不同的預處理方法去除木質素，并提高纖維素的降解率。利用等量的經過NaOH預處理的麥稈和稻草，經纖維素酶解后在發酵產氫過程中的降解率分別為23.2%和12.5%，總產氫量分別為363.3mL和254.9mL，發酵產氣中，氫氣濃度分別為23.8%和29.1%。發酵液相中主要產物為乙醇、乙酸和丁酸。

Shin等[31]研究了餐廚垃圾與污水廠污泥混合厭氧發酵產氫效果。將污泥經過熱處理后作為接種污泥，當餐廚垃圾與污泥的比例為83:17，揮發性固體的含量達到3.0％時，氫氣的產率達到了122.9mL/gCOD，最大比氫氣產率為111.2mL/gVSS·h，遠超過了其他研究者的成果。對于產氫菌來說，有機氮源如蛋白胨或酵母膏是很好的營養源，而銨鹽或尿素則效果不佳，污泥是富含蛋白質的有機廢物，在餐廚垃圾中加入污泥能夠提高系統的碳氮比，增加了產氫菌的氮源營養物質，因此氫氣產量得到大幅度提高。

蒲貴兵等人[32]采用熱預處理(80℃，15min)的城市生活垃圾厭氧消化污泥為接種物，考察了不同預處理方法對餐廚垃圾中溫(36℃)批式發酵產氫的影響。

4結語

目前，發酵法產氫技術存在的主要問題是氫氣產率很低，只有理論氫轉化率的20%～30%。而這一轉化率只有達到60%～80%的情況下才算是一種經濟可行的生物產氫技術。利用廢水或固體廢棄物的厭氧發酵產氫研究大部分都是實驗室研究，工業化應用很少，只有任南琪課題組在小試研究的基礎上進行了糖蜜廢水發酵制氫的中試研究；固體廢棄物產氫的工業化國內鮮有報道，因此在實驗室研究的基礎上如何盡快實現產氫的工業化是今后的發展方向。

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篇9

【關鍵詞】森林病蟲 蟲害 關注

一、蟲害的分類

1.有真核生物，植物界引起林木病害的主要是寄生性種子植物，如兔絲子、桑寄生、斛寄生。動物界引起病害的主要是癭螨類和線蟲類，如毛氈病和松材線蟲病。

2.原核生物，要是細菌和植原體，比較常見的有樹木的根癌病和泡桐叢枝病等。

3.無細胞生物，主要包括病毒和類病毒，它們都是嚴格的細胞內寄生物，林木的病毒病害如楊樹花葉病毒病等，類病毒病害如柑桔裂皮病等。

二、蟲害發生的主要條件

病原物與寄主接觸后，對寄主進行侵染活動（初侵染病程）。由于初侵染的成功，病原物數量得到擴大，并在適當的條件下傳播（氣流傳播、水傳播、昆蟲傳播以及人為傳播）開來，進行不斷的再浸染，使病害不斷擴展。由于寄主組織死亡或進入休眠，病原物隨之進入越冬階段，病害處于休眠狀態。到次年開春時，病原物從其越冬場所經新一輪傳播再對寄主植物進行新的侵染。這就是侵染性病害的一個侵染循環。

三、蟲害發生的癥狀

1.植物得病后的不正常表現稱為癥狀。由真菌引起的病害在寄主患病部位表面有明顯的粉狀物、霉狀物或子實體，由細菌、病毒、線蟲和真菌等微生物引起的病害在寄主上亦有斑點、叢枝、流膠、腐爛、枯萎等癥狀。由土壤缺乏某種元素、氣候環境條件不適合等非生物因素引起的生物性病害不出現上述癥狀，受害林分中的林木往往表現均勻一致的葉片邊色矮小等癥狀。由昆蟲為害的樹木，其葉片上有明顯的缺損，枝干有坑道、蛀孔或蛀屑，即使蚜蟲、介殼蟲、螨類等刺吸性口器造成的褪色、卷葉，也可籍助于手持擴大鏡在樹上找到蟲體。

2.病樹林間分布判斷：林間病株的分布暗示著相應的各種病因可為診斷提供分析的線索。由生物引起的傳染性病害發病初期為點片狀，零星分布，健康樹和病樹混雜存在。由環境條件不適引起的生理性病害在某種樹上表現的癥狀相同，病株在林間成片發生，樹木受害均勻一致。此外，必須了解林木的種源、栽培管理過程中的技術環節氣候是否反常等情況，以有助于病蟲害的診斷。當然，確切的診斷還必須采集標本進行室內分析，通過顯微鏡鏡或解剖鏡仔細觀察，進行病原或病害名稱鑒定，病原物還有進行分離培養和人工接種試驗等，才能得出確切的結論。

四、樹木病害病原的判斷及相應的步驟

1.正確區分侵染性和非侵染性病原，二者在病害的發生發展歷史、分布規律、危害癥狀和是否存在病原物等方面都有顯著的差異，必要時可以進行治療診斷。

2.正確按照癥狀和傳染性等區別不同的病原生物，有時也要借助于一些試驗。

3.應用柯赫法則確定具體的病原菌，柯赫法則的步驟是首先從病植物體上分離出與病害有關的微生物并使其在人工培養基上生長，然后進一步純化培養物，將純菌種接種到同種健康的植物體并使其發病，觀察其是否出現與原病害相同的癥狀，再從接種發病組織上分離出同種微生物，這些步驟常稱人工誘發試驗。柯赫法則是證明一種微生物傳染性和致病性的最科學的方法，目前有的生物類群由于不能人工培養而暫時無法完成柯赫法則的循環，如病毒、類病毒、植原體和絕對寄生菌物，但可以通過嫁接、傳毒等方法證明其致病性，所以也被認為是病原菌。

五、以松材線蟲病的危害為例

1.寄主種類多、分布廣。松材線蟲病寄主種類較多，主要以松樹為主，少數亦非松屬針葉樹。在我國高度感病的松樹有黑松、馬尾松、琉球松、濕地松、云南松、華南五針松、華山松、紅松等，但目前我國大陸自然狀況下發病均以黑松和馬尾松為主，而這兩種松樹正是我國重要的造林綠化樹種。

2.適生區范圍大。我國大部分地區具有適宜松材線蟲病發生的氣候和寄主條件，尤其新疆的特有氣候，更是容易引起這類病蟲的寄主。

3.傳播蔓延迅速。松材線蟲病的傳播主要靠媒介昆蟲和人為攜帶罹病木材及其制品來完成。其遠距離傳播主要是人為攜帶感病木材及其制品所致，從我國發生情況看，人為傳播的現象較為嚴重。

4.致死速度快、防治難。由于松材線蟲和松褐天牛大部分時間均在寄主樹干內取食、為害，防治困難。松樹一旦感病很難治愈，發病速度快，最快的40多天即可枯死。松林染疫后發病迅速，從染病到毀滅只需 3-5 年時間，因此人們稱之為松樹的癌癥。

六、如何防止蟲害對我國森林資源的危害

1.使用農藥。在做好相應的安全措施的情況下，首先要對癥下藥，對于不同的病癥配備不同的藥物，以相應的時間給樹木上藥。

2.使用化學農藥。理使用農藥，注意化學農藥種類、劑型的選擇，合理輪用，混用，選擇高效、低毒、低殘毒農藥。盡量采用低容量、超低容量噴霧選擇適宜防治時機，盡量避免在天敵大量出現期施藥。

3.在進入森林等相關生態區時先做自身的消毒和相應的防護措施，避免攜帶蟲害及其它病原體對樹木造成不必要的傳染。

篇10

關鍵詞：天然木質纖維 五碳糖 生物轉化

中圖分類號：TS262.2 文獻標識碼：A 文章編號：1674-098X（2014）06（c）-0044-01

目前，發酵法生產的燃料乙醇是公認的較為理想的清潔新能源轉化方式。巴西、美國、歐盟等國家紛紛提高乙醇在燃油中的添加量，提高新的能源在燃料中的組成比例。我國同樣面臨能源緊缺和能源安全問題，在眾多糧食作物的副產品及眾多非糧作物中，富含大量的木質纖維產物，而這些木質纖維又是由五、六碳糖構成，因此，如何高效利用農副產品廢料、和天然木質纖維原料降解轉化生產清潔能源就成了科研工作面對的巨大挑戰。

1 木質纖維和五碳糖

木質纖維是大量存在于自然界中的碳水化合物，在木質纖維作物中，纖維素的存在方式是晶體束形式，由半纖維素及木質素復形成的外殼包裹，這種外殼能夠保護植物細胞[1]。目前能夠人工純培養的微生物多數能夠轉化產出乙醇的微生物可以高效利用六碳糖，其中葡萄糖是最容易被利用的碳源，葡萄糖首先由糖酵解途徑或ED途徑轉化為丙酮酸，丙酮酸通過丙酮酸脫羧酶、乙醇脫氫酶轉化成為乙醇。

木質纖維中的五碳糖的轉化以木糖轉化為主，野生型釀酒酵母無法利用木糖轉化生產乙醇，因為其體內因缺少能夠將木糖轉化為乙醇合成關鍵中間產物木酮糖的酶系。因此，木糖轉化為木酮糖步驟是實現木糖轉化乙醇的關鍵環節。真菌中木糖能夠在木糖還原酶和木糖醇脫氫酶的催化下轉化為木酮糖，細菌中木糖能夠在木糖異構酶的催化下轉化為木酮糖[2]。當木糖在生物體內轉化為木酮糖后，木酮糖激酶將木酮糖磷酸化為5-磷酸木酮糖，經過轉醛醇酶及轉酮醇酶的共同作用，5-磷酸木酮糖將進而被轉化為甘油醛-3-磷酸及葡萄糖-6-磷酸，然后轉入磷酸戊糖途徑經丙酮酸脫羧轉化為乙醇[3]。

對現有菌種的改造，目前的研究主要通過兩種方法實現：一種是向酵母等高效利用六碳糖的菌種中導入五碳糖代謝途徑；第二種是向混合糖利用能力強，但目的產物產量低的菌種中導入增強代謝通路轉化的關鍵基因。

2 五碳糖菌株改造方法

在這里介紹幾種目前改造菌株較為常用的技術。在五碳糖轉化的研究中，通常使用能夠高效生產乙醇的微生物作為菌株改造的目標，包括酵母菌、運動發酵單胞菌這樣的菌株，都能以六碳糖作為底物轉化生產乙醇，但無法高效利用五碳糖，因此需要導入五碳糖轉化通路，構建工程菌株[4]。對于能夠轉化混合糖的菌株，如大腸桿菌，由于缺少丙酮酸脫羧酶，且乙醇脫氫酶Ⅱ活性低，因此它們轉化產出乙醇效率則相對較低。這就需要向菌株中導入增大乙醇產出代謝通路的關鍵酶。目前，多數以大腸桿菌為研究目標的基因工程改造工作都是以質粒作為基因載體，但質粒的遺傳穩定性較差，在保藏過程中經常出現丟失等問題，不易于獲得乙醇高產菌株。另外一種常用技術是原生質體融合技術，該技術通過將兩個遺傳性狀不同的細胞融合重組產生一個新細胞，使兩親本株基因融合并產生基因重組并獲得新的性狀的一種技術[5]。原生質體融合技術可在不同種屬間開展，通過不同的生物體細胞融合，達到改造細胞遺傳性狀的目的，并賦予酵母菌代謝五碳糖的能力。

3 轉化產物中的數據獲得方法

培養基中葡萄糖含量的測定方法較多，當以葡萄糖作為單一碳源時，發酵液中葡萄糖含量測定方法通常采用3，5-二硝基水楊酸比色法。在堿性條件下，當葡萄糖與3，5-二硝基水楊酸共熱時，葡萄糖被氧化成產生糖酸等化合物，3，5-二硝基水楊酸發生還原反應，產物3-氨基-5-硝基水楊酸呈棕紅色。葡萄糖的含量與產物中棕紅色物質成比例關系，這時，可在520 nm波長下測棕紅色物質吸光值，再根據吸光值標準曲線計算樣品中葡萄糖含量。

測定發酵液中木糖含量時，同樣利用3，5-二硝基水楊酸比色法。當培養基為葡萄糖與混合糖按比例配置時，可利用葡萄糖試劑盒檢測混合糖發酵液中葡萄糖的含量，在采用比色法測定總還原糖吸光度值，繪制比色法的葡萄糖標準曲線，之后對發酵液中葡萄糖含量加以換算，用總還原糖吸光值減去葡萄糖的部分，就可以獲得混合糖中的木糖吸光值，然后繪制的木糖的標線，計算出木糖的含量。

發酵液中目的產物含量可以通過多種方法獲得，以乙醇為例，乙醇含量可以通過重鉻酸鉀比色法獲得，也可以利用高效液相色譜和氣相色譜法獲得，同時，目前市場上也有多種試劑盒用來測定發酵液中的乙醇含量[6]。其中，高效液相色譜被廣大科研工作者廣泛認可。

4 結語

目前很多研究工作的重點為通過對五碳糖菌株的改造，以期望得到具有高效轉化五碳糖途徑的工程菌株。在這些研究過程中，人們往往只是通過定向基因導入，替代或敲除等技術單純的改變細胞的某一代謝途徑，而無法做到從整體上來調控細胞的代謝平衡。因此，對于目前的研究現狀，還有很多工作等待著科研工作者去完成。

參考文獻

[1] 許玫英，郭俊，岑英華，等.染料的生物降解研究[J].微生物學通報，2006，33（1）：138-143.

[2] 路鵬，江滔，李國學.木質纖維素乙醇發酵研究中的關鍵點及解決方案[J].農業工程學報，2006，22（9）：237，240.

[3] 李祖明，李鴻玉，歷重先，等.纖維素酶轉化木質纖維素生物質生產乙醇的研究進展[J].農業工程技術（新能源產業），2008（2）：28.

[4] 張強，冀偉，王一東.五碳糖和六碳糖共發酵生產酒精菌株選育的研究進展[J].化工進展，2013（1）.