微生物領域研究分析論文

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論文關鍵詞：代謝組學環境微生物評述

論文摘要：代謝組學是效仿基因組學和蛋白質組學的研究思想,對生物體內所有代謝物進行定量分析,并尋找代謝物與生理病理變化的相對關系的研究方式。本文在介紹代謝組學基本含義的基礎之上，對代謝組學的研究方法及其在環境微生物領域的研究進展進行了評述。

一、代謝微生物概述

代謝組學(metabonomics/metabolomics)是效仿基因組學和蛋白質組學的研究思想,對生物體內所有代謝物進行定量分析,并尋找代謝物與生理病理變化的相對關系的研究方式,是系統生物學的組成部分。其研究對象大都是相對分子質量1000以內的小分子物質。先進分析檢測技術結合模式識別和專家系統等計算分析方法是代謝組學研究的基本方法。化學分析技術中最常用的是1H核磁共振(1HNMR)以及色譜(毛細管電泳)-質譜聯用(X-MS)。目前代謝組數據處理的主要方法是:應用主成分分析(PCA)等將從原始圖譜信息或預處理后的信息進行歸類,并采用相應的可視化技術直觀地表達出來;建立類別間的數學模型,使各類樣品間達到最大的分離,并利用建立的多參數模型對未知的樣本進行預測;最終建立可利用的該領域的應用數據庫和專家系統。應用代謝組學可進行疾病診斷、對藥物進行毒性評價和研究植物細胞代謝等。

二、代謝組學的研究方法

代謝物組學分析中,對于不同類型的代謝產物,往往要采取不同的分析方法進行研究。目前,代謝物組學通常采用紅外光譜法(infraredspectroscopy,IR)、核磁共振(nuclearmagneticresonance,NMR)、質譜(massspectrometry,MS)、高效液相色譜(highperformanceliquidchromatography,HPLC)以及各種技術的耦聯,如氣象色譜耦聯質譜(gaschromatography2massspectrometry,GC/MS)和液相色譜耦聯質譜(liquidchromatography2massspectrometry,LC/MS)來分析研究代謝物并為其繪制圖譜。這些技術的耦聯可以提高對樣品的分辨率、敏感性及選擇度,有利于對更多的生物體系內的代謝物繪制圖譜。一般來說,選擇代謝物組學分析方法時,其原則是要同時考慮儀器和技術的檢測速度、選擇性和靈敏度,找到一種最適合目標化合物的方法。

三、代謝組學在微生物領域的研究進展

(一)微生物分類,突變體篩選以及功能基因研究

經典的微生物分類方法多根據微生物形態學以及對不同底物的代謝情況進行表型分類。最近,隨著分子生物學的突飛猛進,基因型分類方法如16SrDNA測序,DNA雜交以及PCR指紋圖譜等方法得到了廣泛應用。然而,某些菌株按照基因型與表型兩類方法分類會得出不同的結果。因此,根據不同的分類目的聯合應用這兩類方法已成為一種趨勢。BIOLOG等方法在表型分類中應用較為廣泛,但是,代謝譜分析方法(metabolicprofiling)異軍突起,逐漸成為一種快速、高通量,全面的表型分類方法。采用代謝組分類時,可以通過檢測胞外代謝物來加以鑒別。常用的胞外代謝物檢測方法為樣品衍生化后進行GC2MS分析、薄層層析或HPLC2MS分析,最后通過特征峰比對進行分類。Bundy等采用NMR分析代謝譜成功地區分開臨床病理來源以及實驗室來源的不同桿菌(bacilluscereus)。除了表型分類外,代謝組學數據可以應用于突變體的篩選。在傳統研究中的沉默突變體(即未發生明顯的表型變化的突變體)內,突變基因可能導致了某些代謝途徑發生變化,通過代謝快照(metabolicsnapshot)可以發現該突變體并研究相應基因的功能。

(二)發酵工藝的監控和優化

發酵工藝的監控和優化需要檢測大量的參數,利用代謝組學研究工具可以減少實驗數量,提高檢測通量,并有助于揭示發酵過程的生化網絡機制,從而有利于理性優化工藝過程。Buchholz等采用連續采樣的方法研究了大腸桿菌在發酵過程中的代謝網絡的動力學變化。他們在葡萄糖缺乏的培養液培養的大腸桿菌中加入葡萄糖,并迅速混勻,按每秒4～5次的頻率連續取樣。利用酶學分析、HPLC/LC2MS等手段監測樣品中多達30種以上的代謝物、核苷以及輔酶,從而解析了葡萄糖以及甘油的代謝途徑和底物攝取體系。通過統計學分析建模,發現在接觸葡萄糖底物后的15～25s范圍內,大腸桿菌體內發生的葡萄糖代謝物變化與經典生化途徑相符,但隨后的過程則與經典途徑不符,推測可能存在新的未知調控步驟。Takors認為,通過上述代謝動力學研究,掌握代謝途徑及網絡中的關鍵參數,將直接有利于代謝工程的優化,包括菌株的理性優化以及發酵參數的調控。

(三)環境微生物研究

微生物降解是環境中去除污染物的主要途徑。深入了解污染物在微生物內的代謝途徑,將有助于人們優化生物降解的條件,從而實現快速的生物修復。這些代謝中間體大都通過萃取、分析方法進行逐個研究,并借助專家經驗擬合出代謝途徑,其動力學過程亦很少觸及。代謝組學方法的采用有可能改變這一現狀。Boersma等采用代謝組學方法研究氟代酚的微生物降解途徑。氟代化合物具有特殊的19F核磁共振屬性,19F的核磁共振靈敏度與1H核相近;由于生物體內無內源性19F核磁信號,因而無本底干擾。所有19F核磁信號均可歸結于異生素及其代謝物。19F核的化學位移值寬,約為700ppm(1H為15ppm,13C為250ppm)。較寬的化學位移導致19F在不同取代物的峰圖不易產生重疊。因此,借助核磁共振技術可以更方便地研究含氟化合物的代謝中間體。Boersma等根據總代謝物的核磁共振圖譜,推測出紅球菌內羥化酶在不同的取代位(1,2,3三種不同的取代數量)羥基化氟代酚,然后再通過兒茶酚內位雙加氧酶開環形成氟代粘糠酸的代謝過程。此外,他們還首次檢測到開環后的下游代謝物,即通過氯粘糠酸異構酶生成氟代粘糠酸內酯以及氟代馬來酸等中間代謝物。根際(rhizosphere)空間在植物2微生物相互作用中發揮著重要的作用。Narasimhan等利用根際代謝物組(rhizospheremetabolomics)方法,闡釋了植物分泌物對根際微生物降解多氯代酚(PCB)的作用機制。然而,在采用擬南芥突變體(產生較少的phenylpropanoids)的對照組中,降解菌的數量較低,降解率也僅達50%。結果表明植物根際分泌的次級代謝物促進降解菌的繁衍增殖,從而促進了污染物的降解。

此外,微生物代謝組學還應研究如何改進樣品的制備方法。例如,在代謝組研究中,為了中止細胞代謝反應采用冷淬火(coldquenching)方法,將細胞樣品迅速置于低溫(液氮或-70℃甲醇中),這會導致許多微生物發生冷休克(cold2shock),釋放出大量的胞內物質,引起代謝組學定量研究發生偏差。

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