蛋白血癥研究管理論文

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【摘要】X-連鎖無丙種球蛋白血癥（X-linkedagammaglobulinemia，XLA）屬于原發性體液免疫缺陷病中的一種，又叫Bruton病。近年來，由于Bruton酪氨酸激酶（Bruton’sagammaglobulinemiatyrosinekinase，BTK）基因突變導致B細胞發育障礙，所以不能產生免疫球蛋白。本文就近年來對BTK的遺傳學特性、基因突變分析、分子致病機制及診斷和治療等的研究進展作一綜述。

【關鍵詞】X-連鎖無丙種球蛋白血癥（XLA）；Burton酪氨酸激酶（BTK）；診斷；治療

【Abstract】X-linkedagammaglobulinemia（XLA）belongstotheprimaryimmunodeficiencydisease（PID），whichcallsBrutondisease.Recently，itcannotgenerateimmuneglobulin，becauseofthemutationoftheBruton’sagammaglobulinemiatyrosinekinase（BTK）gene，whichleadstodevelopmentaldisorderoftheBcell.Thisarticlereviewsthegeneticcharacters，mutationanalysis，molecularpathogenicmechanismandtherapyoftheBKTgene.

【Keywords】XLA；BTK；diagnosis；therapy

X連鎖無丙種球蛋白血癥（X-linkedagammaglobulinemia，XLA），又稱Bruton無丙種球蛋白血癥，是最早發現的人類原發性免疫缺陷病（primaryimmunodeficiencydisease，PID）之一，Bruton（1952年）首次報道。患者臨床上以反復細菌感染為特征，血清中各類免疫球蛋白明顯降低或缺乏，對抗原刺激不能產生抗體應答，血循環中B淋巴細胞減少，淋巴結及淋巴組織缺乏生發中心和淋巴濾泡，骨髓中無漿細胞，但前B淋巴細胞數量正常，T淋巴細胞數量及功能正常。典型病例為出生后半年左右開始反復化膿感染（如肺炎鏈球菌或嗜血流感桿菌）或遲至幼年發病，患者體內缺少成熟B細胞，基本上不能自主產生免疫球蛋白，必須依靠免疫替代療法維持體液免疫水平。該病嚴重危害患者健康，危及患者生命。80%～90%［1］臨床診斷病例可檢出相關致病基因BTK發生突變，而其他10%～20%［1］的病人存在其他問題，有研究顯示常染色體編碼Igφ［2，3］、μHC［4］和LC的基因存在突變。

1BTK的遺傳學特性大多數PID的遺傳形式已經明確，幾乎均為單基因遺傳，多數為常染色體隱性遺傳，其次為X連鎖隱性和常染色體顯性遺傳。大多數情況男性發病，女性攜帶，但也有男性攜帶者不發病的報道。60%的PID突變基因的DNA序列已被克隆，突變位點（包括突變基因定位的染色體節段和基因位點）和突變形式（單個核苷酸缺失、替代、插入、移碼突變、無義或錯義突變等）也已確定［5］。在WHOPID專家委員會的指導下，成立了有關疾病基因庫，記錄登記全球范圍的PID基因突變及其類型。多基因遺傳性PID的確定較困難，至今尚無確切的報道。

1.1BTK的蛋白結構BTK蛋白為B細胞信號傳遞系統中的重要蛋白，屬于非受體型蛋白酪氨酸激酶Tec家族的一員，該家族的成員還包括TEC、ITK/TSK/EMT和BMX。Tec家族蛋白酪氨酸激酶包括5個不同的結構區段（見圖1），從N末端起為PH（pleckstrinhomology；PH）段，約有120個氨基酸，TH（Techomology；TH）段約有60～80個氨基酸SH3（Srchomology3;SH3）段約有60個氨基酸，SH2段約100個氨基酸，激酶催化段約280個氨基酸［6］。

圖1BTK蛋白的組成（從N端開始）包括5個區域：PH、TH、SH3、SH2和激酶區。

注：圖上邊的數字代表各段的氨基酸長度，圖下邊的數字代表不同的外顯子及其相應的位置。

BTK蛋白的空間結構多數已測明，包括PH區、TH區的前半部、SH3區和激酶催化區［7］，SH2區的結構可借用其他蛋白激酶的類似結構進行研究。這些三維空間結構可用于分析突變造成的蛋白空間結構的改變。

1.2BTK基因的分子結構及其突變分析在20世紀80年代，多位學者應用DNA多態性標志分析的方法，成功地將XLA的缺陷基因定位于X染色體中部（Xq21.3-22）的2cm區域內［8］。Vetrie等用定位克隆方法在XLA病變基因區內分離鑒定了一個新的基因，該基因表達于正常人各期B淋巴細胞，在XLA患者中發生突變，故認為是XLA的致病基因。Tsukada等也找到XLA的KD致病基因。BTK基因全長37.5kb，含有19個外顯子，除第一外顯子外，其余18個編碼BTK蛋白的659個氨基酸，分子量為76KD［9］。cDNA含有2560個核苷酸，有一個編碼659個氨基酸多肽的開放閱讀框架，起始密碼子在核苷酸第133位置上，在起始位置上游的15個密碼子處閱讀框架閉合。根據國際研究小組BTK突變分析，迄今已經在471個家族544個XLA病人中發現了BTK基因341個獨立存在的堿基置換、插入或缺失，其中有13個大段缺失和2個大段插入。突變不僅存在于19個外顯子，還涉及內含子和啟動區域。其中，發生頻率最高的是錯義突變，其次是無義突變和拼接位點突變。錯義突變主要發生在三聯體密碼子的前兩位。外顯子8和9的185~287位沒有錯義突變，這些位點可能不易突變或是功能上不重要。33%的替代累及CPG雙核苷酸，這是目前認為的最常見的突變熱點［10］，而突變高頻位點R520也屬于CPG突變［6］。編碼外顯子蛋白突變的區域［11］（見表1）。表1編碼外顯子蛋白突變的區域

2BTK的分子致病機制BTK屬于非受體酪氨酸蛋白激酶，該類激酶廣泛參與細胞信號傳導，影響細胞的存活、增殖和分化，BTK是B細胞發育成熟的關鍵因素。正常人除T細胞和漿細胞外均有BTK表達，而BTK基因突變只影響B細胞的數量，這說明BTK在B細胞的生長發育過程中起著至關重要的作用。目前對BTK參與細胞信號傳導研究比較清楚的是BCR交聯介導的信號傳導途徑。其過程簡述如下：BCR交聯激活Pl-3激酶并產生一定數量的Pl-3，4，5-risphosphate與膜結合，Pl-3，4，5-risphosphate與BTK的SH3段作用使其定位于細胞膜。然后，BTK經過兩步活化：首先BTK激酶段Y551位磷酸化（很可能是與Lyn作用），接著是SH3段Y223位的自身磷酸化。活化后的BTK與B細胞銜接蛋白（BLNK）結合并激活phospholipaseC-γy（PLC-γ），導致鈣離子通道打開，胞外鈣離子內流。該信號傳導途徑最終導致細胞增生加強和轉錄的變化。此模式僅限于以B細胞受體交聯作為刺激信號，至于前B細胞受體交聯是否也引起相同的信號傳導目前還缺乏證據［1，12］。該信號傳導途徑受FcRⅡB和SHIP（SH2-containinginositol-5-phosphatase）磷酸酶介導的另一途徑制約，通過水解Pl-3，4，5-risphosphate和Ins（1，3，4，5）-etraphosphate關閉鈣離子內流通道［13］。BTK不僅可以由BCR和FCR介導激活，也可以通過其他很多受體激活，包括G-protein-coupledreceptors（GPCR）、IL-3、IL-5和IL-6，另外，CD19和單克隆抗體的交聯也可激活BTK［13］，近年來研究表明，CD40也是B細胞發育過程中的重要受體，傳遞刺激信號影響細胞存活、生長和分化。與BCR介導的BTK活化途徑相似，CD40的交聯也可激活BTK。CD40和BCR可能是B細胞發育過程中不同階段激活BTK的信號傳遞通路。但也有研究提示CD40不通過BTK也可提高NFKB和JNK的水平，是獨立于BTK的信號傳導通路［14～16］。BTK在細胞內與很多分子相互作用，共同構成了一種微環境，在信號傳導的過程中起著重要的作用。這些分子分別與BTK的不同區段相互作用，其中與PH段作用的分子研究得很多，R28附近區域與PIP3、IP4、PKCβⅠ、BP-135、F-ac-tin、STAT3和Fas作用。PH-TH區域與Gαq和Gβ雙體作用;SH3與c-Cb1、WASp、Vav和sab作用;SH2與磷酸化的BLNK作用。另外，SH3與TH在BTK分子內作用，抑制BTK的活性。在BCR交聯介導的信號傳導途徑中，Syk和BLNK對BTK的活化起正向調節作用，磷酸化的PKCs、sab和IBTK對BTK的活化有抑制作用。盡管與BTK作用的分子很多，但是它們如何協調地與BTK作用，完成BTK參與的信號傳導，機制目前尚不清楚［17，18］。

3XLA的診斷XLA是一種原發性體液免疫缺陷癥，危害著人們的健康。因而，對該癥進行產前診斷和女性攜帶者的鑒定就顯得十分重要［19］。為了研究XLA家系女性成員的情況，Fearon等采用了X染色體失活的方法去發現攜帶狀況以及驗證B淋巴細胞發育的內在缺陷。根據這一方法用重組DNA探針同時發現RFLP和X染色體基因甲基化。在無攜帶狀態的女性的外周血粒細胞、T淋巴細胞和B淋巴細胞中發現X染色體的隨機失活。相反，該癥的三個攜帶者在外周B淋巴細胞兩個X染色體中的一個優先失活，但不是T細胞或粒細胞。這一發現強烈地支持XLA是由B淋巴細胞發育的內在缺陷所致的假設。Lovering（1994）等［20］對BTK基因缺失患者DNA分子斑點雜交分析見到了已改變的DNA限制性片段，并對7個患者家庭用已經改變的限制性片段方法對與患者有關的女性攜帶狀況作出診斷。隨后，Schuster等［21］報道了對所有19個外顯子。包括側翼內含子邊界采用PCR-SSCP方法成功地檢測到兩例男性患兒BTK的SH2功能區的新突變，并用一個已改變過的第一個引物做PCR擴增突變發生，作出三代中健康女性攜帶者的鑒定。接著，Hagemann等［22］對一個散發的XLA患兒及家庭的三代成員應用PCR擴增基因組DNA，采用序列分析的方法直接鑒定XLA的基因突變，結果診斷出患兒及其免疫學表現正常的女性攜帶者。以上這些方法均可應用于產前診斷。這無疑對優生優育是很有意義的。

4XLA的治療研究免疫重建是采用正常細胞或基因片段植入患兒體內，使之發揮功能，以持久地糾正缺陷的基因及其表達產物。1968年使用HLA配型同種異體骨髓移植治療2例致死性免疫缺陷病獲得成功。至今已有近2000例PID患兒接受骨髓移植，總存活率為62%，其中同型合子骨髓移植達79%。無關供體配型骨髓（matchedunrelatedmarrowdonor，MUD）移植在近年已很盛行，成功率約為50%，5歲以內接受移植者可達85%［23］。近年開展臍血干細胞移植，存活率為75%。用母體骨髓CD34+干細胞宮內移植（腹腔注射）已有成功的報道［5］。將正常目的基因片段整合到患兒干細胞基因組內（基因轉化），隨細胞有絲分裂，轉化的基因片段能在患兒體內復制而持續存在。理論上講，凡能通過骨髓移植治愈的疾病均是基因治療的指針［24］。基因治療PID的嘗試已經歷多年，取得一定成效，但尚處于探索和臨床驗證階段［25］。Faust等［26］的動物實驗是通過免疫球蛋白的增強子和驅動子介導的小鼠BTKcDNA轉錄至兩組免疫缺陷鼠（XLD或BTK-/-鼠）。轉入1個拷貝的XLD或BTK-/-鼠經蛋白印跡法檢測其BTK達到正常量的25%；而轉錄2個拷貝者其BTK達到正常量的50%。兩組小鼠經檢測均有正常數量的脾B細胞，兩組小鼠對TNP一蔗聚糖刺激所產生抗體的反應和血清IgM、lgG3水平較正常野生鼠明顯減低，但較XID小鼠有所提高。Drabek等［27］通過人類BTKcDNA與鼠主要組織相容性復合體Ⅱ區調節因子的轉基因治療，糾正了BTK缺陷鼠的B細胞功能，并發現轉入的基因并不表達于前B細胞以前的分化階段，此外它在胸腺上皮細胞、活化T細胞、單核細胞上表達，并在其他組織均有低水平表達。經蛋白印跡法檢測轉基因鼠的脾細胞產物發現，BTK蛋白總含量可達到與野生型鼠相同。這些研究均向我們提供了基因治療XLA的可能性。此外，Rohrer等［28］通過動物實驗證實，應用極少量正常骨髓細胞輸注即可通過競爭使XID小鼠獲得B系統免疫重建。這項研究推測，即使不成功的基因治療也可對XLA患者有益，為今后開展人類XLA的基因、細胞治療提供有利的基礎和廣闊的前景。總體上說，盡管目前基因治療離成熟的臨床治療技術還有相當的距離，但經過近10年的臨床試驗，人們已獲得了大量寶貴的臨床資料。我們有理由相信，XLA的基因治療將在不久的將來獲得突破性進展。

5展望盡管80%～90%臨床診斷為XLA的病人依靠BTK突變檢測確診為XLA，但是XLA的基因突變位點很多，與臨床癥狀的相關性不強，同一家系中的XLA病人臨床表現程度很可能各不相同。即：基因型和臨床表型的關系是目前需要研究的課題之一［29］。這涉及到突變基因產物蛋白質的功能、結構穩定性和二維構像［30，31］。這樣，通過基因突變及其對蛋白的影響無法預知XLA的病程、復雜程度、B細胞數量和免疫球蛋白的水平。只有徹底明確BTK在B細胞信號傳導中的作用機制，才能找到基因突變和臨床癥狀的相關性，完善XLA的基因診斷，并為治療奠定理論基礎［32］。1994年，國際上成立了BTK基因突變分析小組并建立了BTK基因突變數據庫（http：//www.uta.fi/imt/bioinfo/btkbase/），為XLA的基因診斷提供了便利的條件。但是數據庫中的病源主要來自西方國家、日本和俄羅斯，而國內的BTK基因研究相對處于空白階段。因此，目前開展BTK基因突變的檢測工作應成為國內同類研究的重點，通過建立有效可靠的BTK基因突變篩查方法，研究中國人BTK基因突變的規律。因此，隨著對PID認識的深入和檢測方法的簡化，將會有更多的病例被確診，不僅可以用常規方法治療，而且可以做基因分析，同時，建立PID登記網絡［33］，也將有助于了解確切的發病率和需要治療的患者。總之，來自突變基因的BTK蛋白還沒有被完全認識，在蛋白質水平這些突變的結果還不清楚。BTK基因突變在XLA發病機制中更詳細作用還不清楚，但作為疾病基因，對其基因組結構的研究，將為未來的體細胞基因治療創造條件。當然，體細胞治療存在著一定的問題，目前還不能達到此目的，但這是今后研究的一個重要方向，基因治療無疑是近20年來分子生物學和重組DNA技術迅速發展的一種結果。由于體內大劑量靜脈丙種球蛋白的長期替代療法有不少的副作用，且價格昂貴，不能根本解決問題。若能將缺陷的基因進行原位的修補，基因治療將是最理想的根治方法。

【參考文獻】

1LebienTW.FatesofhumanB-cellprecursors.B1ood，2000，96（1）：9-23.

2MinegishiY，Coustarn-SmithE，RapalusL，etal.MutationsinIg（CD79a）resultinacompleteblockinB-celldevelopment.JournalofClinicalInvestigation，1999，104（8）：1115-1121.

3WangY，KaneganeH，SanalO，etal.NovelIg（CD79a）genemutationinaTurkishpatientwithBcell-deficientagammaglobulinemia.Ameri-canJournalofMedicalGenetics，2002，108（4）：333-336.

4MliliM，AntunesH，Blanco-BetancourtC，etal.Aneecessiveagammaglobulinemiawithimpairedpre-BcelldifferentiationduetoalargedeletionoftheIGHlocus.EuropeanJournalofPediatrics，2002，161（9）：479-484.

5ChapelH，GehaR，RosenF.Primaryimmunodeficiencydiseases：anupdate.ClinExpImmunol，2003，132：9-15CDC.

6VihinenM，KwanSP，LesterT，etal.MutationsofthehumanBTKgenecodingforBrutontyrosinekinaseinX-linkedagammaglobulinemia.Humanmutation，1999，13（4）：280-285.

7MaoC，ZhouM，UckunFM.CrystalStructureofBruton’styrosinekinasedomainsuggestsanovelpathwayfoxactivationandprovidesinsightsintothemolecularbasisofX-linkedagammaglobulinemia.JournalofBiologicalChemistry，2001，276（44）：41435-41443.

8孫金英，劉樂宇，劉桂蘭.X連鎖無丙種球蛋白血癥的分子生物學研究進展.國外醫學·兒科學分冊，2001，28（4）：191-194.

9王劍利，耿松海.BTK基因與XLA.國外醫學·遺傳學分冊，2000，23（5）：263-266.

10VihinenM，BrooimansRA，KwanSP，etal.ImmunolToday，1996，17（1）：502-506.

11VihinenM，CooperMD，DeSaintBasileG，etal.ImmunolToday，1995，16（1）：460-465.

12TanJE-L，WongS-C，GanSK-E，etal.TheadaptorproteinBLNKisrequiredforBcellantigenreceptorinducedactivationofnuclearfactorbandcellcycleentryandsurvivalofBlymphocytes.TheJournalofSiologicalChemistry.TheJournalofBiologicaltheMistry，2001，276（23）：20055-20063.

13Mohamed，Nore，Christensson，etal.SignalingofBruton’styrosinekinase，Btk.ScandinavianJournalofImmunology，1999，49（2）：113.

14BrunnerC，AvotsA，KrethHW，etal.Bruton’styrosinekinaseisactivateduponCD40stimulationinhumanBlymphocytes.Immunobiology，2002，206（4）：432-440.

15MizunoT，RothsteinTL.Cuttingedge：CD40engagementeliminatestheneedforBruton’styrosinekinaseinBcellreceptorsignalingfoxNF—B.JournalofImmunology，2003，170（6）：2806-2810.

16BrunnerC，KrethHW，OchsHD，etal.Unimpairedactivationofc-JunNH2-terminalkinase（JNK）1uponCD40stimulationinBcellsofpatientswithX—linkedagammaglobulinemia.JournalofClinicalImmumology，2002，22（4）：244-251.

17KoyasuS.Beatingakinase.NatureImmunology，2001，2（10）：897-898.

18LiuW，QuintoI，ChenX，etal.DirectinhibitionofBruton’styrosinekinasebyIBtk，aBtkbindingprotein.NatureImmunology，2001，2（10）：939-946.

19黃海.Btk與XLA相關性研究進展.國外醫學·兒科學分冊，1998，25（5）：248-251.

20LoveringRC，SweatmanA，GenetSA，etal.HumGenet，1994，94（1）：77-79.

21SchusterV，SeidenspinnerS，KrethHW，etal.AmJMedGenet，1996，63（1）：318-322.

22HagamannTL，ChenY，RosenFS，etal.AmJModGenet，1995，59（2）：188-192.

23AntoineC，MullerS，CantA，etal.Long-termsurvivalandtransplantationofhaemopoieticstemcellsforimmunodeficiencies：reportoftheEuropeanexperience1968一99.Lancet，2003，361：553-560.

24Hacein-Bey-AbinaS，LeDeistF，CarlierF，etal.SustainedcorrectionofX-linkedseverecombinedimmunodeficiencybyexvivogenetherapy.NEnglJMed，2002，346：1185-1193.

25Hacein-Bey-AbinaS，VonKalleC，SchmidtM，etal.AseriousadverseeventaftersuccessfulgenetherapyforX-linkedseverecombinedimmunodeficiency.NEnglJMed，2003，348：255-256.

26SatterthwaiteAB，CheroutreH，KhanWN，etal.BtkdosagedeterminessensitivitytoBcellantigenreceptorcross一linking.ProcNatlAcadSciUSA，1997，94（24）：13152-13157.

27DrabekD，RaguzS，DeWitTP，etal.CorrectionoftheX-linkedimmunodeficiencyphenotypebytransgenicexpressionofhumanBectontyrosinekinaseunderthecontrolofthelossⅡmajorhistocompatibilitycomplexEalocuscontrolregion.ProcNatlAcidSciUSA，1997，94（2）：610-615.

28RohrerJ，ConleyME.CorrectionofX一linkedimmunodeficientmicebycompetitivereconstitutionwithlimitingnumbersofnormalbonemarrowcells.Blood，1999.94（10）：3358-3365.

29楊錫強.原發性免疫缺陷病的歷史、現狀和展望.中華兒科雜志，2004，42（8）：561-563.

30馮雷.免疫缺陷病.北京：人民衛生出版社，1988，184-217.

31Applyingpublichealthstrategiestoprimaryimmunodeficiencydiseases：apotentialapproachtogeneticdisorders.2004，6.1stavailablefrom：URL：http：//www.cdc.gov/genomics/info/conference/PIsynop.htm.

32張寧，宋淑嬡.X—連鎖無丙種球蛋白血癥研究現狀與展望.國外醫學·免疫學分冊，2004，27（1）：59-62.

33楊錫強.原發性免疫缺陷病的協作網和登記工作.中華兒科雜志，1999，37（6）：328-329.