蛋白酶體范文
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篇1
[關鍵詞] 蛋白酶體抑制劑；泛素-蛋白酶體通路；肺癌；作用機制
[中圖分類號] R734.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2016）08（b）-0038-04
[Abstract] The ubiquitin-proteasome pathway is the principle pathway for intracellular protein degradation. Research shows that ubiquitin-proteasome pathway plays a significant role in the genesis and progression of malignancy by regulating many processes of cellular biology. Proteasome inhibitors targeting the ubiquitin-proteasome pathway can inhibit tumorous cellular growth， becoming a novel class of potent and effective antitumor agents. Lung cancer is the leading cause of cancer-related deaths globally. The study about the effect of proteasome inhibitors on lung cancer is ongoing. The mechanisms are complicated， relating to the down-regulation of NF-κB， cell cycle control， PTEN/PI3K/AKT pathway， the regulation of P53 and others. The recent advances about proteasome inhibitors in the treatment of lung cancer is going to be reviewed in this paper.
[Key words] Proteasome inhibitor； Ubiquitin-proteasome pathway； Lung cancer； Mechanism
泛素-蛋白酶體通路（ubiquitin-proteasome pathway，UPP）是生物體內蛋白質降解的重要通路，此通路選擇性降解細胞內受損及錯誤折疊的蛋白質，并對各種短壽命的功能蛋白具有快速降解作用。80%～90%的細胞內蛋白均通過此途徑降解，其中包括細胞周期調控因子、基因轉錄因子、癌基因蛋白等[1]。UPP通過對上述蛋白的降解，調節細胞增殖、分化、存活和凋亡，在人體諸多生理過程中發揮重要作用，如信號轉導、細胞周期調控、細胞凋亡調節、轉錄調控等，對維持細胞的穩態具有十分重要的意義，其功能的改變和異常能直接導致或誘發人類的許多重要疾病[2]。蛋白酶體抑制劑通過抑制蛋白酶體活性而阻斷UPP，具有抑制多種腫瘤細胞增殖及誘導腫瘤細胞凋亡的作用，目前已成為抗腫瘤治療的研究新熱點。本文就UPP、蛋白酶體抑制劑在肺癌治療中的進展綜述如下：
1 泛素-蛋白酶體通路的組成
UPP由泛素、泛素活化酶E1、泛素結合酶E2、泛素連接酶E3、26S蛋白酶體、去泛素化酶等組成。此途徑的核心是26S蛋白酶體，它是一個多催化復合物，由20S核心蛋白酶和兩端各一的19S調節亞基組成。20S核心蛋白酶是蛋白酶體復合物的水解核心，具有胰蛋白酶、糜蛋白酶和胱天蛋白酶活性。UPP在降解靶蛋白時，首先要實現靶蛋白的泛素化，即若干泛素經E1、E2、E3的作用與靶蛋白相連[3]。只有泛素化的靶蛋白方可被19S調節亞基識別，進而進入20S核心蛋白酶體內部，被降解成3～22個氨基酸的小肽段，在細胞內回收利用。泛素分子則被泛素解離酶從靶蛋白上解離下來，重復利用[4]。
UPP通過上述過程，上調或下調某些抑癌基因、轉錄因子和細胞周期素等的表達以及改變MHC-Ⅰ限制性抗原肽的生成[5]，參與惡性腫瘤多種細胞生物學過程的調節，從而參與惡性腫瘤的發生和發展。
2 蛋白酶體抑制劑
蛋白酶體抑制劑按其不同的末端親電基團可以分為硼酸肽類、環氧酮肽類、醛基肽類和乙烯基砜肽類等多種類型，以上均屬于合成化合物，此外還有天然蛋白酶體抑制劑如乳胞素、3，4-二氯異香豆素（DCI）、阿克拉霉素（Aclacinomycin）、PR-39等。按其作用方式不同，蛋白酶體抑制劑又可分為可逆性和不可逆性兩種。醛基肽類是第一個被發現并廣泛應用的蛋白酶體抑制劑，如MG132，是可逆性蛋白酶體抑制劑，其進入細胞速度快，能抑制ChT-L活性、半胱氨酸和絲氨酸蛋白酶活性，但醛基肽類化合物是非選擇性的，會抑制其他酶類，且穩定性較差，易被氧化。
目前臨床上研究最多、最完善的是硼替佐米，它屬于硼酸肽類，是一種具有高選擇性、可逆性的蛋白酶體抑制劑。硼替佐米（PS341、萬珂）于2003年被美國食品藥品監督管理局（FDA）批準上市，具有較廣的抗腫瘤譜，除了用于治療多發性骨髓瘤、套細胞淋巴瘤外，它對其他腫瘤細胞，如肺癌、結腸癌、乳腺癌、前列腺癌等均具有細胞毒性，可引起腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤生長[6]。近年來，研究者對硼替佐米進行結構改造，得到了新型硼酸肽類蛋白酶體抑制劑YSY-01A，研究表明，它在多種腫瘤細胞中均具有抑制增殖的作用[7]，其LD50值高于硼替佐米3倍，且毒副作用更低，有望成為新的研究熱點。此外，環氧酮肽類化合物卡非佐米也于2012年被FDA批準用于多發性骨髓瘤的治療。
3 蛋白酶體抑制劑與肺癌
肺癌在人類癌癥死亡中居于首位，嚴重危害人類健康。據世界衛生組織統計，2008年，世界范圍內有160萬人被診斷為肺癌，同年有140萬人死于此病。我國每年大約超過60萬人死于此病。而其中非小細胞肺癌（NSCLC）大約占肺癌所有患者的80%。因此，為了使這個龐大的患者群體得到更好的治療，能否制訂出有效的抗腫瘤方案尤為重要。蛋白酶體抑制劑對多種血液系統腫瘤及實體瘤均有療效，有關蛋白酶體抑制劑對肺癌，特別是NSCLC治療研究亦不在少數，但其作用機制仍不完全明確。
3.1 作用機制
3.1.1 下調核因子κB 核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）普遍存在于真核細胞中，對超過200種基因具有調節作用，其中包括細胞黏附分子、血管內皮生長因子、凋亡調節基因如Bcl-2、Bcl-xL等，這些基因與腫瘤生長和轉移息息相關。故而NF-κB的下調對抑制腫瘤的生長或促進腫瘤細胞凋亡發揮重要作用[8]。通常情況下，NF-κB以二聚體形式與其抑制蛋白IκB相結合，以無活性狀態存在于細胞中。但當細胞受到細胞因子、生長因子、細菌、病毒、應激狀態等刺激時，IκB被UPP降解，NF-κB從而被游離、激活[9]，發揮對其下游轉錄基因的調控作用，最終發生腫瘤生長因子表達增多，血管生成，細胞凋亡減少，誘發腫瘤可能[10]。蛋白酶體抑制劑可抑制IκB降解，從而阻止上述過程，調控細胞周期進程，控制細胞凋亡，抑制血管生長，對腫瘤治療的各方面靶點均有作用。
3.1.2 對細胞周期的調控 在真核細胞中，細胞周期由細胞周期蛋白和細胞周期依賴性激酶（CDKs）調節。不同的CDK對應相應的細胞周期蛋白，調節細胞周期的各個階段。而CDKs的抑制物（CKIs）則限制CDKs活性及細胞周期進程。P21WAF1/Cip1是眾多CKIs中的一種，其在細胞周期G2/M期阻滯中發揮作用。P27Kip1是另一種CKI，可以阻止細胞從G1期到S期，上述二者都是UPP的降解底物[11]，當蛋白酶體被抑制時，CKIs不能被降解，使細胞分裂停止于各個不同時期，導致細胞凋亡而抑制腫瘤生長[1]。Ling等[12]在PS341作用于NSCLC H460細胞的研究中發現，在PS341作用下G2/M期細胞增多，研究中亦發現G2/M期阻滯與周期蛋白A1、周期蛋白B及其激酶的增加有關。
抗凋亡基因Bcl-2與腫瘤細胞凋亡抑制及化療抑制有關，蛋白酶體抑制劑能克服Bcl-2介導的凋亡抑制，同時上調Bcl-2家族中的促凋亡分子Bax，降低Bcl-2/Bax的比值，促使腫瘤細胞凋亡。Ling等[13]在PS341作用于NSCLC的另一項研究發現，G2/M期細胞的數目與Bcl-2的磷酸化程度相一致，提示蛋白酶體抑制劑通過磷酸化作用下調NSCLS細胞中的Bcl-2水平，這也是癌細胞凋亡的機制之一。
3.1.3 P53的調控 抑癌基因P53在腫瘤的發生發展過程中發揮重要作用。當細胞受到化學或電離輻射，DNA發生損傷時，P53經磷酸化或其他途徑活化，從其抑制物MDM2中脫離，P53蛋白大量積累，誘導P21WAF1/CIP1轉錄，使細胞周期停滯，并阻止DNA合成，同時修復損傷的DNA。許多腫瘤中都存在P53基因突變，使P53不能表達或無法誘導下游的轉錄活動，DNA無法修復，異常的DNA傳遞給子代細胞，逐步積累，最終導致腫瘤的發生。P53通過UPP降解，故而蛋白酶體抑制劑可使P53積累，且有穩定P53的作用[14]。既往研究認為，P53誘導NSCLC停滯于G2/M期[15]，從而阻止腫瘤的發生。但有研究通過使用除P53外，其余基因完全相同的人類癌細胞，重新評估P53在PI誘導的腫瘤細胞凋亡中的作用[16]，該研究發現，硼替佐米和MG132誘導癌細胞凋亡均不依賴P53。Ling等[12]在NSCLC的研究中也發現，蛋白酶體抑制劑對細胞生長的抑制作用僅部分依賴P53功能，而細胞周期發生G2/M期停滯并不依賴P53。
3.1.4 PTEN/PI3K/Akt 通路 PI3K/Akt信號轉導通路是腫瘤生長的重要通路，PI3K的激活是此通路的基礎，活化的PI3K可將信息傳遞給通路的第二信使PIP3，接著活化Akt及PDK1，通過刺激其下游作用因子，促進腫瘤細胞的生長、增殖、浸潤和轉移。PTEN基因是與腫瘤發生關系密切的抑癌基因，它可通過PIP3去磷酸化拮抗PI3K/Akt通路[17]。Sherwood等[18]在硼替佐米致結腸癌SW480細胞凋亡的研究中發現，PTEN蛋白表達水平與硼替佐米作用時間正相關，隨PTEN蛋白表達增加，Akt蛋白表達降低，從而抑制通路活性。Sun等[19]在YSY-01A抑制NSCLC A549細胞生長的作用機制的研究中亦發現，A549細胞增殖抑制時，PTEN的表達增加，PI3K表達減少。
3.1.5 抑制血管生成 腫瘤直徑達到1～2 mm后，若無新生血管生成來提供營養，則不能繼續生長[20]。新生的血管不僅可以為腫瘤輸注養分、排除廢物，還提供了腫瘤細胞的轉移途徑。實驗證明，蛋白酶體抑制劑通過阻礙NF-κB入細胞核的過程，降低其活性，進而下調缺氧誘導因子1α（HIF-1α）的表達，使血管內皮生長因子（VEGF）減少，抑制血管生成[21-22]，從而抑制腫瘤生長和轉移。
3.1.6 其他 蛋白酶體抑制劑的抗腫瘤機制復雜，除上述機制外，蛋白酶體抑制劑還可促進腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體（TRAIL）誘導的凋亡[23]，此過程與蛋白酶體抑制劑下調NF-κB，誘導caspase-8和caspase -9活化，上調死亡受體DR4/DR5有關。此外，PIs還可逆轉化療藥物的耐藥性、增加放化療敏感性，緩解腫瘤惡病質，這些均為蛋白酶體抑制劑對肺癌的治療提供了基礎。
3.2 聯合治療
放化療是肺癌治療中的重要手段，但肺癌細胞對化療藥物的耐藥性、毒副作用以及放療過程的輻射及患者耐受性是治療過程中的一大難題。上文陳述了蛋白酶體抑制劑在肺癌中的抗腫瘤機制，為肺癌的治療提供新思路。目前關于硼替佐米對肺癌治療的臨床研究較多見，硼替佐米耐受良好，但單一用藥效果較溫和。Li等[24]在硼替佐米對初次化療的已發生癌細胞轉移的NSCLC患者治療的研究中發現，雖然患者耐受良好，但未見疾病客觀緩解，其療效并不明顯。另一些研究也表明，患者對硼替佐米耐受良好。Piperdi等[25]在硼替佐米聯合標準劑量的卡鉑及貝伐單抗治療晚期NSCLC的研究中發現，硼替佐米劑量分為1.3、1.6、1.8 mg/m2三組，在前3周中，三組中所有16例患者均未出現與硼替佐米劑量相關的不良反應，硼替佐米與當前化療方案相結合，則顯示出令人驚喜的療效。Davies等[26]在硼替佐米聯合吉西他濱/卡鉑治療晚期NSCLC的臨床研究中發現，患者生存受益，中位生存期為11個月，1年和2年生存率分別為47%和19%。Zhao等[27]在硼替佐米聯合紫杉醇、卡鉑及胸部放療的治療研究中也提示該方案可潛在獲益，其中位存活期為25個月，12個月生存率為73%，但血液系統方面的副作用，如白細胞減少、中性粒細胞減少等有所增加。
4 小結與展望
蛋白酶體抑制劑對肺癌的治療作用已經取得了一定的研究成果。許多體內外實驗證實蛋白酶體抑制劑對肺癌細胞的殺傷作用，目前的臨床實驗已證實蛋白酶體抑制劑對肺癌的治療具有很高的可行性。隨著蛋白酶體抑制劑的作用機制以及在臨床應用方面研究的不斷深入，在肺癌方面的作用也會進一步明確，可能成為治療肺癌的新方法。
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篇2
【關鍵詞】核糖體核糖體S6Ks蛋白激酶;腫瘤
蛋白分子的磷酸化是細胞內信號傳導過程中最重要的調節方式之一。各種蛋白激酶通過將ATP的γ磷酸基轉移到底物特定的氨基酸殘基上,使底物蛋白磷酸化,這種磷酸化作用不僅可以調節蛋白質活性,還可以使傳導信號逐級放大,最終引起細胞內反應?？梢赃@么說,細胞內所有的活動都離不開蛋白激酶的參與,而激酶的磷酸化作用也正體現了細胞信號傳導過程中最為有效的調節方式。核糖體S6Ks蛋白激酶作為cAMP-cGMP依賴性激酶和PKC激酶超家族成員之一,在細胞生長、繁殖和細胞能量代謝過程中發揮著重要的作用。激酶的活性調節首先是通過一系列絲氨酸/蘇氨酸位點的磷酸化和去磷酸化作用實現的,生長因子、細胞因子、激素等細胞外刺激信號可引起激酶的快速活化,而生長抑制物如類固醇等則能抑制激酶的活性。另一方面,活化的S6Ks蛋白激酶又可以將上游信號傳導給多種效應底物,其中比較著名的就是核糖體蛋白S6,后者作為真核細胞中核糖體40S亞基的組成元件,通過增加具有5’末段寡嘧啶序列結構的mRNA的翻譯,達到誘導多種蛋白組分合成的作用。
1核糖體蛋白S6Ks概述
S6Ks最初分離自有絲分裂劑刺激的瑞典鼠源3T3細胞系,經純化、克隆、表達研究發現RPS6KB1基因定位在17號染色體長臂23位,由于選擇性mRNA剪切和不同的翻譯起始位點得到兩個激酶同工型,分別命名為S6K1和S6K2。根據核漿定位的不同又將激酶區分為核定位的S6K1 I,S6K2 I和漿定位的S6K1 II,S6K2 II,兩者的主要區別在于前者的氨基末端存在有額外的核定位信號。核漿表達轉換是所有胞漿型S6K激酶具有的共同特點之一,表現為在血清饑餓的細胞中S6Ks II型主要存在于胞漿內,而當有血清或生長因子刺激時,S6K II型激酶將轉入細胞核內,盡管這一改變的具體機制不甚明了,但其所存在的意義已經受到多方關注。研究表明S6Ks在控制細胞大小、生長和繁殖中發揮著重要作用,通過協同作用方式達到組織器官的正常發展。
2S6Ks分子的活化機制
首先,在我們具體研究S6K1磷酸化信號通路之前,我們有必要簡述一下S6K1蛋白的一級結構組成,以及每個引起激酶活化的磷酸化位點及其之間的相互作用方式。 S6K1蛋白激酶主要由三個部分組成(圖1),他們分別是:位于羧基末端的自主調控區,具有高度同源性的酸性氨基末端以及位于兩者之間的絲氨酸/蘇氨酸激酶催化區域(1)。
2.1S6K1多磷酸化位點到目前為止,在內源性S6K1蛋白激酶中已基本確定了八個主要的磷酸化位點(1)。其中位于激酶羧基末端自主抑制區內的Ser411、Ser418、Thr421和Ser424四個磷酸化位點是最先被確定下來的,被稱作S/T-P位點,在有絲分裂原刺激的S6K1活化中發揮重要作用。這些位點具有的共同特點是在他們的+1位上有一脯氨酸而在-2位上有一疏水性氨基酸殘基,這一結構可以被一系列脯氨酸作用激酶,例如Erk1和Erk2、壓力活化蛋白激酶和Cdc2所識別,進而使位點得以磷酸化。隨后研究又發現了擁有相同結構特點的Ser371位點和Thr229、Thr389、Ser404位點(2),其中Thr229位于激酶活化環中而其余三者位于連接催化區和自主抑制區的激酶鉸鏈區,這些后期發現的位點均表現出對免疫抑制劑rapamycin和真菌代謝產物wortmannin的高度敏感,在激酶活化過程中具有重要作用。突變分析揭示Thr229、Thr389、Ser404位點有一共同特點即在它們的側位上均有一些龐大的芳香族氨基酸,將這三個位點轉變成酸性或者中性氨基酸會發現Thr229和Thr389具有重要調控作用,而Ser404僅表現一定調節功能。同源性分析還發現Thr229、Thr389、Ser371位點以及他們所定位區域在大部分Ser/Thr激酶的AGC超家族成員中高度保守,相反地,自主抑制區以及S6K1的羧基末端結構在AGC家族的其他成員中卻顯著缺失。這一不同使人們對自主抑制區在S6K1活化過程中的具體作用產生了疑問,為此多種S6K1蛋白截斷體和不同位點突變體被相應構建出,用以分析在各種不同結構中,S6K1蛋白活性情況的改變。比較突出的發現是當截斷S6K1的氨基末端時,將嚴重影響到激酶的活性以及有絲分裂原誘導的Thr229和Thr389位點的磷酸化,而這種影響在同時移除掉激酶羧基末端或缺失掉自主抑制區的情況下得以解救。這些結果說明自主抑制區或者說這些磷酸化位點定位的區域在調控S6K激酶活性以及Thr229和Thr389位點磷酸化的過程中起著重要作用。
2.2磷酸化調節許多研究已表明S6K蛋白激酶的活化是由多磷酸化位點級聯反應,協同作用實現的,它反映出分子水平上錯綜而復雜的交互關系。首先,突變掉氨基末端的p70S6KΔN54突變體,其對有絲分裂原反應活性的降低可被羧基末端同時缺失的行為所解救(3),而突變掉羧基末端四個自主抑制S/T-P位點的行為僅可部分解救其活性損失,這說明自主抑制區在調控p70S6K蛋白活性和Thr229磷酸化水平中起重要作用卻又不完全(1)。其次當突變掉羧基末端104個氨基酸殘基得p70S6KΔC104突變體,發現Thr229基礎磷酸化水平有所升高而Thr389未受影響,但突變體本身卻表現出低激酶活性,當受到血清刺激反應時,Thr229和Thr389的磷酸化水平均提高且相應的激酶被活化(3),這說明羧基末端的缺失將打破對Thr229磷酸化的調節卻無法使激酶活化。進一步的Thr389位點突變反應發現由谷氨酸替代Thr389可以使基礎p70S6K蛋白激酶活性和Thr229的磷酸化水平得以提高,而由丙氨酸替代Thr389后則使p70S6K活性及Thr229相對于血清的磷酸化反應完全喪失(1),這可說明在p70S6K蛋白激酶中,Thr229的磷酸化受到自主抑制區和Thr389位點的協同調節作用。此外還有相關實驗發現缺失掉氨基和羧基末端的突變體p70S6KN54C104對rapamycin不再敏感,卻保留了對wortmannin的敏感性,而缺失羧基末端的p70S6KΔC104突變體卻仍然保持著對rapamycin的敏感性,將這些發現結合在一起可以得出這樣的假設,rapamycin-FKBP12復合物增加了某種負性影響因子的活性,例如磷酸酶,而這一因子的活性作用正需要p70S6K的氨基末端執行其抑制功能。相反的,在PI3K依賴的信號通路中,則可能是某一正性影響因子受到調控,因為p70S6KN54C104仍保有對wortmannin的敏感性。綜上所述,我們可為p70S6K蛋白激酶活化途徑建立如下一個級聯模型(如圖2):首先刺激信號影響自主抑制區的S/T-P位點,使其磷酸化;他們的活化將打破激酶羧基和氨基之間的相互作用,暴露出鏈結構區的Thr389位點,使此位點在氨基末端功能的協調下易于被磷酸化,但此時蛋白仍處于失活狀態;而后Thr389位點的磷酸化將完全暴露激酶活化環中的Thr229位點,此位點的最終磷酸化將激活S6K蛋白活性,發揮其功能。
2.3其他調節位點盡管上述結論使我們建立了一個p70S6K蛋白活化基本模型,但針對細胞內具體活化步驟仍存在有許多疑點。由于缺失掉羧基末端的p70S6KΔC104突變體仍對激酶活化和Thr389磷酸化具有嚴格的調控作用,這說明還存在有其他調節位點在S/T-P缺失的情況下控制Thr389磷酸化。因為AGC家族成員中多數含有與Thr389同源的位點,且在此位點周圍有一些保守結構域(2),為此人們確定出一個新位點,即Ser371(4).Ser371位點的+1位和-2位上也分別有一脯氨酸和疏水性氨基酸殘基,盡管其不能自身磷酸化,但他卻可潛在性的調節激酶氨基末端,催化區域和自主抑制區間的相互作用(4)。實際研究中發現,將Ser371突變為谷氨酸或者天冬氨酸可封閉掉Thr389磷酸化和激酶活性,卻并不影響Thr229的磷酸化(4),這可能是因為Ser371的突變打破了鉸鏈區對Thr389和Thr229磷酸化水平的正常調節功能。要想使有關p70S6K蛋白激酶活化機制的描述更加精確,Ser371和Ser404位點在級聯模型中的作用更加具體,更多的實驗需要我們作進一步研究。
2.4S6K2磷酸化因為S6K2蛋白在調控區域和磷酸化位點上與S6K1高度同源,有研究估計S6K1的活化機制可能也適用于S6K2。除此之外,由于S6K2還在羧基末端含有一個潛在的核定位信號以及一個脯氨素富集區段,可以通過與SH3結構的結合,介導S6K2蛋白與其他含有SH3結構蛋白間的相互作用。因此,S6K1和S6K2的羧基末端可以使S6K1和S6K2分別結合于不同的分子內區域(3)。
3S6Ks蛋白在腫瘤中的表達
近年來有關S6K與腫瘤相關性的研究認為S6K蛋白激酶具有致癌潛能。研究發現在MCF-7乳腺癌細胞系中,基因編碼的S6K1得到大量擴增且表達增加,并且有近10%預后較差的人類乳腺腫瘤與S6K1相關(5)。因此有的作者認為S6K1可以作為第一個致瘤標記物用以評判原位治療術后的預后情況,以及在腫瘤病人診斷初期用于作為臨床是否進行原位治療的標準之一(5)。此外還有報道稱S6K1蛋白在乳腺腺瘤和腺癌,甲狀腺癌(6)以及子宮內膜癌(7)中均有過表達,在原發性人白血病和骨髓瘤中被結構性活化(7),在狀甲狀腺組織中也檢測到S6K1磷酸化水平的增加(5),以上研究結果都讓人意識到S6K1的表達與細胞惡性增生以及腫瘤的發生有著一定的聯系。此外盡管S6K2很少被認為具有致瘤潛能,但有關報道也發現其在小細胞肺癌細胞系(8),乳腺癌及乳腺癌細胞系中過表達(5),其在上皮腺腫瘤細胞核中的聚集強于正常組織。
4展望
隨著人們對S6Ks激酶活化機制諸多細節的研究以及其在各種病理狀態下表達水平的改變,增加了我們對于調控S6Ks激酶功能的上游元件以及激酶在細胞生長中的具體作用機制的了解。這些研究確定了PI3K和mTOR通路為活化S6Ks激酶的兩條主要通路,mTOR作為活化通路上的重要調控元件,參與了多種信號誘導的級聯反應。此外免疫抑制劑rapamycin及其類似物針對mTOR功能的抑制所表現出來的抗腫瘤特性,已受到人們的廣泛關注,盡管他們在一期臨床實驗中所表現的抗腫瘤活性并不十分普遍,但畢竟腫瘤是一個多因素多途徑涉及的病理異常產物,對于它的研究及治療亦需兼顧到多因素的協同作用。因此我們堅信,隨著人們對于S6Ks如何控制蛋白翻譯和細胞生長等具體功能機制研究的逐步完善,勢必為我們在攻克腫瘤疾病這一艱難旅途上提供更為有效的藥物治療依據。
參考文獻
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篇3
鼻咽癌是我國常見惡性腫瘤之一，極易發生侵襲轉移，遠處轉移是其治療失敗的主要原因。目前認為，癌基因異常激活和抑癌基因監控失活在鼻咽癌侵襲轉移等惡性生物學行為中起著重要作用，闡明上述機制，是控制鼻咽癌的關鍵。蛋白酶活化受體家族pars（protease－activated receptors）是介導血栓形成的一種g蛋白耦聯受體，pars家族有4 種亞型,par1是其中研究最為深入的一種。par1表達于人多種正常細胞，在調節血栓形成、細胞粘附和遷移、整合素的銜接、有絲分裂、介導過敏等多種病理生理過程中發揮作用。新近研究發現par1在多種惡性腫瘤（如肺癌、乳腺癌、前列腺癌等）中也高表達par1，而且這種表達與腫瘤侵襲轉移等生物學行為密切相關。par1在人鼻咽癌這一高度惡性高侵襲性的腫瘤中的表達未見文獻報道。本實驗首次對人鼻咽癌組織及細胞系中的par1表達進行研究,并探討par1的表達在人鼻咽癌中的意義。
1 資料及方法
1.1 標本及臨床病理資料
收集武漢協和醫院耳鼻喉科門診2006年12月～2007年9月期間的鼻咽部活檢標本共89例，均為初治患者，所有標本均經光鏡he染色后病理學診斷：其中鼻咽良性病變28例，鼻咽癌61例。腫瘤生長模式按照顯微鏡下npc 癌細胞生長方式分為三型[1]即: 癌細胞巢狀膨脹性生長為主的regaud型,癌細胞彌漫性浸潤性生長為主的schminke型,癌細胞既膨脹性又浸潤性生長的combination混合型。
1.2 藥物和試劑
細胞培養試劑購自gibco公司，trizol (invitrogen公司)，逆轉錄試劑盒(k1621)由武漢晶美公司購自fermentas公司。par1鼠抗人單克隆抗體(購自santa cruz biotechology,sc?13503)。sp kit、hrp標記羊抗鼠igg購自、dab顯色劑均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。蛋白裂解液購自pierce公司。
1.3 細胞培養
人鼻咽高分化鱗癌細胞株cne?1、低分化鱗癌細胞株cne?2由華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院中心實驗室饋贈。細胞培養選用含有10％新生牛血清的rpmi1640培養液，置于37℃、5％ co2培養箱中培養。待細胞長滿培養瓶底部70％～80％時，用含0.02% edta的胰蛋白酶消化傳代，取對數生長期用于實驗。
1.4 rt?pcr檢測鼻咽癌細胞株中的par1mrna的表達
用trizol從細胞中提取總rna并逆轉錄成cdna。設計引物序列(上海生工)，見表1。pcr儀進行相應基因擴增。反應體系為：2.5μl的10×pcr緩沖液(含mg2＋)，2μl cdna，1μl dntps(2.5mmol／l)，上下游引物各0.5μl (10pmol/l)，taq聚合酶0.5μl (5u/l )，用滅菌ddho，補足至25μl。pcr循環參數為：94℃,5min，1個循環；94℃ 50s，59.8℃(par1)／56℃(β?actin) 50s，72℃ 50s，35個循環；72℃ 10min終止反應。pcr產物經瓊脂糖凝膠電泳,eb染色,紫外燈觀察并照相。 表1 par1和內參β?actin基因引物序列
基因引物序列擴增長度par1上游：gtgctgtttgtgtctgtgct598bp下游：cctctgtggtggaagtgtgaβ?actin上游： ggcggcaacaccatgtaccct202bp下游： aggggccggactcgtcatact
1.5 western blot檢測
檢測細胞株中par1蛋白表達，并比較兩種細胞株中的表達差異：取對數生長期的cne?1、cne?2細胞各1×107/ml（約50ml培養瓶），蛋白提取: 用預冷的pbs 洗細胞3 次, 加入細胞裂解液400μl(900μl mem?per加入100μl pmsf）裂解細胞，冰盒上刮下細胞,4℃、10000r/min離心10min,收集上清,－20℃保存，bradford比色法測定蛋白濃度定量，調蛋白濃度一致后，行sds?page電泳，轉移至硝酸纖維素膜上，用5％脫脂奶粉37℃封閉1h，與鼠抗人par1一抗（1∶200稀釋）4℃孵育過夜，用tbst洗滌3次，每次15min,后加入hrp標記羊抗鼠igg（1∶5000稀釋），37℃孵育1h后，用ecl發光試劑，暗室中曝光壓片，檢測蛋白質表達，膠片掃描保存。
1.6 免疫組織化學（sp法）檢測
檢測鼻咽癌標本及鼻咽良性標本中par1的蛋白表達并行亞細胞定位。標本處理：收集新鮮鼻咽部活檢標本用0.9％生理鹽水沖洗后立即置于100ml/l 甲醛固定24h，常規石蠟包埋，切片厚4μm，he染色進行組織學分類。免疫組化sp法,具體步驟參照試劑盒說明書?？瞻讓φ找詐bs取代一抗，陽性對照為已知陽性片。陽性判斷標準：陽性染色呈棕黃色顆粒狀，陰性對照無著色。對每例鼻咽部活檢標本的par1表達情況與患者臨床資料進行分析。
1.7 統計學方法
采用spss10.0軟件進行分析，相關性分析采用χ2檢驗,定量分析采用均數±標準差(±s)表示，行t檢驗。
2 結果
2.1 兩種鼻咽癌細胞株中par1的mrna和蛋白的表達情況及其差異
rt?pcr檢測到兩種細胞株中均存在par1mrna的表達, 兩種鼻咽癌細胞株中的表達存在明顯差異，其中低分化鱗癌細胞株cne?2中為高表達，高分化鱗癌細胞株cne?1為中等表達，見圖1。western blot檢測到兩種鼻咽癌細胞株中存在par1蛋白表達，par1在cne?2中的表達明顯高于par1在cne?1中的表達，見圖2。
2.2 免疫組化結果
免疫組化示，par1主要表達于細胞膜，28例良性鼻咽組織表達為10（+），61鼻咽癌組織中48（+），鼻咽癌組織中par1表達率明顯高于良性鼻咽組織（χ2＝15.219， p<0.01）。癌細胞膜上可見陽性染色的棕黃色顆粒（圖略）。
2.3 par1的表達與鼻咽癌患者臨床參數的關系
研究顯示，par1在鼻咽癌中的表達與癌細胞
圖1 rt?pcr顯示兩種細胞株中par1的表達
圖示兩種鼻咽癌細胞株中存在par1蛋白表達，t檢驗得出par1在cne?2細胞株中的表達明顯高于par1在cne?1細胞株中的表達（條帶灰值：cne?1：0.34356686±0.149120837, cne?2：0.89469757±0.100732874, p＝0.188）
圖2 western blot顯示兩種細胞株
中par1的蛋白表達及其差異
的生長方式、局部淋巴結有無轉移、tnm分期早晚相關（p<0.05），見表2。schmincke型方式生長的鼻咽癌患者中par1的表達明顯高于regaud型,有局部淋巴結轉移的患者,par1的表達高于無局部淋巴結轉移患者，par1的表達率與原發腫瘤范圍即t分期（但隨t分期的提高表達率增加）無明顯相關，但與tnm分期密切相關，分期越晚，par1的表達率越高。此外，男性患者中par1表達率稍高于女性患者，隨著年齡的增高，par1的表達率也增高，但差異無統計學意義（p>0.05）。
3 討論
惡性腫瘤侵襲轉移是其危害患者生命的主要原因，阻斷惡性腫瘤的侵襲轉移在惡性腫瘤的治療中尤為關鍵。最新研究提示,par1在多種惡性腫瘤中高表達[2]。高表達的par1介導某些腫瘤的惡性生物學行為，主要是表現在許多腫瘤中與腫瘤的侵襲轉移相關。在良性乳腺上皮及非侵襲性細胞株中par1的表達最低或無表達,而在侵襲性乳腺癌mda?mb?21細胞株中則表達高水平的功能性par1[2]。martin等[3]得出par1的表達水平與促進前列腺癌細胞的骨轉移相關。
目前認為，par1主要是作為某些介導惡性腫瘤侵襲轉移的物質的受體而作用，主要是與凝血酶[4]、基質金屬蛋白酶家族（mmps）[5]、整合素家族[6]、血管生存[7，8]等相關。此外，研究發現par1還可能參與某些信號通路而與腫瘤形成[9]、分化[10]、凋亡逃避[11]、耐藥[12]等也有關。
表2 par1的表達與鼻咽癌患者臨床參數的關系par1在惡性腫瘤侵襲轉移等復雜生物學行為中的具體作用及調控機制遠未被闡明，par1在許多腫瘤中的作用具有明顯的特征性。不同類型腫瘤在腫瘤進展的不同期別，par1發揮的作用，值得深入研究。
par1在鼻咽癌組織及細胞系中表達尚無文獻報道,筆者首次采用免疫組織化學、western blot和rt?pcr方法檢測par1在鼻咽癌組織及細胞系中par1的表達。結果顯示,鼻咽癌組織中par1的表達水平明顯高于鼻咽部良性病變。61例鼻咽癌標本中，不同性別鼻咽癌患者的par1的表達無明顯差異,年齡高低與par1的表達亦無明顯相關。schmincke型方式生長的鼻咽癌患者中par1的表達明顯高于regaud型，par1的表達和局部淋巴結轉移相關,這說明par1的表達可能增強癌細胞侵襲，影響了癌細胞間的粘附性，使癌細胞容易相互分離并向間質移動，導致向周圍鄰近組織侵襲。此外，par1的表達率與原發腫瘤范圍無明顯相關，可能有待增加病例數證實,但與tnm分期密切相關，分期越晚，par1的表達率越高。低分化鱗癌細胞株cne?2中par1表達水平顯著高于高分化鱗癌細胞株cne?1，病理組織學認為，分化程度越低的腫瘤細胞惡性程度越高，侵襲性越強，提示par1在鼻咽癌中的表達水平可能與鼻咽癌細胞惡性程度及侵襲力相關，這與par1在其他惡性腫瘤中的研究一致。
綜上，初步研究得出par1在鼻咽癌中的高表達與腫瘤的侵襲轉移等惡性生物學行為相關。本研究尚待擴大標本數,進一步完善臨床病理資料（如病理類型、治療反應、預后）和結合細胞學功能實驗,探討par1的表達及其改變與鼻咽癌成瘤襲轉移等生物學行為的關系，為今后研究鼻咽癌的發生侵襲轉移等機制并進行干預打下基礎。
(致謝：感謝武漢協和醫院耳鼻喉科胡運梅護師，鐘剛、陳沛、陳建軍醫師等在收集鼻咽部標本中給予的幫助。)
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篇4
到底這家管理了840家百貨店及13家奧萊商場的美國百貨零售巨頭是如何做到的？我們又能從中得到什么啟示，走出困境？
SoLoMoMe：零售業進入“價格透明新紀元”
市場研究機構InsightExpress的數據顯示，2011年當人們在實體店購物時，有59%的智能手機用戶會利用移動終端尋找更優惠的價格，這一比例比2010年增長了40%。數字營銷機構ComScore的調查顯示，在進入實體零售店的購物者中，有近6成會選擇隨后在網上購物。
零售巨頭沃爾瑪CEO Mike Duke稱，SoLoMo正將零售業帶入“價格透明新紀元”，零售商正處于SoLoMoMe(social社交+local本地化+mobile移動+personalized個性化)經濟時端的起點。
為了應對這一挑戰，百貨業必須脫胎換骨，全渠道(Omni-channel)零售已經成為必然選擇。歐美百貨業已經完成了從單一渠道(singlechannel)向多渠道(multi-channel)的進化，目前正向全渠道零售階段過渡。
全渠道零售，是指以消費者為中心，利用所有的銷售渠道，將消費者在各種不同渠道的購物體驗無縫鏈接，同時將消費過程的愉悅性最大化。因此顧客可以同時利用一切的渠道，如實體店、目錄、呼叫中心、互聯網以及手機等，隨時隨地購物。
大數據：消費者服務的縱深挖掘與探索
梅西百貨在對顧客的購買行為進行分析后發現，大部分顧客并不是只在網上或者只在實體店購物，他們會根據自己的需要選擇購買渠道。因此，重要的是讓顧客知道，梅西百貨能夠滿足他們的購物需要，無論是在梅西實體店里、在梅西網站、在梅西移動應用上還是在其他梅西品牌的渠道，關鍵是讓消費者選擇梅西品牌。
全渠道：關鍵是讓消費者選擇梅西品牌
梅西百貨的多渠道策略有個非常明確的主題--“讓購物體驗簡單而周到”。這些改變能夠為顧客提供更快速、更高效和更輕松的購物體驗，考慮到顧客在網購時的習慣(購買前喜歡在網上了解商品，并到實體店內感受商品)，梅西百貨還增加了許多新的設施，盡力讓顧客的購物體驗完美而周到。這種雙管齊下的策略，讓顧客獲得所有必要的產品信息的同時，不會犧牲便利性。
這充分體現了梅西百貨對于多渠道的看法：購物，不論是使用哪種渠道，都應當從實體店和在線體驗中吸取最好的精華。正如其CEO倫德格倫所說：“我們‘泛策略’的最終目標是與客戶建立更深的關系，確保顧客無論想何時、以何種方式來梅西百貨和布魯明戴爾百貨店購物，都能夠如愿以償?！?/p>
泛渠道策略：讓購物體驗簡單而周到
在電子商務的初創期，各企業都努力在網上營造出實體店的顧客體驗。當網上商城紅火了以后，各大零售商們從網上購物的體驗中吸取精華后移植到實體店里。而梅西百貨的做法是將這兩種理念結合，互取所長，以期為顧客打造出貫穿多種購物渠道的、始終如一的和無縫的購物體驗，從而留住顧客，贏得競爭。梅西百貨將其稱之為“泛渠道(Omni-Channel)策略”。
在這一策略之下，梅西百貨和布魯明戴爾百貨店開展了一系列試點項目，推出多項互動性的自助服務技術，以加速購物結算流程和“移植網上購物體驗”。同時，梅西百貨也努力在其網上商城加進典型的“實體店特性”，比如在網上如試穿一樣精準地選擇牛仔褲。具體而言，梅西百貨實行的十二項O2O全渠道戰略包括：
Apple Pay蘋果支付：
2014年9月，梅西百貨成為首批支持Apple Pay ?移動支付系統零售商，由于其指紋方案和近場通訊技術NFC芯片技術，業界紛紛看好，認為其離線化、易識別等特性使其更安全；當日送達：
梅西百貨自今年秋季將開始試點，與眾包當日送達服務供應商Deliv合作，在全美先期選擇在幾個梅西銷售規模大的城市試點如芝加哥、洛杉磯等，對PC和手機端線上購物用戶承諾當日購買，當日到店取貨。
線上購買線下取貨(BOPS)：
從2013年開始試點，現已實現梅西百貨全網店通用。
線下店鋪銷售端的技術創新：
梅西在幾家店內試點各種與銷售相關的技術創新，如能幫助店員更有效地為消費者展示貨品搭配和商品信息，并加快交易的新一代加強版的手持終端和平板電腦;在幾家店試點設立梅西聯絡中心(Connect@Macy’s Centers)便于線上購物消費者取貨;增加店員數量為消費者提供風格搭配建議和產品推薦;有些試點店鋪內，消費者還可以在電子服務站和大型互動屏幕顯示，通過手機購買產品；
加強購物APP應用：
梅西了iOS和安卓版的購物APP，并在不斷改進和添加幫助人們購物體驗的功能；
梅西圖像搜索：
梅西網站在舊金山的創新實驗室開發出此項新技術概念，并迅速研發應用，消費者可以拍攝并上傳任何一件日常生活中見到的產品，系統會為消費者找到梅西網站對應或相似產品，就像在“聽到”歌曲之后立即辨別出歌曲和藝術家的一樣。
這個軟件模擬人類視覺皮質分析圖像的過程，將產品的顏色、質地、樣式和形狀作為參考。比如，可以照一張花或者有花的襯衣，應用就會搜索“庫存里我們符合這兩項的商品”，列出可供選擇的帶有相似圖案的襯衣和裙子?！八赡軟]法找到一模一樣的衣服，但會是類似的。”
這個功能也可用來在高檔商店拍攝昂貴的服飾，然后尋找同款的平價商品。這個應用目前已上傳并“吸納”了84個品種1000多件物品，并且會每天更新庫存。
梅西官網的總裁Kent Anderson表示：“當我們的消費者在他們的朋友和名人身上看到喜歡的打扮時，他們可以在macys.com上直接訂購相關產品，不用花費太多力氣去搜索就能買到想要的?！?/p>
梅西手機錢包：
該功能使消費者輕松存儲和了解優惠及打折券信息，并為梅西的忠誠會員提供無縫全渠道的使用體驗，線上線下店內外都可使用。
RFID應用和擴展：
梅西百貨是首批全美范圍使用該技術的零售商，自2011年至今已初見成效。RFID (射頻技術或電子標簽技術)提高了其庫存盤點準確度，特別是幫助公司清楚了解哪些貨品和尺寸在庫可銷售，方便及時補貨。最近通過RFID技術在時尚品類的試點應用，得益于精準的實時庫存盤點，梅西的正裝裙，男士運動外套和休閑褲賣得更好。2015年將完成時尚品類的RFID應用；
Shopkick逛街應用：
通過與全球應用范圍最廣的購物應用shopkick合作，梅西在所有門店都將推廣使用這個基于iBeacon?技術的位置服務應用，也將是迄今為止該技術在零售商店最大規模的一次使用，梅西各門店屆時將安裝4千臺設備，每家門店可定制推送折扣、推薦等促銷信息。設備安裝將于今年秋天完成并啟用；
智能試衣間：
試衣間配有壁掛平板電腦供店員和消費者掃描查詢產品顏色尺寸和產品推薦等搭配信息，還可不必出門，通過一鍵呼叫店員幫助；
梅西數字出版：
梅西在推出了秋季時尚購物目錄后，梅西網站將推出數字版，充分利用屏幕如360度圖片介紹，看時尚視頻，線上個人風格混搭等；
梅西桌面搭配：
篇5
泛素結合酶 E2 家族中的 UbcH10，又稱周期蛋白選擇性泛素載體蛋白 E2-C，是腫瘤相關的泛素結合酶，在多種惡性腫瘤中過度表達，自然成為抗腫瘤靶標之一。Wagner等報道，抑制 UbcH10 的過表達和基因擴增是腫瘤的潛在治療方法。研究者采用siRNA 選擇性沉默 UbcH10 轉錄導致 UbcH10 表達減少，結果顯示能明顯抑制腫瘤細胞但正常細胞增殖卻不受影響。當結合 DR5/TRAIL 受體拮抗劑時，針對 UbcH10 轉錄的siRNA 增強了對腫瘤細胞的殺傷力，而不殺傷增殖中的原代人上皮細胞或成纖維細胞。Berlingieri 等發現通過 RNA 干擾封閉 UbcH10 的蛋白質合成能抑制卵巢癌細胞的生長。研究還發現，在大腸癌組織中 UbcH10 的表達明顯高于非癌組織，而且它還與腫瘤分化程度和淋巴結轉移相關。在體外實驗中，UbcH10 能促進細胞增殖和腫瘤的侵襲，但通過 RNA 干擾封閉 UbcH10 的蛋白質合成能明顯抑制細胞的增殖和降低腫瘤細胞的侵襲轉移力。UbcH10 可能是一個新的腫瘤標志物，為大腸癌的治療提供了一個新方案，在大腸癌的診斷和預后判定上也有非常重要價值。針對 UbcH10 的干擾和抑制可能成為一種新型的臨床分子靶點抗癌藥物。
E3 與腫瘤的相關性很大程度上是因為它們能導致癌基因或腫瘤抑制物降解。目前研究得比較清楚的是環狀 E3 連接酶 HDM2(human double minute2)，HDM2 蛋白是腫瘤抑制蛋白 p53 蛋白的負調節蛋白，它同時也是能調控細胞周期的多亞基 SCF 連接酶的負40調節蛋白。針對 E3 的活性位點、或針對它們與底物間的特異性相互作用來開發出副作用小的高選擇性藥物，HDM2 蛋白自然成了首選藥物靶標。如果使 HDM2 失活，就能夠激活 p53 通路，導致細胞周期停滯、細胞凋亡。另一個藥物靶標是 SKP2 蛋白，它是SCF 連接酶復合體中的底物特異性亞基，如果在細胞周期抑制蛋白 p27 表達水平較低的腫瘤細胞中的 SKP2 蛋白失活，可能也會起到一定的抑癌效果。但在一些腫瘤中，反而應該提高 E3 的活性，可這要比抑制它們的活性困難得多。如在高表達 c-Myc 或 cyclin E蛋白的腫瘤患者體內使用 Fbxw7 激動劑，就會促進上述這些癌基因產物降解;而促進VHL 連接酶的活性也能夠使 HIF1α 失穩，抑制腫瘤血管的形成。近 10 年來，一直在尋求 E3 連接酶的抑制劑或激動劑，也開發出了能特異性抑制 HDM2 蛋白 E3 連接酶活性的小分子抑制劑，不過還沒有一種藥物在臨床上表現出抗癌效果。用 HLI98 抑制劑來治療腫瘤的作用機理就是激活了 p53 信號通路，誘導細胞發生凋亡。但這些藥物的生物效價差，同時還有與 p53 無關的脫靶效應，其中最成功的是 Nutlins，該藥物能針對 HDM2蛋白的溝槽(groove)結構，而該溝槽結構正是 HDM2 蛋白與 p53 蛋白相結合的部位。
但 Nutlins 藥物只針對表達野生型 p53 蛋白的腫瘤細胞起作用，而對表達突變型 p53 蛋白或不表達 p53 蛋白的腫瘤細胞則無效。
還有一條開發泛素連接酶抑制劑的策略，那就是找到一種能與連接酶底物蛋白相結合的物質，從而阻止其被泛素化。以 p53 蛋白為例，發現一種名為 RITA 的小分子化合物能夠與 p53 蛋白的 N 末端相結合，使得細胞生長停滯。不過 RITA 并不是通過特異性抑制 p53 蛋白與 HMD2 蛋白間的相互作用來起作用的，它還能影響好幾個能與 p53 蛋白相結合的其它蛋白，而這些蛋白都能通過不同于泛素修飾途徑的方法來抑制 p53 蛋白。去泛素化酶是致癌或抑癌 E3 連接酶的直接抑制物，也可作為抗癌治療的靶標。其中最有望取得成功的是核去泛素化酶(nuclear DUB)，包括 USP1、USP28 和 USP44，它們都與癌癥的發生和發展有關。USP1 蛋白通過抑制范康尼貧血互補基團 D2 蛋白(FANCD2)和 PCNA 蛋白的單泛素化作用調控 DNA 修復檢查點。USP28 蛋白在結腸癌、乳腺癌患者體內都過量表達，它通過抑制 SCF–Fbxw7 連接酶的泛素化活性來穩定cyclin E1 蛋白和 c-Myc 蛋白。而 USP44 蛋白則能夠通過去除 Cdc20 蛋白的泛素化修飾作用來對抗細胞分裂后期促進蛋白 APC/C 的活性，防止紡錘體檢查點過早失效。
其它與腫瘤相關的去泛素化酶還能調控 NF-κB 信號通路。泛素連接酶以及去泛素化酶都參與了 NF-κB 的調控，它們可能同處于一個復合體中，甚至共同位于一條多肽鏈上。正因為如此，它們才能更有效地對 NF-κB 信號通路進行動態調控。這種泛素連接酶與去泛素化酶之間 “親密關系”最為經典的范例非 A20 蛋白莫屬。A20 蛋白的 OUT 結構域具有去泛素化酶活性，而 A20 蛋白的鋅指結構具有 E3 連接酶的活性。A20 蛋白能催化 RIP蛋白和 NEMO 蛋白等底物蛋白上第 63 位賴氨酸位點去泛素化，也能促進靶蛋白的第 48位賴氨酸位點與泛素蛋白連接，繼而靶蛋白被蛋白酶體降解。
另一種名為 CYLD 的去泛素化酶也能調控 NF-κB 信號通路。CYLD 蛋白見于一種皮膚腫瘤—圓柱瘤病的患者體內，由一種抑癌基因的突變體所編碼。CYLD 蛋白在其 C末端含有一個泛素蛋白水解酶結構域，該結構域能將連接在靶蛋白第 63 位賴氨酸殘基上的多聚泛素蛋白修飾物水解掉，這些靶蛋白中有許多都參與了細胞因子誘導的 NF-κB信號通路調控。在人體皮膚癌以及腎臟腫瘤、肝臟腫瘤以及宮頸腫瘤等患者體內都發現CYLD 蛋白的表達量下降，甚至被抑制，這說明 CYLD 蛋白具有普遍的抑癌作用。對敲除了 CYLD 基因的小鼠進行研究發現，BCL3 蛋白是 CYLD 蛋白的重要底物，BCL3 蛋白對于圓柱瘤病相關腫瘤的發生發展具有極其重要的作用。BCL3 蛋白是一種轉錄輔助激活因子，它在胞質中處于失活狀態，經多泛素蛋白修飾后活化進入核內，隨后與NF-κB1 蛋白或 NF-κB2 蛋白一起啟動轉錄復合體，促進有助細胞增殖的靶基因表達。
對去泛素化酶進行更深入研究，將有助于開發出去泛素化酶抑制劑并將其作為抗癌藥物。已證實，針對泛素蛋白 C 末端水解酶(UCH-L1)的小分子抑制劑具有治療肺癌的作用。雖然這一成功案例證明，去泛素化酶抑制劑具有美好的前景，但是要將它真正應用到臨床，還有很多問題需要克服。
2. 針對腫瘤細胞的蛋白酶體
蛋白酶體抑制劑通過抑制蛋白酶體的活性，阻斷其對細胞蛋白的降解，以此來抑制腫瘤細胞生長，促進腫瘤細胞凋亡。蛋白酶體抑制劑在體外可誘導多種腫瘤細胞的凋亡，為人類開發新的抗腫瘤藥物提供了新的思路。蛋白酶體抑制劑對腫瘤細胞和正常細胞引起的反應是不相同的，它作用于正常細胞常常會造成細胞周期阻滯，而在快速增殖的腫瘤細胞則更容易誘發凋亡。
硼替佐米的成功帶動了一大批蛋白酶體抑制劑的研發，比如 PR-171(carfilzomib)、NPI-0052 和 CEP-18770 等。目前各種蛋白酶體抑制劑作用機制以及作用靶點各不相同，比如有針對 20S 蛋白酶體糜蛋白酶活性位點的、針對 20S 蛋白酶體胰蛋白酶活性位點的以及針對 20S 蛋白酶體半胱天冬酶活性位點等。作用機制也分為可逆性的抑制與不可逆性的結合或共價修飾等。我們需要開發針對更多種底物、生物利用度更高、毒性更低的蛋白酶體抑制劑。argyrinA 就是這樣一種新型的蛋白酶體抑制劑，它是在篩選能穩定細胞周期抑制蛋白 p27Kip1的復合物時發現的，因此其抗癌活性必須依賴 p27Kip1蛋白的正常表達，如果缺乏 p27Kip1蛋白，那么 argyrinA 也就不能起到抗癌作用。
癌霉素(Gankyrin)是一個近年發現的癌蛋白，是 19S 顆粒的組分之一，可以與細胞周期蛋白依賴性激酶 CDK4 緊密結合。19S 顆粒的 Rpt3 亞基可特異地、不穩定地結合Gankyrin，形成一個 19S 調控復合體，加速體內 pRB 的磷酸化，增強 pRB 通過蛋白酶體降解;還與 p53 的一個主要 E3 酶 MDM2 結合，提高 MDM2 的活性，利于 p53 的多聚泛素化并被 26S 蛋白酶體降解。癌霉素的過表達使 pRB 和 p53 通過泛素-蛋白酶體通路的降解增強，表達下降。
在肝癌等一些類型的腫瘤細胞發現中 Gankyrin 過表達，它能夠拮抗致 DNA 損傷物質所誘發的細胞凋亡。Gankyrin 水平的下調能夠誘導野生型 p53 基因的腫瘤細胞凋亡。在腫瘤生物學中，抑癌基因 Rb 與 p53 發揮核心作用，這兩條通路失活是形成腫瘤的重要條件。所以說，作為 Rb 和 p53 共同的負調節物，Gankyrin 很有可能會成為腫瘤治療的靶點。
參考文獻：
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篇6
本病由于骨髓中惡性漿細胞無節制地增生、廣泛浸潤和大量單一的免疫球蛋白的出現及沉積，使正常的免疫球蛋白分泌受到抑制，從而引起廣泛骨質破壞、高鈣血癥、反復感染、貧血、高黏滯綜合征、腎功能不全等一系列臨床表現并導致嚴重不良后果。根據多發性骨髓瘤研究基金會的數據統計，僅2004年一年我國就有1.1萬人死于這種疾病。
由于受醫學發展水平的制約，傳統方法治療多發性骨髓瘤的效果不佳，臨床緩解率不高。國內部分統計數據顯示，傳統化療方案M2、MP、VAD的有效率分別為55.6%、50%和66.7%，化療總緩解率約為60%，平均生存時間僅為30~36個月。盡管大劑量化療后自體干細胞移植等新方法使緩解率和生存期有所改善，但該病仍無法治愈，最終會出現耐藥及復發。近10年來，治療緩解率或緩解期及總生存率沒有明顯提高，患者急切需要新的治療方法。
正當廣大患者飽受病魔煎熬、臨床醫學工作者束手無策之際，硼替左米問世了。硼替左米是目前全球唯一批準用于臨床治療的蛋白酶體抑制劑，它的應用將為多發性骨髓瘤的治療帶來希望。人體細胞內的蛋白酶體可調節正常細胞的生長，但當蛋白酶體超出它的正常生理作用時，就會減弱對癌細胞的抑制，減少癌細胞的凋亡，引發各種腫瘤。硼替左米這種誕生前就與2004年諾貝爾化學獎緊密聯系的藥物，開啟了腫瘤細胞通向凋亡的大門?？茖W家通過硼替左米來抑制蛋白酶體，達到抑制腫瘤生長，促使腫瘤細胞凋亡，促進正常細胞生長，恢復正常細胞的平穩狀態的目的。
自從2003年5月在全球市場上市以來，硼替左米已廣泛應用于臨床，顯著提高了多發性骨髓瘤患者的生存期，與接受地塞米松治療的患者相比，患者的病死率減少了55%。此外，硼替左米對于復發性與難治性多發性骨髓瘤的治療效果也令人折服，緩解率約為30%。也就是說，對一般化療方案無效或曾經有效治療一段時間后無效的患者，仍有30% 對硼替左米敏感。目前，該藥已被視為治療復發性與頑固性多發性骨髓瘤的突破性療法，可以減緩甚至逆轉患者病情惡化。該藥被PrixGalien獎的評審小組稱贊為“高度創新、也是多發性骨髓瘤治療上令人振奮的獨特藥物”。
如今，越來越多的多發性骨髓瘤患者看到了希望，該病的治療已不再是難題，更多患者的緩解和延長生存期將不再是幻想。
篇7
【摘要】 目的 構建含衣原體蛋白酶樣活性因子(CPAF)的原核表達載體，經轉化E.coli以表達CPAF融合蛋白，研究其生物學功能。方法 從病料中克隆得到CPAF的原始基因，將PCR產物經純化連接到pMD18T，將重組質粒pMDCPAF經NdeI和BamHI雙酶切，與用相同酶消化的原核表達載體pET42b(+)連接，建立pET42b(+)CPAF表達載體，陽性克隆經鑒定后，轉化大腸桿菌BL21(DE3)進行表達，經親和純化、離子交換純化、分子篩純化融合蛋白，進行SDSPAGE分析，Western印跡檢測。結果 經酶切鑒定和測序分析證實原核表達質粒構建正確。SDSPAGE和Western印跡結果顯示在70 kD處呈現單一蛋白條帶，pET42b(+)CPAF重組載體在大腸桿菌BL21(DE3)中成功地表達了CPAF天然蛋白，目的蛋白占全菌體蛋白的20%左右，采用鎳柱的親和純化后，可達70%左右。結論 經DNA測序、SDSPAGE、Western印跡檢測表明成功構建了能夠穩定表達可溶性CPAF的菌株，并獲得純化CPAF的方法，為今后CPAF的研究及應用奠定了基礎。
【關鍵詞】 衣原體蛋白酶樣活性因子(CPAF);表達;純化;生物學功能
衣原體泌尿生殖道感染是艾滋病病毒(HIV)感染的重要危險因素，也是人狀瘤病毒(HPV)致宮頸癌的協同因子。衣原體具有廣泛的宿主，盡管不同種屬衣原體的宿主不盡相同，然而他們卻擁有極其相似的基因組序列和高度保守的細胞內生活周期。衣原體要確保完成其胞內繁殖，就必須保證受浸染細胞不被機體免疫細胞識別，從而逃逸宿主的免疫防御。衣原體擁有多種策略來逃逸宿主的免疫防御，衣原體蛋白酶樣活性因子(chlamydial protease activity factor，CPAF)就是重要的一種因子，其作用的機制是通過降解形成肌球蛋白重鏈(MHC)所必須的轉錄因子，例如：調節因子X5(RFX5)和上游刺激因子1(USF1)，來達到抑制MHC合成的作用〔1〕。人類受到衣原體感染時，CPAF特異性抗體效價明顯高于外膜蛋白(MOMP)和熱休克蛋白60(HSP60)，這說明CPAF具有良好的免疫原性。同時，人體內針對CPAF的抗體具有良好的中和效應，并能夠有效保護機體免受感染，具有抑制衣原體感染的效果〔2〕。種種跡象表明CPAF極有可能成為潛在的衣原體免疫原，運用到將來的疫苗開發中。本研究選擇對CPAF進行全序列基因克隆，并在不同的載體系統中表達CPAF，獲得可溶性蛋白，同時摸索出能夠大量制備高純度蛋白的純化方法，為下一步應用奠定良好的基礎。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 菌株與載體 表達載體pET42b(+)載體及工程菌BL21(DE3)由本研究室保存;pMD18T vector購自大連寶生物公司。
1.1.2 病料 沙眼衣原體分離于病人組織。
1.1.3 主要試劑 工具酶均購自大連寶生物公司，常用試劑及質粒提取試劑盒購自Sigma公司;PCR純化及凝膠回收試劑盒購自Qiagen公司;胰蛋白胨、酵母提取物購自Oxiod公司。其他生化試劑均為國產分析純。
1.2 方法
1.2.1 模板的制備 按照細菌基因組提取方法改進提取，在第5步之后將上清加入Sigma試劑盒中的柱子，其后步驟按照Sigma質粒提取試劑盒說明書操作。
1.2.2 PCR引物設計 應用Primer5.0設計引物，由大連寶生物公司合成。CPAF上游引物5′GCCCGGCATATGCTCCTGTACAAGGAG3′(引入NdeI位點)，下游引物5′CTTGGGATCCAAAACTACCATCTT3′(引入BamHI位點)。
1.2.3 目的基因擴增 按如下程序進行PCR循環：95℃預變性5 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 2 min，共循環30次，最后72℃延伸10 min。PCR產物的純化按照Qiagen公司PCR純化試劑盒說明書進行。
1.2.4 基因克隆 將PCR產物經純化連接到pMD18T后轉化工程菌JM109。用PCR、雙酶切篩選陽性克隆，陽性重組子命名為pMDCPAF，送公司測序。
1.2.5 構建表達載體 將pMDCPAF用NdeI和BamHI兩種酶同時消化，得到目的基因CPAF。目的基因純化按照Qiagen凝膠回收純化試劑盒說明書進行。將CPAF與用相同酶消化的原核表達載體pET42b(+)連接，轉化大腸桿菌BL21(DE3)后涂布含有卡那霉素(50 mg/L)的固體培養基，經PCR、酶切進行陽性克隆篩選，將陽性重組子命名為pET42b(+)CPAF。
1.2.6 誘導表達 挑取陽性單克隆，接種于2 ml LB/Kanr液體培養基中，37℃搖床，250 r/min過夜培養。次日以1∶100比例接種至200 ml LB/Kanr液體培養基中，37℃ 250 r/min培養至OD600=0.6～1。加入異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度為1 mmol/L，37℃誘導5 h后，4 000 r/min離心10 min收集菌體，用40 ml TE緩沖液將沉淀重懸，超聲波破碎裂解菌體，離心后收集上清，用于檢測可溶性表達。
1.2.7 SDSPAGE凝膠電泳檢測 常規制備13%分離膠和4.5%濃縮膠電泳，考馬斯亮藍染色后用凝膠掃描影像系統拍照，并用系統軟件分析蛋白含量同時確定目的蛋白分子量。
1.2.8 CPAF的親和純化 將破碎上清液用0.45 μm濾膜過濾后加至經0.02 mol/L Tris緩沖液(pH8.0)平衡好的Ni2+柱，用含有0.015 mol/L咪唑的0.02 mol/L Tris緩沖液(pH8.0)洗去未結合的雜蛋白，然后用含有0.25 mol/L咪唑的0.02 mol/L Tris緩沖液(pH8.0)將CPAF蛋白解離下來。
1.2.9 CPAF的離子交換純化 采用蛋白液相層析純化(AKTA)系統進行純化，陰離子純化柱采用Source Q，溶液A為不含NaCl的0.02 mol/L Tris緩沖液(pH8.0)，溶液B含1 mol/L NaCl的0.02 mol/L Tris緩沖液(pH8.0)。程序如下，將上述經親和純化解離的樣品用A液稀釋5倍后，直接上用A液平衡好的QFF柱，上完樣品之后用1個柱體積的A液預洗滌，之后按照程序將A、B液混合，逐漸提高B液的含量進行梯度洗滌，用自動收集器收集樣品，每管收集0.5 ml。
1.2.10 CPAF的分子篩純化 采用AKTA系統進行純化，分子篩純化柱采用Superdex200，溶液C為含0.15 mol/L NaCl的0.02 mol/L Tris緩沖液(pH8.0)。程序如下，將上述經離子純化的樣品經30 kD孔徑的超濾膜進行超濾濃縮，將濃縮的樣品直接上用C液平衡好的Superdex200柱，樣品上完之后用1個柱體積的C液預洗滌之后開始用自動收集器收集樣品，每管收集0.5 ml。
1.2.11 Western印跡檢測 將初步純化的CPAF蛋白經過SDSPAGE后，轉到硝酸纖維素膜，以鼠抗組氨酸標簽抗體作為一抗，進行常規Western檢測。
2 結 果
2.1 目的基因PCR結果及陽性重組載體pET42b(+)CPAF的構建與鑒定 將pMDCPAF克隆載體用NdeI和BamHI兩種酶同時消化，得到目的基因CPAF。用T4 DNA連接酶將目的基因與用相同酶消化的表達載體pET42b(+)連接(圖1)。設計引物時在目的基因的末端不含終止密碼子，表達蛋白為帶有組氨酸標簽的融合蛋白。見圖1，圖2。
圖1 pET42b(+)CPAF 的構建示意圖圖2 CPAF的PCR擴增產物
2.2 CPAF融合蛋白表達條件的確定 經過摸索確定的最佳誘導表達條件如下：IPTG終濃度為1 mmol/L，培養菌的溫度及誘導溫度均為37℃，最佳誘導時間為5 h(5 h時蛋白濃度達最大，延長時間表達量沒有明顯變化)。取誘導前、全菌體、破碎上清、破碎沉淀進行13%濃度SDSPAGE電泳，考馬斯亮藍染色，誘導后與誘導前相比在13 kD處存在一條明顯的特異帶，說明pET42b(+)CPAF重組載體在大腸桿菌BL21(DE3)中得以成功表達，目的蛋白絕大部分存在于破碎上清中，說明該蛋白為可溶性表達，這為以后研究其佐劑功效奠定了良好的基礎。經Imagemaster VDS Pharmbta Biotech凝膠掃描影像系統分析，目的蛋白占全菌體蛋白的20%左右。
2.3 CPAF的純化
2.3.1 CPAF的親和純化 融合CPAF蛋白帶有6個組氨酸標簽，采用鎳柱的親和純化后，蛋白的純度可達70%左右，這時候蛋白在含有高咪唑的環境中很不穩定，需要立即稀釋并迅速進行離子交換柱的純化。
2.3.2 CPAF的離子交換純化 采用AKTA系統進行純化，陰離子純化柱采用Source Q，CPAF蛋白在pH8.0的Fris緩沖液條件下能夠很好的結合在離子交換樹脂上，易于分離純化，同樣也易于解離下來，見圖3。
圖3 CPAF經Source Q陰離子交換柱純化圖
2.3.3 CPAF的分子篩純化 采用AKTA系統進行純化，分子篩純化柱采用Superdex200，該步驟的目的主要是進一步純化CPAF蛋白，同時改變蛋白的環境，使其處在一個低鹽的環境中，見圖4。
2.4 Western檢測結果 純化產物在目的位置出現單一特異性條帶，未誘導的表達產物未見特異性條帶。見圖5。
圖4 CPAF經Superdex200分子篩純化圖1: pET42b(+)CPAF;2: 單純重組CPAF;3:未誘導的表達產物
圖5 重組蛋白表達產物及純化產物的Western分析
3 討 論
近年來，由衣原體引起的性傳播疾病(STD)在許多國家已超過了淋病和梅毒。根據WHO估計，每年有9 200萬新的泌尿生殖道衣原體感染病例發生，其中美國每年大約有400萬新感染者。我國泌尿生殖道沙眼衣原體感染居STD第三位，并且發病率呈逐年升高趨勢。衣原體具有無癥狀感染特性，感染后可能產生不孕、異位妊娠、盆腔炎等嚴重的后遺癥，甚至還可以協同HPV感染和HIV經性傳播。
衣原體全基因組序列分析發現編碼多形態膜蛋白基因家族的存在。已發現鸚鵡熱嗜衣原體至少有6個基因編碼Pmp90和Pmp98蛋白家族，Cpn有21個基因編碼Pmp1～Pmp21，衣原體有9個基因編碼PmpAPmpH，其中Ct的PmpD(Cpn的Pmp21)引起過人們的廣泛關注〔3〕。衣原體不同型別間的核苷酸差異多發生于4個VD區域，因此檢測編碼VDs的外膜蛋白omp l堿基序列和數目即可達到對衣原體分型的目的。根據其主要外膜蛋白抗原表位差異可將衣原體分為19個血清型，其中A、B/Ba、C型引起地方性沙眼，L1、L2 /L2a、L3型引起性病性淋巴肉芽腫，而D～K型則主要感染泌尿生殖道，是引起尿道炎和宮頸炎的重要原因〔4〕。近年來人們又將目光聚集在CPAF上，人體內針對CPAF的抗體具有良好的中和效應，并能夠有效保護機體免受感染，具有抑制衣原體感染的效果〔5，6〕。這一點給了人們不少啟示，認為CPAF可能成為衣原體潛在的免疫原〔7，8〕。由于衣原體只能在活細胞內生長，通過大規模培養衣原體，并分離、純化天然的CPAF很困難，為研究CPAF的功能和其生物活性，故采用 DNA重組技術克隆和表達重組CPAF。但是CPAF具有跨膜區域，全長的CPAF表達量非常低而且常常形成不可溶的包涵體。本文根據CPAF的二級結構根據不同區域的疏水性篩選CPAF片段，最終發現從第53個氨基酸開始到596個氨基酸結束，這個片段的表達產物為可溶性的。這樣僅僅減少的幾個疏水部分就能導致蛋白的可溶，并提高了產物的表達量。該蛋白的純化具有相當的難度，CPAF在純化過程中很容易沉淀，全程均需要在4℃下進行，該蛋白對鹽離子濃度非常敏感，故在經過陰離子交換柱后，蛋白應盡快過分子篩，主要目的是脫鹽，保持其處在一個低鹽的環境中，有利于保持其穩定性。
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篇8
目的: 從蛇毒中獲得大量高純度的具有激肽原酶活性的蛋白水解酶。方法: 采用離子交換和親和層析技術進行純化。結果: 從江浙蝮蛇毒中提取出了一種高純度的具有激肽原酶活性的蛋白水解酶, 不需活化即可水解激肽原, 釋放激肽, 并具有精氨酸酯酶活性。粗毒經提純, 比活可達800 u/mg以上, 遠遠高于哺乳動物來源的激肽原酶, 純度可達95%以上。對其性質考察, mr為38 000, n-末端的15個氨基酸序列分析表明, 該酶與蛇毒絲氨酸蛋白酶及胰蛋白酶——激肽釋放酶同源。結論: 這種方法適合于工業化生產。 【關鍵詞】 江浙蝮蛇 蛇毒 激肽原酶
自從有人在美洲矛頭蝮蛇(bothrops jararaca)蛇毒中發現激肽原酶后, 蛇毒激肽原酶越來越受到廣大學者的重視［1］。我國蛇類資源豐富, 但受提純工藝的限制, 至今仍未開發出蛇毒激肽原酶的藥物制劑。我們采用離子交換和親和層析技術, 從江浙蝮蛇（agkistrodon halys pallas）蛇毒中提取了高純度的激肽原酶, 并對其性質進行了研究。
1 材料和方法
1.1 材料 江浙蝮蛇蛇毒凍干粉（遼寧省清源縣）, deae-sepharose , 瓊脂糖凝膠（瑞典pharmacia公司）, 苯甲酰精氨酸乙酯（baee）, 對甲苯磺酰精氨酸甲酯（tame）, 標準蛋白, 激肽原, 激肽等底物（sigma公司）, 低壓型高效液相色譜儀（日本島津公司）, 8823b紫外檢測儀（北京賓達英創科技有限公司）, balb/c小鼠（7周齡）由中國藥品生物制品檢定所實驗動物中心提供。Www.133229.Com
1.2 方法
1.2.1 蛇毒激肽原酶的分離純化 （1）deae-sepharose離子交換色譜: 稱取江浙蝮蛇毒15 g, 用0.02 mol/l ph7.8的tris-hcl緩沖液溶解, 以4 000 r/min離心20 min, 取上清, 透析12 h后, 以6.0 ml/min的流速上陰離子交換柱（deae-sepharose）, 上樣完畢后以0.02 mol/l ph7.8的tris-hcl緩沖液洗去未吸附的雜蛋白。（2）親和色譜法: ①免疫抗體親和層析柱的制備: 取少量離子交換色譜活性洗脫液, 用高效液相色譜法純化并經定性得到蛇毒激肽原酶, 取該蛇毒激肽原酶50 μg與等體積完全佐劑混合乳化作為刺激物, 對7周齡的balb/c小鼠皮下注射免疫, 每次0.2 ml, 每周1次, 共免疫6次。在采集血清前3 d取0.2 ml刺激物小鼠尾靜脈注射加強免疫。用抗原親和層析柱純化抗體。用溴化氰活化4b-sepharose瓊脂糖凝膠, 把得到的蛇毒激肽原酶抗體偶聯到多糖基質上, 從而制成免疫親和層析柱。 ②親和色譜法純化蛇毒激肽原酶: 將經離子交換純化的酶用平衡液透析, 上抗體親和層析柱。用親和層析洗脫液（0.02 mol/l tris-hcl緩沖液, ph7.2, 含0.5 mol/l nacl, 70 g/l arg）洗脫。收集洗脫峰, 冷凍干燥保存。（3）純度檢測: 取主峰組分適當稀釋, 用高效液相色譜（hplc）法檢測。色譜條件: tsk-2000sw凝膠柱, 280 nm檢測, 流速1.0 ml/min, 0.5 mol/l磷酸鹽緩沖液（ph7.0）為流動相, 進樣量20 μl。
1.2.2 比活性測定 ① 舒緩激肽原酶活力測定［2］: 取0.2 ml激肽原底物（20 g/l, 0.05 mol/l, ph7.8磷酸緩沖液配制）, 加0.1 ml酶液, 37℃水浴保溫3 min, 立即取0.15 ml測離體豚鼠回腸平滑肌收縮幅度, 用0.1 μg激肽做對照, 以每毫升酶液3 min釋放相當于1 μg激肽定為1活力單位（u）。②精氨酸酯酶活力的測定: 以baee及tame為底物測定［3］。③蛋白含量的測定: 采取凱氏定氮法測定蛋白質含量。
1.2.3 理化性質 ①電泳法相對分子質量（mr）測定: 以兔磷酸化酶b（mr 97 400）、 牛血清白蛋白（mr 66 200）、 兔肌動蛋白（mr 43 000）、 牛碳酸酐酶（mr 31 000）、 胰蛋白酶抑制劑（mr 20 100）、 雞蛋清溶菌酶（mr 14 400）作標準蛋白, 用還原型sds聚丙烯酰胺電泳法測定。②高效液相色譜分析: 色譜條件（tsk-2000凝膠柱, 280 nm檢測, 流速1.0 ml/min, 0.5 mol/l磷酸鹽緩沖液（ph7.0）為流動相）。以牛血清白蛋白第v組份（66 200）、 卵清蛋白（44 300）、 木瓜蛋白酶（mr 21 000）、 溶菌酶（mr 14 300）為標準蛋白, 測定純度及mr。③n-末端氨基酸殘基測定: pvdf膜上樣, abi procise 491型測序儀測定。
1.2.4 酶學性質 ①最適ph: 將baee配于不同ph的0.05 mol/l tris緩沖液中, 測定激肽原酶水解baee的最適ph。②不同ph值下的穩定性: 將激肽原酶分別溶于不同ph值的0.1 mol/l tris緩沖液, 于室溫靜置24 h后, 取樣測定水解baee底物的活性。③不同溫度下的穩定性: 將激肽原酶分別于不同溫度下保溫3 h, 測定水解baee的活性。④edta對激肽原酶活性的影響: 將激肽原酶制成含0.1 mol/l edta的溶液, 測定水解baee活性。⑤不同二價金屬離子對激肽原酶活性的影響: 將激肽原酶制成含ca2+、 zn2+ 、 co2+、 hg2+、 mg2+、 ba2+0.01~0.1 mol/l的溶液, 測定其水解baee的活性, 并用edta絡合后再分別測定其水解baee活性。
2 結果
2.1 蛇毒激肽原酶的分離純化 蝮蛇毒經deae-sepharose陰離子交換層析, 親和層析, 可將雜質蛋白除去, 得到的樣品經hplc檢驗, 純度可達95%以上。
圖1 deae-sepharose離子交換色譜圖（略）
透過峰過后, 梯度洗脫得到5個峰, 經定性檢測3, 4號峰為活性峰.
圖2 蛇毒激肽原酶親和色譜圖（略）
1: 平衡液洗脫透過峰; 2: 為親和洗脫液洗脫所得活性峰.
圖3 激肽原酶純度檢驗圖譜（略）
色譜條件: tsk-2000凝膠柱, 280 nm檢測, 流速 1.0 ml/min, 0.5 mol/l磷酸鹽緩沖液（ph7.0）為流動相, 對峰面積積分, 主峰面積達95%以上.
圖4 激肽原酶sds聚丙烯酰胺電泳圖譜（略）
m: 分子量標準品; s: 蛇毒激肽原酶樣品.
2.2 活性測定 與粗毒相比, 提純高的激肽原酶比活提高了約300倍, 活力回收率可達60%以上, 水解baee的比活可達到800 u/mg以上, 水解tame活性較低, 約是水解baee活性的5%。
2.3 理化性質 經sds聚丙烯酰胺電泳及hplc方法檢測, 江浙蝮蛇毒激肽原酶的mr約為38 000, 與組織型激肽原酶相似。
2.4 江浙蝮蛇毒激肽原酶與其他蛇毒絲氨酸蛋白酶、 哺乳動物胰蛋白酶n末端氨基酸序列［4］比較 蛇毒激肽原酶與其他它絲氨酸蛋白酶具有同源性, 屬絲氨酸蛋白酶的一種, 且與哺乳動物的胰蛋白酶——激肽釋放酶具有同源性。
表1 江浙蝮蛇毒激肽原酶與其他蛇毒絲氨酸蛋白酶、 哺乳動物胰蛋白酶n末端氨基酸序列比較（略）
2.5 酶學性質 ①最適ph: 測定蛇毒激肽原酶水解baee底物活性的最適ph值為7.0~8.0, 這與哺乳動物的組織激肽原酶相同, ph10以上, 底物自發水解無法測定。②不同ph值下的穩定性: 蛇毒激肽原酶在ph4.0~9.0條件下, 活性基本不變, ph低于4.0或高于9.0時, 活性迅速下降, ph大于10.0時, 底物baee發生水解而無法測定。③不同溫度下的穩定性: 在30℃以下時, 激肽原酶的活力基本不變, 超過40℃時, 活力迅速下降, 高于60℃時, 發生蛋白質變性而有沉淀析出。④edta對激肽原酶活性的影響: edta對激肽原酶的活力無影響, 證明蛇毒激肽原酶不是金屬酶。⑤不同二價金屬離子對激肽原酶活性的影響: ca2+、 mg2+、 ba2+對激肽原酶活力無影響, zn2+（0.1 mol/l）、 hg2+（0.01 mol/l）、 co2+（0.1 mol/l）可完全抑制激肽原酶活性, 且用edta絡合不能使其活力恢復, 蛇毒激肽原酶具有一般蛋白酶的性質, 故hg2+可使其活性喪失, 但zn2+ 、 co2+對其活性影響的原因尚不明確, 可能是因為與蛇毒激肽原酶不可逆性結合, 從而改變其構象使其失活。
3 討論
激肽原酶在體內有重要的生理功能［5］, 目前臨床廣泛用于原性高血壓、 心絞痛、 動脈硬化、 視網膜血流障礙、 肢端知覺異常, 閉塞性血栓性血管炎等疾病的治療。但因為以往從哺乳動物的胰腺提取的胰激肽原酶純度不高, 具有一定的抗原性, 進入人體后, 可能誘發過敏抗原抗體反應, 已有報導注射胰激肽原酶導致固定性藥疹［6］及重癥多形紅斑藥疹［7］, 且不能實現靜脈給藥, 使藥物不能最大限度發揮效用。近年的提取工藝雖可得到高純度激肽原酶, 但在提取過程中, 酶活力損失較大, 回收率低, 難以實現工業化生產, 因此尋找高純度且無抗原性的激肽原酶并建立一套適合工業規?；a的工藝方法是目前面臨的新課題。
我們在傳統提取工藝的基礎上, 用離子交換, 親和層析兩步即可制備高純度的蛇毒激肽原酶, 該方法設備簡單, 條件溫和, 產品回收率高, 產量大, 完全符合工業化生產的要求, 填補了蛇毒激肽原酶生產工藝上的一項空白。與哺乳動物來源的激肽原酶相比, 從江浙蝮蛇毒中提取的激肽原酶有如下特點: ①比活高（≥800 u/mg）, mr?。s為38 000）, 等活力單位給藥蛋白含量低, 不易引起過敏反應; ②純度高, 提純后純度可達95%以上。如果用于藥物, 大大提高了藥物的安全性; ③無病毒隱患。不攜帶可能同人類共同感染的病毒。④無酶原形式, 不需活化即可釋放激肽, 可直接發揮作用。該蛇毒激肽原酶最適ph值為7.0~8.0, 且在ph4.0~9.0范圍內, 活力基本保持不變, 有利于在人血漿環境中保持其活性。該酶在30℃以下活力基本不變, 而在凍干狀態下, 37℃放置90 d, 活力下降在5%以內, 經試驗, 在整個凍干制劑生產過程中, 酶活力的損失率均在10%以內, 因此可以生產出相對穩定的制劑產品。n-末端的氨基酸測序結果表明, 蛇毒激肽原酶與其他它絲氨酸蛋白酶同源, 屬絲氨酸蛋白酶的一種, 可能也具備大多數蛇毒絲氨酸蛋白酶的特性具有較長的生理半衰期, 可能成為臨床用藥; 同時, 它與哺乳動物的胰蛋白酶激肽釋放酶具有同源性, 可以部分解釋其與組織激肽原酶的相似性。蛇毒激肽原酶具有一般蛋白酶的性質, 不是金屬酶, 而zn2+、 co2+對酶活性的影響的機制可能與改變其構象有關, 有待進一步證明。
總之, 我們從蛇毒提取的激肽原酶將為藥學領域提供一條新的途徑, 應用于藥物必將帶來臨床新的治療方法。
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篇9
[關鍵詞] D-二聚體；高敏C反應蛋白；抗凝血酶III；腦梗死
中圖分類號：R743.3 文獻標識碼：B 文章編號：2095-5200（2016）03-076-03
DOI：10.11876/mimt201603028
隨著我國人口老齡化，老年群體腦梗死人數有所增加[1]。腦梗死致殘、致死率均較高，判斷梗死程度，及早干預治療是改善患者預后關鍵。有研究發現， D-二聚體（D-dimer，D-D）、超敏C反應蛋白（High sensitivity C reactive protein，hs-CRP）及抗凝血酶Ⅲ（Antithrombin Ⅲ，AT-Ⅲ）是機體炎性反應、反映高凝和纖溶亢進狀態的重要標志物[2]。為進一步探究其臨床價值，本研究對我院2012年9月―2014年9月收治的92例腦梗死患者血漿D-D、hs-CRP、AT-Ⅲ水平進行研究分析。
1 一般資料
1.1 病例資料
選取我院2012年9月―2014年9月收治的92例腦梗死患者納入腦梗死組，患者均首次發病，參照全國腦血管病學術會議（1996）制定的腦梗死臨床診斷標準確診[3]。按照美國衛生研究院卒中評分（NIHSS）分為輕度組（0～15分）65例，中重度組（>15分）27例。同期80例健康體檢者納入正常對照組。2組受試者一般臨床資料比較見表1，年齡、性別比例、體質量指數（BMI）、血糖水平等指標比較均未見明顯統計學差異（P>0.05），腦梗死患者TC、TG、HDL-C水平顯著高于正常組（P
1.2 研究方法
抽取2組受試者清晨空腹肘靜脈血3 mL，于30 min內以3000 r/min離心10 min，保存于-20℃冰箱內，統一檢測D-D、hs-CRP及AT-Ⅲ。D-D檢測使用膠乳凝集法，試劑盒購自美國貝克曼公司。hs-CRP檢測使用免疫散射比濁法，試劑盒購自德國德靈公司。AT-Ⅲ檢測使用發光底物法，試劑盒購自北京科美生物技術有限公司。
1.3 統計學分析
所有數據采用SPSS18.0進行分析，計數資料以（n/%）表示，采用χ2檢驗，計量資料以（x±s）表示，t檢驗。使用Pearson法分析D-D、hs-CRP、AT-Ⅲ與腦梗死患者病情的相關性。以P
2 結果
2.1 腦梗死患者與健康體檢者血漿D-D、hs-CRP及
AT-Ⅲ水平比較
腦梗死組與正常組血漿D-D、hs-CRP、AT-Ⅲ水平比較如表2所示。腦梗死組血漿D-D、hs-CRP水平顯著高于正常組，AT-Ⅲ水平顯著低于正常組（P
2.2 輕度與中重度腦梗死患者血漿D-D、hs-CRP及
AT-Ⅲ水平比較
輕度組與中重度組患者血漿D-D、hs-CRP、AT-Ⅲ水平比較如表3所示。輕度組D-D水平顯著低于中重度組（P
2.3 D-D、hs-CRP、AT-Ⅲ與腦梗死患者病情相關性
Pearson相關分析顯示，血漿D-D、hs-CRP水平與腦梗死病情呈顯著正相關（P
3 討論
動脈粥樣硬化是腦梗死最常見的病因之一，斑塊破裂引發的鈣超載、氧自由基釋放、炎性因子釋放、各類酶激活是導致腦組織損傷加劇的主要病理生理過程[4]。本研究發現，雖然腦梗死患者TC、TG、HDL-C等血脂指標較正常組顯著增高，但其特異性不足，無法起到有效的預警作用。D-D是纖溶過程特異性標志物之一，常用于纖溶酶和凝血酶活性的觀察。在本次研究中，腦梗死患者血漿D-D水平顯著升高，且中重度組患者D-D水平升高更為顯著，提示D-D在腦梗死的發生發展中起到了重要作用。其機制可能為：腦梗死導致的腦組織損傷促進凝血因子釋放，引發機體高凝狀態，患者凝血系統的激活進一步促進了纖溶系統代償性亢進，導致纖維蛋白單體降解產物D-D釋放增加[5]。隨著患者病情加劇，其凝血功能異常更為嚴重，抗凝纖溶系統受到抑制，D-D水平進一步上升。故血漿D-D水平與腦梗死病情呈顯著正相關。Palmieri等[6]亦指出，D-D在血漿中具有較高穩定性，對體內血栓形成的評價有著良好的敏感性與特異性，且檢測方法簡單、迅速，可作為腦梗死病情的檢測指標。
hs-CRP由肝細胞受細胞因子誘導合成，是一種急性期反應蛋白。腦梗死患者機體炎性反應明顯，導致hs-CRP水平顯著升高?；颊吖Ｋ烂娣e越大，局部炎性反應越嚴重[7]，故hs-CRP水平升高更為明顯，本研究中血漿hs-CRP與腦梗死病情呈顯著正相關，印證了上述結論。此外，hs-CRP還可促進單核細胞釋放組織因子，加劇凝血纖溶系統失衡狀態，并可通過激活補體系統損傷血管內膜、增加血管通透性，使動脈粥樣硬化斑塊擴大、血栓形成[8]?？梢哉J為，hs-CRP與患者梗死面積、嚴重程度及預后均具有密切關聯，早期積極干預hs-CRP水平有望延緩動脈粥樣硬化進展，改善患者預后。
AT-Ⅲ是一種由肝臟合成的蛋白酶抑制劑，主要參與彌散性血管內凝血、肝病等各類血液障礙疾病[9]，在抗凝系統中發揮著重要作用。正常情況下，機體抗凝、凝血系統處于動態平衡狀態，若機體發生凝血功能異常，往往導致凝血系統因子激活、抗凝纖溶系統抑制，血管內皮細胞受損，促進血栓形成[10]。本研究可見，腦梗死患者AT-Ⅲ水平顯著低于正常組，且中重度腦梗死患者AT-Ⅲ水平下降更為明顯，提示腦梗死患者凝血因子激活、凝血酶活化分泌過程消耗了大量的AT-Ⅲ。同時，機體凝血功能亢進狀態亦影響了AT-Ⅲ合成[11]，導致AT-Ⅲ水平進一步下降。因此，AT-Ⅲ能夠有效反映機體抗凝功能狀態，動態觀察血漿AT-Ⅲ水平能夠明確腦梗死病程的動態變化[12]。
在本次研究中，腦梗死患者血漿D-D、hs-CRP、AT-Ⅲ水平均與健康體檢者存在顯著差異，且病情越嚴重，患者上述指標變化越明顯。說明腦梗死患者存在明顯的凝血功能異常、炎性因子高表達狀態，據此進行臨床診斷、預后評估，并實施合理的干預方案，對延緩病情進展、改善患者預后均具有重要意義。
參 考 文 獻
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篇10
摘要
為探究不同熱處理方式的小米蛋白質的消化情況，采用胃蛋白酶-胰蛋白酶體外模擬消化法測定蒸制、煮制、擠壓處理并經淀粉酶解的小米蛋白消化率。對從小米生粉中提取的醇溶蛋白蒸制、煮制的蛋白消化率進行測定，結果表明，經120min的胃蛋白酶和胰蛋白酶處理，蒸制、煮制和擠壓處理的小米的體外蛋白消化率分別較未處理小米降低了31.00%，17.15%和11.02%。蒸煮的醇溶蛋白消化率也分別降低了35.57%和28.63%。蒸煮對小麥蛋白的消化率有不利影響，擠壓處理優于蒸煮處理。蒸煮處理降低小麥蛋白體外消化率可能與醇溶蛋白消化率的降低有關。
關鍵詞
小米；蒸制；煮制；擠壓；蛋白消化率
小米隸屬禾本科草本植物，是世界上主要糧食作物之一，主要種植在亞洲和非洲。我國種植的多為谷子，谷子脫殼后的種仁即小米。小米適口性好，營養豐富，深受我國北方人民的喜愛。小米的蛋白質含量較高，其干基平均含量為13.08%，高于其它禾谷類作物[1]。其中醇溶蛋白占46%，是小米中含量最多的一種蛋白，此外還有21.1%的堿溶蛋白以及5.5%的清蛋白和球蛋白[2]。通常用來評價食物蛋白好壞的最主要的2個指標是蛋白質的氨基酸組成和蛋白消化率[3]。在小米蛋白質的氨基酸組成模式中，谷氨酸、亮氨酸、丙氨酸和天門冬氨酸是小米氨基酸的主要組成部分，賴氨酸和蘇氨酸是小米中的第一、第二限制性氨基酸[4-5]。蛋白消化率是動物從食物中所消化吸收的蛋白質占總攝入量的百分比，是評價食物營養價值的重要指標[6]。對于食物蛋白質消化率的研究通常采用建立蛋白質體外消化模型模擬食物在胃和小腸中的消化情況的方法，胃蛋白酶-胰蛋白酶體外模擬消化法是一種常見的方法。影響蛋白質消化性的因素可歸為兩類：外因主要是酚類化合物、植酸、碳水化合物、脂類及蛋白酶抑制劑等，內因主要是指蛋白質本身的結構特性[7]。蛋白質經加熱處理后其結構會發生改變，從而影響其消化率。絕大多數谷物如大米、玉米、蕎麥等在一定的加熱處理之后的蛋白消化率都會有所提高[8-10]，但也有個別谷物如高粱，蒸煮之后的蛋白消化率反而降低[11]。小米作為一種公認的營養保健養胃米，它與高粱在蛋白質組成上非常相似。劉思思[12]研究發現，蒸煮之后打漿的小米乳蛋白質具有較低的消化率，而小米醇溶蛋白本身形成的二硫鍵及強烈的疏水性是導致小米蛋白抗消化的主要原因。本研究主要采用胃蛋白酶-胰蛋白酶體外模擬消化的方法，分析小米和小米醇溶蛋白經蒸制、煮制和擠壓處理之后蛋白消化率的變化情況，探討不同加熱處理方式對小米蛋白消化率的影響，為小米蛋白的品質評價以及小米相關產品的開發提供依據。
1材料與方法
1.1材料谷子：長生07，產自山西。
1.2主要試劑胃蛋白酶（活性：800~2500U/mg），北京拜爾迪生物技術有限公司；胰蛋白酶（活性：250Umg），北京拜爾迪生物技術有限公司；α-淀粉酶（活性>6000U/mg），北京博奧拓達科技有限公司。
1.3主要設備與儀器三立式搗精機（SY88-TH），雙龍機械產業；高速萬能粉碎機（LD-T300A），上海頂帥電器有限公司；雙螺桿試驗機（DS30-Ⅲ），山東賽信機械有限公司；恒溫水浴振蕩器（SHA-BA），金壇市榮華儀器制造有限公司；冷凍干燥機（LGJ-2C），北京市四環科學儀器廠有限公司；高速冷凍離心機（GL-20G-Ⅱ），上海安亭科學儀器廠；控溫消煮爐（KXL-1010），北京市通潤源機電技術責任有限公司；電子精密天平，奧豪斯國際貿易（上海）有限公司；梅特勒-托利多pH計（FE20），梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；凱氏定氮儀（KDY-9820），北京市通潤源機電技術責任有限公司。
1.4方法
1.4.1樣品制備谷子樣品經搗精機脫殼，分別做以下處理：蒸制：小米與水以1∶5（m∶V）混合，上汽后蒸制25min，于烘箱內58℃烘干8h，磨粉，糊化度為92.67%。煮制：小米與水以1∶20（m∶V）混合，水開后煮制30min，于烘箱內58℃烘干12h后磨粉，糊化度為91.88%。擠壓：小米磨粉，水分調制16%，雙螺桿擠壓設備設定：一區溫度90℃，二區150℃，三區190℃，螺桿轉速120r/min，喂料速度25r/min，糊化度為92.05%。
1.4.2小米醇溶蛋白提取小米脫殼后磨粉，過40目篩，小米粉∶正己烷=1∶5（W/V）振蕩4h脫脂，靜止1h除去上清液，將沉淀在通風櫥內風干。風干的小米粉粉碎后過60目篩，用65%乙醇溶液以料液比1∶6，75℃水浴振蕩1h，浸提液8000r/min離心15min。取上清液在4℃冰箱內進行透析，2h換1次水。換水3~4次后取透析袋內溶液8000r/min離心15min，將沉淀在-20℃冰箱內速凍，于冷凍干燥機內冷凍干燥12h，獲得的蛋白純度在85%以上。
1.4.3淀粉酶處理取5g樣品于150mL錐形瓶中，以料液比1∶5（m∶V）加水，37℃水浴5min，以酶與底物比例為1∶100（m∶m）加入淀粉酶，在恒溫水浴振蕩器上37℃水浴30min，以確保樣品中的淀粉充分水解。
1.4.4蛋白質體外消化小米蛋白質的體外消化實驗采用胃蛋白酶-胰蛋白酶體外消化模型。具體操作如下：準確稱取一定質量的樣品分散于0.1mol/LHCl中形成50g/L的溶液，置于37℃水浴中預熱5min，以酶∶底物為1∶100（m∶m）加入胃蛋白酶，在37℃恒溫振蕩器上反應，分別在不同的消化時間（0，30，60，120min）取樣，用1mol/LNaOH調節pH7.0終止消化反應。對120min時所得消化液調節pH7.0，以酶∶底物為1∶100（m∶m）加入胰蛋白酶，在消化30，60，90，120min之后煮沸停止反應，分別取樣分析[13]。
1.4.5體外消化率測定體外消化率采用TCA-NSI（三氯乙酸氮溶指數）法[14]測定和計算。取5mL不同消化液于5mL10%TCA中，4000r/min離心20min，沉淀用10%TCA洗滌2次，離心得到TCA不溶組分。TCA不溶性氮含量采用凱氏定氮法測得，氮含量采用凱氏定氮法（GB5009.5-2010）測定，消化過程氮釋放量由下式計算。
2結果分析
2.1不同加熱處理的小米蛋白消化率經蒸制、煮制和擠壓處理的小米樣品蛋白消化率變化情況如圖1所示。胃蛋白酶和胰蛋白酶各消化120min，未經處理的小米蛋白消化率達到66.38%，而經蒸制、煮制和擠壓處理的小米蛋白消化率分別下降了41.65%，32.52%和1.94%。在胃蛋白酶消化過程中，蒸小米、煮小米和擠壓小米蛋白消化率的變化率在前30min較大，之后逐漸減小，甚至趨于0，而生小米的蛋白消化率的變化率則在前30min較小，之后迅速提高。這可能與包裹小米蛋白體的其它成分如淀粉等有關。這一推測也可在后面經淀粉酶解后不同加熱處理的小米蛋白的消化率的變化中得到印證。在胰蛋白酶消化過程中，除擠壓小米外，生小米和蒸煮小米的蛋白消化率的變化率幾乎不再變化，而擠壓小米的蛋白消化率先增高后趨于0。通常在谷物蛋白體周圍都存在淀粉顆粒而影響蛋白的消化。在人體消化食物的過程中，先有一個唾液淀粉酶解的過程。將經各種處理的小米先用淀粉酶解，后用胃蛋白酶和胰蛋白酶消化。由圖2可看出，經淀粉酶解的各種處理的小米蛋白消化率顯著提高。表1列出最終消化率的對比情況。經淀粉酶解后，生小米、蒸小米、煮小米和擠壓小米的蛋白消化率分別提高了29.89%，53.60%，59.48%和17.87%。生小米在經淀粉酶處理后蛋白消化率達到86.22%，比經相同條件蒸煮處理的大米蛋白消化率（75.84%和81.09%）高。幾種加熱處理后小米的蛋白消化率變化情況較未加淀粉酶時有一定的差異。從圖2可看出，淀粉酶解后蒸小米、煮小米和擠壓小米的蛋白消化率較生小米分別降低了31.00%，17.15%和11.02%。在胃蛋白酶解階段，小米蛋白消化率的變化率在前30min較大，之后減小，甚至趨近于0。在胃蛋白酶終止作用時，蒸小米、煮小米和擠壓小米的蛋白消化率非常接近。在胰蛋白酶作用階段，生小米和蒸小米的蛋白消化率幾乎不再變化，擠壓小米的蛋白消化率先升高后趨于平緩，煮小米的消化率則呈直線升高。
2.2不同加熱處理的小米醇溶蛋白的消化率小米蛋白中約有46%為醇溶蛋白[3]，是含量最多的一種蛋白。其經不同加工處理的消化率的變化對小米總蛋白的消化率有一定影響。因本試驗中采用雙螺桿擠壓膨化機對樣品進行擠壓膨化，所需物料量較大，故沒有研究擠壓處理的醇溶蛋白。如圖3所示，蒸制和煮制的小米醇溶蛋白的消化率分別為54.21%和48.94%，較生蛋白分別降低了35.57%和28.63%。在胃蛋白酶消化階段，前30min蒸蛋白的消化率最高，之后趨于平緩，直至胰蛋白酶消化結束。生蛋白和煮蛋白的消化率的變化趨勢相同，在胃蛋白酶消化階段，前60min消化率提高較快，之后減慢，甚至趨于平緩；在胰蛋白酶消化階段，消化率先提高后趨于平緩。醇溶蛋白的消化率變化規律和小米蛋白消化率變化趨勢相似，推測醇溶蛋白在加熱過程中的變化，很可能是影響小米蛋白消化率的一個主要因素。
3討論
濕熱處理對蛋白質的影響較大，對于大多數谷物來說，適宜的熱處理可提高蛋白質的消化率和必需氨基酸的生物有效性[15]。也有一些谷物在濕熱處理下蛋白質的消化率反而降低。本研究發現蒸煮加工對小米蛋白的消化具有不利的影響，這與之前很多研究[10、16-18]報道的高粱蛋白質消化率因蒸煮而降低的結果類似。這些研究發現醇溶蛋白的低溶解性和二硫鍵的形成，很可能是造成高粱蒸煮后蛋白消化率降低的主要原因。Hamaker等[10]通過不同的溶劑對未經蒸煮和蒸煮的高粱醇溶蛋白進行提取，發現蒸煮后用酒精提取的醇溶蛋白成分明顯減少，而用乙醇加2-巰基乙醇和亞硫酸鈉的溶劑提取的醇溶蛋白明顯增多，由此得出蒸煮之后醇溶蛋白的溶解度降低的結論。早在1991年，Shull[19]等根據分子質量將醇溶蛋白分成3類，即位于蛋白體中心的α-醇溶蛋白（24ku和26ku）以及位于的β-醇溶蛋白（20，18ku和16ku）和γ-醇溶蛋白（28ku）。Rom[17]和Oria[18]等通過電鏡觀察到消化過程中，經蒸煮的高粱蛋白體的很難被酶破壞，而在添加了能夠破壞二硫鍵的還原劑后，其會出現明顯的凹陷，推測是由于β-和γ-醇溶蛋白通過二硫鍵形成抵抗酶的聚合物，從而保護內部的α-醇溶蛋白不被消化。Hamaker[10]等通過電泳的方法也發現了類似結果。
劉思思[12]對小米所含4種蛋白進行電泳，發現含量最多的醇溶蛋白主要分布在低分子質量范圍，其電泳圖譜與高粱基本相同，有α-（18～21ku）、β-（15ku）、γ-（23ku）醇溶蛋白以及分布在12ku的4條譜帶。通常小米蛋白在60℃左右會發生熱變性。在對小米乳經胃蛋白酶和胰蛋白酶消化的殘渣電泳后，劉思思[12]發現醇溶蛋白僅有18～21ku的少部分蛋白條帶消失，進一步經亞硫酸氫鈉處理消化殘渣后大部分電泳條帶消失，說明小米醇溶蛋白中的二硫鍵是影響小米蛋白消化率的一個主要的原因。小米醇溶蛋白，如高粱醇溶蛋白一樣，通過二硫鍵在形成致密的保護結構，阻止蛋白酶與蛋白的結合，從而導致消化率低。劉思思[12]還發現，蒸煮后的小米醇溶蛋白和生的醇溶蛋白的消化殘渣用亞硫酸氫鈉處理后，其電泳條帶無顯著差異，說明亞基間未形成新的二硫鍵。本研究發現蒸煮后小米蛋白的消化率明顯降低。濕熱處理后小米蛋白質消化率的降低是否與醇溶蛋白加熱后形成二硫鍵有關，這尚需證實。CalvinOnyango[20]等人對玉米-小米預混粉烹煮、發酵、擠壓等處理后也發現，經發酵、擠壓以及發酵后再擠壓幾種處理后，預混粉的蛋白消化率較生粉明顯提高，然而經發酵再烹煮后，預混粉的蛋白消化率甚至較生粉還低，CalvinOnyango推測這可能是由于長時間加熱熟化導致蛋白多聚體的形成，從而抵抗酶的作用而致。擠壓作為一種高溫短時的加熱處理方式，在加工過程中，對谷物蛋白質有很大的影響。擠壓溫度和樣品水分是影響蛋白質結構的重要指標。通過擠壓導致的蛋白質變性可以暴露蛋白酶作用位點，從而提高蛋白消化率[20]，然而也會通過疏水作用、二硫鍵連同其它形式的共價鍵共同作用，使蛋白質發生聚集，導致溶解性降低[21]，從而降低蛋白質消化率。通過選擇合適的擠壓溫度和樣品水分來實現提高小米蛋白消化率的目的。
4結論
