血小板膜糖蛋白Ⅵ研究論文

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【摘要】血小板膜糖蛋白Ⅵ（GPⅥ）是血小板表面重要的膠原受體，能介導血小板與膠原的初期黏附，產生信號轉導，提高整合蛋白受體親合力，引起血小板聚集和血栓形成。抑制GPⅥ功能可顯著抑制膠原誘導的血小板黏附、聚集和血栓形成，故GPⅥ已成為研制新型抗血小板藥物的主要靶點。過去幾年中，對血小板和膠原相互作用的研究取得很大進展,本文就GPⅥ的結構，GPⅥ的功能，GPⅥ功能相關因素，GPⅥ與臨床等作一綜述。

【關鍵詞】血小板膜糖蛋白Ⅵ；膠原；血栓形成

AdvancesintheStudiesofplateletglycoproteinⅥ（GPⅥ）——Review

AbstractplateletglycoproteinⅥ（GPⅥ）isamajorreceptorforcollagenontheplateletsurface.Itmediatestheinitialplateletcontactwithcollagen,generatesintracellularsignals,increasestheaffinityofintegrinreceptor,andcausesplateletaggregationandthrombosis.SuppressionofGPⅥfunctioncansignicantlyinhibitcollagen-inducedplateletadhesion,aggregationandthrombosis,soGPⅥhasbecomeanoveltargetforantiplatelettherapy.Withinthelastfewyears,majoradvanceshavebeenmadeinunderstandingplatelet-collageninteractions.Inthispaper,theadvancesofstudyonGPⅥ,includingcompositionofGPⅥ,functionsofGPⅥ,factorsrelatedwithfunctionsofGPⅥ,GPⅥandclinicweresummarized.

KeywordsGPⅥ;collagen;thrombosis

血小板與血管損傷部位暴露的細胞外基質（extracellularmatrix，ECM）接觸是形成血栓、修復損傷組織和止血的第一道防線。在ECM的大分子組成成分中膠原起主要作用,它不但可以通過直接和間接的途徑與血小板黏附，還可引起血小板聚集及促凝活性的表達,在存在高切應力的動脈或損傷血管處血小板與膠原的相互作用尤為重要。目前研究認為，血小板表面有兩類膠原受體即整合蛋白α2β1(GPⅠa/Ⅱa)和血小板膜糖蛋白Ⅵ（GPⅥ）。α2β1可直接與膠原結合,但需要經過由內向外的信號轉導轉變為高親和力狀態才能實現，而GPⅥ在介導血小板與膠原黏附、快速信號轉導、血小板活化及促凝活性表達等復雜過程中處中心位置［1］。近年來對GPⅥ的研究取得很大進展，現綜述如下。

GPⅥ的結構

1982年,應用2-D凝膠電泳，GPⅥ首次被確認。1999年，Clemetson等［2］首先報道人GPⅥ克隆為Ⅰ型單鏈跨膜糖蛋白,屬免疫球蛋白超家族成員。GPⅥ基因定位于19號染色體長臂(19q13.4)，含有8個外顯子，分子量為62kD，其cDNA克隆全長1017bp,編碼319個氨基酸殘基和20個氨基酸信號肽，分子結構分為胞外區、跨膜區和胞內區。胞外區有2個免疫球蛋白樣結構域和含多個O糖基化位點的黏蛋白樣富含絲／蘇氨酸區域，為分子的空間活動提供一定的柔韌度；位于GPⅥ跨膜區19個氨基酸中第3位帶正電荷的精氨酸與免疫球蛋白Fc受體γ鏈跨膜區的天門冬氨酸殘基以鹽鍵相連，組成受體復合物；胞內區含51個氨基酸，不含酪氨酸殘基，但含有2個獨特序列，一是靠近跨膜區富含堿性氨基酸的區域，能與鈣調蛋白結合；另一個是位于中部的富含脯氨酸基序，可選擇性與Src家族酪氨酸激酶Fyn和Lyn的SH3區結合［3］。

GPⅥ的功能

GPⅥ介導血小板與膠原的初期黏附，產生信號轉導，提高整合蛋白受體親合力，引起血小板聚集、釋放和血栓形成［4］。

膠原、合成膠原及GPⅥ特異性配體

在人類基因組上，有20余種膠原基因，其中9種被證實表達于血管壁上，纖維膠原Ⅰ、Ⅲ型是血管壁ECM的重要組成成分，而Ⅳ型網狀膠原是內皮細胞基底膜的組成形式。血小板可被不溶性纖維膠原激活，可溶性膠原不結合靜止狀態的血小板，而與另一膠原受體，活化的整合蛋白α2β1結合，它只有轉變為纖維膠原時才能激活血小板［5］。膠原含有重復的GPO基序（G，甘氨酸；P，脯氨酸；O，羥脯氨酸），約占Ⅰ、Ⅲ型膠原的10％，是血小板與ECM接觸的重要結構形式，也是與GPⅥ免疫球蛋白樣結構域的結合基序。膠原相關肽（collagen-relatedpeptide，CRP）是含有串聯的GPO基序的人工合成肽段，是GPⅥ的誘導劑。許多蛇毒肽可通過GPⅥ發揮作用，其中C型凝集素convulxin是最早被證實的，它通過使受體叢集誘導血小板活化。

GPⅥ與免疫球蛋白Fc受體γ鏈復合物

Jarvis等［6］發現，缺乏FcRγ鏈的血小板對膠原的刺激無反應，提示GPⅥ和FcRγ鏈以非共價鍵結合的蛋白復合物是所有類型膠原的關鍵受體，兩者在結構和功能上密切相關。Yoshiki等［7］也實驗證實，GPⅥ只有和FcRγ鏈組成異源二聚體，才能與膠原結合，而且只結合不溶性纖維膠原。FcRγ鏈含有免疫受體酪氨酸活化基序（immunoreceptortyrosinebasedactivationmotif，ITAM），是該復合物的信號轉導部分。

GPⅥ與信號轉導

膠原通過其特異性GPO序列與GPⅥ／FcRγ鏈受體復合物結合后，使2個GPⅥ復合物交聯而活化。GPⅥ胞內富含脯氨酸的基序選擇性與Src家族酪氨酸激酶Fyn和Lyn的SH3區結合，使FcRγ鏈的ITAM磷酸化，ITAM磷酸化為Syk家族酪氨酸激酶提供了結合位點，可特異結合在其串聯的SH2區而使Syk酪氨酸磷酸化。擁有多個磷酸化位點的Syk底物，接頭蛋白LAT和SLP-76等可募集其他信號轉導復合體，引發下游許多效應酶包括磷脂酰C－γ2,小G蛋白和磷脂酰肌醇3激酶等活化，從而使信號轉導級聯擴大，導致胞內鈣離子濃度升高，纖維蛋白原受體活化，細胞骨架重排，最終血小板發生聚集、釋放和促凝活性表達。GPⅥ在體內分布有明顯的空間限制性,僅分布于巨核細胞和血小板,在其他組織細胞未見表達,被認為是血小板膠原特異的信號轉導蛋白。GPⅥ基因剔除小鼠血小板表現出對膠原刺激無反應，但無明顯出血傾向［8］。

GPⅥ功能相關的影響因素

整合蛋白α2β1的作用

整合蛋白α2β1（也被稱作為GPⅠa/Ⅱa或淋巴細胞VLA-2）是血小板上第一個被確認的膠原受體，依賴于Mg2與膠原結合，但不能誘導酪氨酸激酶活化。GFOGER序列是α2β1特異性螺旋肽，支持α2β1介導的黏附［9］。α2β1在體內多種組織上表達，是膠原和層黏連蛋白的受體，但在血小板上只和膠原結合。上個世紀80年代后期及90年代早期，α2β1被認為是血小板表面最主要的膠原受體，在血小板與膠原的黏附、活化中起關鍵作用，但后來對α2β1作用的研究出現爭議。Jung和Moroi［10］的研究認為，整合蛋白與膠原的親合力受細胞內信號的調整，即GPⅥ介導與膠原最初的結合，導致整合蛋白α2β1和αⅡbβ3的活化，反過來它們又介導了與膠原的穩定結合并加強了GPⅥ的信號轉導。但另有研究證實α2β1在血小板與膠原的最初黏附中起著重要作用［11］。Auger等［12］應用特異性抗α2β1和GPⅥ抗體以及Src家族酪氨酸激酶抑制劑研究發現，α2β1和GPⅥ是通過不同途徑介導血小板與膠原的結合，提示這兩種膠原受體可能相互協作增加血小板與膠原的結合而刺激血小板活化。最近，Sarratt等［13］應用藥理學和基因學方法研究證實，α2β1和GPⅥ這兩個結構各異的膠原受體在血小板與膠原的結合中發揮同等重要的作用，都能產生細胞內信號轉導，導致血小板聚集，并且兩者有密切的合作關系。

GPⅠb-Ⅴ－Ⅸ復合體的作用

內皮下膠原最初俘獲血小板需要血漿蛋白vWF，它能同時結合膠原和GPⅠb-Ⅴ－Ⅸ。vWF依賴的膠原結合作用可快速終止，使血小板僅在vWF表面滾動但不能形成穩定的血栓，這種結合能被膠原和膠原受體更穩定的結合而取代。vWF和GPⅠb-Ⅴ－Ⅸ結合后刺激鈣的動員和細胞骨架重排，上調αⅡbβ3親合力，使其與VWF結合，增加黏附，結合纖維蛋白原而形成血栓。vWF和GPⅠb-Ⅴ－Ⅸ結合后也可刺激血小板信號轉導，引起血小板顆粒釋放，上調整合蛋白親合力，其具體途徑可能類似于GPⅥ在血小板內的信號轉導。GPⅠb-Ⅴ－Ⅸ和GPⅥ兩者的關系一般認為，在低切應力狀態下，GPⅥ啟動血小板聚集，而GPⅠb-Ⅴ－Ⅸ復合物則引發高切應力條件下的血小板聚集。但最近對GPⅠb-Ⅴ－Ⅸ及GPⅥ功能和信號轉導的研究顯示兩者有許多共同特征，從而推測它們在細胞表面可能相互關聯［14］。Arthur等［15］最近也研究發現，應用GPⅠb特異性單克隆抗體SZ2，可明顯阻斷GPⅥ特異性誘聚劑CRP所誘導的血小板聚集，并證實在靜止和活化的血小板表面，GPⅥ和GPⅠb-Ⅴ－Ⅸ復合物均存在相互作用。

αⅡbβ3（GPⅡb/Ⅲa）的作用

αⅡbβ3作為纖維蛋白原受體是血小板血栓形成的最后步驟。當血管壁受損暴露血管內皮下基質,血小板通過GPⅠb及GPⅥ介導黏附于內皮下膠原組織,黏附的血小板隨后發生一系列反應,包括花生四烯酸代謝,產生血栓烷A2和釋放細胞顆粒內容物ADP等,導致αⅡbβ3復合物構型改變和纖維蛋白原受體的暴露,并通過與纖維蛋白原的結合而使血小板之間相互黏附、聚集成團,在血管破損處形成血栓。αⅡbβ3由內向外的活化依賴于鈣離子而αⅡbβ3與配體結合后還會產生由外向內的信號傳遞引起血小板的第二次活化反應，促進顆粒釋放，以正反饋增強活化過程；同時，血小板膜磷脂的翻轉促進了血液的凝固過程［16］。

第二介質在膠原引發血小板聚集的作用

細胞活化是血小板與膠原黏附的必要條件,GPⅥ在此過程中起主要作用,但是GPⅥ介導的活化可被ADP和血栓烷等第二介質強化。這些可溶性活化誘導劑激活血小板并非與膠原直接接觸，而是通過激活血小板上黏附膠原的整合蛋白α2β1和αⅡbβ3，促進信號轉導。研究證明ADP是通過與G蛋白偶聯的受體P2Y1和P2Y12激活血小板，當血小板被其他的誘聚劑激活，致密顆粒分泌ADP作用于P2Y1／P2Y12受體以自分泌和旁分泌機制促進血小板穩定聚集，這個信號轉導途徑協同GPⅥ信號促進整合蛋白活化。P2Y1偶聯于Gαq，調節鈣依賴的信號轉導，引起血小板形狀改變和快速、可逆的αⅡbβ3依賴性血小板聚集；P2Y12偶聯于Gαi通過抑制腺苷酸環化酶產生cAMP來激活αⅡbβ3，這兩個受體的相互關系是P2Y1啟動聚集，P2Y12起加強作用［17］。當血小板通過α2β1途徑結合膠原時，并不依賴于ADP和血栓烷等介質［18］。

GPⅥ活化途徑的負性調節因子

血小板活化的信號轉導能被血小板內皮細胞黏附分子1（plateletendothelialcelladhesionmolecule1,PECAM-1）抑制［19］。表達于血細胞及內皮細胞的PECAM-1(也稱為CD31)參與白細胞跨膜遷移，調節細胞活化及凋亡等多個過程。當PECAM-1被激活后，通過Src家族酪氨酸激酶使其免疫受體酪氨酸抑制基序（immunoreceptortyrosinebasedinhibitionmotif，ITIM）磷酸化，募集酪氨酸、絲氨酸／蘇氨酸或磷酯酶，隨后抑制激酶依賴的信號轉導。黏附受體的活化信號及PECAM-1抑制信號的平衡可調整血栓形成的刺激閾值，決定血栓大小和穩定度，防止血栓形成失控。

其他有爭議的膠原受體

CD36（或GPⅣ）在上個世紀80年代晚期被認為是膠原受體，近來認為它是Ⅴ型膠原的特異性受體而非膠原的功能性受體，因為缺乏CD36的人或鼠，血小板對Ⅰ－Ⅴ型膠原的反應均正常［6］。另一個膠原受體是GPⅤ，它以非共價鍵與GPⅠb/Ⅸ相連，但其功能卻不甚明了，不同的實驗結果差異較大［1］，所以是否真正存在第三個功能性的膠原受體尚存在爭議。綜上所述，血小板與膠原的黏附模式為：循環血流中血小板黏附到受損血管壁的第一步是vWF分子的A3區與暴露的膠原結合，vWF分子的A1區發生構象的改變，而與血小板GP-Ⅳ-Ⅴ復合物結合，使血小板間接黏附于膠原纖維，同時GPⅥ介導血小板與膠原直接結合；第二步，GPⅥ－膠原的相互作用產生細胞內信號將β1、β3整合蛋白轉為高親合力狀態，并誘發可溶性誘導劑的釋放（主要是ADP和血栓素）放大整合蛋白的活化，通過活化更多的血小板而介導血栓形成［20］。GPⅠb介導的信號轉導可放大GPⅥ誘發的活化信號；最后，血小板通過活化的整合蛋白α2β1（直接作用）和αⅡbβ3（通過vWF或其他配體間接作用）與膠原牢固黏附。整合蛋白介導的黏附加強了GPⅥ與膠原的相互作用，引起信號轉導增加，更上調整合蛋白活性，增加釋放和促凝活性的表達，最終導致血栓形成。

GPⅥ與臨床

GPⅥ在止血和血栓中的臨床意義

盡管細胞外基質成分復雜，但血小板和膠原的黏附在體內啟動止血和血栓起重要作用。抑制GPⅥ功能可在體外高切應力下顯著抑制膠原誘導的血小板黏附、聚集和血小板血栓形成［21］。GPⅥ缺乏最重要的特點是患者血小板對膠原誘導的聚集無反應，但對其他誘聚劑反應正常。Boylan等［22］報道在一例ITP患者血漿中檢測到抗GPⅥ自身抗體，雖然其GPⅥ基因正常，但血小板表面GPⅥ和FcRγ鏈幾乎喪失，證實是其自身抗體特異性結合GPⅥ陽性血小板，清除血漿中可溶性GPⅥ，導致血小板不能結合膠原，也不能形成血栓。Samaha等［23］用流式細胞技術直接測定血小板表面的膠原受體密度，發現心肌梗死患者受體密度較正常對照增高，提示血小板膠原受體密度增高可能是心肌梗死患者新的危險因素。Bellucci等［24］報道2例惡性血液病患者膠原誘導的血小板功能障礙是由于GPⅥ偶聯的信號轉導通路受損。Nurden等［25］報道1例灰色血小板綜合癥患者伴有獲得性GPⅥ缺乏，其膠原誘導的血小板聚集功能受損。

新型抗血小板藥物的研究進展

血栓栓塞性疾病是當前危害人類健康的主要原因之一,血小板異常活化在血栓形成中起重要作用,因而研制開發抑制血小板黏附、釋放、聚集功能和血小板活化的抗血小板藥物是抗血栓治療的一個重要策略。如抗血小板GPⅡb/Ⅲa單克隆抗體阿昔單抗能有效預防冠狀動脈閉塞患者溶栓治療和冠狀動脈腔內成型術后的冠狀動脈再栓塞，但存在治療窗口狹小和并發出血等不良反應。血小板與膠原之間的相互作用是血小板黏附、聚集和活化的始動因素,因而成為研制新型抗血小板藥物的主要靶點［26］。在小鼠體內動脈損傷模型中發現，經抗GPⅥ抗體處理的血小板不與損傷的動脈內膜發生黏附，也不在局部形成血栓［27］。體外試驗也表明，抗小鼠GPⅥ單克隆抗體JAQ1對膠原誘導的血小板聚集有一定的抑制效應［13］，它可使循環血小板表面的GPⅥ內化和降解,產生GPⅥ基因剔除樣現象，但不影響其他血小板受體如GPⅡb/Ⅲa、GPⅠb/Ⅸ等,表明JAQ1是特異性阻斷GPⅥ依賴性血小板活化通路。Qian等［28］應用組合抗體文庫技術制備人源抗GPⅥ抗體,其中A10克隆可特異性抑制膠原誘導的血小板聚集。

Smethurst等［29］應用噬菌體抗體庫技術篩選出抗GPⅥScFv抗體(10B12),可顯著抑制膠原與GPⅥ的結合。因GPⅥ僅在血小板和巨核細胞上表達，針對GPⅥ為靶點的抗體對抑制血小板活化具有特異性的阻斷作用,且GPⅥ缺乏患者僅表現為輕微的出血傾向，更容易耐受，故目前人們正積極尋找有效的GPⅥ拮抗劑，聯合不同作用機制的抗血小板藥物可能是抗栓治療的一個方向。

結語

近年來，對血小板及膠原相互作用以及在啟動止血及血栓作用的研究取得很大進展。GPⅥ作為主要的膠原受體參與血小板的初期黏附,并誘發一系列血小板由內到外的信號轉導,活化血小板膜表面整合蛋白受體,導致血小板聚集和血小板血栓形成，故血小板GPⅥ結構和功能的完整性對正常止血功能的發揮和動脈血管內高切應力條件下的病理性血栓形成有重要影響。開發GPⅥ高度特異性抑制劑對基礎研究很有價值并具有臨床應用潛力。

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