蛋白質的質譜透析

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蛋白質是生物體中含量最高，功能最重要的生物大分子，存在于所有生物細胞，約占細胞干質量的50%以上，作為生命的物質基礎之一，蛋白質在催化生命體內各種反應進行、調節代謝、抵御外來物質入侵及控制遺傳信息等方面都起著至關重要的作用，因此蛋白質也是生命科學中極為重要的研究對象。

1質譜分析的特點

質譜分析用于蛋白質等生物活性分子的研究具有如下優點：很高的靈敏度能為亞微克級試樣提供信息，能最有效地與色譜聯用，適用于復雜體系中痕量物質的鑒定或結構測定，同時具有準確性、易操作性、快速性及很好的普適性。

2質譜分析的方法

近年來涌現出較成功地用于生物大分子質譜分析的軟電離技術主要有下列幾種：

①電噴霧電離質譜；

②基質輔助激光解吸電離質譜；

③快原子轟擊質譜；

④離子噴霧電離質譜；

⑤大氣壓電離質譜。在這些軟電離技術中，以前面三種近年來研究得最多，應用得也最廣泛。

3蛋白質的質譜分析

蛋自質是一條或多條肽鏈以特殊方式組合的生物大分子，復雜結構主要包括以肽鏈為基礎的肽鏈線型序列[稱為一級結構]及由肽鏈卷曲折疊而形成三維[稱為二級，三級或四級]結構。目前質譜主要測定蛋自質一級結構包括分子量、肽鏈氨基酸排序及多肽或二硫鍵數目和位置。

3.1蛋白質的質譜分析原理以往質譜(MS)僅用于小分子揮發物質的分析，由于新的離子化技術的出現，如介質輔助的激光解析/離子化、電噴霧離子化，各種新的質譜技術開始用于生物大分子的分析。其原理是：通過電離源將蛋白質分子轉化為氣相離子，然后利用質譜分析儀的電場、磁場將具有特定質量與電荷比值(M/Z值)的蛋白質離子分離開來，經過離子檢測器收集分離的離子，確定離子的M/Z值，分析鑒定未知蛋白質。

3.2蛋白質和肽的序列分析現代研究結果發現越來越多的小肽同蛋白質一樣具有生物功能，建立具有特殊、高效的生物功能肽的肽庫是現在的研究熱點之一。因此需要高效率、高靈敏度的肽和蛋白質序列測定方法支持這些研究的進行。現有的肽和蛋白質測序方法包括N末端序列測定的化學方法Edman法、C末端酶解方法、C末端化學降解法等，這些方法都存在一些缺陷。例如作為肽和蛋白質序列測定標準方法的N末端氨基酸苯異硫氰酸酯(phenylisothiocyanate)PITC分析法(即Edman法，又稱PTH法)，測序速度較慢(50個氨基酸殘基/天)；樣品用量較大(nmol級或幾十pmol級)；對樣品純度要求很高；對于修飾氨基酸殘基往往會錯誤識別，而對N末端保護的肽鏈則無法測序。C末端化學降解測序法則由于無法找到PITC這樣理想的化學探針，其發展仍面臨著很大的困難。在這種背景下，質譜由于很高的靈敏度、準確性、易操作性、快速性及很好的普適性而倍受科學家的廣泛注意。在質譜測序中，靈敏度及準確性隨分子量增大有明顯降低，所以肽的序列分析比蛋白容易許多，許多研究也都是以肽作為分析對象進行的。近年來隨著電噴霧電離質譜(electrosprayionisation，ESI)及基質輔助激光解吸質譜(matrixassistedlaserdesorption/ionization，MALDI)等質譜軟電離技術的發展與完善，極性肽分子的分析成為可能，檢測限下降到fmol級別，可測定分子量范圍則高達100000Da，目前基質輔助的激光解吸電離飛行時間質譜法(MALDITOFMS)已成為測定生物大分子尤其是蛋白質、多肽分子量和一級結構的有效工具，也是當今生命科學領域中重大課題——蛋白質組研究所必不可缺的關鍵技術之一。目前在歐洲分子生物實驗室(EMBL)及美國、瑞士等國的一些高校已建立了MALDITOFMS蛋白質一級結構(序列)譜庫，能為解析FAST譜圖提供極大的幫助，并為確證分析結果提供可靠的依據。

3.3蛋白質的質譜分析方式質譜用于肽和蛋白質的序列測定主要可以分為三種方法：一種方法叫蛋白圖譜(proteinmapping)，即用特異性的酶解或化學水解的方法將蛋白切成小的片段，然后用質譜檢測各產物肽分子量，將所得到的肽譜數據輸入數據庫，搜索與之相對應的已知蛋白，從而獲取待測蛋白序列。將蛋白質繪制“肽圖”是一重要測列方法。第二種方法是利用待測分子在電離及飛行過程中產生的亞穩離子，通過分析相鄰同組類型峰的質量差，識別相應的氨基酸殘基，其中亞穩離子碎裂包括“自身”碎裂及外界作用誘導碎裂.第三種方法與Edman法有相似之處，即用化學探針或酶解使蛋白或肽從N端或C端逐一降解下氨基酸殘基，形成相互間差一個氨基酸殘基的系列肽，名為梯狀測序(laddersequencing)，經質譜檢測，由相鄰峰的質量差知道相應氨基酸殘基。

3.3.1蛋白消化蛋白的基團越大，質譜檢測的準確率越低。因此，在質譜檢測之前，須將蛋白消化成小分子的多肽，以提高質譜檢測的準確率。一般而言，6-20個氨基酸的多肽最適合質譜儀的檢測。現今最常用的酶為胰蛋白酶(trypsin)，它于蛋白的賴氨酸(lysine)和精氨酸(arginine)處將其切斷。因此，同一蛋白經胰蛋白酶消化后，會產生相同的多肽。

3.3.2基質輔助激光解吸電離/飛行時間質譜測量法(MALDI-TOFMS)簡而言之，基質輔助激光解吸電離/飛行時間質譜測量儀是將多肽成分轉換成離子信號，并依據質量/電荷之比(mass/charge，m/z)來對該多肽進行分析，以判斷該多肽源自哪一個蛋白。

3.3.3電子噴霧電離質譜測量法(electrosprayion-izationmassspectrometry，ESI-MS)。

4蛋白質質譜分析的應用

1981年首先采用FAB雙聚焦質譜測定肽分子量，分析十一肽(Mr=1318)，質譜中出現準分子離子[M+1]+=1319強峰。在蛋白質的質譜分析中，質譜的準確性(accuracy)對測定結果有很大影響，因此質譜測序現在仍很難被應用于未知蛋白的序列測定。肽和蛋白的質譜序列測定方法具有快速、用量少、易操作等優點，這些都非常適合于現在科學研究的需要。我們相信，隨著各種衍生化方法和酶解方法的不斷改進，蛋白雙向電泳的應用以及質譜技術的不斷完善，質譜將會成為多肽和蛋白質分析最有威力的工具之一。