醫學畢業論文:氟西汀對海馬神經元生長的影響

時間:2022-11-15 04:21:00

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醫學畢業論文:氟西汀對海馬神經元生長的影響

【關鍵詞】氟西汀;細胞培養;海馬神經元;大鼠

氟西汀是5-羥色胺(5-HT)再攝取抑制劑之一,是應用較廣的抗抑郁藥。氟西汀除有抗抑郁作用外,尚可治療其他中樞神經系統疾病。有研究表明,氟西汀對海馬的神經保護作用是其發揮抗抑郁效應的機制之一[1]。關于氟西汀對體外培養的海馬神經元生長的影響未見報道,本研究初步探討了氟西汀對原代培養的海馬神經元生長的影響。

1材料與方法

1.1新生大鼠海馬神經元的分離和培養

技術方法在參考文獻[2]基礎上加以改進。取出生24h內的新生SD大鼠(東南大學醫學院動物實驗中心提供),無菌分離出雙側海馬,用顯微剪剪碎,D-Hank''''s液清洗2或3次,將剪碎的海馬組織轉移至離心管中,加入等量0.25%的胰酶(美國Sigma公司),37℃消化30min,中間振搖1或2次,加入10%的DMEM/F12(美國Gibco公司)5ml,輕輕吹打15次,然后1000r·min-1離心5min,制成單細胞懸液,置于CO2培養箱(德國Heraeus公司產品)中,差速貼壁30min,去除成纖維細胞,吸取未貼壁的細胞,并用200目的不銹鋼濾網過濾,收集過濾后的單細胞懸液于培養皿中,然后至離心管中,取一滴單細胞懸液進行計數,并用DMEM/F12將細胞密度調到1×106ml-1,然后接種于200μg·ml-1多聚賴氨酸(美國Sigma公司)包被的6孔培養板中,轉移至培養箱內培養,4h后換為無血清培養基,即含2%B27的Neurobasl培養基(美國Gibco公司),以后每3天半量換液1次。使用培養6d的神經元進行染色鑒定。

1.2大鼠海馬神經元的鑒定

1.2.1烯醇化酶(NSE)免疫細胞化學染色

取培養6d6孔培養板中的蓋玻片進行神經元特異的NSE免疫組織化學染色。棄去培養液,4%多聚甲醛室溫固定1h,加入0.3%H2O2甲醇去除內源性過氧化氫酶,0.1%TritonX-100破膜,10%綿羊血清封閉,加入一抗1∶200兔抗鼠NSE抗體,4℃濕盒過夜,0.01mmol·L-1PBS清洗,加入二抗1∶200生物素化的山羊抗兔IgG,放入37℃溫箱孵育60min;0.01mmol·L-1PBS清洗,滴加SABC過氧化物酶復合物,37℃溫箱中孵育60min,0.01mmol·L-1PBS清洗,滴加DAB顯色液作用3~10min,自來水沖洗后,常規脫水,透明封片。光鏡下觀察NSE表達陽性細胞。

1.2.2尼氏染色

6孔培養板的細胞培養7d時,取出蓋玻片進行尼氏染色。棄去培養液,0.01mmol·L-1PBS清洗,4%多聚甲醛室溫固定1h,0.01mmol·L-1PBS清洗3次,氯仿中1min,95%、70%乙醇各1min,蒸餾水清洗,置于1%甲苯胺藍染液中染色20min,95%乙醇分化,在顯微鏡下觀察控制,時間以尼氏體顯示清晰為準,37℃干燥,二甲苯透明,中性樹脂封片,光學顯微鏡下觀察。

1.3實驗分組

在培養的第3天加入氟西汀(常州第四制藥廠生產),根據藥物濃度不同,將實驗細胞分為5組,分別加入1、10、20、40μmol·L-1氟西汀;正常對照組加入等體積的培養基。

1.4海馬細胞形態定量分析

倒置相差顯微鏡(德國Zeiss公司產品)下觀察加藥48h后的海馬神經元形態,每組各孔隨機選擇20個視野(每個視野0.17mm2),記錄每個視野內細胞長出突起的神經元數目,目鏡測微尺隨機測量15個神經元突起的長度和胞體的長徑。

1.5統計學處理

應用SPSS12.0軟件進行統計分析,各項檢測結果以x-±s表示。多組比較及組間兩兩比較采用方差分析。

2結果

2.1海馬神經元形態學觀察

倒置相差顯微鏡下觀察,培養1d,細胞絕大部分貼壁,細胞形態大小不一,以單突起的小細胞為主。培養6d,神經元胞體較大,突起進一步增多、延長,并形成稀疏的網絡(圖1)。培養12d,神經元胞體進一步增大,突起形成比較稠密的網絡。培養24d,神經元胞體出現空泡,部分神經元死亡,胞體崩解,突觸斷裂。

2.2海馬神經元鑒定

NSE免疫細胞化學染色:染色后光鏡下觀察第6天的神經細胞,胞漿和突起被染成棕黃色為NSE抗體表達陽性細胞,以3個視野中陽性神經元的數目占總細胞的比例為神經元純度,經鑒定神經元的純度為90%。見圖2A。

2.3氟西汀對海馬神經元形態學的影響

結果見表1和圖3。不同濃度的氟西汀對海馬神經元形態學指標的影響是不同的,10μmol·L-1氟西汀組海馬神經元與正常對照組相比,有突起的神經元數目增加、最長突起長度增長(P<0.05);40μmol·L-1氟西汀組海馬神經元與正常對照組相比,有突起神經元數目減少(P<0.05),最長突起長度及胞體長徑無顯著性差異(P>0.05);1、20μmol·L-1氟西汀組海馬神經元與正常對照組相比,有突起神經元數目、最長突起長度及胞體長徑無顯著性差異(P>0.05)。表1氟西汀對加藥48h海馬神經元形態學的影響(略)

3討論

本實驗嚴格控制胰酶的量和消化時間,采用了0.25%胰蛋白酶低濃度溶液、30min長時間消化的方法,盡可能減少分離過程中的化學損傷。為了避免操作過程中的機械損傷,分離時動作輕柔,規律換藥,每72h半量換液1次,換液時速度快,以減少對神經元生長的影響。本實驗采用了差速貼壁生長,去除了成纖維細胞,并采用B27無血清培養基,可以選擇性地促使神經元生長,抑制非神經元的生長和繁殖[3],從而可以純化海馬神經元。NSE是神經元分化成熟的特異性標志酶之一,它主要表達于神經元的胞體、軸突、樹突部分[4],通過NSE免疫細胞化學染色方法,可以鑒定體外培養的新生大鼠海馬神經元及其純度。本實驗通過NSE免疫化學染色,發現大部分細胞胞漿和突起被染成棕黃色,計數陽性細胞百分率為90%。尼氏體是神經元的特征性結構之一,存在于神經元胞體和樹突內,可被堿性染料染成深色的顆粒和斑塊,它是細胞內的一種蛋白質合成裝置,可作為觀察神經細胞功能狀態的靈敏指標。本實驗觀察到培養的海馬神經元胞質內尼氏體數量較多,說明培養的海馬神經細胞生長良好。NSE免疫細胞化學染色和尼氏染色結果提示,本實驗能培養出純度較高、生長良好的海馬神經元。氟西汀不僅是廣泛應用的抗抑郁藥,而且可以用于治療癲癇、偏頭痛、認知障礙、焦慮障礙、兒童孤獨癥等諸多神經精神疾病。目前研究認為,氟西汀抗抑郁效應與它對海馬的神經保護作用有關,這種作用可能是通過促進海馬細胞增殖來抵抗神經元的萎縮和丟失來實現的。李鸝等[1]研究發現,氟西汀在顯著改善抑郁大鼠抑郁行為的同時,增加了海馬齒狀回神經前體細胞的數目,其增殖也增強,推測促進海馬神經元再生可能是氟西汀治療抑郁癥的機制之一。李云峰等[5]通過慢性應激建立小鼠抑郁模型,認為氟西汀促進海馬齒狀回神經元再生可能是抗抑郁劑共同作用機制之一,并且可能與提高海馬BDNF水平密切相關。一些臨床研究的結果也提示抗抑郁藥具有神經保護作用。Santarelli等[6]

研究發現5-HT再攝取抑制劑能部分逆轉認知功能障礙大鼠海馬齒狀回神經元增殖減少及樹突萎縮,并能促進海馬神經元的再生和存活。Yatte等[7]通過高分辨率的MRI和立體定位方法測定海馬容量,發現持續性接受抗抑郁藥物治療與只在發作時接受治療的患者相比,海馬容量無顯著性降低。

本研究首次以體外培養的新生SD大鼠海馬神經元為模型,通過細胞形態定量分析,探討氟西汀對海馬神經元生長的影響。Chiou等[8]通過MTT方法,發現濃度在55μmol·L-1以下的氟西汀可明顯促進海馬神經干細胞存活,在20μmol·L-1時達到高峰。根據Chiou等[8]的研究結果,本實驗選擇了濃度分別為1、10、20、40μmol·L-1的氟西汀來干預海馬神經元。結果發現不同濃度的氟西汀對海馬神經元形態學指標的影響是不同的,10μmol·L-1氟西汀組海馬神經元與正常對照組相比,有突起的神經元數目增加、最長突起長度增長(P<0.05);40μmol·L-1氟西汀組海馬神經元與正常對照組相比,有突起神經元數目減少(P<0.05),最長突起長度及胞體長徑無顯著性差異(P>0.05);1、20μmol·L-1氟西汀組海馬神經元與正常對照組相比,有突起神經元數目、最長突起長度及胞體長徑無顯著性差異(P>0.05)。結果表明氟西汀對海馬神經元生長的影響有濃度依賴性,濃度過低(1μmol·L-1)對海馬神經元生長的作用不明顯,適當濃度(10μmol·L-1)可以促進海馬神經元的生長發育,濃度過高(40μmol·L-1)則抑制海馬神經元的生長。本實驗中氟西汀濃度為40μmol·L-1即出現對海馬神經元的抑制作用,與Chiou等[8]研究結果不完全一致,表明氟西汀對海馬神經元和神經干細胞的影響存在差異。氟西汀促海馬神經元生長的機制尚不明了,有研究[9]表明,長期給予氟西汀后,大鼠海馬神經元的腦源性神經營養因子(BDNF)mRNA表達明顯高于對照組,而BDNF具有很強的刺激和促進神經細胞生長和分化,維持神經細胞存活和正常功能的作用,Dwivedi等[10]發現氟西汀不僅能夠增加海馬BDNFmRNA的表達,還可以逆轉皮質酮導致的海馬BDNFmRNA表達的降低。據此可以推測,氟西汀促海馬BDNF表達可能是促海馬神經元生長的機制之一。非營養因子家族,包括睫狀神經營養因子、膠質細胞源性神經營養因子、成纖維細胞生長因子等,都能促進海馬神經元的生長,氟西汀是否也可能通過上調這些因子的表達而促進海馬神經元的生長有待研究。

本實驗結果提示,氟西汀可以促進新生大鼠海馬神經元的生長,這為氟西汀治療與海馬損害有關的神經精神疾病提供實驗基礎和理論依據。氟西汀促海馬神經元生長的確切機制尚待進一步探討。

【參考文獻】

[1]李鸝,涂自良,杜士明,等.氟西汀對實驗性抑郁癥大鼠抑郁行為及海馬神經元再生的影響[J].醫藥導報,2006,25(4):280-282.

[2]BrewerGJ.Isolationandcultureofadultrathippocampalneurons[J].JNeurosciMethods,1997,71(2):143-155.

[3]BrewerGJ,TorricelliJR,EvegeEK,etal.Optimizedsur-vivalofhippocampalneuronsinB27-supplementalneuron-basal,anewserum-freemediumcombination[J].JNeurosciRes,1993,35(5);567-576.

[4]SchmechelDE,BrightmanMW,MarangosPJ.Neuronsswitchfromnon-neuronalenolasetoneuron-specificenolaseduringdifferentiation[J].BrainRes,1980,190(1):195-214.

[5]李云峰,劉艷芹,張有志,等.抗抑郁劑對慢性應激小鼠海馬神經元再生的影響[J].中國藥理學通報,2004,20(4):385-388.

[6]SantarelliL,SaxeM,GrossC,etal.Requirementofhipp-ocampalneurogenesisforthebehavioraleffectsofantide-pressants[J].Science,2003,301(5634):805-809.

[7]YatteI,ShelineMD,MokhtarH,etal.Untreateddepressionandhippocampalvolumeloss[J].AmJPsychiatry,2003,160(7):1516-1518.

[8]ChiouSH,ChenSJ,PengCH,etal.Fluoxetineup-regu-latesexpressionofcellularFLICE-inhibitoryproteinandin-hibitsLPS-inducedapoptosisinhippocampus-derivedneuralstemcell[J].BiochemBiophysResCommun,2006,343(2):391-400.

[9]許珂,張永亮,郁繆宇,等.氟西汀對大鼠海馬腦源性神經營養因子基因表達的作用[J].中國藥理學通報,2000,16(4):453-455.

[10]DwivediY,RizaviHS,Pandey,GN.Antidepressantsre-versecorticosterone-mediateddecreaseinbrain-derivedneu-rotrophicfactorexpression:Differentialregulationofspecif-icexonsbyantidepressantsandcorticosterone[J].Neuro-science,2006,139(3):1017-1029.