微生物油脂工藝研究論文

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1材料與方法

1．1材料

微生物油脂（含43％ARA），嘉必優(yōu)生物工程（武漢）有限公司贈(zèng)送；固定化酶（LipozymeRMIM）購于北京諾維信公司；1，3－ARA－DAG、1，2－ARA－DAG購于瑞典Larodan公司；正己烷、乙酸乙酯、冰乙酸、甲醇均為色譜純，購于德國CNW公司；氫氧化鈉、尿素、無水硫酸鎂、鹽酸、乙醇、石油醚、甘油、無水乙醚、4A型分子篩均為分析純，購于國藥化學(xué)試劑集團(tuán)。

1．2試驗(yàn)儀器

分析天平（AUY120，SHIMADZU，Japan）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE－52A，上海亞榮生化儀器）；集熱式恒溫磁力攪拌水浴鍋（DF－101S，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；氣相色譜儀（Agilent7890A，美國Agilent公司）；高效液相色譜儀（Agilent1200，美國Agilent公司）；質(zhì)譜儀（AB4000Q－Trap，美國AB公司）；微型旋渦混合儀（WH－3，上海滬西分析儀器有限公司）。

1．3試驗(yàn)方法

1．3．1尿素包埋法純化微生物油脂于500mL三口瓶中加入40g微生物油脂、200mL無水乙醇、30％氫氧化鈉（以微生物油脂質(zhì)量計(jì)），充氮?dú)獗Ｗo(hù)下，在恒溫水浴加熱攪拌器上80℃水浴回流2h，加入100mL的蒸餾水，攪拌均勻并冷卻至室溫，加鹽酸酸化至pH＝1～2左右［18］。用無水乙醚∶石油醚＝1∶1（V／V）混合溶液萃取2～3次，將萃取液水洗至中性，并旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)相，得到游離形態(tài)的脂肪酸混合物。將其加入到尿素／乙醇溶液中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下回流2h后，迅速轉(zhuǎn)移到250mL的錐形瓶中，密封后于－20℃冰箱中結(jié)晶過夜。所得到的尿素包合物經(jīng)抽濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)和萃取后，經(jīng)無水硫酸鎂脫水得到純化后的脂肪酸。稱重并計(jì)算回收率。并取少量原樣品和尿素包埋后的樣品進(jìn)行甲酯化衍生化處理，經(jīng)GC檢測(cè)尿素包埋前后ARA的含量變化。1．3．2酶法合成富含ARA的1，3－DAG按照一定的摩爾比準(zhǔn)確稱取ARA和甘油于20mL兩口圓底燒瓶中，氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下，將其置于一定溫度的水浴鍋中，待攪拌均勻后，加入一定量的固定化酶LipozymeRMIM和20％（占底物總質(zhì)量）已活化的4A型分子篩，在200r／min的轉(zhuǎn)速下攪拌反應(yīng)，按一定的時(shí)間間隔取樣，采用HPLC－MS－MRM分析酯化后產(chǎn)物及各組分的相對(duì)百分含量。1．3．3脂肪酸的GC檢測(cè)脂肪酸的甲酯化衍生化處理采用本實(shí)驗(yàn)室建立的方法［19］。GC檢測(cè)條件為色譜柱：HP－FFAP毛細(xì)管柱（Agilent，30m×0．25mm×0．5μm）；檢測(cè)器：氫離子火焰化檢測(cè)器（FlameIonizationDetector，F(xiàn)ID）；以氮?dú)鉃檩d氣，進(jìn)樣口壓力為25psi，進(jìn)樣量為1μL，分流比為1∶30；升溫程序：初始溫度210℃保持7min，以20℃／min升溫至230℃并保持5min，總分析時(shí)間為12min；進(jìn)樣口和檢測(cè)器溫度分別為260℃和280℃。采用面積歸一法計(jì)算脂肪酸的相對(duì)百分含量。1．3．4產(chǎn)物中1，3－DAG的HPLC－MS－MRM檢測(cè)產(chǎn)物中1，3－ARA－DAG的HPLC檢測(cè)條件為色譜柱：Agilent－SIL（5μm，2．0mm×250mm）；流動(dòng)相：正己烷／乙酸乙酯／乙酸＝80∶20∶1，（V／V／V）；流速：0．5mL／min；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：10μL；總時(shí)間：20min。檢測(cè)器MS的條件為APCI模式：正離子；CUR：137．9kPa；CAD：medium；NC：27．38kPa；溫度（TEM）：450℃；掃描模式：MRM－EPI；掃描速度：1000u／s；離子源氣體1（ionsourcegas1，GS1）∶344．75kPa；輔助加熱（interfaceheater，ihe）：開；DP：80V；CE：35V和55V；碰撞電壓擺幅（collisionenergyspread，CES）：5V；碰撞室輸出電壓（collisioncellexitprotential，CXP）17V；質(zhì)量范圍：500～1000m／z。采用面積歸一法計(jì)算產(chǎn)物中1，3－DAG的相對(duì)百分含量。1．3．5數(shù)據(jù)分析本實(shí)驗(yàn)采用SAS（statisticalanalysissystem）9．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，取其平均值。用Origin作圖工具，對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

2結(jié)果與分析

2．1尿素包埋法純化微生物油脂中的ARA

尿素包埋法作為一種普遍的富集LC－PUFAs的方法，一直受到人們的青睞［21］。本實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)尿素∶混合脂肪酸∶甲醇比為2g∶1g∶20mL，結(jié)晶溫度為－20℃時(shí)，經(jīng)GC檢測(cè)分析后，ARA的相對(duì)百分含量由原來的43％（如圖1中A）提高到83％，且回收率為54．35％。力為25psi，進(jìn)樣量為1μL，分流比為1∶30；升溫程序：初始溫度210℃保持7min，以20℃／min升溫至230℃并保持5min，總分析時(shí)間為12min；進(jìn)樣口和檢測(cè)器溫度分別為260℃和280℃。采用面積歸一法計(jì)算脂肪酸的相對(duì)百分含量。1．3．4產(chǎn)物中1，3－DAG的HPLC－MS－MRM檢測(cè)產(chǎn)物中1，3－ARA－DAG的HPLC檢測(cè)條件為色譜柱：Agilent－SIL（5μm，2．0mm×250mm）；流動(dòng)相：正己烷／乙酸乙酯／乙酸＝80∶20∶1，（V／V／V）；流速：0．5mL／min；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：10μL；總時(shí)間：20min。檢測(cè)器MS的條件為APCI模式：正離子；CUR：137．9kPa；CAD：medium；NC：27．38kPa；溫度（TEM）：450℃；掃描模式：MRM－EPI；掃描速度：1000u／s；離子源氣體1（ionsourcegas1，GS1）∶344．75kPa；輔助加熱（interfaceheater，ihe）：開；DP：80V；CE：35V和55V；碰撞電壓擺幅（collisionenergyspread，CES）：5V；碰撞室輸出電壓（collisioncellexitprotential，CXP）17V；質(zhì)量范圍：500～1000m／z。

2．2產(chǎn)物中1，3－DAG的HPLC－MS－MRM檢測(cè)

脂肪酸與甘油酯化反應(yīng)的產(chǎn)物中有TAG、1，2－DAG、1，3－DAG、1（2）－MAG和未反應(yīng)的脂肪酸及甘油。本實(shí)驗(yàn)就產(chǎn)物中主要的產(chǎn)物TAG、1，2－DAG、1，3－DAG進(jìn)行定量檢測(cè)，通過優(yōu)化色譜條件，最終確定流動(dòng)相：正己烷／乙酸乙酯／乙酸＝80∶20∶1，（V／V／V）；流速：0．5mL／min；進(jìn)樣量：10μL；總時(shí)間：20min時(shí)，分離效果較好。

2．3脂肪酶催化合成

1，3－DAG的單因素實(shí)驗(yàn)2．3．1反應(yīng)時(shí)間對(duì)酶促酯化合成1，3－DAG的影響本實(shí)驗(yàn)在甘油與ARA摩爾比為1∶2，脂肪酶添加量為5％（以底物總質(zhì)量計(jì)），反應(yīng)溫度為50℃的條件下，定期取樣分析產(chǎn)物中1，3－DAG含量的變化。結(jié)果如圖3所示，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，底物中1，3－DAG的相對(duì)百分含量呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)，并在2h時(shí)，達(dá)到最大值68．9％；2h后，1，3－DAG的相對(duì)百分含量明顯下降，到10h時(shí)降為16．1％并趨于穩(wěn)定。這可能是因?yàn)殡S著反應(yīng)時(shí)間的延長，1，3－DAG發(fā)生了酰基轉(zhuǎn)移，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為1，2－DAG或者TAG，從而使反應(yīng)產(chǎn)物中1，3－DAG的含量降低。因此，2h為最佳的反應(yīng)時(shí)間。2．3．2反應(yīng)溫度對(duì)酶促酯化合成1，3－DAG的影響本實(shí)驗(yàn)在反應(yīng)時(shí)間（2h）、脂肪酶添加量（5％）和底物摩爾比（甘油／ARA＝1∶2）一定的條件下來優(yōu)化溫度對(duì)酯化合成1，3－DAG的影響。由圖4可知，隨著反應(yīng)溫度的升高，1，3－DAG的相對(duì)百分含量呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)，并在50℃時(shí)達(dá)到最大，為68．3％。隨著溫度的繼續(xù)升高，其含量呈現(xiàn)遞減的趨勢(shì)。這可能是由于溫度的升高促使脂肪酶的活力逐漸提高，而且溫度升高有利于底物混合均勻，降低反應(yīng)體系的黏度，從而更有利于酯化反應(yīng)的進(jìn)行。然而，隨著溫度進(jìn)一步升高，酰基轉(zhuǎn)移率也相應(yīng)的增加，從而使1，3－DAG的相對(duì)百分含量降低；此外，長時(shí)間的高溫反應(yīng)環(huán)境條件會(huì)造成部分酶活力喪失，甚至?xí)斐葾RA發(fā)生氧化，均可能導(dǎo)致1，3－DAG相對(duì)百分含量的降低。因此，綜合考慮以上因素，50℃作為反應(yīng)溫度較佳。2．3．3不同底物摩爾比對(duì)酶促酯化合成1，3－DAG的影響在反應(yīng)溫度50℃、反應(yīng)時(shí)間2h及脂肪酶添加量為5％的條件下，考察不同底物摩爾比對(duì)反應(yīng)結(jié)果的影響。由圖5可知，在一定范圍內(nèi)，隨著體系中ARA含量的增加，產(chǎn)物中1，3－DAG的相對(duì)百分含量逐漸增加，并在甘油／ARA為1∶2時(shí)，1，3－DAG的相對(duì)百分含量最高達(dá)72．1％。然而隨著ARA的繼續(xù)增加，產(chǎn)物中1，3－DAG的量開始降低，這可能是過量的ARA與產(chǎn)物中的1，3－DAG進(jìn)一步發(fā)生反應(yīng)生成了TAG。因此綜合考慮，反應(yīng)體系中底物摩爾比甘油／ARA采用1∶2為宜。2．3．4脂肪酶添加量對(duì)酶促酯化合成1，3－DAG的影響在反應(yīng)時(shí)間2h、反應(yīng)溫度50℃和底物摩爾比（甘油／ARA）為1∶2的條件下，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)考察脂肪酶添加量對(duì)產(chǎn)物中1，3－DAG的影響。如圖6所示，脂肪酶的添加量對(duì)反應(yīng)有顯著影響。脂肪酶添加量在1％～5％的范圍內(nèi)，1，3－DAG的相對(duì)百分含量隨著脂肪酶添加量的增加而增加，并在酶添加量為5％時(shí)，1，3－DAG相對(duì)百分含量達(dá)到最大值82．8％；當(dāng)繼續(xù)增加酶量到10％時(shí)，1，3－DAG的含量有所降低，這可能是因?yàn)榈孜镆呀?jīng)被脂肪酶分子所飽和，且隨著脂肪酶添加量的增加，一定程度上也增加了發(fā)生酰基轉(zhuǎn)移的幾率，將1，3－DAG轉(zhuǎn)化為1，2－DAG或者TAG。綜合考慮以上因素，最佳的脂肪酶添加量為5％。

2．4響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2．4．1回歸方程的建立與分析基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取溫度（X1）、時(shí)間（X2）、酶加量（X3）及底物摩爾比（X4）為自變量，以產(chǎn)物中1，3－DAG相對(duì)百分含量（以峰面積表示）Y為響應(yīng)值，采用中心組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，對(duì)所獲得的單因素條件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。以Box－Benheken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)獲得數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，在此基礎(chǔ)上利用SAS9．0軟件對(duì)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合分析，得到1，3－DAG含量的動(dòng)態(tài)參數(shù)方程如下：Y＝152300＋20562．58X1＋36337．5X2＋47125X3＋1780．25X4－20213．37X1X1＋1502．25X1X2＋12545X1X3－12985X1X4－38758．75X2X2＋10302．5X2X3＋12946．75X2X4－30572．5X3X3＋15107．5X3X4－20180．37X4X4。從回歸方程模型系數(shù)的方差分析結(jié)果（表3）可以看出，模型P＝0．0063＜0．01，說明回歸模型方程極顯著。模型的R2值為0．8407，表明優(yōu)化好的參數(shù)值有大約84．07％來源于回歸方程模型，同時(shí)模型的失擬項(xiàng)P＝0．544869＞0．05，符合失擬項(xiàng)不顯著的要求。這表明此模型可以很好的用來預(yù)測(cè)最優(yōu)化條件。且根據(jù)方差分析可知，各因子對(duì)1，3－DAG的影響主次關(guān)系為X3＞X2＞X1＞X4，即酶添加量最大，其次為時(shí)間、溫度，底物摩爾比最小。2．4．2響應(yīng)面優(yōu)化及模型驗(yàn)證為了更直觀地顯示各因素之間的關(guān)系，對(duì)經(jīng)響應(yīng)面法優(yōu)化后的結(jié)果進(jìn)行規(guī)范分析，考察SAS9．0所擬合的響應(yīng)曲面形狀，獲得響應(yīng)面立體圖及對(duì)應(yīng)的等高線圖，如圖7所示，模型具有穩(wěn)定點(diǎn)，各因素間的交互作用較明顯。經(jīng)擬合分析后，得出酶促酯化合成1，3－DAG的穩(wěn)定值及最優(yōu)條件，最佳工藝參數(shù)為：X1（溫度）57℃，X2（時(shí)間）2．7h，X3（酶量）7．9％，X4（摩爾比）2．5∶1。在此最優(yōu)條件下，進(jìn)行三次重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，1，3－DAG的實(shí)際平均峰面積為9．8×104，與理論值（1．0×105）非常接近，說明該預(yù)測(cè)模型是可靠的；并且，此時(shí)1，3－DAG在整個(gè)DAG和TAG混合物中的相對(duì)百分含量為73．5％，且1，3－ARA－DAG含量為38．1％。

3結(jié)論

本文系統(tǒng)地研究了無溶劑體系中，以富含ARA的微生物油脂為原料，通過酶促酯化反應(yīng)合成富含ARA的1，3－DAG的工藝。得出合成富含ARA的1，3－DAG的最佳工藝條件為：反應(yīng)溫度57℃，反應(yīng)時(shí)間2．7h，酶添加量7．9％，ARA與甘油的底物摩爾比為2．5∶1，在此最優(yōu)條件下，1，3－DAG在反應(yīng)產(chǎn)物中DAG和TAG混合物中的相對(duì)百分含量為73．5％，且1，3－ARA－DAG含量為38．1％，結(jié)果較為理想。本研究所建立的酶法合成富含ARA的1，3－DAG的工藝研究，對(duì)進(jìn)一步開發(fā)利用微生物油脂資源，提高微生物油脂的附加值有著非常重要的實(shí)際意義。這方面研究將在今后生產(chǎn)有利于人體健康和食品加工的專用油脂、富含LC－PUFA的功能性油脂和結(jié)構(gòu)脂質(zhì)產(chǎn)品的研發(fā)等領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。

作者：劉四磊劉偉董緒燕魏芳王湘呂昕鐘娟吳琳陳洪單位：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所湖北省脂質(zhì)化學(xué)與營養(yǎng)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室華中科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院