動物行為學研究方法范文
時間：2024-01-02 17:55:54
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篇1
1 神經行為學在藥理評價中的應用
1.1 抗腦卒中藥物的評價
一般用運動行為實驗對腦栓塞動物模型（如大鼠）進行卒中后運動和協調能力的評價，從而判定藥物是否對腦卒中后神經損傷恢復有效。運動整合及協調能力實驗主要包括：平衡木實驗、轉棒實驗、肌力實驗、網屏實驗、肢體對稱實驗、肢體放置實驗、前肢放置檢測、平行杠實驗、爬繩實驗、爬梯實驗、前爪伸屈實驗、步態分析實驗等。然而，大腦尾狀核、皮層和紋狀區對運動 - 感覺信息的處理和整合起一定作用，這些區域在大腦中動脈梗死后很容易受損，并累及周圍區域如肢體的皮層、額葉和顳葉。因此，目前認為缺血損傷后動物模型的神經行為學評價除了評估一般感覺運動功能，還應該將認知實驗加入評估中。有證據表明，卒中后認知缺陷可持續超過一般的感覺運動缺陷。認知實驗主要包括 Morris 水迷宮、放射狀迷宮和 T 迷宮。
腦卒中動物模型在不同時期的行為學表現不同，因此行為學評價抗腦卒中藥物，相關行為學指標表現出的敏感性，同時也存在著廣泛的偏差，組織學檢查結果和行為學實驗相關，另一些則無關或相反。因此，當前的評價方法尚不能全面的反映腦卒中的生理病理狀態，這就需要對模型生理病理指標與行為學指標相關性進行研究，綜合多種方法進行評估，尋找最敏感穩定的行為學指標。
1.2 抗精神病藥物的評價
焦慮模型主要分為 2 類：非條件反射模型和條件反射模型。其中比較經典的研究方法基于動物有畏懼空曠場地的天性和其活動具有趨避性而建立的曠場實驗、避暗實驗、高架十字迷宮和 Vogels 飲水沖突模型。
目前抑郁癥行為學評價方法主要包括強迫游泳實驗、懸尾實驗、空場實驗、獲得性無助實驗、新奇抑制攝食實驗、糖水偏愛實驗、間斷性行為實驗、睡眠干擾實驗等。其中，動物強迫性游泳和懸尾測試是評價抗抑郁藥作用最常用的方法，因其快速、方便、對多種抗抑郁藥物有效，被廣為接受和應用。然而，也有學者認為動物漂浮既可以是抑郁的表現，也可以是一種適應機制，動物以此節約能量，漂浮更長的時間，以維持更長的存活時間。
由于應激是導致焦慮和抑郁發生的重要原因之一，應激對心理情感、認知功能及反應判斷能力等行為活動均產生影響，研究應激致動物行為方法主要有社會交互實驗，動物可出現社會逃避及興趣缺失的抑郁樣行為，此外還有動物束縛實驗、糖水偏愛實驗、條件性防御掩埋實驗、聽覺驚跳實驗等。
1.3 抗衰老藥物的評價
神經退行性病變是由于神經元進行性變性死亡導致的以中樞神經系統損害為主的神經系統疾病，與年齡相關的大腦退行性變化是大腦中樞神經系統在生長、發育、成熟之后走向衰老過程中而表現的生物老化的正常生理現象。其最突出的臨床表現是記憶和學習能力下降，因此抗衰老藥物行為學評價主要考察對學習記憶障礙的作用。主要研究方法包括空間記憶和非空間記憶，在空間學習記憶中，采用 Morris 水迷宮、八臂迷宮、T 型迷宮、輻射式迷宮等方法。近年來新的認知方法出現，可以對空間學習記憶和非空間學習記憶進行測試，如物體認知測試系統，包含新物體的識別、新物置識別以及情景記憶和時序記憶。其中新物體的識別、情景記憶和時序記憶屬于空間記憶；新物置識別屬于非空間記憶。在條件反射方法中，非條件刺激可以是懲罰性的也可以是獎勵性的。使用懲罰性條件刺激的行為檢測方法如穿梭、跳臺、避暗等已被廣泛應用于學習記憶和鞏固相關行為研究。但這些方法檢測的學習記憶能力大多是基于對環境刺激的被動反應，而且需要給予懲罰性 / 傷害性刺激使動物完成學習記憶，對動物的生理及心理影響較大，同時影響神經遞質的釋放。而利用獎勵物質的獎賞效應，大腦會向負責決策的區域發送獎賞信號，形成好的記憶。獎賞效應能使機體的認知能力進一步提升，形成良性循環，易化條件反射的形成。
1.4 其他藥物的評價
神經行為學方法除了主要用于以上藥物的評價，還用于抗疲勞藥物、促進睡眠藥物以及鎮痛藥物的評價中，抗疲勞藥物大多具有興奮中樞神經系統的作用，行為學檢測主要采用游泳實驗、轉棒實驗。促進睡眠藥物主要采用閾下催眠實驗。鎮痛藥物根據作用部位不同可分為中樞鎮痛藥和外周鎮痛藥，用于評價外周藥物鎮痛作用的方法主要有小鼠醋酸扭體實驗；評價中樞鎮痛藥物的方法熱板法、熱輻射甩尾實驗以及福爾馬林測痛實驗，目前新的研究方法有步態行為測試，通過研究動物運動的步態及足底壓力評價藥物的治療作用。
2 神經行為學在藥物安全性評價的應用
2.1 在一般毒性評價中的應用
神經行為學實驗可以發現一些神經毒性的相關終點，長期毒性實驗中增加對特異性終點的評價，可以提高實驗動物的利用率，縮短危險評價所用的時間，并獲得額外的數據。如評價抗抑郁藥物的長期毒性實驗可增加對動物自主活性的觀察指標。而在一些不確定是否有神經毒性的創新藥物評價中，神經毒性篩查也可與長期毒性實驗相組合，篩查的目的在于確定是否需要進行附加的更加深入的神經毒理學實驗，如步態異常有助于毒性部位的確定，例如下運動神經元疾病可致跨越步態；剪形步態和僵硬步態說明上運動神經元損害；小腦功能不良可致共濟失調及步態蹣跚。關于神經系統的毒性特征，猶如靶器官毒性一樣，能隨染毒期限的長短表現不同。神經毒性作用的意義取決于它的可逆性，一般來說，不可逆作用較可逆作用嚴重，神經系統的區域對生理功能影響較其他系統更為重要。
2.2 在安全性藥理評價中的應用
由于毒物對神經系統的作用范圍很廣，一般采用功能組合實驗來評價藥物對神經系統的安全性。目前動物神經行為測試還沒有一套標準模式的神經行為功能測試組合，只是經濟合作與發展組織（OECD）在感覺、運動、認知等方面推薦了一些測試方法，綜合評價被測化學物質的神經行為毒性。國家食品藥品監督管理總局（CFDA）規定中樞神經系統藥物安全性評價可定性和定量評價給藥后動物的運動功能、行為改變、協調功能、感覺 / 運動反射和體溫的變化等，以確定藥物對中樞神經系統的影響。當核心組合實驗及文獻報道提示藥物存在潛在的與人體安全性有關的不良反應時，應進行追加和 /或補充的安全藥理學研究。追加的安全藥理實驗是除了核心組合實驗外，反映受試物對中樞神經系統、心血管系統和呼吸系統的深入研究。如追加的安全藥理學實驗對中樞神經系統的影響包括對行為、學習記憶、神經生化、視覺、聽覺和 / 或電生理等指標的檢測。
2.3 藥物依賴性的評價
幾乎所有的依賴性藥物，如阿片、酒精、可卡因、苯丙胺、尼古丁等都會使濫用成癮者戒斷后出現情緒問題，包括抑郁、焦慮、缺乏等，是藥物依賴患者急性或慢性戒斷期常見的特征，也是引起藥物依賴者對藥物產生心理依賴和復吸的重要原因。藥物依賴與沖動行為有著密切的聯系，藥物依賴能夠使沖動行為發生變化；同時可以誘導動機獎賞系統及學習記憶相關腦區內神經元結構發生可塑性改變，該變化在停藥后仍可長期存在。對于精神依賴性由于是機體對藥物內在的感知綜合體現，如動物心理滿足感、欣，同時，本身沖動性不同的個體對依賴藥物的易感性存在個體差異。實驗評價難度較大，目前評價方法主要結合抑郁、焦慮、學習記憶等神經行為學方法進行研究，其中應用較多的是操作式行為實驗方法，如獎賞實驗及采用自身給藥模擬人的覓藥行為和藥物辨別行為，因該方法需要儀器設備復雜，實驗周期較長。目前廣泛用于藥物精神依賴的評價方法是條件位置偏愛實驗，該方法經濟簡便。
2.4 在發育神經毒性評價中的應用
發育神經毒性（DONT）評價是藥物臨床前安全性評價的重要組成部分，是指個體在發育過程中暴露于某些神經毒性物質后引起的神經系統結構和功能的異常改變，進而引起個體的感覺、運動及各種認知功能改變，表現為個體發育產生某些缺陷。常見的有行為改變、智力低下、精神失常、孤僻癥等。神經毒性藥物評價通常與生殖發育毒性研究相結合，以母體染毒對仔代或在仔代實驗中進行神經行為學測試。目前常用的研究動物為大鼠。但是，非人靈長類因與人的行為活動最為相似，是研究發育神經毒性最適合的動物。非人靈長類神經行為學的測試方法包括學習能力、記憶能力、計劃控制行為、情緒行為能力、信息處理能力、社會行為、感知功能、視動協調能力以及視覺空間定位能力等測試。其中使用照片、幻燈片、計算機化圖象及視頻學習行為被越來越多地用在非人靈長類動物發育研究中。然而，由于這些介質都被設計來模擬自然色彩，鑒于人類與非靈長類動物不同物種之間和內部存在的色彩感覺的差異，有必要考慮識別這些介質的適用性變化，使用的攝影和錄像的刺激應該在復制自然的顏色接近該物種的視覺感官。研究藥物對靈長類動物的發育毒性行為變化可以為人類精神發育病理學提供獨特的見解。
篇2
[關鍵詞] 感染性腦損傷；橙皮苷；強迫游泳
[中圖分類號] R-33 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2013）11（c）-0031-02
Influce of hesperidin on forced swimming test of mice with cerebral injury induced by LPS
WU Jian1 LIU Hong-zhi1 WEN Xiang-ru2 FU Yan-yan1 ZHANG Lei3 SUN Ying3 ZHANG Fang1 LIU Yong-min2 DONG Hong-yan1 LIU Yong-hai3 SONG Yuan-jian1
1.Neurobiology Research Center， Basic Courses School of Xuzhou Medical College in Jiangsu Province， Xuzhou 221004， China；2.Teaching and Research Section of Chemistry， Public Education School of Xuzhou Medical College in Jiangsu Province， Xuzhou 221004， China；3.Department of Neurology， Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College in Jiangsu Province， Xuzhou 221004， China
[Abstract] Objective To investigate the influence of hesperidin on forced swimming test of mice with cerebral injury induced by lipopolysaccharide （LPS）. Methods 45 ICR mice at 3 weeks were evenly divided into saline group， LPS group and LPS + hesperidin group （Hesp） in random. Mice from 3 groups in accumulative distance and cumulative time within 5 minutes′ swimming were tested by ZH-QPT forced swimming test video analysis system. Results Compared with saline group， the accumulative distance of swimming in LPS group was obviously shorter， but there was no significant change in cumulative time in the two groups. In comparison with the LPS group， the accumulative distance of swimming in LPS+Hesp group became longer， but without obvious changes in cumulative time. Conclusion Hesperidin can remarkably prolong the distance in forced swimming test in mice with infectious cerebral injury.
[Key words] Infectious cerebral injury； Hesperidin； Forced swimming
腦部細菌或病毒感染是導致新生兒、幼兒腦損傷的重要原因之一。腦損傷后常遺留運動功能障礙、認知行為障礙等神經系統后遺癥[1]。因此，探究感染性腦損傷后行為學指標的改變有重要意義。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革蘭氏陰性細菌細胞壁的主要成分，為脂質和多糖的復合物，屬內毒素，具有神經毒性。幼年小鼠的血-腦脊液屏障（blood brain barrier，BBB）尚不健全，LPS會造成小鼠感染性腦損傷。可應用LPS建立小鼠的感染性腦損傷模型，并借助這一模型研究感染性腦損傷后行為學指標的改變。橙皮苷（hesperidin，Hesp）在柑桔類植物的果實中廣泛存在，具有多種功能，如抗炎、鎮痛、抗氧化、抗癌等[2-3]，另有很好的神經保護作用[4]。它是否會影響感染性腦損傷動物的行為，目前未見報道。
強迫游泳行為學實驗可用于初步研究神經或精神類藥物的作用，也可初步篩選相關藥物[5]。通過強迫游泳實驗，考察LPS誘導的感染性腦損傷小鼠的行為學變化，以及橙皮苷對該行為學變化的影響，有助于認識和理解腦損傷導致的行為變化規律，為感染性腦損傷的診斷、治療和康復提供新的思路和方法。
1 材料與方法
1.1 儀器和試劑
LPS購自Sigma公司，Hesp購自鄭州荔諾生物科技有限公司；強迫游泳實驗設備采用淮北正華公司的ZH-QPT型強迫游泳實驗視頻分析系統，硬件系統尺寸為直徑10 cm，高30 cm；記錄分析軟件采用Stoelting公司的Any-maze system，版本為4.72版。
1.2動物及分組
3周齡、雄性健康ICR小鼠45只，體重為8～11 g，由徐州醫學院實驗動物中心提供。將小鼠隨機分為3組，每組15只：生理鹽水（saline）組，腹腔注射生理鹽水；LPS組，腹腔注射LPS；Hesp組，即先用LPS處理，后給予Hesp。
1.3方法
1.3.1 動物模型制備 saline組小鼠腹腔注射生理鹽水；LPS組腹腔注射LPS生理鹽水溶液，劑量為5 mg/kg；LPS+Hesp組先腹腔注射LPS（5 mg/kg），0.5 h后Hesp（劑量為200 mg/kg，混懸于0.5%羥甲基纖維素鈉水溶液中）灌胃。將以上各組小鼠6 h后置于ZH-QPT型強迫游泳實驗視頻分析系統中觀察并記錄其行為學指標。
1.3.2 強迫游泳實驗行為研究 實驗環境的水溫20～25℃，首先將小鼠置于水中適應2 min，再記錄隨后5 min的行為，用Any-maze system軟件記錄分析活動指標，包括活動路程、累積活動時間及累積靜止時間。
1.3.3統計學方法 采用SPSS 13.0統計軟件，計量資料以x±s表示，組間比較采用方差分析，以P
2結果
saline組小鼠在5 min內游動了（14.49±4.08）m，LPS處理后，小鼠游動路程大幅縮短，僅（6.96±1.74）m，差異有統計學意義（P
表1 各組小鼠在強迫游泳實驗視頻分析系統中的活動路程、累積游動時間和累積靜止時間的比較（x±s）
與saline組比較，aP
圖1 小鼠強迫游泳實驗視頻分析系統中的狀態圖
A.靜止狀態；B.活動狀態
3 討論
腦損傷中，除創傷性損傷外，感染性腦損傷、漸進性腦損傷的發生、進展的機制多樣而復雜。感染性腦損傷常見于新生兒和幼兒，腦損傷可能導致幼兒精神神經異常和行為障礙，治療困難[6]，康復往往采用高壓氧等方法[7]，常會導致患兒認知障礙、精神神經行為異常。幼年小鼠的血-腦脊液屏障不健全，本研究用LPS處理雄性ICR小鼠，建立了感染性腦損傷模型。
除強迫游泳實驗外，研究動物的行為變化還可采用曠場實驗、水迷宮實驗、懸尾實驗等，強迫游泳實驗是最早用于研究抑郁類行為的方法[8]，結果可靠性強。不同性別小鼠的強迫游泳行為不同[9]，本研究討論雄性ICR小鼠的強迫游泳行為。溫度等理化因素對實驗動物的強迫游泳行為也有影響，本研究控制實驗水溫為20～25℃。結果表明感染性腦損傷小鼠在強迫游泳實驗中行為異常，雖然累積靜止時間沒有變化，但是活動路程顯著降低。
Hesp是治療心血管病的藥物，是多效藥物，有研究表明其有神經保護作用，但作用機制不明，對動物的行為學有何影響，目前未見報道。本研究通過強迫游泳實驗發現Hesp可以逆轉LPS對小鼠游泳行為的影響，在維持累積靜止時間不變的同時，顯著增加活動路程。
因此，從強迫游泳實驗結果看，Hesp可以有效減輕LPS誘導的小鼠游泳行為障礙，其中所涉及的分子機制，本實驗室正在進一步研究。
[參考文獻]
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篇3
關鍵詞：帕金森病；大鼠；6-羥基多巴胺
帕金森病（PD）是常見的中老年人中樞神經系統退行性疾病，其病因及發病機制目前尚不清楚， 研究認為可能與遺傳、環境因素、線粒體功能障礙、興奮性氨基酸、氧化應激、過多的自由基形成及神經生長因子缺乏等有關，是多種機制協同作用的結果[1-2]。偏側6-OHDA損毀模型是目前使用最多的PD動物模型之一，其在癥狀、病理、生化方面的表現與人類PD有不少相似之處，但該模型的損傷程度因6-OHDA的劑量、濃度、注射位點不同而存有爭議，特別是對損傷早期大鼠行為學方面的觀察比較缺乏。本實驗通過觀察6-OHDA損傷早期PD大鼠行為學及黑質部位組織學的變化特點，驗證損傷早期PD大鼠模型的穩定性及可靠性。
1資料與方法
1.1一般資料 選用健康雄性SD大鼠40只， 體重 250～300 g，由南通大學實驗動物中心提供。6-OHDA、抗壞血酸干粉劑、鹽酸阿樸嗎啡（apomorphine）、抗酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase， TH）抗體均購于Sigma公司。
1.2方法
1.2.1實驗動物分組 40只SD大鼠隨機分為三組：①空白對照組（n=8）；②6-OHDA模型組（n=24）：分為24 h組（n=8）、7 d組（n=8）和28 d組（n=8）3個亞組；③假手術組（n=8）。
1.2.2動物模型 模型組大鼠用復合麻醉劑（含戊巴比妥鈉、丙二醇、硫酸鎂等，0.25 mL/100 g體重）腹腔注射麻醉，待大鼠后肢回縮反射及角膜反射消失后，將其頭部水平位固定在腦立體定位儀上，剪除顱頂鼠毛，碘酒、酒精消毒皮膚，沿中線切開一長約2cm切口，充分暴露前囟，參照Paxinos & Watson（1996）《大鼠腦立體定位圖譜》確定左側前腦內側束（mfb）三維坐標位置，選取mfb區坐標：前囟后2.8 mm，中線左側2.0 mm，硬膜下8.2 mm。根據注射位點確定鉆顱部位，手術刀尖小心鉆開一直徑約2 mm顱骨孔，微量進樣器緩慢進針至靶點，留針10 min，以9 ng/s的速度注入2 μg/μL 6-OHDA 4 μL（含0.02%抗壞血酸），注射完畢后留針5min，以1mm/min的速度退針。手術完畢，用明膠海綿堵塞顱骨孔，適量青霉素涂敷創口，消毒縫合皮膚，放回籠中飼養。并于24 h、7 d、28 d分別檢測大鼠行為學和組織學的改變。假手術組同法予含0.02%抗壞血酸的生理鹽水4 μL，空白對照組不作任何處理。
1.2.3行為學檢測
1.2.3.1跨步調節試驗[3] 將大鼠身體的后半部分拖起 ，并使大鼠身體重量僅由一側前肢支撐 ，記錄10s內大鼠這一前肢走步次數 ，然后同法檢測另一前肢的情況，以損傷對側前肢行走次數所占比例（損傷對側前肢行走次數/（損傷對側前肢行走次數+損傷側前肢行走次數））為評價指標。
1.2.3.2姿勢不對稱性試驗[4] 握住鼠尾的中后部將其提起，懸空于實驗臺上方約10 cm處，使大鼠頭向下處于垂直狀態， 以其偏離垂直軸不超過10°為垂直位（標準位），記錄大鼠頭或上身左右擺動的情況，以擺動偏離垂直位并再返回到垂直位記數為1次。觀察45 s內大鼠頭或身體轉動的方向和次數，以向損傷對側擺動的次數所占比例（損傷對側擺動的次數/（損傷對側擺動的次數+損傷側擺動的次數））為評價指標。
1.2.3.3阿撲嗎啡誘發旋轉試驗 模型組分別于術后24 h、7 d、28 d于動物腹腔內注射阿撲嗎啡0.5 mg/Kg 誘發大鼠向右側（健側）旋轉，于阿撲嗎啡注射后5 min開始記錄，持續記錄30 min。以24 h誘發旋轉次數210次/30 min為合格模型。
1.2.4組織學檢測
1.2.4.1動物灌注、固定、取材、切片 各組大鼠在最后一次行為學檢測后，用復合麻醉劑麻醉，剪開大鼠胸腔，經主動脈快速灌注生理鹽水（37℃）150～200 mL沖洗，至大鼠肝臟發白，流出液基本無色為止。隨即灌注4%甲醛（4℃）先快速灌注 200 mL，再緩慢灌注300 mL，至頭與四肢均已發硬。斷頭取腦，置于4%甲醛，放4℃冰箱固定4 h，再依次置入20%及30%蔗糖磷酸鹽緩沖液內，存4℃冰箱至腦塊沉入瓶底。取中腦黑質組織塊進行冠狀連續冰凍切片，片厚20 μm。
1.2.4.2抗TH染色 作漂片SABC法染色，具體步驟依次為：冰凍切片用0.01 M（pH7.4）磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗3次，5 min/次。0.3% H2O2抑制內源性過氧化物酶活性， 0.02 mol/L EDTA（95℃）復性（2 min），非免疫的正常羊血清，室溫下孵育30 min，抗TH抗體（1∶1000，抗體稀釋液稀釋），37℃孵育4 h， SABC試劑，室溫下孵育1 h， DAB顯色（陽性產物為棕黃色）。以上各步驟之間均以0.01M（PH7.4）PBS漂洗3次，5 min/次，正常羊血清與抗TH抗體孵育之間不漂洗。顯色后貼片，自然風干，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。
1.2.4.3 TH陽性神經元記數 各組大鼠取包含黑質致密部最明顯的中腦切片，在×100倍顯微鏡下計數兩側黑質有完整細胞體的TH陽性細胞，計算左側與右側黑質TH陽性細胞數的百分比（左側黑質TH陽性細胞數/右側黑質TH陽性細胞數×100% ）。參照蔡文琴等[5]介紹的神經細胞計數方法進行細胞計數。
1.2.5統計學分析 數據結果均使用 SPSS13.0軟件進行統計學分析。數據資料采用均數±標準差（x±s）表示。單因素方差分析進行差異性檢驗，P
2結果
2.1行為學觀察 對照組及假手術組大鼠經阿撲嗎啡誘發后無旋轉行為，也未出現非藥物誘發的行為學改變。模型組大鼠在注射6-OHDA后數小時即出現損毀側肢體動作減少，身體重心偏向損毀側，并出現身體向損毀側緩慢旋轉，不能進行直線或隨意爬行。
2.1.1跨步調節試驗 對照組及假手術組大鼠兩側前肢10 s內跨步次數基本相同，模型組大鼠在左側前腦內側束注射6-OHDA后24 h跨步調節試驗評分出現有意義減少，7 d及28 d評分進一步減少，見表1。
2.1.2姿勢不對稱試驗 在左側前腦內側束注射6-OHDA后24 h，姿勢不對稱試驗結果顯示模型組大鼠頭部和身體出現向右側轉動次數有意義增加，7 d及28 d姿勢不對稱試驗評分進一步增加，對照組及假手術組大鼠頭部和身體向兩側轉動次數大致相同，見表2。
2.1.3阿撲嗎啡誘發旋轉試驗 在注射6-OHDA后24 h，阿撲嗎啡腹腔注射誘發大鼠以右側后肢為支點，首尾相接向右側旋轉，30 min旋轉次數210次/30 min，對照組及假手術組大鼠未誘發出旋轉行為，見表3。
2.2組織學檢測 抗TH染色結果顯示，在左側前腦內側束注射6-OHDA后24 h，大鼠左側黑質TH陽性神經元數目出現有意義減少，高倍鏡下見少部分神經元出現胞體腫脹、核膜界限消失等變性征象，部分神經軸突斷裂、錯亂；7 d和28 d時大鼠左側黑質TH陽性神經元幾乎消失，殘留的TH神經元表現出染色質濃縮壞死現象，神經軸突散在稀疏；模型組大鼠右側黑質TH陽性神經元數目同時也有部分減少；對照組及假手術組大鼠兩側黑質TH陽性神經元無明顯改變，見表4，圖1。
3討論
研究PD需要建立穩定可靠的模型。6-OHDA是一種選擇性中樞兒茶酚胺能神經元毒性物質，具有很強的呼吸鏈抑制作用，偏側6-OHDA損毀模型是目前使用最多的PD模型之一。1970年Ungerstedl[6]首先報道了應用6-OHDA成功制備大鼠偏側PD模型，這種模型能夠在多巴胺能藥物的誘發下產生旋轉行為，以便于判斷模型成功與否。阿撲嗎啡是多巴胺（dopamine，DA）受體激動劑，能夠引起該模型向健側旋轉，這是由于損傷側紋狀體多巴胺含量下降，多巴胺D2受體代償性大量增加，且敏感性增高，出現超敏現象[7]，此時應用DA受體激動劑使損傷側興奮作用占優勢而產生向健側旋轉。
PD的神經保護治療需要早期進行，評估6-OHDA損傷早期大鼠行為學變化，可進一步明確模型是否成功及神經保護性治療是否有效。阿撲嗎啡誘發旋轉試驗結合非藥物誘發的行為學試驗，其評估結果更加有效、可靠[8]。在偏側前腦內側束注射6-OHDA后數小時，大鼠出現肢體動作減少，身體重心偏向損毀側，并出現身體向損毀側不自主旋轉，不能進行直線或隨意爬行，6-OHDA注射后24 h大鼠跨步調節試驗和姿勢不對稱試驗出現有意義改變，腹腔注射阿撲嗎啡后可誘導大鼠在原地向健側旋轉，以健側后肢為支點，首尾相接，形成環狀，但旋轉次數
偏側前腦內側束注射6-OHDA后24 h大鼠出現行為學和組織學方面的變化，為檢測模型的穩定性和可靠性，實驗設立6-OHDA損傷后7d和28d組。結果顯示：大鼠行為學改變較24 h組更加顯著，阿撲嗎啡誘發旋轉次數>210次/30 min，符合成功PD模型標準；7 d和28 d時大鼠左側黑質TH陽性神經元減少90%。偏側前腦內側束注射6-OHDA后，損傷對側有部分DA能神經元丟失，可能與藥物的滲透作用或經血液循環等有關。
綜上所述，通過早期行為學檢測，可為神經保護性研究確立合格的PD模型，避免了藥物提前干預存在的藥物顯效與模型失敗之間的爭議。
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篇4
【摘要】 目的：探討中藥固本祛風湯治療變應性鼻炎（AR）豚鼠模型的療效以及對其行為學的影響。方法：將 90 只豚鼠隨機分成正常對照組、模型組、辛芩顆粒組和中藥治療組，以卵清蛋白致敏激發造成變應性鼻炎豚鼠模型，分別給予中藥和辛芩顆粒，觀察各組動物的行為學改變。結果：中藥治療組癥狀顯著低于模型組，其差別有統計學意義（P < 0.05）。結論：固本祛風湯可明顯改善變應性鼻炎豚鼠模型的癥狀，從而發揮對 AR 的治療作用。
【關鍵詞】 變應性鼻炎；豚鼠模型；固本祛風湯；行為學
〔Abstract〕 Objective To study the effect of Chinese medicine GubenQufeng prescription treating guinea pig model of allergic rhinitis and its reaction on behavioristics. Methods 90 guinea pigs were randomly pided into normal control group， model group， Xinqin particles and the Chinese medicinegroup， sensitized to ovalbumin excitation caused guinea pig model of allergic rhinitis， were given medicine and Xinqin particles， behavioristics observed after treatment. Results Symptoms of Chinese medicine treatment group was significantly lower than that of model group， There was a statistically significant difference (P < 0.05). Conclusion
GubenQufeng prescription can significantly improve the guinea pig model of allergicrhinitis symptoms， thereby play a role in the treatment of AR.
〔Key Words〕
Allergic rhinitis; Guinea pig model; GubenQufeng prescription; Behavioristics
變應性鼻炎（Allergic Rhinitis， AR）是由 IgE 介導的Ⅰ型超敏反應性疾病，由于大氣污染等多種原因，近年來發病率不斷升高。變應性鼻炎在中醫屬于“鼻鼽”范疇，歷代醫家對本病的認識頗不一致，但都認為其發病與外界因素有密切關系。筆者經過多年的臨床實踐，認為本病病機主要在于肺、脾、腎三臟的虛損，自擬固本祛風湯對變應性鼻炎患者進行治療，在臨床上取得了顯著的療效。為進一步探討固本祛風湯對變應性鼻炎治療的機制，我們將其用于卵清蛋白誘發的變應性鼻炎豚鼠模型，用固本祛風湯治療后觀察動物模型的行為學改變，為將其更好地用于臨床治療變應性鼻炎提供實驗依據。
1
材料和方法
1.1
實驗動物
Hartley 豚鼠 90 只，清潔級，雌雄各半，體重 250~300 g，由中山醫科大學動物中心提供。在空調動物房飼養，溫度 25~28℃，濕度 40%~50%，飼養房避免過敏原存在，適應性飼養 1 周后開始正式實驗。
1.1.1
藥物和試劑
固本祛風湯：制附子、黃芪、桂枝、全蟲、辛荑花、防風、肉桂、徐長卿、茯苓、甘草。
辛芩顆粒：由上海中醫大藥業股份有限公司生產（國藥準字 Z31020014）。
卵清蛋白（OVA）：由美國 Sigma 公司生產。
1.1.2
動物分組
將豚鼠隨機分為 6 個組：A 組（正常對照組），B 組（模型組），C 組（辛芩顆粒組），D 組（中藥低劑量組），E 組（中藥中劑量組），F 組（中藥高劑量組），每組 15 只。
1.1.3
造模方法
采用卵清蛋白致敏的方法[1-5]，對模型組和實驗組豚鼠分別以每只腹腔注射卵清蛋白混懸液 1 mL（卵清蛋白 0.3 mg 為抗原，氫氧化鋁 30 mg 為佐劑，溶于 1 mL 生理鹽水配成），隔日 1 次，共 7 次。
1.1.4
模型評價
于末次鼻腔激發后第 2 日，分別在模型組、對照組和實驗組隨機各選取 3 只，行 PCA 試驗。即每只于球后靜脈叢采血 0.3 mL，離心（3 000 r/min）10 min 后分離出血清，取 40 L 生理鹽水稀釋，分別配成 1:4、1:16、1:64、1:256 濃度；取健康白色大鼠，背部剃毛，將上述不同濃度血清分別注射于背部皮下，間隔 2 cm，并作記號；72 h 后，以卵清蛋白 1 mg、伊文斯蘭 5 mg 溶于 1 mL 生理鹽水，于大鼠尾靜脈注射，30 min 后觀察結果，藍斑直徑超過 5 mm 為陽性，即造模成功。觀察造模成功后，每側鼻腔均以 2% 卵清蛋白溶液用微量加樣器滴入 40 L，每日 1 次，共 7 次。
1.1.5
給藥方法
經 PCA 試驗藍斑呈陽性后，以 2% 卵清蛋白溶液滴鼻，從第 1 次 OVA 滴鼻當日起，實驗組和對照組于滴鼻前口飼給藥，中藥濃煎后用蒸餾水稀釋，調整濃度，使每只每天給藥量均為 3 mL；模型組和空白組每只每天予口飼 3 mL 生理鹽水。每日 1 次，共 7 次。
1.1.6
給藥劑量
實驗組：低劑量組：每日 7.5 g/kg；中劑量組：每日 15 g/kg；高劑量組：每日 30 g/kg。
對照組：辛芩顆粒每日 6 g 生藥 / kg。
1.2
標本采集
所有動物末次給藥后 1 h，于球后靜脈叢采血 3 mL，離心（3 000 r/min）15 min 后分離出血清，于-20℃ 保存。同時予 10% 水合氯醛溶液以 0.4 mL/kg 腹腔注射麻醉后，分離鼻骨前皮膚，咬除鼻骨，取下鼻中隔及其黏膜，于 4% 多聚甲醛溶液中固定。
1.3
指標檢測
1.3.1
行為學觀察
記錄每次激發后 30 min 內動物的鼻癢、噴嚏、清涕出現的時間、次數與輕重程度，并打分。評分標準：0 分：無噴嚏、抓鼻、喘息及鼻分泌物；1 分：噴嚏 < 4個，輕度抓鼻，喘息急促，前鼻孔有鼻分泌物；2 分：噴嚏 4~10 個，頻繁抓鼻，喘息加重，鼻分泌物超過前鼻孔；3 分：噴嚏 > 11 個，持續抓鼻，因喘息致死，臉部布滿鼻分泌物。總分 > 5 分表示造模成功[6]。
1.4
統計學方法
統計學方法采用 U 檢驗或 t 檢驗。
2
結
果
2.1
死亡情況
PCA 試驗：各組死亡 3 只；正常對照組和模型組：各死亡 2 只，剩余 10 只；中藥高劑量組、辛芩組：各死亡 1 只，剩余 11 只。
2.2
PCA 試驗
PCA 實驗發現，以正常對照組血清接種的大鼠背部無藍斑出現。以其余各組血清接種的大鼠背部，分別于 1:4，1:16，1:64，1:256 濃度處均出現藍斑，直徑最大的為 1.5 cm，最小的為 0.5 cm，濃度越小藍斑越小。
2.3
行為學改變
A 組僅偶有抓鼻現象，個別豚鼠打噴嚏；B 組于鼻腔滴入抗原后頻繁用前爪抓鼻，打噴嚏，并伴有清水樣鼻涕，部分豚鼠涕流滿面；其余各組癥狀輕微，出現輕度抓鼻及少數噴嚏，部分可見鼻涕。模型組與其余各組比較差異均有統計學意義 （P < 0.05），正常對照組與各實驗組之間差異有統計學意義（P < 0.05），結果見表 1。
3
討
論
變應性鼻炎是一類主要由 IgE 介導的Ⅰ型變態反應性疾病，近年來發現細胞因子水平與變應性鼻炎的發病關系密切[7，8]。
中藥的許多藥材經現代研究表明，具有調整機體免疫狀況的作用，必將在變應性鼻炎的治療中占據重要的地位。如黃芪可調節體液免疫，從而抑制組胺等介質的釋放；細辛、桂枝等對過敏介質有拮抗作用；防風、甘草、辛荑、五味子、烏梅、蟬蛻均有抗過敏作用。
筆者在多年的臨床實踐中認識到，變應性鼻炎的發生主要是由肺氣虛弱，衛外不固，導致外邪侵襲而成鼻鼽。此外，本病與先天腎氣不足和后天脾失健運也有非常密切的關系。歷代醫家多采用補肺固表、健脾扶正、補腎溫陽等方法辨證論治，方藥多采用玉屏風散、小青龍湯、桂枝湯、麻黃附子細辛湯等加減治療本病。固本祛風湯即是在玉屏風散的基礎上加減而成。主要由制附子、黃芪、桂枝、全蟲、辛荑花、防風、肉桂、徐長卿、茯苓、甘草等組成，本方以制附子、肉桂補腎溫陽；茯苓健脾利水；黃芪、桂枝益氣固表、助陽化氣；輔以防風、辛荑祛風通竅，全蟲搜風活絡，徐長卿祛風止癢。綜觀全方，具有補肺散寒，健脾益腎，祛風通竅之功效。現代藥理研究認為，黃芪具有雙向免疫調節作用，附子、防風、辛荑、徐長卿均有抗炎及增強免疫作用，可以降低炎癥細胞的通透性，減輕其水腫、浸潤等炎性反應，辛荑還可以抗組胺及收斂鼻黏膜血管，減輕變應性鼻炎所致的鼻癢、打噴嚏、流涕等癥狀。實驗研究結果顯示， 固本祛風湯治療組癥狀顯著低于模型組，差異有統計學意義（P < 0.05），表明固本祛風湯可以顯著改善變應性鼻炎的癥狀，減輕其炎癥反應，從而達到治療變應性鼻炎的作用。
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篇5
【摘要】 ：目的 圍繞海馬結構的形態學研究定志小丸的抗抑郁機制。方法 40只雌性大鼠分為對照組、抑郁癥模型組(模型組)、蒸餾水組(DW組)和定志小丸組(中藥組)，Open field法檢測行為學得分，ELISA法檢測血清皮質醇和雌二醇(E2)含量，HE染色和電鏡技術觀察海馬CA3區神經元形態，免疫組化技術檢測齒狀回神經干細胞(NSC)增殖。結果 與對照組比較，模型組和DW組行為學得分及血清E2含量顯著下降，皮質醇水平升高和NSC增殖明顯降低，海馬CA3區神經元損傷明顯；中藥組行為學得分和血清E2含量無明顯變化，皮質醇明顯減少，NSC增殖顯著增加，海馬CA3區神經元基本正常。結論 定志小丸能夠保護海馬結構，這可能是其抗抑郁機制之一。
【關鍵詞】 抑郁癥 定志小丸 雌二醇 神經干細胞 皮質醇 大鼠
Abstract：Objective To study the anti-depression mechanism of Dingzhixiaowan concerning on histology of hippocampal formation. Methods 40 female rats were pided into control， depression model group (model group)， distilled water group (DW group) and Dingzhixiaowan group (Chinese herb group). Behavior points were measured by open field method. Serum concentrations of cortisol and estradiol (E2) were checked with ELISA. HE staining and electron microscopy were applied to observe the histology of neurons in hippocampal formation. Immunohistochemistry method was employed to detect Nestin expression. Results Compared with the control， behavior points， serum E2 level and Nestin expression decreased obviously and serum cortisol level increased markedly， CA3 neurons were seriously damaged in model and DW groups. While behavior points， serum E2 level did not change， Nestin expression increased obviously and serum cortisol level decreased markedly， CA3 neurons were basically normal in Chinese herb groups. Conclusion Dingzhixiaowan can protect hippocampal formation， which might be one of the anti-depression mechnisms.
Key words：depression；Dingzhixiaowan；estradiol；neural stem cell；cortisol；rat
目前認為，慢性應激刺激造成的海馬結構損傷是抑郁癥發病的主要原因。對海馬結構來說，糖皮質激素是損傷激素，雌激素為保護激素，而女性的雌激素水平變化較大，其保護作用時常減弱，這可能是女性抑郁癥發病率較高的原因。本研究以此為出發點，研究定志小丸的抗抑郁機制。
1 材料與方法
1.1 動物及分組
成年Wistar雌性大鼠(230±20)g，遼寧中醫藥大學動物實驗中心提供，合格證號：SCXK(遼)2004-0018。適應性飼養1周后，選擇體重和行為學得分相近的40只大鼠，隨機分為對照組、模型組、蒸餾水組(DW組)和定志小丸組(中藥組)，每組10只。對照組每籠5只飼養，其余3組每籠1只飼養。
1.2 抑郁癥模型的建立
除對照組外，其余3組動物均接受慢性應激刺激，復制慢性不可預見性應激模型。其方法是：在21 d內施加電擊足底(36 V交流電，5 min)、冰水游泳(4 ℃，5 min)、搖晃(1 min)、夾尾(1 min)、禁水(24 h)、禁食(24 h)等刺激，每種刺激3～4次。
1.3 給藥
對照組不給藥；模型組只施加灌胃動作；DW組灌服1 mL蒸餾水；中藥組灌服定志小丸。定志小丸為人參、茯苓、遠志、石菖蒲的標準提取物(購于安徽宣城百草生物有限公司，提純比例為5∶1)，劑量分別是10、10、6、6 g，溶于適量水中，加熱后濃縮為1 kg/L。按成人用量折算成灌胃劑量[1 mL/100(g? d)]，于刺激前1 h灌服。
1.4 大鼠行為學檢測
采用Open field法檢測，以3 min內大鼠水平穿越方格數作為水平活動得分，以前肢抬起次數為垂直活動得分。檢測過程中保證時間、光照、溫度及環境噪音的一致性。檢測由3人同時完成，1人負責計時，1人負責觀察大鼠的水平活動，1人負責計數垂直活動。正式檢測前，3人首先熟悉檢測標準，并進行多次訓練，盡量減少人為誤差。
1.5 血清皮質醇和雌二醇檢測
在第22天，大鼠腹腔注射20%氨基甲酸乙酯(0.4 mL/100 g)麻醉后，腹主動脈取血，離心后取血清，凍存備用。于總醫院內分泌實驗室采用ELISA方法檢測血清皮質醇和雌二醇(E2)含量。
1.6 海馬組織學觀察
將取血后的大鼠用150 mL生理鹽水經主動脈快速沖洗，取一側海馬行常規HE染色，另一側于掃描電鏡下觀察形態學變化。
1.7 齒狀回神經干細胞(NSC)增殖檢測
采用Nestin免疫組化方法，取經生理鹽水快速沖洗后的海馬，4%多聚甲醛固定4～6 h，30%蔗糖溶液沉底。冰凍連續切片，片厚25 μm，隔4片取1片。將切片置含新鮮0.5% H2O2的純甲醇中30 min；0.1% Triton溶液中30 min；正常山羊血清60 min；兔抗鼠Nestin一抗(1∶2000，Sigma)，25 ℃孵育1 h，4 ℃過夜；生物素化山羊抗兔IgG(博士德二抗試劑盒)，室溫下60 min；SABC復合物，室溫60 min；DAB顯色(博士德)。染色對照：用正常山羊血清和PBS代替Nestin一抗作孵育，其余步驟同上。利用BI-2000醫學圖像分析系統，計數陽性細胞數。
1.8 統計學方法
實驗數據以x±s表示，采用SPSS11.5進行統計處理。
2 結果
2.1 各組大鼠海馬CA3區神經元的形態學變化
光鏡下可見，對照組CA3區有大量致密錐體細胞，排列整齊，細胞完整，邊緣清晰，死亡細胞較少；模型組和DW組可見細胞層次減少、紊亂、中斷，大量細胞壞死；中藥組神經元形態與對照組基本接近。電鏡下可見，對照組細胞器豐富，輪廓清晰，細胞核呈圓形，核膜清晰光滑完整，核染色質分布均勻；模型組和DW組細胞器減少，線粒體空泡化，細胞核變小，不規則，且核膜增厚，核周電子密度降低；中藥組與對照組基本相同。
2.2 各組大鼠齒狀回Nestin表達
鏡下可見Nestin免疫陽性反應產物呈棕黃色，環形分布于核膜周圍。對照組鏡下可見較多的棕黃色反應物，邊緣相對清晰，細胞大小相近；模型組和DW組棕黃色反應物較少，邊緣不清，細胞大小不一致；中藥組鏡下可見大量棕黃色反應物，邊緣清晰，細胞大小一致。各組Nestin陽性細胞數見表1。表1 各組大鼠Nestin陽性細胞數(略)注：與對照組比較，*P
2.3 各組大鼠行為學得分
(見表2)表2 各組大鼠的行為學得分(略)注：與本組第0天比較，P
2.4 各組大鼠血清皮質醇和雌二醇含量
(見表3)表3 各組大鼠血清皮質醇和雌二醇含量變化(略)
3 討論
海馬結構具有調節內臟功能、情緒和行為的多種作用，主要由海馬和齒狀回組成。齒狀回存在NSC，能夠增殖、遷移至海馬CA3區，分化形成新的神經細胞。因為抑制齒狀回NSC增殖后，許多抗抑郁藥物會失效，所以，海馬CA3與齒狀回的關系在抑郁癥發病中的作用逐漸受到重視。抑郁癥的發病機制目前認為是慢性應激刺激引起腎上腺皮質過度分泌糖皮質激素，繼而損傷海馬神經元。本實驗也觀察到同樣現象。由于高水平的糖皮質激素還能抑制齒狀回NSC增殖，從而降低了海馬結構的自我修復能力[1]，繼而導致海馬結構出現不可逆損傷。因此，抑郁癥的根治應圍繞保護海馬成熟神經元和齒狀回NSC兩方面進行。
定志小丸由遠志、石菖蒲、茯苓和人參組成，具有祛痰開竅、健脾益智作用，主治心氣不定、五臟不足、憂悲不樂等。實驗結果表明，該方能夠對抗慢性應激對大鼠行為學的影響，具有抗抑郁作用，這可能與其保護海馬CA3區神經元和齒狀回NSC增殖有關。盡管定志小丸不能抑制皮質醇的過度分泌，但其維持E2水平的作用可能更為重要，因此，該方可能是替代雌激素的一種選擇，成為治療女性抑郁癥的備選藥物。
篇6
【關鍵詞】 CCI模型； 大鼠； 疼痛行為學； 痛閾
疼痛是人們一生中經常遇到的不愉覺，它提供軀體受到威脅的警報信號，是生命不可缺少的一種特殊保護功能。另一方面，它又是各種疾病最常見的癥狀，也是當今困擾人類健康最嚴重的問題之一。根據神經生理功能，疼痛可分為生理性疼痛和病理性疼痛，神經病理性疼痛是由神經系統損傷或異常引起的一種難以治療的疼痛狀態。CCI模型是最常用的神經病理性疼痛動物模型。本研究主要觀察CCI模型大鼠疼痛行為學表現。
1 資料與方法
1.1 實驗動物 SPF級SD大鼠，6~8周齡，雄性，體重180~200 g，購自川北醫學院實驗動物中心。動物飼養環境安靜，有良好的通風和空氣過濾系統，室溫22 ℃左右，濕度50%左右，明暗光照12 h:12 h，自由攝食，隔日更換籠具和墊料。動物適應環境3 d。雄性SD大鼠(n=48只)隨機分為三組，即正常對照組(Nave組：n=16，分7、14 d亞組，每亞組8只)、假手術組(Sham組：n=16，分7、14 d亞組，每亞組8只)以及CCI組(n=16，分7、14 d亞組，每亞組8只)。
1.2 CCI模型的建立 (1)按Bennet和Xie[1]方法制作CCI模型；(2)稱重：采用腹腔給藥10%水合氯醛麻醉，300~500 mg/kg。側臥位，手術側在上，消毒，鋪巾，選擇左后肢，在股骨下方約l cm平行于股骨切開皮膚，用小剝離子經股二頭肌間隙鈍性分離肌肉，暴露坐骨神經，用神經剝離子輕柔將坐骨神經與周圍軟組織分離；(3)在坐骨神經分成三支前的主干部位游離神經7 mm左右，在距神經起始處(三支分叉處)上方2 mm處，用4.0含鉻羊腸線結扎坐骨神經4道，每道間隔約1 mm，使被結扎的神經長約4~5 mm。注意結扎的松緊度，以打結時可見肌肉輕微抽動為準；(4)局部生理鹽水沖洗，間斷縫合肌肉筋膜、皮下組織以及皮膚；術畢將大鼠放入鼠籠，于溫暖、安靜環境自由喂養；(5)假手術組除不結扎坐骨神經外，其余同模型組；手術由同一人操作。
1.3 行為學觀察 在手術后2周內，每隔1~2 d觀察1次，包括大鼠的步態和左后肢的姿勢、局部皮膚以及肌肉張力的改變程度、是否存在舔咬肢體現象等。
1.4 機械刺激傷害感受閾值(MWT)的測量 在安靜的環境中，將大鼠單獨放置于透明的有機玻璃體中，待大鼠適應環境15~30 min后，以Electronic von Frey刺激針刺激大鼠左、右足底，每只大鼠刺激3次，間隔大于10 s。大鼠會出現抬足、縮足、快速甩足以及甩足后舔足等反應。將3次讀數取平均值作為機械縮足反射閾值(MWT)。各組于術前、術后第1、3、6、8、10、13天進行測量。測量時間固定為9:00~13:00。術前測定值為基礎機械痛閾。
1.5 統計學處理 采用PASW Statistics 18軟件進行統計學處理，計量資料以(x±s)表示，兩組樣本均數間的比較用t檢驗，組間比較采用重復資料方差分析和post hoc檢驗，P
2 結果
2.1 大鼠行為學變化 CCI大鼠術后健康狀況良好，體重無明顯減輕，毛發富有光澤，覓食飲水基本正常。術后1~2周，手術足趾并攏輕度外翻，下肢行走無力，步態呈現跛行，經常左后足懸空或不敢著地；站立時以右后肢持重，左后肢抬起并緊貼于腹部；術后14 d左右，左后肢出現比較明顯的肌肉萎縮，給予輕微von Frey刺激時，大鼠經常迅速將左后肢抬起，有時放入口中舔吮；CCI大鼠左后肢懸空時間常超過25 s，CCI大鼠無自噬肢體現象。
2.2 大鼠體重變化 CCI組大鼠術后健康狀況良好，體重無明顯減輕，但體重增長較Sham組和Nave組略慢。各組大鼠術前基礎值、術后第1、3天體重比較差異無統計學意義(P>0.05)。在術后第6、8、10、13天，CCI組大鼠體重與Nave組、Sham組比較差異有統計學意義(P0.05)，見表1。
2.3 機械刺激傷害感受閾(MWT)變化 各組大鼠術前機械性痛閾比較差異無統計學意義(P>0.05)。手術前、后Nave組大鼠痛閾與Sham組比較差異無統計學意義(P>0.05)。各組大鼠非術側機械性痛閾比較差異無統計學意義(P>0.05)。CCI組大鼠術側痛閾在手術后第3、6、8、10、13天明顯低于非手術側，亦明顯低于Sham組和Nave組(P
篇7
關鍵詞：黑逍遙散；老年性癡呆；動物行為；氫溴酸東莨菪堿；乙酰膽堿酯酶；膽堿乙酰轉移酶；小鼠
中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2013）10-0035-03
阿爾茨海默病（Alzheimer’s Disease，AD）是一種常見的以進行性認知功能障礙和行為損害為特征的神經系統退行性病變。目前的治療主要是根據其不同病理生理學說給予對應性干預，尚未找到有效的防治藥物。從中醫藥中尋找有效防治藥物，成為近年研究的熱點。本研究選用黑逍遙散組、逍遙散組及其精簡方組開展相關研究，探討黑逍遙散防治AD的作用機理，為本病的辨證論治提供新的思路與有效治療藥物。
1 實驗材料
1.1 動物
SPF級KM小鼠50只，雌雄各半，體質量（20±2）g，甘肅中醫學院科研實驗動物中心提供，動物質量合格證編號：SCXK（甘）2004-0006-0000994，實驗設施使用許可證編號：SYXK（甘）2004-0006-0000308。動物分籠飼養，食固體飼料（甘肅中醫學院科研實驗動物中心提供），食水自由，室溫20～25 ℃，相對濕度45%～52%。
1.2 藥物與試劑
實驗所用藥材均購于甘肅中醫學院附屬醫院藥房；黑逍遙散、逍遙散、精簡方中各藥用量參照2005年版《中華人民共和國藥典》及全國高等中醫院校規劃《方劑學》確立的比例。黑逍遙散：熟地黃∶柴胡∶當歸∶白芍∶白術∶茯苓∶生姜∶炙甘草∶薄荷=7.5∶5∶5∶5∶5∶5∶5∶4∶1。逍遙散為黑逍遙散去熟地黃，精簡方則進一步減去白芍、薄荷、生姜、炙甘草。各組藥物加水冷浸3 h，16倍量水微沸1 h，煎煮2次后合并濾液，制成濃度均為0.50 g原藥材/mL的水提液。
氫溴酸東莨菪堿注射液，上海禾豐制藥有限公司生產，批號100101。考馬斯亮藍蛋白（批號20100520）、乙酰膽堿酯酶（AchE）試劑盒（批號20100522）、膽堿乙酰轉移酶（ChAT）試劑盒（批號20100522）均由南京建成生物化學試劑有限公司生產。
1.3 儀器與設備
Y型水迷宮（自制），甘肅中醫學院科研實驗中心提供；小鼠避暗自動測試儀（型號BA-200），購于成都泰盟科技有限公司；小鼠跳臺儀（型號DT-200），購于成都泰盟科技有限公司；E200NIKON光鏡，由甘肅中醫學院科研實驗中心提供。
2 實驗方法
2.1 實驗動物篩選
在正式實驗前，用Y型水迷宮對小鼠進行游泳測試，以剔除先天運動功能障礙小鼠。
2.2 分組與給藥
KM種小鼠隨機分為分為空白組、模型組、黑逍遙散組、逍遙散組、精簡方組，每組10只。空白組和模型組小鼠每日灌胃生理鹽水0.02 mL/g，藥物組給予相應的原藥材水煎液。按照人臨床給藥劑量折算動物給藥劑量倍數，各組劑量均為2.314 g/（kg?d），每日灌胃1次，連續10 d。
2.3 水迷宮、跳臺、避暗測試
灌胃給藥第6、8日，除空白組外，其余各組小鼠均在灌胃1 h后腹腔注射氫溴酸東莨菪堿（2.0 mg/kg）進行造模[1]，注射20 min后使用水迷宮進行學習能力跳臺、避暗訓練，第10日同法造模后進行行為學能力測試。
2.4 生物化學檢測
灌胃給藥第10日，行為學能力測試完畢后，處死動物，迅速取出腦組織，用生理鹽水制成10%勻漿，放入低溫離心機中，3000 r/min離心10 min，取上清液裝入試管中冷凍備用，按照試劑盒說明書進行AchE和ChAT的測定。
3 統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行分析。數據以―x±s表示，組間均數比較采用方差分析。P
4 結果
4.1 Y型水迷宮測試結果
與空白組比較，模型組小鼠的錯誤次數顯著升高，記憶潛伏時間顯著延長，差異有統計學意義（P
4.2 跳臺測試結果
與空白組比較，模型組小鼠受到電擊的次數增多，記憶潛伏時間顯著縮短，差異有統計學意義（P
4.3 避暗測試結果
與空白組比較，模型組小鼠受到電擊的次數增多，記憶潛伏時間顯著縮短，差異有統計學意義（P
4.4 黑逍遙散對癡呆小鼠腦組織勻漿中乙酰膽堿酯酶膽堿、乙酰轉移酶活性的影響
與空白組比較，模型組小鼠腦組織勻漿中的ChAT活性顯著降低，AchE活性顯著增高，差異有統計學意義（P
5 討論
中醫學認為，老年癡呆的發生病位在腦，與心、腎最為密切，屬本虛標實，治療多從益氣補血、滋補心腎、活血祛瘀、化痰解毒等立法。而我們通過中醫文獻回顧分析，結合現代醫學研究成果，認為肝郁是導致瘀血、痰濁等標實的主因，提出了從肝、脾論治的新假說。因肝主疏泄條達，氣能行血，氣能行水，肝郁則氣滯，氣滯則血瘀，水停而成痰濁。根據這一假說，我們首先選取疏肝健脾的代表方黑逍遙散進行了研究，表明該方具有顯著改善AD模型小鼠學習記憶能力，增強其認知、判斷能力，調節腦內相關神經遞質[2]。說明黑逍遙散能通過疏肝理氣、養血活血、健脾除濕而發揮補其虛（補血填精以益髓）、祛其邪（行氣、化痰、活血）的作用。
黑逍遙散是在逍遙散的基礎上加地黃一味，為逍遙散演化類方，養血填精之力更強。現代藥理研究表明，熟地黃通過激活MAP等發揮出抗氧化作用；可以提高超氧化物歧化酶、一氧化氮合酶活性，減少丙二醛和過氧化脂質含量，能改善衰老大鼠學習記憶能力，延緩大鼠腦衰老[3-4]。因此，我們選用黑逍遙散與逍遙散開展對照研究，以進一步驗證藥效，印證從肝、脾論治AD的科學性和有效性。
本研究結果表明：黑逍遙散組、逍遙散組及精簡方組均能減少水迷宮測試中錯誤次數，縮短潛伏時間；減少在跳臺、避暗測試中電擊次數，延長潛伏期時間；均能升高腦組織勻漿ChAT活性、降低AchE活性，與模型組比較，差異有統計學意義（P
參考文獻：
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篇8
關鍵詞：頤腦解郁復方；卒中后抑郁；行為學；海馬CA1區；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.07.012
中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2017）07-0049-05
Abstract： Objective To investigate the intervention effects of Yinao Jieyu Prescription on the behaviors and damages in hippocampal CA1 area of the rats with post-stroke depression （PSD）. Methods Totally 168 SPF male SD rats were randomly divided into normal group， sham-operation group， stroke group， PSD group， Western medicine group and TCM group. There were 24 rats in the normal group and sham-operation group， and 30 rats in the other groups. Rats in the normal group received no intervention. Rats in the sham-operation group received no suture. Rats in the stroke group were given middle cerebral artery occlusion operation and normally fed after operation. Rats in the PSD group， Western medicinal group and TCM group were made into PSD models by chronic immobilization stress for one week and individual battery to the end. At the inception of modeling， Western medicine group received fluoxetine hydrochloride for gavage； TCM group received Yinao Jieyu Prescription for gavage； other groups received distilled water for gavage， once a day. At the end of week 2， 4， and 8， the morphology of the hippocampal CA1 area in each rat was observed by microscope after HE stained. Results Except for the week 2， at the same time point， the behavior scores of the rats in the TCM group were higher than those in the PSD group. At the same time point， the CA1 region of the hippocampus in the TCM group was more complete than the PSD group， and the cells were arranged neatly and in normal morphology. Conclusion Yinao Jieyu Prescription can improve the symptoms of PSD rats， and has protective effects on hippocampal CA1 area.
Key words： Yinao Jieyu Prescription； post-stroke depression； behaviors； hippocampal CA1 area； rats
卒中后抑郁（post-stroke depression，PSD）是R床腦卒中后常見并發癥，主要表現為情緒低落、思維遲滯、興趣減退及社會角色的紊亂等。我國每年大約有160萬～200萬新發腦卒中患者，約1/3存活患者發生PSD[1-2]。頤腦解郁復方是本課題組自行研制治療PSD的中藥復方，具有益腎疏肝、活血化瘀的功效，前期臨床研究顯示療效顯著[3]。本實驗建立一種高度模擬臨床PSD的大鼠模型，以探討頤腦解郁復方對PSD大鼠行為學及海馬CA1區的干預作用。
1 實驗材料
1.1 動物
SPF級健康雄性SD大鼠168只，2月齡，體質量（300±20）g，北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號SCXK（京）2012-0001。飼養于室溫（20±2）℃、相對濕度50%～60%環境，光照明暗交替12 h/12 h，自由攝食飲水。
1.2 藥物及制備
頤腦解郁復方，北京中醫藥大學第三附屬醫院提供，依據前期研究[4]確定灌胃劑量為9.92 g/（kg?d），按照灌胃劑量煎藥濃縮，濃度為0.62 g原藥材/mL，4 ℃冰箱保存備用，用前加熱；鹽酸氟西汀膠囊，禮來（蘇州）制藥公司，批號0943A，臨用時溶于蒸餾水，濃度為0.233 g/L，按照成人用量7倍計算大鼠用量為2.33 mg/（kg?d）。
1.3 主要試劑與儀器
戊巴比妥鈉（美國Sigma公司，貨號P3761-5），磷酸鹽緩沖液（粉劑，福州邁新生物技術開發有限公司，貨號PBS-0060），尼龍栓線（北京沙東生物技術有限公司，貨號2838-A4），蘇木素染色液（北京益利精細化學品有限公司，編號201506251323），水溶性伊紅染色液（北京益利精細化學品有限公司，編號YZB/京0102-2011），返藍染色液（北京益利精細化學品有限公司，編號2015032514324659）。曠場試驗用敞箱（自制），強迫游泳試驗用水箱（自制），自動化智能型正置研究級顯微鏡（奧林巴斯有限公司，型號BX53）。
2 實驗方法
2.1 分組
大鼠實驗前適應性飼養1周，采用隨機數字法分為正常組24只、假手術組24只、卒中組30只、PSD組30只、西藥組30只、中藥組30只。正常組不干預，假手術組不插入線栓，卒中組僅進行卒中手術，PSD組、西藥組和中藥組均在卒中手術后1周進行PSD模型制備。自造模開始至實驗結束，西藥組和中藥組大鼠分別灌胃氟西汀、頤腦解郁復方藥液，其余各組每日灌胃等量蒸餾水。根據大鼠體質量計算氟西汀、頤腦解郁復方藥液每日灌胃量，自腦卒中造模開始至實驗結束，每次約3～4 mL，每日1次。
2.2 造模
參考新式線栓法[5]，制備大腦中動脈阻塞的腦卒中模型，缺血2 h后進行再灌注。入組標準：大鼠于缺血2 h后出現對側前肢蜷曲、行走D圈或行走向對側倒體征則納入，無此體征或于2 h后仍不清醒者棄去。待腦卒中大鼠造模成功1周后，大鼠神經功能恢復后，將群養的PSD組、西藥組、中藥組大鼠分開單籠飼養至實驗結束。孤養同時，每日10：00～16：00期間任取時間，將大鼠限制在特制的T型束縛臺[6]（自制）上予2 h的行為限制，連續7 d。
2.3 觀測方法
2.3.1 曠場試驗 第2、4、8周末對各組大鼠進行曠場試驗。將大鼠置于敞箱中心方格內，觀察大鼠3 min內水平穿越格數（記為水平運動得分）、后肢直立次數（記為垂直運動得分）。
2.3.2 強迫游泳試驗 第2、4、8周末對各組大鼠進行強迫游泳試驗。大鼠禁食21 h，水箱內水深25 cm、水溫（25±1）℃，連續觀察5 min，記錄大鼠在水中強迫游泳時間。
2.3.3 糖水偏愛試驗 第2、4、8周末對各組大鼠進行糖水偏愛試驗。大鼠禁食禁水20 h后，同時給予每只大鼠事先定量好的1瓶1%糖水和1瓶純水。30 min后調換糖水和純水的位置，60 min后取走2瓶并稱量，計算大鼠糖水消耗比例。糖水偏愛度=糖水消耗量÷總液體消耗量。
2.3.4 病理觀察 第2、4、8周末大鼠行為學測試后，各時點大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉（0.5 mL/100 g）麻醉，開胸暴露心臟，0.9%氯化鈉溶液快速灌注，再用4%多聚甲醛先快后慢灌注固定，斷頭取腦，4%多聚甲醛溶液內室溫固定36 h，石蠟包埋后做冠狀切片，HE染色，光鏡下觀察海馬CA1區結構變化。
3 統計學方法
采用SPSS20.0統計軟件進行分析。實驗數據以―x±s表示，組間比較采用方差分析，方差不齊用Welch法分析，兩兩比較用LSD法。P
4 結果
4.1 曠場試驗結果
在2、4、8周時，同一時點PSD組大鼠與卒中組比較水平運動得分均降低，4周時差異有統計學意義（P
4.2 強迫游泳試驗結果
在2、4、8周時，同一時點PSD組大鼠與卒中組比較強迫游泳時間均減少，2、4周時差異有統計學意義（P
4.3 糖水偏愛試驗結果
PSD組大鼠與卒中組比較，同一時點糖水偏愛度均降低，4、8周時差異有統計學意義（P
4.4 大鼠海馬CA1區病理觀察結果
2周時，正常組和假手術組大鼠海馬CA1區結構完整，有3～4層細胞，排列緊密，呈圓形或橢圓形，胞核、核仁清晰；卒中組大鼠海馬CA1區結構尚完整，細胞較假手術組排列疏松，有2～3層細胞，細胞染色加深、核固縮，核仁不明顯；PSD組大鼠海馬CA1區有2～3層細胞，較卒中組更加疏松，細胞染色深、核固縮，核仁不明顯，形態不規則，部分細胞呈空泡狀；西藥組和中藥組大鼠海馬CA1區結構完整，有3～4層正常細胞，排列緊密，核仁清晰，有少量細胞出現深染現象（見圖1）。4周時，正常組和假手術組大鼠海馬CA1區與2周時比較改變不明顯；卒中組大鼠海馬CA1區結構尚完整，有1～2層細胞，較正常組排列疏松，細胞染色加深、核固縮，核仁不明顯；PSD組大鼠海馬CA1區結構不完整，有1～2層細胞，較卒中組受損加重，大量細胞呈空泡狀；西藥組和中藥組大鼠海馬CA1區結構完整，有2～3層正常細胞，排列較緊密，有少量細胞出現深染現象，正常細胞周圍出現淺粉色結構（見圖2）。
8周時，正常組和假手術組大鼠海馬CA1區與4周時比較變化不明顯；卒中組大鼠海馬CA1區結構不完整，有1～2層細胞，染色深、核固縮，核仁不明顯；PSD組大鼠海馬CA1區結構不完整，細胞量少，多呈空泡狀；西藥組和中藥組大鼠海馬CA1區結構完整，有1～2層正常細胞，排列較緊密，細胞呈圓形或橢圓形，核仁清晰，深染細胞較少（見圖3）。
5 討論
本實驗在腦缺血模型基礎上應用慢性束縛應激復合單籠飼養方法制備PSD大鼠模型，觀察頤腦解郁復方對PSD大鼠行為學及海馬CA1區的干預作用。實驗中采用線栓法制備腦卒中模型，在充分考慮大鼠腦卒中病理基礎上，選用刺激溫和、量小的慢性束縛應激結合孤養的方法制備PSD大鼠模型。該模型既有腦缺血卒中和抑郁發病的病理基礎，又有卒中后肢體活動受限、離開親友等情志刺激因素，模擬了PSD發生的生物學和心理學因素[7]，操作較簡單，造模成功率高，是理想的PSD大鼠模型。行為學測試結果顯示，4周時可成功建立PSD大鼠模型。
海馬與人類的學習及情感等認知功能密切相關，是介導應激反應的最重要的腦區之一。研究表明，PSD大鼠存在腦卒中損傷側海馬神經再生障礙，而海馬神經細胞凋亡會引發一系列抑郁癥狀[8]。本實驗觀察了大鼠缺血側海馬CA1區病理變化，發現PSD組大鼠海馬CA1區較卒中組受損嚴重，應用藥物干預的西藥組與中藥組大鼠海馬CA1區受損情況明顯減輕，提示PSD加重卒中后海馬CA1區受損情況，而中藥頤腦解郁復方可改善海馬CA1區受損情況，保護腦內神經細胞。
中醫“腦髓”的現代生物學基礎是腦內神經元和神經營養因子。腎主生髓，“補腎填髓”中藥可減少神經元死亡，促進神經元存活與再生[9]。肝主疏泄，主藏血，具有調暢氣機、調節血量的職能，腦的血供和營養依賴于肝所藏之血及肝的疏泄功能[10]。研究表明，舒肝活血中藥復方能改善中風后抑郁狀態[11]，并可保護腦內神經元，緩解細胞凋亡[12]。本課題組認為腦卒中多因腎虛髓海失充，元神失養致病，而后情志不遂，肝氣失調，痰瘀互結，發生PSD。病位在肝腎二臟，腎虛為基礎，又兼氣、痰、瘀阻滯。故課題組選用補腎填精、疏肝活血中藥，立頤腦解郁復方以益腎舒肝、活血化瘀、頤腦醒神。行為學及病理結果顯示，頤腦解郁復方可改善大鼠PSD癥狀，減輕大鼠海馬CA1區受損情況，保護海馬CA1區細胞。
有研究表明，益腎舒肝中藥復方可顯著增強PSD大鼠腦內膠質纖維酸性蛋白、腦源性神經營養因子、堿性成纖維生長因子等表達[13]，參與調節PSD的多條信號通路[14-15]，但其防治機制是一個復雜的過程，目前研究尚未完全闡明。本實驗從行為學和病理改變探討頤腦解郁復方對PSD的干預作用，研究尚不深入，未來將在神經干細胞增殖分化及信號分子的變化方面加以探索。
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篇9
【摘要】 探討柴郁溫膽湯及其拆方對抑郁大鼠血清ACTH、COR和海馬cAMP的影響。［方法］健康雄性SD大鼠84只，隨機分為正常組、模型組、柴郁溫膽湯組、化痰組、調氣血組、養心脾組、馬普替林組。參照Katz刺激方法制備慢性輕度不可預見性應激(CUMS)抑郁模型。采用放射免疫法測血清ACTH、COR和大鼠海馬cAMP含量。［結果］與正常組相比，模型組大鼠血清ACTH和COR水平明顯升高、海馬cAMP含量明顯降低。同模型組相比，柴郁溫膽湯組及調氣血組能明顯降低ACTH濃度(P
【關鍵詞】 柴郁溫膽湯；組分；抑郁癥；HPA軸；ACTH；COR；cAMP
UniversityAbstract:［Objective］ To explore the effects of the traditional Chinese drugs Chaiyuwendantang (CYWDT) and its component on the plasm levels of ACTH， COR and cAMP in hippocampus of depressed mode. ［Methods］ Eighty-four male rats were pided into seven groups: control group， depressed model group， group of CYWDT， group of HuaTan， group of TiaoQiXue， group of YangXinPi， group of maprotiline equally and made up models in chronic unpredictable mild stress (CUMS). The plasm levels of ACTH， COR and the level of cAMP in hippocampus were detected by radioimmunoassay. ［Results］ We found that the plasm levels of ACTH， COR were significantly increase and cAMP in hippocampus was significantly decreasd in depression model of rat. CYWDT and TiaoQiXue could significantly decreased the level of ACTH(P＜0.05); CYWDT， HuaTan and TiaoQiXue could significantly decreased the level of COR(P＜0.01). CYWDT， HuaTan and TiaoQiXue could significantly increase the level of cAMP in hippocampus. ［Conclusion］ Chronic unpredictable mild stress can increase the plasm levels of ACTH， COR and the level of cAMP in hippocampus of depression rats. CYWDT could reverse all the changes. The mechanism maybe relatd to regulate hypothalamicpituitaryadrenal axis and signal transmission in cell.
Key words: Chaiyuwendantang; component;depression; hypothalamicpituitaryadrenal axis; adrenocorticotropic hormone; cortisol; cyclic adenosine monophosphate
抑郁癥(depression)是最常見的心境障礙，嚴重威脅人類的身心健康。我們在前期研究中證實柴郁溫膽湯對腦單胺類神經遞質代謝紊亂具有良好的調節作用，且可明顯增加大鼠海馬部位PKA表達［1］。本實驗擬觀察柴郁溫膽湯及其拆方對抑郁大鼠血清ACTH、COR和海馬cAMP的影響。并與四環類抗抑郁藥馬普替林相對照，現報告如下。
1 材料與方法
1.1 材料
(1) 實驗動物:健康SpragueDawley(SD)雄性大鼠84只，體重（180±20）g，由南京醫科大學實驗動物中心提供(許可證號：SCXK(蘇)20020031)。所有大鼠均用普通飼料喂養兩周后開始造模。(2)實驗藥品:柴郁溫膽湯組（柴胡、郁金、半夏、陳皮、竹茹、枳實、人參、茯苓、炙甘草）濃度為1.84g生藥量/ml。化痰組（半夏、陳皮、竹茹）濃度為0.64g生藥量/ml。調氣血組（柴胡、郁金、枳實）濃度為0.6g生藥量/ml。養心脾組（人參、茯苓、炙甘草、大棗）濃度為0.5g生藥量/ml。以上藥物的煎制和濃縮均手工操作，所用煎藥器具為陶瓷制品以保證藥物在煎制過程中的穩定性。濃縮后的藥物中每種單味藥的濃度在整方和拆方中均相同，以保證各組實驗結果的可比性。鹽酸馬普替林(北京諾華制藥有限公司生產，國藥準字H19991047)用去離子雙蒸水配制成1mg/ml藥物混懸液。(3)主要實驗試劑和儀器 促腎上腺皮質激素(adrenocorticotropic hormone ACTH)放射免疫分析試劑盒(北京北方生物技術研究所)、皮質醇(cortisol COR)放射免疫分析試劑盒(北京華英室溫技術研究所)、環磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate cAMP)放射免疫分析試劑盒(上海中醫藥大學核醫學試驗室)。儀器：GC911γ放射免疫計數器(科大創新股份有限公司中佳分公司)。
1.2 方法
1.2.1 動物分組及給藥
選取Openfield評分相近的大鼠84只，隨機分為正常組、模型組、柴郁溫膽湯組、化痰組、調氣血組、養心脾組、馬普替林組，每組12只。各治療組在應激的第2天開始均按提取液(濃縮后)1ml/100g灌胃給藥；模型組和正常組給予等量生理鹽水。每天上午8時給藥1次，持續至實驗的第23天。
1.2.2 模型制備
正常組每籠飼養6只，正常攝水飲食，不給任何刺激。其余各組，每只均單籠飼養，并接受21天各種不同的應激刺激，參照Katz方法［2］，每天隨機給予一種刺激。使大鼠不能預料刺激的發生，以避免產生適應。
1.2.3 行為學測定
Openfield法測定行為 所用自制敞箱規格為高40cm、直徑80cm的內空圓柱桶，周壁為黑色，地面用黑線劃分為面積相等的25塊。以動物四肢完全進入一個分區作為一個水平活動(crossing)得分、以雙前肢完全抬離地面至放下作為一次垂直活動(rearing)得分、以及觀察大鼠的理毛(修飾)次數和大便顆粒數。每只動物僅進行一次測定，每次觀察3min。
1.2.4 糖水消耗實驗
在實驗第22天所有實驗大鼠均單籠飼養并禁食和禁水，只給1%蔗糖溶液150ml，計算大鼠24h飲用1%蔗糖溶液量。
1.2.5 大鼠血清ACTH和COR測定
用10%水合氯醛(0.36ml/100g) 給大鼠腹腔注射，麻醉后開腹，腹主動脈抽取血液5ml，待測ACTH和COR。按試劑盒方法要求分離血清，采用125I標記放免法測定。
1.2.6 大鼠海馬cAMP含量測定
按大鼠腦立體定向圖譜(包新民等編著，人民衛生出版社，1991年)定位，冰上分離大鼠一側海馬，裝于凍存管并立即投入液氮中，待固化后稱重，放入-86℃冰箱保存待測。檢測時海馬置于pH4.75的醋酸緩沖液中勻漿，加入無水乙醇沉淀蛋白，離心取上清液。采用125I標記放免法測定cAMP含量。
1.3 統計學方法
所有數據均以均數±標準差(x±s)表示。用SPSS11.5統計軟件對兩組間均數進行兩獨立樣本t檢驗和F檢驗。
2 結果
各組大鼠行為學變化，見表1。表1 柴郁溫膽湯及其組分對大鼠行為學評分的影響(略)．與正常組比較 P
3 討論
對于抑郁大鼠的行為學觀察多采用經典的Openfield法，目前比較肯定的觀察指標是大鼠的水平運動得分和垂直運動得分。本試驗觀察了大鼠的修飾次數以及大便顆粒數。其中水平得分代表動物的活動度；垂直得分代表動物對新鮮事物的好奇程度和對外界環境的探究興趣［2］。修飾次數代表了動物對周圍環境的要求和自身的關注程度，大便顆粒數反應了CUMS抑郁模型大鼠是否有便秘的抑郁癥常見并發癥。結果顯示復方柴郁溫膽湯能夠顯著提升抑郁模型大鼠的水平得分、垂直得分、修飾次數和大便顆粒數。相對于馬普替林，更是顯示了少或無馬普替林的抗膽堿能副作用—便秘。
本實驗研究觀察到模型組大鼠血清ACTH和COR濃度較正常組顯著增高，與上述文獻報道一致，這也進一步證實模型組大鼠存在HPA軸功能亢進。柴郁溫膽湯組和調氣血組能能夠逆轉ACTH的升高；柴郁溫膽湯組、化痰組和調氣血組能逆轉大鼠COR水平的增高；馬普替林組能夠同時逆轉ACTH和COR的升高。說明柴郁溫膽湯具有調節HPA軸功能紊亂的作用，強度與馬普替林相似，其中起主要作用的是化痰和調氣血組分。
cAMP是細胞內第二信使，可介導多種細胞內激素、神經遞質及其他信號分子的作用。本試驗研究表明，模型組大鼠海馬cAMP含量較正常組明顯降低。柴郁溫膽湯組、化痰組、馬普替林組均能夠逆轉這種改變，提示柴郁溫膽湯參與了細胞信號通路的調節，其中起主要作用的是化痰藥，可能為其抗抑郁機理之一。
參考文獻
篇10
【關鍵詞】老年癡呆 行為學指標 腦內有關物質含量檢測指標 腦組織形態學觀察指標 血液檢測指標
中圖分類號：R592文獻標識碼：A文章編號：1005-0515（2010）12-030-03
【ABSTRACT】Objective To sum up and appraisal the evaluating indicators and methods of treating senile dementia. Methods Former indicators were summarized from four aspects of the behavior indicator, the examination indicator of related material content in brain, the brain tectology observation indicator and the blood examination indicator and other indicators were carried on the forecast. Results Through the discussion of drug efficacy targets and the methods,it provides newly and important data for the senile dementia mechanism and the treatment research. Conclusion There is a very important significance to find the effective mathods to prevent and treat the senile dementia by intensively studing main evaluating indicators and methods of treating senile dementia .
【KEY WORDS】Senile dementia; Behavior indicator; Examination indicator of related material content in brain; Brain tectology observation indicator ; Blood examination indicator
眾所周知，人類社會己經逐漸進入老齡化社會，老年癡呆已成為威脅人類晚年身心健康的主要疾病之一，患病率呈逐年上升趨勢。資料顯示，研究者已針對腦的結構、功能和信息傳遞的新認知開發出了許許多多的治療藥物，且防治效果顯著，但相關藥效評價指標多散在于浩如煙海的文獻中，為此本文總結相關文獻，從行為學指標、腦內有關物質含量檢測指標、腦組織形態學觀察指標、血液檢測指標四個方面對藥物治療老年癡呆進行藥效評價，為老年癡呆機理和治療的研究提供新的、重要的數據源。
1 行為學指標
1.1 水迷宮指標
20世紀80年代初，Morris發明了水迷宮，它是一種測量空間學習和記憶能力的實驗方法，可用來評估嚙齒動物由于老年癡呆等因素所造成的學習記憶的影響，目前已被認為是此類研究的經典。
Morris水迷宮實驗由兩個主要的實驗組成，分別是定向航行實驗和空間探索實驗。
定向航行實驗時，將動物從之前劃分好的四個象限中隨機放入，在最大游泳時間內，可以記錄并作為評價指標的主要是逃避潛伏期（指大鼠自進入迷宮開始至找到平臺所需的時間，經典的水迷宮實驗以此作為主要指標進行統計分析），除此之外還有游泳路程長度（指大鼠自進入迷宮開始至找到平臺游過的總距離。它是逃避潛伏期和平均游泳速度的乘積，是一個綜合指標，受兩者共同的影響，既可以反映大鼠對平臺位置的學習記憶能力，又反映了大鼠的運動能力）、游泳速度（指大鼠進入水迷宮運動的快慢，速度的快慢，一般并不反映大鼠的學習記憶能力，僅反映大鼠的游泳能力。但在某種程度上，大鼠的逃避潛伏期短，那么相對消耗的體力也會少，速度也可能會較快。速度較快，那么，行程也可能會較長）、入水角度（指大鼠進入水迷宮后開始運動的方向與入水點和平臺連線的夾角。如果與逃避潛伏期結合分析，在某種程度上可以彌補單純考慮時間的不足）、搜索策略等可作為評價指標的補充，在分析過程中起參考作用，這個實驗主要用于評價動物的空間學習能力。對于最大游泳時間，各實驗人員有不同看法，通常選擇 120s，90s或60s。最大游泳時間會在統計中由于個別動物而影響整組數據，特別是選擇較大的游泳時間時，因此，應該在實驗前做好動物的篩選工作，并在統計數據時去掉異常值。
定向航行實驗進行幾天后（按動物學習情況定），開始空間探索實驗，將平臺撤去，一般探索時間在90s或60s內[2]，可以記錄并作為評價指標的主要有尋求原平臺的次數（也就是跨平臺次數：是在撤去平臺后，動物穿越原平臺所在位置的次數，反應動物尋找平臺的能力，與原平臺象限停留時間結合起來考慮更能反應大鼠的學習記憶能力的變化）、原平臺象限的游泳時間，原平臺象限游泳時間占總時間百分比，這個實驗主要用于評價動物的空間記憶能力。
水迷宮實驗作為老年癡呆動物的評價指標來說充分而又準確的，是最常用的評價治療老年癡呆藥效的指標，但是它也有不足之處，Graziano [3]認為簡單地使用目前常用的觀測指標不能準確的反映真實的搜索策略，于是選擇了一些自定義的行為種類、大量的數值變量和重要區域，使用判別式分析的方法來獲得較高的準確率。Graziano的這種方法雖然準確但是種類繁多比較復雜，所以我們進行日常實驗時，只要選擇主要的評價指標補充幾個次要指標就可以清楚地反映實驗的結果了。
1.2 跳臺實驗指標
跳臺實驗是藥理學常用的評價動物對藥物及其他給予的干預后的神經行為學中一個測試現象較為明顯的實驗，也就是測量大小鼠記憶能力的變化的實驗。跳臺實驗指標是評價藥效常用的指標之一，從文獻的記錄中看實屬完善成熟。
檢測方法：將大鼠或小鼠放入跳臺儀內適應環境,然后通電,大多數跳上跳臺逃避電擊。從通電到完全穩定上臺所用的時間為潛伏期,跳下時大鼠雙足同時接觸銅柵視為錯誤反應,訓練并記錄訓練時間內的潛伏期和錯誤次數作為學習指標。24h后重測,先將大鼠或小鼠放在跳臺上,記錄第1次跳下跳臺時間為潛伏期,并記錄錯誤次數作為記憶能力指標。
2腦內有關物質含量檢測指標
老年癡呆發病機制復雜，多種信號通路參與此過程，許多信號分子在其中發揮重要作用[4]。目前已公認，學習記憶與中樞膽堿神經系統關系極為密切。研究還表明，患者的癡呆程度與皮質和海馬中信號分子的缺失程度密切相關，在患者腦中，基底前腦的膽堿能神經細胞明顯丟失，膽堿能神經纖維發生退變，AchE、谷氨酸、p-KER2等在腦內的表達出現異常，尤以皮質和海馬顯著。
2.1 膽堿酯酶（AchE）活性的檢測
膽堿酯酶是膽堿能神經遞質乙酰膽堿的水解酶直接參與自主神經功能調節、肌肉運動、大腦思維記憶等重要功能。研究證實老年癡呆患者中樞膽堿能系統損傷，AchE活性和突觸前膽堿能標志在多處腦區均顯著降低或缺失患者基底前腦區膽堿能神經元丟失，從基底節到皮質，膽堿乙酰轉移酶(ChAT)活性降低和乙酰膽堿酯酶(AChE)活性明顯升高，造成乙酰膽堿 (ACh)的合成、儲存和釋放減少，皮質 ACh受體數目減少，產生癡呆癥狀 [5]。總的來說，老年癡呆患者腦組織中膽堿乙酰化酶活性明顯降低，膽堿酯酶活性顯著升高，造成 ACh含量不足，導致中樞神經系統功能障礙，出現學習記憶及認知功能下降，甚至智力喪失[6]。因此AchE活性的檢測作為評價老年癡呆藥效的主要指標，且在藥效評價中的使用甚為頻繁。
檢測方法：斷頭法處死實驗動物后，迅速取腦，用預冷的生理鹽水沖凈表面血液，用濾紙吸干，去除軟腦膜血管。取右腦稱重，置微型勻漿器中，加無水乙醇研磨，再加生理鹽水充分研磨制成勻漿。冷凍離心機離心，取上清液。用羥胺比色法測定AChE活性(可按照試劑盒說明書進行操作)。
2.2 谷氨酸含量的測定
谷氨酸是腦內主要的興奮性神經遞質，介導興奮性突觸傳遞，并與長時程增強（long term potentiation LTP）的形成密切相關 [7]，也作為老年癡呆藥效的相關評價之一。
檢測方法：在海馬組織中加入HCL溶液，冰浴下超聲勻漿，低溫離心，取上清液加入正亮氨酸為內標物，利用異硫氰酸苯酯衍生，用內標法測定谷氨酸含量[8]。
2.3 p-KER2含量的測定
p-KER2含量測定：將海馬組織放到預冷的裂解液中。低溫超聲粉碎后，離心，取上清液分裝。用Braford法測定蛋白質含量，以牛血清白蛋白為標準品。用磷酸化抗體，常規Western蛋白印跡法測定p-KER2含量[9]。掃描蛋白條帶，進行吸光度分析，吸光度值代表p-KER2含量。
2.4 Aβ和S.P含量的測定
Aβ由分泌酶水解β淀粉樣前體蛋白產生，稱為β-淀粉樣肽，Aβ生成的增多對神經元有毒性作用[10]，大腦海馬組織形態也發生明顯的變化。而Aβ被認為是導致神經元損傷及認知功能衰退的主要致病物質[11]。
S.P是世界上發現最早的神經肽，研究表明，S.P與學習記憶功能有關，且對中樞神經系統具有保護作用，向人們提示了其對老年性癡呆等神經系統疾病具有潛在的防治價值[12]。
因此Aβ和S.P含量的測定對藥效的評價有著重要的作用。
2.5 皮質的蛋白含量的測定
檢測方法：分離腦皮質，稱重，組織加入磷酸鹽緩沖液（PBS）液，在組織勻漿器中充分研磨后，離心，吸取上清液，用PBS按1:4的比例配成組織勻漿液。最后用酶標儀微量比色法測定皮質勻漿液的蛋白含量。
3 腦組織形態學觀察指標
3.1 海馬病理形態觀察
海馬組織主要負責存儲信息,是人學習和記憶的關鍵部位。海馬結構的整合是空間學習的基礎，海馬區的受損影響大鼠學習行為的實驗結果，和臨床患者健忘、癡呆等表現是一致的[13] 。海馬萎縮被看成是與記憶損傷相關的重要指標，也是評價藥效的主要指標之一。
檢測方法：斷頭處死，開顱取出完整的腦組織，用10%的福爾馬林固定，切取腦組織，石蠟包埋，連續切片，行HE常規染色，進行細胞形態學觀察。
3.2 檢測海馬及邊緣系統的膽堿能神經元丟失狀況
老年癡呆患者的病理學特征是大量神經細胞內神經纖維纏結、細胞外老年斑和彌漫性腦萎縮[14]。計算神經元數目檢測海馬及邊緣系統的膽堿能神經元丟失狀況可以直觀簡單地推測出患者的生理狀態，是評價藥效的重要指標。
3.3 病理組織切片及免疫組織化學染色
病理組織切片及免疫組織化學染色只要在光學顯微鏡下，老年癡呆動物模型內部結構的病理變化就一目了然，從而透徹地解析老年癡呆的病因和發病機制。
檢測方法：開顱取腦后固定、脫水等過程后，進行冠狀冷凍切片。切片PBS沖洗，經過溶于 PBST進行過氧化反應，封閉處理后，加入鼠抗搖勻、孵育過夜。然后，在室溫下加入生物素化羊抗鼠IgG搖勻、孵育，室溫搖勻、孵育，顯色。最后，經過常規粘片、干燥、脫水、透明、封片，光學顯微鏡下觀察并拍攝。
4 血液檢測指標
近年來的研究表明，血液指標的檢測不僅可預測患上老年癡呆的風險，其準確率高達90%，還可以作為不可或缺的藥效評價指標，專家認為，血液檢測有望為人類防治老年癡呆癥帶來革命性變化。
4.1 血清β淀粉樣蛋白、轉化生長因子及類胰島素樣生長因子Ⅱ水平檢測
分泌酶水解β淀粉樣前體蛋白產生Aβ,而Aβ又是導致認知功能衰退的主要致病物質，所以老年癡呆伴有β-淀粉樣蛋白沉積，可通過檢測血清β淀粉樣蛋白的水平來估計Aβ的含量。
檢測方法：取血分離血清,血清β淀粉樣蛋白、轉化生長因子及類胰島素樣生長因子Ⅱ檢測采用放免法。
4.2 超氧化物岐化酶(SOD)和丙二醛(MDA)羥自由基的含量檢測
檢測方法：快速開胸，心臟取血，離心取血清，置于低溫保存，按試劑盒說明書，紫外分光光度法檢測超氧化物岐化酶(SOD)和丙二醛(MDA)羥自由基的含量觀察動物腦組織形態學的病理變化。
4.3 血液流變學檢測
研究表明，血液流變學異常是導致血液成分改變的主要因素之一。有研究認為，高黏血癥是癡呆的危險因素之一。其機制可能與血液黏滯度異常則血流變慢，血液黏稠度增加而致腦血流量下降，腦部缺血缺氧，損害大腦的學習記憶功能有關[15]。血液流變學檢測也可以評價藥物療效的好壞。
5 小結
到目前為止，各種藥效評價指標層出不窮，除了上述常用的指標外，按照每種治療方法或者藥物對此疾病改善的不同，檢測的指標也會有所不同，如晚期老年癡呆存在嚴重氨基酸代謝障礙，腦脊液，血漿中興奮性氨基酸谷氨酸、天門冬氨酸含量的測定具有重要價值；老年癡呆能引起nNOS和NO表達增加，而MTPG(代謝型谷氨酸受體阻斷劑α-甲基-（4-四唑基-苯）甘氨酸能阻斷老年癡呆誘導的nNOS表達增加[16]，因此nNOS含量的檢測在MTPG這種受體阻斷劑的影響下有相對重要的意義等。還有血糖指標，海馬顳葉中D2受體變化、載脂蛋白E的含量等等都與老年癡呆的機理息息相關，由于這些指標多而雜是近幾年的研究發現，還未得到廣泛的應用及證實，還未成熟，故本文只選取了一些成熟、常用、重要且有效的指標及其檢測方法進行整理歸類，為以后的研究提供更方便的查找途徑，但是歸類的指標中也還很多細節到現在為止還沒有透徹，值得進一步研究、完善，使其更加適用于老年癡呆的機制探討和藥理研究。
這些評價指標的整理與總結以老年癡呆藥理學的研究為基礎，以評價藥效為目的，從而為多層次、多角度深入研究老年癡呆的發病機理奠定了基礎，為藥物治療老年癡呆提供更多的途徑，有利于進一步提高藥物治療老年癡呆的療效以及臨床價值，并為研究開發療效更高、毒性更小的治療老年癡呆的藥物提供更多思路。
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