中醫證候的基因芯片分析論文
時間:2022-02-03 09:21:00
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1中醫證候及其證候基因組
辨證論治是中醫學理論的特點之一,論治取決于辨證。中醫的“證”是生命物質在疾病過程中具有時相性的本質反映。“候”的原意則是用以說明事物變化的情狀,即所謂的疾病的臨床表現。由于中醫學對于疾病的認識側重于整體、宏觀、司外揣內,重視疾病某階段機體的整體狀態,辨證論治也即是通過對疾病表現在外的征象,進而推測演繹疾病的病因、病性和病位,由此歸納出證的概念[2]。用現代科技研究中醫“證候”是中醫研究的重要課題,證候病機及其與疾病和方劑的相關性是證候研究的重要科學問題[3]。中醫證候是中醫藥研究的核心,“證候”本質的研究是中醫現代化研究的熱點和難點,如能獲得突破性進展,必將使中醫理論研究取得質的飛躍。應用現代醫學理論和分子生物學技術闡明中醫“證候”本質是實現中醫藥現代化的基礎和關鍵,具有重大科學意義。中醫“證候”本質研究雖經歷幾十年至今未能實質性突破,其根本原因在于以前沒有一種像基因芯片那樣十分有效地研究手段能同時檢測許多機體、組織和細胞的變化,并比較變化以識別其規律[4]。中醫證候的現代研究從以癥狀、疾病、組織、細胞等為主體,逐漸發展至分子水平、基因水平,并已由單個基因向多基因,由個別基因向基因組發展,由個別基因研究積累到研究基因表達譜,當今在引入基因芯片技術后,建立起證候的功能基因組表達譜[5],旨在尋找一些與證候相關的基因,然后根據這些基因與證候的關系密切程度用于證候的基因診斷和療效評價[6]。從中醫理論看,證候的形成是由先天的體質因素和后天的環境因素共同作用的結果,因而對證候的研究可能要繪制3張圖譜:基因組圖譜、單核苷多態性(SNP)圖譜和蛋白質組學圖譜。而SNP譜體現了不同人種和同一人種不同個體之間的基因組差異,并決定人類個體體質差異和疾病易感性,也可能是中醫稟賦學說的基因組背景。
2中醫證候的基因芯片研究
2.1腎陽虛證
倪紅梅等[7]對腎陽虛體質青少年差異表達基因的基因芯片研究,選取上海16~24歲青少年154例進行腎陽虛體質篩查,篩查出6例腎陽虛體質者,男性1例,女性5例,余148例為對照,分別采集兩組的外周血,分離白細胞并抽提RNA。基因芯片采用上海博星公司的H80S型,可做人標本的8465點雜交,結果篩選出127條差異基因,其中63條上調基因,64條下調基因,其涉及免疫相關、細胞周期蛋白、發育相關、細胞生長、細胞凋亡相關蛋白、代謝、離子通道、轉運蛋白、轉錄因子,以及信號轉導系統。由此說明體質的本質是人體防御免疫功能、自我代償修復和自我調節的反映,其物質基礎是建立在人體各系統形態、機能及代謝活動之上的,其內在機理也是多系統多環節的。譚從娥等[8]對篩選出1例骨關節炎(OA)腎陽虛證行溫針治療(取穴:氣海、關元、足三里、內外膝眼、陽陵泉),于治療前后采集其外周血,做白細胞RNA抽提,以基因芯片研究其治療前后的基因表達譜。結果:在70條差異表達基因中,上調基因49條,下調基因21條,并對34條基因初步分類分析:與免疫相關基因10條,主要表現為上調。如退火素A1基因(NM-000700),OA早期一些患者滑膜液中可有T細胞浸潤,OA晚期某些細胞因子(IL-1,TNF-α)參與局部組織損傷,其與炎癥免疫和自身免疫發生有關,致使關節軟骨發生退行性變,故認為溫針治療后,免疫相關基因上調,提示溫針治療后可通過調節機體的免疫反應來干預OA的發病過程,還有熱休克90KDβ鏈蛋白1基因(NM-007355)與基礎代謝相關的基因5條,如II型cAMP依賴性調節蛋白酶β鏈基因(NM-002736),經針刺后上調了2.43倍,已知cAMP為調節新陳代謝的第二信使,其受cAMP依賴性蛋白激酶(PKA)調節,可誘導蛋白質酶,加速新陳代謝,升高體溫,調節機體能量平衡。提示溫針可調節與基礎代謝相關基因表達來改善患者基礎代謝低的臨床癥狀。與肌肉運動相關的基因5條,主要為下調基因,如膽堿能受體、煙堿性、α多肽1基因(NM-000079),此基因是突觸內神經信息傳遞的基礎,與骨骼肌運動、肌肉收縮直接相關。與生長發育相關基因9條,人體各組織均有轉化生長因子β(TGFβ)誘導早期生長反應基因(NM-005655),上調了2.8倍,其可調節細胞生長分化。與信息相關的基因5條,主要表現為下調,如G蛋白信號調節因子1(RGS1)基因(NM-002922)下調了0.35倍,其是G蛋白結合受體復合物的重要調節和組成部分。溫針可促進氣血流通,使機體協調,起到全身調節作用。楊麗萍等[9]也以溫針治療腎陽虛骨關節炎,篩選出與免疫相關基因,其中上調基因5條,下調基因4條,上調基因主要有NCF1基因和CCR7基因,前者編碼嗜中性細胞因子,后者編碼G蛋白受體家族成員-趨化因子受體7。溫針治療下調基因CD97,其編碼一個EGF-TM7家族成員,并存在于大部分活化的白細胞表面的糖蛋白,有G蛋白偶聯特征。陳曉玲等[10]對一個典型的腎陽虛家系15個成員,以寡核苷酸雜交技術對其外周血單核細胞的差異表達譜分析研究,同時對血樣本進行血液生化、免疫指標檢測,還設正常人10人作為對照,比較二者結果。盡管存在普遍的血液生化與免疫學指標異常,但該腎陽虛寒證家族患者作為一個典型的陽虛寒證抽樣,經統計學處理均未見顯著性差異。此提示檢測眾多血液生化、免疫指標,對整體性失調的證侯群,其臨床意義不大,故作為西醫臨床診斷所依仗的血液生化與免疫學指標,在諸如腎陽虛寒證等中醫證的診斷方面,參考意義不明顯。用5張北京博奧生物芯片中心生產的人全基因組表達譜芯片(2200個雜交點),來研究腎陽虛患者外周血紅細胞基因表達譜,結果:①典型腎陽虛證/正常對照組:上調基因100條,下調基因33條;②腎陽虛證/正常對照組:上調基因148條,下調基因31條;③典型腎陽虛證治療顯效者治療前/治療后:上調基因12條,下調基因47條;④典型腎陽虛證/正常配偶:上調基因66條,下調基因44條。這些基因主要為:物質代謝、信號轉導、能量代謝和免疫調節等,初步反映出腎陽虛證患者惡寒喜暖、肢冷倦臥、面色白等宏觀證候在微觀基因表達的分子生物學基礎。
2.2虛寒證
為了研究虛寒證與能量代謝的關系,陸明等[11]分別在四川和陜西選擇臨床較常見的虛寒證肢冷患者10例和4例,前者溫針治療(取穴同譚從娥等[8])14d后,與對照組比較及治療前后自身比較,結果在4張芯片中患者1,2,3,4的差異表達基因分別為41條、246條、57條和70條。后者以有明顯肢冷者為實驗組,無肢冷者為對照組,比較二者,結果差異表達基因101條。在5張芯片中,共有重復差異表達基因30條,可查庫基因19條,其中與能量代謝相關基因占21.43%,說明肢冷與新陳代謝密切相關。吳斌等[12]對一虛寒證典型家系(3代16人)篩選出虛寒證患者5人作為實驗組,正常人5人做對照組,采集其外周血,抽提其細胞RNA行基因芯片檢測,芯片采用上海博星公司的BiostarH-40ScDNA表達譜芯片。結果:篩選出差異基因79條,主要有與新陳代謝有關的基因占56.04%,與細胞生理過程有關的占40.66%,與細胞信號轉導有關的占29.67%,與生物的生理過程有關的占15.38%,表明虛寒證集中于代謝基因的異常表達。另外,還涉及15條路徑:其中人脂蛋白酶mRNA(Hs.180878)明顯低表達,其主要功能為水解循環乳糜微粒的三酰甘油和極低密度脂蛋白,涉及了脂肪代謝路徑。為研究OA虛寒證的基因表達譜,選擇患者8例,同時選8例正常人為對照,采血提取細胞mRNA以北京博奧公司的22000點基因芯片檢測,結果篩選出差異表達基因75條,其中上調基因23條,下調基因52條[13]。研究發現與免疫相關基因7條如與嚴重OA的自身免疫機制密切相關的中性粒細胞因子1基因(NM-000265),可促使免疫細胞穿過外周組織并進入次級淋巴器官的趨化因子受體7基因(NM-001838),與免疫抑制相關的環孢素B受體基因(NM-000942)等。還有調節軟骨細胞生長分化的生長因子相關基因4,如轉化生長因子β、胰島素樣生長因子等,其參與細胞的有絲分裂,促進軟骨細胞增殖、分化和合成軟骨基質。如調節細胞生長和分化的早期關鍵生長反應因子3基因(NM-004430),激活轉化生長因子(TGF-β1)的早期生長反應因子1基因(NM-001964),具有抑制表皮生長因子受體并在其溶酶體降解中具有重要作用的選擇性連接蛋白(NM-003100)等。還有Ras誘導衰老因子基因(AF438313)上調。與能量代謝低下相關基因5條,如構成線粒體、呼吸鏈結構的線粒體ATP合成酶運輸H+的F1復合體亞家族基因(NM-001697)GTP酶激活蛋白的G蛋白信號調節因子2基因(NM-002923)等。由腎主骨、藏精氣、主生長發育,故OA發病與腎虛有密切關系,而腎虛時亦可出現一系列生長發育相關基因表達異常。王米渠等[14]對寒證基因芯片的檢測數據提出了分析方法:①縱向發展的聚類分析(個體用藥后的連續追蹤,進而研究家系寒證);②橫向互比的聚類分析(利用樹狀分層圖等分析有關證候的調查數據);③分證候的聚類分析(如肢冷單個證候的療效分析);④合寒證聚類分析(研究寒證證候變異主因素及其主效基因組之關系)。楊麗萍等[15]也對上述家系進一步做了能量代謝相關基因異常表達的探討,結果涉及新陳代謝基因達70.73%。
2.3心陽虛證
用基因芯片探討冠心病心陽虛證特征性基因表達譜,各采集5例患者和正常人外周血,抽提白細胞RNA行基因芯片檢測,并對5例患者做溫陽通痹治療,1例顯效,比較這1例治療前后差異基因表達。結果:5例患者與正常人比較,差異表達基因231條,其與典型患者(1例)治療前后的基因芯片差異基因譜中有39條差異基因表達一致,兩條差異基因表達相異。說明這39條基因的差異表達可能是冠心病心陽虛證發生的分子生物學基礎。差異基因的功能分析表明:主要涉及代謝、細胞發育、分化相關和免疫應答相關基因,部分闡釋了冠心病心陽虛證的病理機制[16]。
2.4肺虛證
對慢性阻塞性肺疾病(COPD)肺氣虛和肺陰虛患者各4例及正常人4例采集其外周血,抽提淋巴細胞RNA行基因芯片檢測。結果篩選出肺氣虛/正常人45條差異表達基因,其中41條基因上調,4條基因下調;肺氣虛/肺陰虛差異表達基因43條,其中上調基因27條,下調基因16條。主要涉及免疫相關基因和酶相關基因。由此可見,肺氣虛證實質主要是與免疫相關基因表達譜的改變[17,18]。
2.5脾虛證應用基因芯片技術研究利血平脾虛證大鼠模型大腦皮層基因表達譜的改變,選取雌性的Wistar大鼠30只,分為造模組和對照組。造模組用利血平注射液背部皮下注射,于第14天處死,取大腦皮層,抽提mRNA行基因芯片檢測,結果篩選出差異表達基因145條,占檢測基因的3.54%。在已知的47條基因中,11條與免疫、應激和炎癥反應有關,7條與能量代謝有關,與信號轉導/轉錄有關和與細胞生長和分化有關的各為6條,5條與蛋白質合成有關,各為3條的是與DNA合成、修復有關的,與神經退行性疾病有關的,與神經遞質傳遞和釋放有關的基因,兩條基因與離子通道和轉運體有關的基因[19]。用4張基因芯片探討脾氣虛證免疫相關基因組學機制,選擇脾氣虛證慢性胃炎和潰瘍性結腸炎病例及正常人各3例,分別采集其外周血,提取白細胞RNA行基因芯片檢測,結果慢性胃炎脾氣虛證和潰瘍性結腸炎脾氣虛證異常表達的免疫相關基因分別為68條和57條,二者相同的差異表達基因為7條,主要是與免疫相關的基因。提示脾氣虛證發生有其免疫相關基因組學基礎,是細胞免疫、體液免疫以及非特異性免疫功能等方面發生功能紊亂[20]。
2.6寒熱證
2.6.1類風濕性關節炎(RA)在33例RA患者中探討活動期和非活動期RA寒熱證候的基因表達差異,分別采集患者和正常人靜脈血,純化得CD4+T淋巴細胞,用基因芯片進行檢測。結果篩選出活動期和穩定期差別基因63條,主要涉及免疫應答,穩定期RA寒熱證患者篩選出48條差異基因,只有4條基因與上述63條基因重復,活動期RA寒熱證有59條差異基因,但與上述基因不重復,二期均主要涉及功能代謝基因。提示RA患者穩定期和活動期的表達基因差異與寒熱證候的基因表達差異不一致。說明RA分期與中醫寒熱證候分類都有各自的基因組學基礎[21]。在這些病例中還進行了RA類風濕因子(RF)陰性和陽性與其寒熱證分類的比較,結果RF陰性和陽性間有55條基因表達差異,主要涉及免疫應答;RF陽性和RF陰性RA寒熱證患者各有71條和70條基因異常表達,前者主要涉及功能代謝和免疫應答,后者主要涉及功能代謝,與上述55條基因無重復,但與前者71條基因有兩條基因重復。說明以RF陽性和陰性分型與中醫寒熱證分類的基因表達并不一致,都有各自的基因組學基礎[22]。同樣還有以RA早期和非早期差異基因與正常人基因表達比較,結果RA早期和非早期患者外周血CD4+T淋巴細胞基因表達存在明顯差異,與正常人比較的差異基因與RA早期和非早期比較的差異基因不一致[23]。在5例活動期RA患者和3例正常人間比較RA患者外周血單核細胞基因表達差異,結果篩選出差異表達基因151條,主要涉及炎癥/免疫反應,特別是與IgG及其免疫復合物結合的Fc受體(FcγR)高表達,其與RA初始階段炎癥激活及其后的炎癥級聯反應、慢性持續性炎癥和關節破壞密切相關[24]。
2.6.2系統性紅斑狼瘡(SLE)對4例熱毒熾盛型、5例陰虛內熱型的SLE患者和6例正常人采集外周血,抽提白細胞RNA行基因芯片(7500余雜交點)檢測,結果:篩選出差異表達基因89條,其中上調基因45條,下調44條,涉及細胞因子及其受體相關基因、免疫相關基因、信號傳導和傳遞蛋白、離子通道和轉運蛋白、蛋白翻譯合成等。總的表達模式為免疫細胞對干擾素應答增高,免疫細胞蛋白質合成受抑,誘導細胞凋亡增加等。9張芯片的聚類分析表明,4例熱毒熾盛型和5例陰虛內熱型患者各歸為一類。前者處于SLE中、重度活動期,其代謝相關基因、急性時相炎癥反應相關基因表達水平明顯高于后者[25],盡管不同患者存在個體差異[26]。
基因芯片研究是全景式研究,使人們從整個細胞的角度觀察已知基因在研究者設立的條件下整體表達情況,其與其他分子生物學方法結合起來將會使研究更廣闊[27]。中醫擅長宏觀的整體性功能調節,而在微觀其也是從整體上調節對立雙方的基因功能,亦即從修飾或改變基因的表達與基因產物的功能著手,而不是改變與糾正基因的結構[28]。問題的關鍵是要找出不同證候的具有特征意義的差異表達基因,基因芯片技術為此提供了有力的工具。
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【摘要】用現代科學技術研究中醫證候是中醫研究的重要課題。文章簡要介紹了用基因芯片探討中醫證候本質的研究近況,主要包括腎陽虛證、虛寒證、心陽虛證、肺虛證、脾虛證和寒熱證差異基因表達譜的研究,從而為從基因水平上闡釋中醫證候的本質特征和進一步建立中醫證候的基因組學做了有意義的探索。
【關鍵詞】中醫證候基因芯片生命科學
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