人工關節金屬磨損研究論文

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【摘要】設計一種體外制備、分離人工關節金屬磨損顆粒的方法，并驗證這種顆粒用于醫學實驗的可行性。［方法］用鈦鋁釩合金、鈷鉻鉬合金材料分別制成球磨罐(國家發明專利，申請號：03142073.7),球磨罐內裝有用同種材料制成的磨塊;向該球磨罐內注入模擬生物體液;震動球磨得到顆粒混懸液。梯度離心獲得金屬顆粒。對顆粒進行：(1)元素成分鑒定；(2)顆粒大小鑒定和粒度分析；(3)掃描電鏡對顆粒的表面形態觀察；(4)將顆粒與J774A.1巨噬細胞共同培養，觀察細胞吞噬顆粒的情況。［結果］通過此方法成功產生并分離出大量直徑1μm左右的鈦合金和鈷鉻鉬合金顆粒。(1)元素分析證實整個處理過程中無雜質成分污染；(2)鈦合金顆粒的平均直徑Dv90∶1.009，鈷鉻鉬顆粒的平均直徑Dv90∶1.008，粒度分布曲線基本成正態；(3)掃描電鏡圖象顯示顆粒大小均勻，形狀多為不規則，與體內顆粒極為相似；(4)J774A.1巨噬細胞能完整吞噬2種材料的顆粒。［結論］此方法能持續大量產生人工關節假體金屬材料的磨損顆粒，產生的顆粒能在各方面很好地模擬體內磨損顆粒，為今后人工關節假體松動相關研究的體內、體外研究提供可靠的顆粒來源。

【關鍵詞】人工關節生物相容性材料磨損顆粒體內研究體外研究

Abstract：［Objective］Todesignamethodofinvitropreparationandseperationformetallicwearparticlesaroundjointprosthesisandevaluateitsfeasibilityinmedicalexperiments.［Method］Ti-6Al-4VandCo-Gr-Moalloyswereusedtomaketwofrictionjarsrespectirely.Nationalinventivepatentappliednumber03142073.7.Lotsofquadrateblocksmadeofthesamematerialsareputintothejarsrespectively,whichwerethen.lubricatedbymanmadebodyfluidandvibratedonabottleshaker.After21daysthefluidwasharvestedandcentrifugedtogettheproducedwearparticles.Thecollectedparticleswerestudiedbyusingelementtraceanalysis,lasercountersizerandscanningelectronmicroscopy.TheJ774.A1macrophagesculturedtogetherwiththeseparticlesfor24hourswereobservedunderinvertedphasecontrastmicroscopyandtransmissionelectronmicroscopy.［Result］Agotgreatamountsofmetallicparticleswith1μmdiameterconedbeproduceusingthismethod.Theaveragediameteroftitaniumalloys(Dv90)is1.011andthatofCoGrMois1.010.Particlesizedistributionhadgoodconsistencyindifferentmaterials.Underscanningelectronmicroscopy,theparticleshadirregularshapesjustlikethosegotfromrevisionoperations.TheparticlestakenintotheJ774.A1macrophagescouldbeseenunderinvertedphasecontrastmicroscopyandtransmissionelectronmicroscopy.［Conclusion］Thismethodisgoodenoughtoproducllotsofmetallicwearparticlesmosthlikethosearoundtotaljointprosthesisandcanbeusedinfurtherinvivoandinvitrostudiesaboutjointprosthesisloosening.

Keywords：artifitialjoint;biomechanicalreceptivematerial;wearparticle;invivo;invitro

人工關節假體晚期松動是長期困擾骨科領域的難題。長期的研究形成共識：假體材料磨損顆粒引發的由巨噬細胞介導的破骨細胞性骨吸收是假體松動的主要生物學原因［1］。隨著各種新型生物金屬材料的不斷產生和人們對金屬-金屬人工關節假體的重新評價，細小金屬顆粒在假體松動中的作用又成為了研究的熱點［2，3］。為解決人工關節松動相關研究中顆粒來源匱乏的問題，本研究在參考Rogers［4］方法的基礎上設計出一種體外產生生物金屬材料細小磨損顆粒的方法，采用此方法成功制成了直徑1μm的鈦合金和鈷鉻鉬合金顆粒。并對顆粒的成份、大小、形態和粒度分布進行分析觀察。顆粒與巨噬細胞體外培養中觀察吞噬的方法初步驗證顆粒用于醫學實驗的可行性。

1材料與方法

1.1顆粒制備裝置的研制

原料選用醫用鈦鋁釩合金（上海思愛高科技開發有限公司提供）和鈷鉻鉬合金（北京力達康科技有限公司提供）。采用非焊接技術制成3個中空的橢球形球磨罐（100mm×70mm×70mm）和立方形磨塊若干（5mm×5mm×5mm）。頂部開口處采用螺紋旋入式頂蓋，加用聚乙烯的墊圈，以提高系統的密封性能，在設計上確保聚乙烯墊圈不外露于容器的內壁，以防止混入聚乙烯磨損顆粒。底部支架使磨罐能在平面放置（圖1、2）。本裝置的所有組件按ASTMF86-76標準進行清洗，75%酒精浸泡，高溫滅菌（121℃、15min）后備用。

生物金屬顆粒產生裝置及分離保存方法已申請國家發明專利。

發明名稱：一種生物金屬材料超細粉末的制備方法及其制備裝置。

專利申請號：03142073.7

1.2磨損顆粒的制備、離心分離與保存

無菌條件下打開頂蓋，將磨塊放入球磨罐中，加入事先配制好模擬生物體液（PBS2%小牛血清5IU/ml青霉素5μg/ml鏈霉素）75ml作為潤滑液。裝置至于搖床上，搖晃72h，棄掉潤滑液，重新加入潤滑液75ml，搖晃21d。收集潤滑液與磨損顆粒的混懸液，加潤滑液至80ml待用。

將鈷鉻鉬合金混懸液80ml分裝在8個10ml的試管中，500r/min離心2min，棄沉淀物，重新加潤滑液至10ml，重復2次。1000r/min離心5min，棄上清，重新加潤滑液至10ml,重復1000r/min離心5min1次，加潤滑液至4ml,-20℃凍存備用。

將鈦合金混懸液80ml分裝在8個10ml的試管中，500r/min離心4min，棄沉淀物，重新加潤滑液至10ml，重復2次。1000r/min離心40min，棄上清，重新加潤滑液至10ml,重復1000r/min離心40min一次，加潤滑液至4ml,-20℃凍存備用。

1.3磨損顆粒成分元素分析

隨機抽樣選取鈦鋁釩合金原料和磨損顆粒樣品各一份進行元素分析。秤取0.1g原料和磨損顆粒樣品，于聚四氟乙烯燒杯中，加入10mlHF（分析純），加熱1h，加入10mlH2SO4(GR),加熱1h，定容于500ml容量瓶中。取液進入等離子體發射光譜儀（IRISAdvantage1000美國），儀器自動讀出樣品元素組成。

1.4磨損顆粒的粒度分析

用潤滑液（PBS2%小牛血清5IU/ml青霉素5μg/ml鏈霉素）進入激光粒度儀（TSL100上海理工大學研制）校準調零。取顆粒混懸液4ml,在旋渦混合器上充分混勻，進入激光粒度儀，計算機自動顆粒濃度、粒度數據和粒度分布曲線。

1.5磨損顆粒的掃描電鏡觀察

取顆粒混懸液50ml，滴加到孔徑為0.22μm的濾膜上，烘干48h后表面真空離子噴金，掃描電子顯微鏡（QUANTA200荷蘭）進行觀察并攝取圖像。

1.6巨噬細胞培養與吞噬實驗

J774A.1巨噬細胞株來源于BALB/c小鼠網狀細胞肉瘤，由AmericanTypeCultureCollectionCo.（Rockville,MD,USA）提供，培養在含10%小牛血清、100μg/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素和2%谷氨酰胺的DMEM培養液，于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養。收集對數生長期的細胞，以2×105/ml接種于6孔板中，培養4～6h后，加入體外制備的鈷鉻鉬合金顆粒混懸液（107個/孔），另外于35mm培養皿中按上述方法接種細胞，刺激24h后用2.5%戊二醛溶液固定，進行倒置相差顯微鏡觀察。同時設置不加任何刺激物的對照孔。

1.7巨噬細胞透射電鏡觀察

J774A.1巨噬細胞分別加入鈷鉻鉬合金顆粒混懸液和鈦鋁釩合金顆粒混懸液（107個/孔），作用24h后用2.5%戊二醛溶液固定。用橡皮刮子將全部細胞從皿底輕輕刮下，收集在離心管中離心2000r/min20min，棄上清，將沉淀的細胞團塊取出，用棉花紙包裹起來，然后進行漂洗、1%鋨酸后固定15min、漂洗、脫水、浸透，將樣品從棉花紙內取出進行包埋，60℃烘箱內48h，超薄切片，透射電鏡（HITACHIH-500日本）觀察并攝像。

2結果

2.1磨損顆粒成分元素分析

分析結果顯示：實驗中獲得的鈦鋁釩合金顆粒的元素構成與其原料基本相同（表1），證實磨損顆粒的產生過程中無雜質元素污染。表1鈦鋁釩合金磨損顆粒的元素分析結果

2.2磨損顆粒的粒度分析

鈦鋁釩顆粒的平均直徑Dv90∶1.009，99.93%的顆粒直徑在0.3～1.2μm之間；鈷鉻鉬顆粒的平均直徑Dv90∶1.008，99.93%的顆粒直徑在0.3～1.2μm之間；2種顆粒粒度分布曲線形態非常相似（圖3、4）。

2.3磨損顆粒的掃描電鏡觀察

鏡下可見體外制備的鈦鋁釩合金顆粒呈片狀、盤狀、柱狀、針狀等各種不規則形狀，表面有低密度的血清蛋白沉積（圖5）。未見明顯的顆粒疊加和成團聚集的情況。大小顆粒在濾膜上分布不均勻，大顆粒集中在邊緣上，小顆粒集中在中心部位。

體外制造的鈷鉻鉬合金顆粒也有片狀、盤狀、柱狀、針狀等各種不規則形狀，鈷鉻鉬合金顆粒更多為塊狀顆粒，是由于顆粒輕度聚集，顯得體積更大（圖6）。

與體內分離顆粒對照發現，顆粒的形態均非常近似，表面都有蛋白沉積。體內分離顆粒大小分布更加不均勻（圖7）。

2.4巨噬細胞培養與吞噬實驗

J774A.1巨噬細胞經合適的條件培養24h后細胞生長旺盛，吞噬活性較強。倒置相差顯微鏡下細胞成圓形或橢圓形，細胞輪廓清晰，胞漿內無明顯吞噬小體（圖8）。與體外制備的鈷鉻鉬顆粒共同培養24h后，鏡下細胞形態發生變化。細胞密度減小，細胞腫脹成圓形，胞核變大，甚至見到細胞大片壞死，核溶解，細胞碎裂，胞漿內有被吞噬的鈷鉻鉬顆粒影像（圖9）。

2.5培養的巨噬細胞透射電鏡觀察

當金屬顆粒接近J774A.1巨噬細胞時，細胞伸出偽足逐漸將較小的顆粒吞噬入細胞內。此時細胞開始張大，胞漿內線粒體和粗面內質網增生，表示分泌活動活躍，顆粒進入細胞成為吞噬體。胞漿密度變得不均勻，有空泡樣變（圖10）。

3討論

為闡明假體松動的機理和對新型假體材料的生物相容性進行評價，眾多學者采用體外細胞培養、組織培養、體內植入等方法對顆粒引發的生物學反應進行研究［5～7］。由于體內顆粒來源有限，國內學者常采用簡單的材料對磨、過篩或接受國外贈送的方法體外獲得顆粒，而國外學者采用的方法有對磨（milling）、金屬熔體霧化（aerosolization）、氣化（gasatomization）、激光制粉法等［4］。由于來源雜亂，顆粒的各項特性變異較大，使大量的實驗數據因無法重復和比較而失去實際意義。如何體外產生生物金屬的顆粒并使之能很好地模擬體內顆粒是一個普遍地急需解決的問題。

大量的研究已經顯示：磨損顆粒的物理、化學性質是影響機體反應程度和假體松動的關鍵因素。這些性質包括：顆粒數量、大小、粒度分布、表面積、化學元素構成、表面形態、可溶性金屬離子釋放、表面電荷等［5］。使體外生成的顆粒最大限度地模擬體內磨損顆粒是作者設計這個方法時始終堅持的原則。

3.1顆粒的產生方法

人工關節周圍的金屬磨損顆粒可以來源于關節面、柄-骨界面、假體-骨水泥界面、臼杯-骨界面、組合式假體的柄-頭結合處。從磨損機理上講屬于表面摩擦磨損，因此借鑒工業球磨的方法產生顆粒是合理的。作者自行設計的球磨罐具有以下特點：(1)采用相同的材料加工球磨罐和磨塊，無焊接工藝和罐口的密封裝置避免了任何其它材料參與摩擦，保證了顆粒的純凈；(2)潤滑液采用PBS2%小牛血清5IU/ml青霉素5μg/ml鏈霉素，動物血清對顆粒進行預孵化(preincubation)，經蛋白孵化的顆粒的生物學行為更接近體內顆粒。在實踐中作者發現，預孵化過程能在顆粒表面形成蛋白保護膜，明顯減少顆粒的聚集成團現象，有利于顆粒的離心分離和電鏡觀察；(3)本裝置的所有組件按ASTMF86-76標準進行清洗，75%酒精浸泡，高溫滅菌，無菌操作過程和含抗生素的潤滑液都保證了顆粒無微生物和內毒素污染，這對于體內和體外醫學實驗是非常重要的；(4)低能量緩慢搖晃和潤滑液的加入，使磨塊與罐壁、磨塊與磨塊之間進行緩慢的摩擦，產生細小的顆粒，篩選效率提高。

3.2顆粒的分離方法

本實驗采用“梯度離心”的方法對顆粒進行篩選。其原理來自于Stokes''''法則：

R2=9ηh/(2t［ρ-ρ0］ω2n)

R：顆粒半徑η：潤滑液黏滯度h：樣品高度t：離心時間ρ：金屬密度ρ0：潤滑液密度ω：離心角速度n：樣品與旋轉軸距離

本實驗中的常規變量只有ω和t，因此公式簡化為：

RCo2=4.5×106/t(min)×ω2(r/min)

RTi2=9.0×106/t(min)×ω2(r/min)

RCo：鈷鉻鉬合金顆粒半徑RTi：鈦合金顆粒半徑t：離心時間ω：離心角速度

總之，本實驗方法簡單，設備要求不高，利于應用和推廣。

3.3顆粒的粒度測定方法

傳統的顆粒測定方法是在光鏡或電鏡下對顆粒進行直接計數，工作量大、精確度差。激光粒度儀利用測定激光束穿透顆粒混懸液的散射估計出顆粒的平均體積，如假設顆粒為標準球體，則可計算出顆粒直徑。在應用中作者認為粒度儀用于人工關節顆粒分析的優勢在于：測量速度快、誤差小、可定量分析、操作簡單，非常適合大量樣本的檢測與對比研究。激光粒度儀是確定顆粒大小的有效方法，但在應用中仍需注意：(1)激光粒度儀是在忽略顆粒形狀差異的基礎上對顆粒大小的計算和估計，所以顆粒形狀對于結果有影響。光鏡或電鏡下對顆粒進行直接計數的方法可以彌補上述不足，并可以獲得顆粒形態的直觀資料，兩者可以取長補短；(2)由于金屬顆粒的密度大，在液體中沉降迅速，也給結果帶來偏差。所以注意分離好的顆粒混懸液要盡快進行測定，測定前再次震蕩混勻，有條件時可以選取甘油等高黏度懸浮液。

3.4發展方向展望

隨著各種新型生物金屬材料的不斷產生和人們對金屬-金屬和陶瓷-陶瓷人工關節假體的重新評價，細小金屬和陶瓷顆粒在假體松動中的作用又成為了研究的熱點［2，3］。為適應這一研究發展的需要，作者正在研究能產生更加細小金屬和陶瓷顆粒（直徑25nm左右）的方法。

圖1鈦鋁釩合金球磨罐和磨塊圖2鈷鉻鉬合金球磨罐和磨塊圖3鈦鋁釩顆粒平均直徑Dv90∶1.009，99.93%的顆粒直徑在0.3～1.2μm之間圖4鈷鉻鉬顆粒平均直徑Dv90∶1.008，99.93%的顆粒直徑在0.3～1.2μm之間圖5體外人工制造的鈦鋁釩合金顆粒掃描電鏡顯示：顆粒呈片狀、盤狀、柱狀、針狀等各種不規則形狀，表面有低密度的血清蛋白沉積（2000×）圖6體外制備鈷鉻鉬合金顆粒掃描電鏡，鉻鉬合金顆粒更多為塊狀顆粒，是由于顆粒輕度聚集，顯得體積更大（2000×）圖7體內分離與體外制備的鈦鋁釩顆粒掃描電鏡比較圖7aR為體內分離顆粒圖7b為體外制備顆粒。顆粒的形態均非常近似，表面都有血清蛋白的沉積膜，體內分離顆粒大小分布更加不均勻（R1000×，L2000×）圖8作為空白對照組的J774A.1巨噬細胞培養24h后的形態，細胞成圓形或橢圓形，細胞輪廓清晰，胞漿內無明顯吞噬小體（200×）圖9J774A.1巨噬細胞與鈷鉻鉬顆粒共同培養24h后的形態改變，細胞密度減小，細胞腫脹成圓形，胞核變大，甚至見到細胞大片壞死，核溶解，細胞碎裂，胞漿內有被吞噬的顆粒影像↑（200×）圖10J774A.1巨噬細胞內的金屬顆粒，胞漿內線粒體和粗面內質網增生，顆粒進入細胞成為吞噬體，↑為金屬顆粒。胞漿密度變得不均勻（3500×）

【參考文獻】

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