軟骨復合研究論文

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【摘要】探討軟骨組織工程方法修復骨軟骨缺損理想的種子細胞和支架材料。［方法］體外誘導骨髓基質干細胞向軟骨細胞定向分化，分別與PLGA支架復合培養(yǎng)，并模仿馬賽克骨軟骨移植術在犬關節(jié)骨軟骨缺損深層置入MSC－支架復合體，淺層置入誘導培養(yǎng)后的MSC－支架復合體，緊密壓配，體內構建骨軟骨復合體，觀察其修復的情況。［結果］16周實驗組缺損區(qū)完全由透明軟骨修復，與周圍正常軟骨完全融合，組織觀察顯示以軟骨細胞修復為主，軟骨下骨形成，潮線基本恢復；陰性對照組缺損區(qū)主要由纖維組織修復，部分由透明軟骨修復，組織觀察顯示以纖維細胞修復為主，混有部分軟骨細胞；空白對照組完全由纖維組織修復。［結論］MSCs經(jīng)向軟骨細胞定向分化后復合PLGA支架材料，通過緊密壓配方式與MSCs－PLGA支架在體內構建骨軟骨復合體，可以有效修復骨軟骨缺損。

【關鍵詞】骨髓基質干細胞馬賽克移植術骨軟骨復合體骨軟骨缺損

Abstract：［Objective］Toevaluatetheeffectoftreatingtheosteochondraldefectswithimplantedcellscaffoldcomposites,culturedMSCsasseedcellsandPLGAasscaffolds,andtoacquiredesirableseedcellsandscaffoldmaterials.［Method］BMSCswereinducedtodifferenciatiatedintochondrocytes,coculturedwithPLGAscaffoldrespectivelyinvitro,thenimplantedintoosteochondraldefectsoncaninemodelsbyusingtechniquesofmosaicplasty,inducedBMSCPLGAscaffoldcompositesinthetopofthedefectandBMSCPLGAscaffoldcompositesinthebottomofthedefect,osteochondralcompositeswereconstructedinvivo,andrepairwasobservedwithnakedeyesandhistology.［Result］At16weeksaftertransplantationthedefectsofexpeirmentalgroupwerecoveredwithsemitransparentsmoothwhitetissueandthemarginsbetweentherepairtissueandthesurroundingcartilagewerenotrecognized.Histologically,mostoftherepairtissuewasconsistedwithchondrocytes,maintainedtheirthicknesstothefulldepthoftheoriginaldefects.Thesubchondralbonewaswellremodeled.Thetidemarkwasobserved.Thedefectsofpositivecontrolgroupwerecoveredwithrepairtissues,andpartialwereconformedwithoriginalcartilage.Therepairtissuewaspartlyfilledwithchondrocytes.However,thedefectsofnegativecontrolgroupwererepairedwithsoftfibroustissueswithoutluster,andanobviousboundarybetweenreparativeandoriginalcartilagewasseen.［Conclusion］MSCsPLGAscaffoldcomposites,constructedintoosteochondralcompositesbysuppressingcloselyinvivo,aretheidealmaterialsforrepairingcartilagedefects.

Keywords：bonemesenchymalstemcells(MSCs);mosaicplasty;osteochondralcomposites;osteochondraldefect

關節(jié)軟骨損傷是骨科臨床的常見疾病，以往臨床使用的治療方法均難以達到理想的要求。組織工程技術的迅速發(fā)展，為這一難題的解決提供了前所未有的機遇。本實驗研究的目的是采用軟骨組織工程技術，體外分離骨髓間充質干細胞（MSCs）為種子細胞，經(jīng)軟骨細胞誘導生長因子的誘導培養(yǎng)后，與聚羥基乙酸（polyglycolicacid，PLA）－聚乳酸（polylacticacid，PGA）共聚物(PLGA)支架材料復合培養(yǎng)，并模仿馬賽克骨軟骨移植術在犬膝關節(jié)骨軟骨缺損深層置入MSC－支架復合體，淺層置入誘導培養(yǎng)后的軟骨細胞－支架復合體，緊密壓配，體內構建骨軟骨復合體，觀察其修復的情況。期望能夠找到軟骨組織工程理想的種子細胞和支架材料。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1種子細胞10～12個月齡健康比格犬，無菌穿刺抽取髂骨骨髓7～8ml，Percoll分離法分離骨髓間充質干細胞，進行原代、傳代細胞培養(yǎng)。

1.1.2支架材料將PLGA支架(購自山東醫(yī)療器械研究所)剪成1.0cm×1.0cm×0.2cm大小的方塊，放入12孔板內，然后經(jīng)紫外線照射30min消毒，備用。

1.1.3受體動物及分組10～12個月齡健康比格犬10只（購自山東大學動物實驗中心），體重在8～10kg。在每只犬的雙側膝關節(jié)分別制造3個骨軟骨缺損區(qū)，隨機分為3組。A組：實驗組關節(jié)軟骨缺損內深層植入MSCs復合PLGA支架材料，淺層植入經(jīng)過誘導培養(yǎng)的軟骨細胞復合PLGA支架材料，緊密壓配；B組：陰性對照組，缺損內僅植入MSCs復合PLGA支架材料；C組：陽性對照組，缺損內不植入任何材料。

1.1.4主要試劑一抗：兔抗人Ⅱ型膠原抗體，二抗:山羊抗兔IgG，DAB顯色試劑盒，以上均購自武漢博士德公司。

1.2方法

1.2.1MSCs向軟骨細胞定向分化P1傳代細胞培養(yǎng)至細胞鋪滿瓶底時，消化后調整細胞濃度，加入含TGFβ110ng/ml、10％胎牛血清的低糖DMEM溶液誘導培養(yǎng)。

1.2.2誘導MSCs的鑒定（1）糖胺聚糖（GAG）檢測（表1）。取傳代培養(yǎng)第二代MSCs（P2），實驗組加入TGFβ1誘導培養(yǎng)，對照組用常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)，待細胞長滿全層時，胰酶消化，調整細胞濃度為1×104/ml，接種于96孔板每孔200μl，繼續(xù)加入含不同的培養(yǎng)液每孔200μl，每組5孔，培養(yǎng)第3d換液1次，第7d（誘導培養(yǎng)后第15d）時，取細胞培養(yǎng)上清液，以硫酸軟骨素為標準品，紫外分光光度計制作標準曲線，阿利新藍法檢測細胞培養(yǎng)上清液中GAG含量；（2）Ⅱ型膠原免疫組化按試劑盒說明書進行操作，Ⅱ型膠原陽性的細胞，胞漿著色呈黃色或棕黃色（表2）。表1細胞因子對MSCs分泌糖胺聚糖（GAG）的檢測表2Ⅱ型膠原免疫組化陽性細胞數(shù)（個/視野）

1.2.3細胞－支架復合體的構建及其體外培養(yǎng)將上述2種細胞懸液調整濃度后，滴加到PLGA支架上，37℃、5％CO2孵箱培養(yǎng)。繼續(xù)各用原培養(yǎng)液進行培養(yǎng)7～8d，備掃描電鏡檢查和動物實驗。

1.2.4復合體移植10～12個月齡健康比格犬10只，靜脈麻醉成功后，術區(qū)準備完畢后，取膝關節(jié)內側切口，顯露膝關節(jié)，在膝關節(jié)股骨滑車處，用手搖鉆制作一個直徑為5mm的圓柱形軟骨缺損區(qū)，深達軟骨下骨，平均深為5mm。按照分組情況，A組：軟骨缺損處先在深層植入未誘導分化組的MSCs－PLGA復合體，再在淺層植入誘導分化組的軟骨細胞－PLGA復合體，緊密壓配；B組：缺損處全層植入未誘導分化組的MSCs－PLGA復合體；C組：空白對照，只造成缺損不植入任何材料。嚴密縫合關節(jié)囊。術后分籠飼養(yǎng)，自由活動。

1.2.5大體觀察分別于術后12、16周取材，觀察缺損區(qū)軟骨生長情況。

1.2.6組織學觀察

2結果

2.1細胞形態(tài)學改變

倒置相差顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，原代細胞接種后1～3d可見少量細胞貼壁，呈短梭形。3d后出現(xiàn)細胞集落，7～8d廣泛集落形成。12～14d細胞形成單層。傳代細胞貼壁快，7～8d形成單層，細胞核大，胞漿內顆粒多。加入細胞因子后，細胞生長明顯加快，體積增大，胞體變圓，呈漩渦狀生長；

2.2實驗組

MTT吸光度值、培養(yǎng)上清液中的糖胺聚糖（GAG）含量和Ⅱ型膠原分泌均明顯高于對照組。Ⅱ型膠原免疫組化陽性的MSCs胞漿染色為黃色或棕黃色(圖1、2)。

2.3電鏡觀察

掃描電鏡顯示PLGA支架呈不規(guī)則多孔狀，孔徑控制在200～300μm，孔徑率85%，孔壁厚度較均勻,為20～40μm。復合材料顯示MSCs細胞在PLGA支架上的黏附、伸展和增殖良好，可以見到細胞分泌的基質和細胞偽足的鉚固作用(圖3)，表明支架材料具有良好的細胞親和性。

2.4動物實驗結果

大體觀察。術后12周：A組新生組織表面平整、光滑，與周圍軟骨界線模糊，端面顯示軟骨厚度與正常軟骨相近；B組修復高度較周圍軟骨水平相近，但軟骨層厚度比A組明顯偏薄，無光澤，與周圍軟骨界線尚清楚；C組部分接近正常修復高度，修復組織呈黃色，局部凹陷。術后16周，A組缺損修復區(qū)組織與周圍關節(jié)軟骨相整合，軟骨缺損區(qū)被光滑白色半透明的組織覆蓋，與周圍軟骨組織外形無差異(圖4)；B組缺損區(qū)修復組織與周圍軟骨部分整合在一起，光澤較差(圖4)；C組缺損處修復組織低凹新生組織軟，無光澤，與周圍軟骨組織區(qū)別明顯。

組織學觀察。術后12周：A組缺損區(qū)形成透明樣軟骨組織，比周圍正常軟骨偏厚，軟骨細胞數(shù)量多，出現(xiàn)明顯的規(guī)律，表面層的軟骨細胞平行關節(jié)面排列，深層縱向排列，軟骨基質染色較四周時淡，軟骨下骨豐富。B組邊緣區(qū)厚度與周圍正常軟骨接近，軟骨細胞排列不規(guī)則，與周圍軟骨結合可，無明顯裂隙存在。近中央?yún)^(qū)仍以纖維組織修復為主，細胞數(shù)很少，局部有裂隙。C組表面為纖維組織，細胞成分較少。術后16周，A組缺損區(qū)軟骨厚度與正常軟骨組織接近，細胞排列出現(xiàn)明顯規(guī)律，表面層的軟骨細胞平行關節(jié)面排列，深層縱向排列，與透明軟骨組織相似，軟骨下骨形成，潮線基本恢復，與周圍正常軟骨連接較好(圖5)。B組軟骨細胞排列不規(guī)則，中央修復區(qū)大部分為纖維組織修復(圖6)。C組缺損區(qū)內主要為纖維組織(圖7)。

2.5統(tǒng)計學分析

采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件包分析，數(shù)值以±s表示，以P＜0.05表示差異有顯著性意義。表3關節(jié)軟骨缺損的組織學評分標準表4各組軟骨修復組織學評分結果各時間段A組與B組、C組比較均有顯著性差異，*P＜0.05。

3討論

有研究認為對于微環(huán)境尚未受到嚴重破壞的組織修復或再生治療，不需要進行體外誘導即可用干細胞直接移植修復，而對于缺損或微環(huán)境嚴重受損的組織修復或再生治療，則需要對干細胞進行定向誘導后移植［1］。作者的實驗結果表明，在體外對MSCs進行誘導培養(yǎng)，(1)可以使細胞擴增；(2)可以向軟骨細胞定向分化。在體外構建成熟的組織工程化軟骨，是在模擬體內微環(huán)境的條件，探索和研究軟骨種子細胞在支架內黏附、增殖及種子細胞與支架材料的相容性即軟骨形成的條件、機制的問題。作者把細胞－PLGA支架復合體在體外培養(yǎng)1周后，塑成圓柱狀，采用馬賽克移植方法植入缺損部位，底部為MSCsPLGA支架復合體，表層部分為誘導培養(yǎng)的MSCsPLGA支架復合體。在體內微環(huán)境的作用下，迅速生成軟骨組織。在12周時，軟骨組織已充滿了整個缺損區(qū)，隨后深層軟骨組織逐漸被軟骨下骨替代。16周時軟骨細胞出現(xiàn)分層排列，與周圍正常組織無明顯差別。在制造骨軟骨缺損模型的時候，損傷區(qū)會釋放生物活性因子，包括TGFβ、IGF1和BMP［2］。早期復合組織植入缺損部位后，在這些細胞因子的作用下，經(jīng)誘導的MSCs細胞在PLGA支架材料中迅速增殖，表層的復合體在關節(jié)內滑液細胞因子和周圍軟骨組織微環(huán)境的作用下形成早期軟骨組織。而深部的復合體被來自于損傷區(qū)的血管組織侵入，機體的MSCs細胞和誘導植入的MSCs細胞，在局部微環(huán)境的作用下，形成骨組織－軟骨下骨，從而完成骨軟骨缺損組織的修復。這種修復的特點是軟骨與軟骨下骨形成堅固的自然連接，軟骨下骨與軟骨同時獲得修復。但是作者某些切片中觀察到2種復合體之間有裂隙、整合差，但深部復合體與軟骨下骨的結合均良好。

盡管很多專家學者在體內、體外均成功構建出骨軟骨復合組織［3～7］,但是存在以下問題:(1)無論在體外或體內,構建組織的骨、軟骨界面結合欠佳；（2）植入軟骨與周圍宿主軟骨組織整合欠佳；(3)形成的軟骨組織質量缺陷:透明軟骨比例少,缺乏正常關節(jié)軟骨的分層結構,缺乏表淺的扁平細胞層和潮標等；（4）更為重要的是,以上構建的骨軟骨復合組織只是短期觀察有證據(jù)初步表明在形態(tài)學、生化成分等方面具有骨軟骨組織結構,其生理功能、機械性能、能否長期持續(xù)存在等尚待進一步研究證實。為了改善骨軟骨復合組織的結構和界面形成情況,設計一體化、呈梯度變化的雙層支架材料將更為有利。Sherwood等［8］應用TheriForm三維打印方法研制出一種新型的骨軟骨三維支架,在骨、軟骨端配件交界區(qū)組成成分含量、氣孔率等方面形成梯度變化,這樣可以避免支架在體外培養(yǎng)和體內植入時發(fā)生界面分層而有利于新生的骨與軟骨組織之間形成良好界面。

本實驗結果證實：MSCs適合成為軟骨組織工程的種子細胞。取材方便，體外培養(yǎng)性能穩(wěn)定，易于傳代擴增，在一定誘導條件的培養(yǎng)下，可以分化為軟骨細胞。TGFβ1在促進MSCs細胞增殖和向軟骨細胞定向分化方面有顯著的作用。PLGA支架是理想的軟骨組織工程支架材料，具有良好的孔隙率和組織相容性，MSCs在其中可以很好地黏附、擴展和增殖。MSCs經(jīng)向軟骨細胞定向分化后復合PLGA支架材料，通過緊密壓配方式與MSCs－PLGA支架在體內構建骨軟骨復合體，可以有效修復骨軟骨缺損。

圖1對照組MSCs免疫組化結果陰性，胞漿內未見到棕褐色顆粒圖2實驗組MSCs免疫組化結果呈陽性，胞漿內見有棕黃色顆粒圖3細胞在支架材料上黏附、增殖，形成細胞團，借偽足錨固于支架上圖4A組（黃箭頭）修復軟骨厚度較B組（綠箭頭）厚，與周圍組織邊界不清，需仔細辨認（4個月后）圖5A組缺損區(qū)軟骨下骨結合緊密，潮線形成，與周圍軟骨組織融合好（4個月后×20）圖6B組缺損由纖維組織修復，細胞排列規(guī)律，與軟骨下骨結合尚可，局部有裂隙（4個月×10）圖7C組缺損部分纖維組織，排列雜亂，見分泌基質。

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