南極魚(yú)抗凍蛋白功能和進(jìn)化研究

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在6500萬(wàn)年前的新生代時(shí)期,南極大陸開(kāi)始緩慢移動(dòng),同時(shí)其溫度逐漸降低,到大約2000萬(wàn)年前溫度降到0℃以下。隨著海水溫度的降低,多數(shù)魚(yú)類由于無(wú)法適應(yīng)而滅絕[1]。部分魚(yú)類發(fā)生了適應(yīng)性進(jìn)化,適應(yīng)了極端寒冷環(huán)境而生存下來(lái),形成了現(xiàn)在的南極魚(yú)類。據(jù)統(tǒng)計(jì),占地球海洋總面積約10%的南大洋擁有的魚(yú)類包括50個(gè)科,322個(gè)種,僅占地球魚(yú)類總數(shù)的1.3%。其中硬骨魚(yú)南極魚(yú)亞目(Notothenioids)魚(yú)類達(dá)120多種,占南大洋所有魚(yú)類的46%,而在南極洲周圍海域南極魚(yú)亞目比例高達(dá)90%[2]。南極魚(yú)常年生活在穩(wěn)定的、極端寒冷和氧氣充足的南極海域中,在生化和生理功能等方面發(fā)生了許多適應(yīng)性改變和新的性狀以適應(yīng)南極的極端環(huán)境,其中抗凍蛋白是南極魚(yú)適應(yīng)極端寒冷環(huán)境的最重要特征之一[3-4]。20世紀(jì)60年代,科學(xué)家首次在南極冰魚(yú)(Nototheniidae)血液中發(fā)現(xiàn)抗凍糖蛋白(antifreezeglycoprotein,AFGP)[4]。目前已知大多極地魚(yú)類和冷水魚(yú)體內(nèi)都可以產(chǎn)生抗凍蛋白(antifreezeprotein,AFP)或抗凍糖蛋白,這些蛋白質(zhì)可以把魚(yú)類體液的冰點(diǎn)降低,從而在環(huán)境水域冰點(diǎn)之下仍能保持體液的流動(dòng)性,避免冷凍損傷的發(fā)生[5]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),其他極地物種包括昆蟲(chóng)、植物、微生物也可以產(chǎn)生抗凍蛋白[6]。隨著對(duì)抗凍蛋白認(rèn)識(shí)的不斷深入,科學(xué)家漸漸把抗凍蛋白應(yīng)用在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、食品和工業(yè)等多個(gè)領(lǐng)域。

1南極魚(yú)類抗凍蛋白分子特征和適應(yīng)性進(jìn)化

目前至少1種抗凍糖蛋白和4種抗凍蛋白已經(jīng)被鑒定出來(lái),它們分布在多種分類地位相差很遠(yuǎn)的極地魚(yú)類中。這些抗凍蛋白的氨基酸序列和空間結(jié)構(gòu)都不相同,但都具有結(jié)合冰晶并抑制冰晶生長(zhǎng)的功能。最初在南極冰魚(yú)(Nototheniidae)中發(fā)現(xiàn)AFGP,由一個(gè)糖三肽(Thr-Ala-Ala)基本結(jié)構(gòu)單位重復(fù)組成,Thr殘基上可以連接雙糖基團(tuán)(β-D半乳糖基,1,3-α-N-乙酰氨基半乳糖),糖基上發(fā)生化學(xué)修飾會(huì)降低AFGP的抗凍活性。魚(yú)類可以合成一系列大小不一的AFGP分子,由不同數(shù)量的糖三肽單位聚合而成。根據(jù)糖三肽單位重復(fù)數(shù)目不同,AFGP可分為8個(gè)類別,重復(fù)數(shù)為4~50,分子量從2.7~32kD[7]。魚(yú)類的AFP也根據(jù)氨基酸組成和結(jié)構(gòu)差異進(jìn)行分類。I型抗凍蛋白(AFPI)存在于北極和北大西洋的扁魚(yú)(Pleuronectespp.)和杜父魚(yú)(Myoxoce-phalusspp.)中,是3.5~4.5kD的小分子肽。AFPI分子中富含丙氨酸(Ala),形成一個(gè)幾乎規(guī)范的alpha螺旋結(jié)構(gòu)[8]。II型抗凍蛋白(AFPII)是分子量1417kD的多肽,富含半胱氨酸(Cys),分布范圍較窄,目前僅在大西洋鯡(Clupeaharengus)和美絨杜父魚(yú)(Hemitripterusamericanus)等幾種魚(yú)中發(fā)現(xiàn)AFPII[9]。III型抗凍蛋白(AFPIII)是研究最為廣泛的一種抗凍蛋白,主要分布在極地海域和大西洋的幾種綿鳚亞目(Zoarcidae)的魚(yú)中,包括斷線真狼綿鳚(Lychodyichthysdearborni)和北極狼綿鳚(Locodespolaris)[10]。目前已經(jīng)從南極大頭鰻鱺(Lycodichthysdearborni)的血漿中分離出8種AFPIII成分,包括3種主要成分(RD1、RD2、RD3)和5種少量成分[11-12]。AFPIV是從多棘床杜父魚(yú)(Myoxocephalusoctodecimspinosis)血清中分離到的一種抗凍蛋白(LS12)[13],分子量約12.3kD,含108個(gè)氨基酸殘基,其中17%是谷氨酰胺,N末端被焦谷氨酰基團(tuán)所封閉。AFPIV廣泛分布于硬骨魚(yú)類中,具有降低冰點(diǎn)和冰晶修飾等AFP的特征性功能[13]。抗凍蛋白的進(jìn)化是南極魚(yú)寒冷適應(yīng)的一個(gè)重要機(jī)制,其中南極魚(yú)的AFGP從頭進(jìn)化機(jī)制是近年來(lái)的重要發(fā)現(xiàn)。南極魚(yú)類的AFGP基因由功能上不相關(guān)的胰蛋白酶原基因(trypsinogen)演化而來(lái)。trypsinogen第一內(nèi)含子和第二外顯子交接處的編碼Thr−Ala−Ala的9核苷酸序列在5′端微衛(wèi)星DNA序列的引導(dǎo)下擴(kuò)增,首先形成一個(gè)trypainogen−AFGP中間分子,隨后經(jīng)歷了大部分trypsiongen編碼區(qū)序列缺失而形成獨(dú)立的AFGP編碼基因,并進(jìn)一步通過(guò)分子內(nèi)大規(guī)模擴(kuò)增形成一個(gè)龐大的AFGP基因家族[14]。北極魚(yú)類的AFGP蛋白在氨基酸序列上與南極魚(yú)類的AFGP幾乎沒(méi)有區(qū)別,但經(jīng)過(guò)研究卻發(fā)現(xiàn)北極魚(yú)類的AFGP蛋白在基因進(jìn)化上與trypsinogen毫無(wú)關(guān)系[4]。有研究發(fā)現(xiàn)來(lái)自于南極大頭鰻鱺的AFPIII基因起源于一個(gè)唾液酸合成酶(SAS)基因拷貝[15]。IV型AFP與其他類型的魚(yú)類AFP相似度較低,被鑒定并歸類為新的IV型AFP,并且這種蛋白質(zhì)被認(rèn)為是從載脂蛋白進(jìn)化而來(lái)的[13]。抗凍蛋白基因起源的發(fā)現(xiàn)揭示了一種新基因起源的進(jìn)化機(jī)制,同時(shí)也把分子進(jìn)化、環(huán)境適應(yīng)和物種分化緊密地聯(lián)系在一起。

2抗凍蛋白的作用機(jī)制

抗凍蛋白作用機(jī)制在于可以結(jié)合微小的冰晶并抑制冰晶的繼續(xù)生長(zhǎng)。抗凍蛋白以非依數(shù)性形式降低水溶液的冰點(diǎn)而對(duì)其熔點(diǎn)(meltingpoint,MP)影響甚微,從而導(dǎo)致水溶液的熔點(diǎn)(MP)和冰點(diǎn)(freezingpoint,FP)之間出現(xiàn)差值,這個(gè)差值稱為熱滯活性(thermalhysteresisactivity,THA)[16]。THA已被用于定量描述AFP的活性(圖1),對(duì)于大多數(shù)魚(yú)類AFP,觀察到的THA約為1℃。在冬季(–1.9℃),這種溫度差距可以為海水提供足夠的緩沖,使極地魚(yú)在寒冷的環(huán)境中生存[17]。抗凍蛋白的第二個(gè)功能是冰重結(jié)晶抑制(icerecrystal-lizationinhibition,IRI)。冰重結(jié)晶(IR)解釋了一個(gè)熱力學(xué)上有利的過(guò)程,其中較大的冰晶的形成以犧牲較小的冰晶為代價(jià)。較大的冰晶對(duì)于冷凍保存的細(xì)胞以及棲息在極地或寒冷地區(qū)的生物體可能是致命的,而抗凍蛋白可以在非常低的濃度下抑制冰重結(jié)晶,冰晶晶體之間界面處的AFP可以與冰粒表面結(jié)合并抑制其生長(zhǎng)過(guò)程,其依賴AFP的冰重結(jié)晶抑制機(jī)制仍不是很明確[18-19]。將含AFP的溶液與30%蔗糖以1∶1的比例混合。將混合溶液點(diǎn)在兩個(gè)蓋玻片之間并快速冷凍。然后,將樣品置于–6℃,并在特定時(shí)間段內(nèi)觀察變化。如圖1所示,較大的冰粒以較小的冰晶為代價(jià)而增長(zhǎng),而在AFP存在的情況下,在較低的面板中停止生長(zhǎng)[20]。冰重結(jié)晶抑制更可能是耐寒生物在極冷環(huán)境中生存的關(guān)鍵屬性,冰重結(jié)晶抑制被認(rèn)為可以保護(hù)細(xì)胞膜免受凍傷。圖1使用改良的激冷板實(shí)驗(yàn)檢測(cè)AFP的冰重結(jié)晶抑制功能[20]Fig.1IcerecrystallizationinhibitionassayofAFPusingmodifiedsplatassay[20]熱滯活性(THA)和冰重結(jié)晶抑制(IRI)均基于AFP對(duì)冰的親和力。然而,THA并不總是與IRI活性成正比(圖2),較低THA活性的AFP可以表現(xiàn)出較高的IRI活性[20]。Olijve等[21]證明了AFPⅢ及其突變體顯示出不同的THA值,但具有幾乎相同的IRI活性。與中度熱滯活性的抗凍蛋白LeIBP相比,高熱滯活性的抗凍蛋白FfIBP卻在IRI中表現(xiàn)出較低的活性[22]。這些結(jié)果提示,抗凍蛋白的THA并不能夠直接轉(zhuǎn)化為生物樣品的冷凍保存效率,因此不能僅靠THA來(lái)考慮AFP在冷凍保存中的應(yīng)用。

3抗凍蛋白在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用研究

抗凍蛋白的熱滯活性(THA)和冰重結(jié)晶抑制(IRI)活性使其在冷凍保存中具有重要作用。冷凍保存可用于在極低溫度下儲(chǔ)存各種類型的細(xì)胞、組織和器官、鮮冷食品等,已成為生命科學(xué)、醫(yī)藥衛(wèi)生、食品、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域的關(guān)鍵技術(shù)。冷凍保存中最重要的是避免冰晶形成導(dǎo)致的細(xì)胞損傷。目前常用的冷凍保存劑(如二甲基亞砜和甘油)可以減少冰的形成,但高濃度的冷凍保存劑對(duì)細(xì)胞具有毒性[23]。解凍期間的冰再結(jié)晶也是冷凍保存對(duì)細(xì)胞損傷的重要因素,而AFP在抑制冰再結(jié)晶,提高冷凍保存效率方面具有良好的應(yīng)用潛力。3.1在生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用冷凍保存是生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的關(guān)鍵技術(shù)之一,可以解決不孕不育、延遲生育等問(wèn)題。AFP可應(yīng)用于精子、卵子和胚胎等組織器官的冷凍保存[24]。研究報(bào)道極地魚(yú)類來(lái)源的抗凍蛋白AFPIII對(duì)小鼠卵母細(xì)胞的冷凍保存具有顯著的保護(hù)作用。使用抗凍蛋白明顯降低了小鼠卵母細(xì)胞冷凍保存−復(fù)蘇后的損傷,ROS的產(chǎn)生、DNA雙鏈斷裂程度和細(xì)胞凋亡的程度明顯降低,復(fù)蘇后卵子的發(fā)育完整性增強(qiáng),使用抗凍蛋白冷凍保存的受精卵發(fā)育水平明顯高于對(duì)照組[25-26]。在牛的卵子玻璃化冷凍保存研究中發(fā)現(xiàn),抗凍蛋白AFGP-8的加入也明顯降低了冷凍損傷的發(fā)生,提高了冷凍卵母細(xì)胞復(fù)蘇后正常發(fā)育的水平[27]。在魚(yú)類的胚胎冷凍保存實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn),用加入含有AFPI的冷凍保存液進(jìn)行顯微注射或孵育的魚(yú)胚胎,在低溫(4℃或–10℃)冷卻后存活率顯著提高[28-29]。哺乳動(dòng)物精子的冷凍保存技術(shù)比較成熟,但也有研究報(bào)道AFP和AFGP在精子冷凍保存中發(fā)揮重要作用,可明顯降低冷凍損傷,提高精子的活力和漿膜的完整性[30-32]。這些研究表明AFP在精子、卵子、胚胎冷凍保存中具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。3.2在外科中的應(yīng)用冷凍手術(shù)是目前腫瘤治療的一項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù),研究報(bào)道手術(shù)前將少許AFP注射到待切除組織中,可以提高手術(shù)成功率,減少冷凍手術(shù)后的目標(biāo)組織發(fā)生冷凍損傷問(wèn)題[33]。AFP也被用于器官移植手術(shù)的組織、器官的冷凍保存,AFP在器官冷凍儲(chǔ)存中的保護(hù)效果受多種因素的影響,包括AFP的濃度、冷凍保護(hù)液的成分等。如有研究發(fā)現(xiàn)較高濃度的AFGP對(duì)低溫儲(chǔ)存的心臟沒(méi)有保護(hù)作用[34]。同時(shí)有報(bào)道AFP可以保護(hù)低溫保存的大鼠心臟,用含有AFP的保存液保存的心臟在移植手術(shù)后具有更高的存活率、表現(xiàn)出更好的血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)和更低的細(xì)胞凋亡水平[35-36]。目前對(duì)AFP在組織、器官低溫儲(chǔ)存中的作用機(jī)理和應(yīng)用潛能方面的研究較薄弱,該方面的基礎(chǔ)研究對(duì)AFP在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用開(kāi)發(fā)是急需開(kāi)展的。

4抗凍蛋白在食品領(lǐng)域的應(yīng)用研究

抗凍蛋白作為食品添加劑可以抑制冰晶生長(zhǎng),改善冷凍食品的品質(zhì)[37]。添加有AFP的冰激凌,冰碴的產(chǎn)生顯著減少,而未加AFP的冰淇淋樣品中冰晶較大且不均勻,AFP添加改善了冰激凌的質(zhì)量和口感[38]。抗凍蛋白還可以應(yīng)用在冷鮮、冷凍食品的儲(chǔ)存和運(yùn)輸環(huán)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)AFP在肉類的冷凍保存中,可以減少肌肉細(xì)胞內(nèi)冰晶的產(chǎn)生,可以保持肌球蛋白ATP酶的活性,從而提高冷凍肉類的品質(zhì)和口感[39-40]。在羔羊屠宰前注射AFPG,宰后肉在–20℃凍藏2~16周后解凍檢測(cè)產(chǎn)品質(zhì)量發(fā)現(xiàn):屠宰前注射AFPG均可顯著降低冰晶的體積和液滴的數(shù)量[41]。速凍果蔬容易出現(xiàn)汁液流失、軟爛、失去原有形態(tài)。運(yùn)用基因工程的方法將異源高活性抗凍蛋白基因?qū)牍咧?能夠有效改善這種狀況。美國(guó)DNA工程公司把抗凍蛋白基因?qū)敕阎?這種新的轉(zhuǎn)基因番茄耐寒性能增強(qiáng),可以在–6℃生存幾個(gè)小時(shí),而且果實(shí)冷藏后不變形[42]。

5抗凍蛋白在農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用研究

5.1抗凍蛋白轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高動(dòng)植物的耐寒能力。低溫冷害是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的一個(gè)重要危害,每年因低溫冷害造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失,提高動(dòng)植物的耐寒能力是解決這一問(wèn)題的關(guān)鍵。近年來(lái),隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷成熟,抗凍蛋白基因被引入植物和動(dòng)物物種,以擴(kuò)大其地理適應(yīng)范圍,增加低溫生存的能力。目前科學(xué)家已經(jīng)生產(chǎn)出多種能夠合成抗凍基因的轉(zhuǎn)基因物種,包括煙草,番茄和馬鈴薯植物等,初步觀察發(fā)現(xiàn)這些轉(zhuǎn)基因植物中獲得了增加的抗凍能力[43-44]。而表達(dá)外源AGFP的小鼠對(duì)于低溫引起的凍傷具有更好的抵抗力[45],同樣表達(dá)外源AGFP的果蠅也具有更強(qiáng)的低溫耐受能力[46]。抗凍蛋白轉(zhuǎn)基因作物的推廣,將有效地幫助農(nóng)業(yè)生產(chǎn)避免惡劣天氣帶來(lái)的損失,擴(kuò)展作物的栽種范圍和生長(zhǎng)季節(jié),提高農(nóng)作物的產(chǎn)量和質(zhì)量。此外,抗凍蛋白轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物還有望在后續(xù)的運(yùn)輸、低溫儲(chǔ)藏和加工等多個(gè)環(huán)節(jié)更加有效和便利,抗凍蛋白在農(nóng)業(yè)和食品行業(yè)極具應(yīng)用前景。5.2抗凍蛋白轉(zhuǎn)基因能有效提高水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)魚(yú)類的耐寒能力。每年因低溫冷害造成的漁業(yè)損失巨大,將抗凍蛋白基因轉(zhuǎn)入溫度敏感經(jīng)濟(jì)魚(yú)類,可以提高這些魚(yú)類的抗寒能力,改善這些魚(yú)類的養(yǎng)殖區(qū)域。20世紀(jì)90年代,科學(xué)家發(fā)現(xiàn)將抗凍蛋白轉(zhuǎn)基因羅非魚(yú)顯示出增強(qiáng)的耐寒能力,但當(dāng)時(shí)由于轉(zhuǎn)基因技術(shù)還不成熟,抗凍蛋白的表達(dá)水平比較低[47]。直接顯微注射南極魚(yú)抗凍蛋白到斑馬魚(yú)受精卵,斑馬魚(yú)發(fā)育成熟后表現(xiàn)出強(qiáng)的耐寒能力[29]。美國(guó)AquaBountyTechnologies公司擁有世界上首個(gè)被批準(zhǔn)上市的轉(zhuǎn)基因魚(yú),他們研發(fā)的轉(zhuǎn)基因三文魚(yú)AquAdvantage被轉(zhuǎn)入了兩種基因:太平洋奇努克三文魚(yú)的生長(zhǎng)激素基因和大洋鱈的抗凍蛋白基因,使其可以在大西洋寒冷的底部也能快速持續(xù)生長(zhǎng)[48]。由于來(lái)自極地魚(yú)類的抗凍蛋白屬于長(zhǎng)期被人類食用的天然蛋白,在食品安全方面沒(méi)有問(wèn)題,容易被大眾接受。

6南極魚(yú)抗凍蛋白研究和應(yīng)用開(kāi)發(fā)所存在的問(wèn)題

盡管南極魚(yú)抗凍蛋白在醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域都有良好的應(yīng)用前景,但是目前在生產(chǎn)成本和產(chǎn)業(yè)化等方面還存在一些限制和不足,生產(chǎn)僅限于研究和專門的應(yīng)用。因此,如何低成本地生產(chǎn)高活性的抗凍蛋白是其應(yīng)用開(kāi)發(fā)的技術(shù)關(guān)鍵。目前有學(xué)者通過(guò)原核或真核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)和純化了重組的南極魚(yú)AFP[49-50],但上述研究仍停留在實(shí)驗(yàn)室階段,有待于進(jìn)一步提高表達(dá)量和規(guī)模化生產(chǎn)。此外,也有研究報(bào)道通過(guò)混合使用多種AFP或表達(dá)多種AFP的融合蛋白來(lái)增加AFPs與冰晶結(jié)合的能力,以提高AFP的熱滯活性[51]。AFP的應(yīng)用開(kāi)發(fā)需要解決以下幾個(gè)問(wèn)題。首先,應(yīng)建立AFP的基因工程產(chǎn)業(yè)體系,大規(guī)模生產(chǎn)AFP,降低其成本;其次,充分研究AFP在冷凍介質(zhì)中的行為和作用機(jī)制。高濃度的冷凍劑,如DMSO、乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮等,可能使AFP不穩(wěn)定,甚至功能喪失;第三,應(yīng)該設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)高活性的AFP,以克服天然AFPs的局限性。如有研究表明,含有三個(gè)結(jié)構(gòu)域的AFPIII抗凍活性明顯高于一個(gè)和兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的AFPIII[52]。楊敏等[53]報(bào)道人工合成含有4個(gè)結(jié)構(gòu)域的AFPIII抗凍蛋白(LD4)具有更強(qiáng)的抗凍、抗寒活性。LD4由4個(gè)AFPIII分子通過(guò)9個(gè)氨基酸的linker串聯(lián)而成,具有4個(gè)與冰晶結(jié)合的活性平面。LD4不僅具有抗凍功能,而且具有在非冰凍溫度下抵抗低溫傷害的抗寒功能,轉(zhuǎn)LD4基因的斑馬魚(yú)細(xì)胞可獲得強(qiáng)的耐寒特性。天然AFP無(wú)法穿透細(xì)胞膜,有報(bào)道進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)化或穿透AFP的研發(fā),這樣有利于AFPs在組織、胚胎等的冷凍保存中更好地發(fā)揮作用,從而減少冷凍液中冷凍劑的使用量,提高冷凍保存的效率[20]。

總之,如何獲得大量的高效抗凍蛋白,降低抗凍蛋白的成本,是實(shí)現(xiàn)其廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵。

作者:張俊芳 陶筱帆 韓兵社 單位:上海海洋大學(xué)