中藥復(fù)方制劑抗真菌分析論文

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1體外抗真菌活性

臨床報道，較多的中藥方劑對真菌感染性疾病顯示出良好的治療作用［7-11］。通過實(shí)驗(yàn)研究亦發(fā)現(xiàn)中藥復(fù)方制劑具有良好的體外抗真菌活性。目前體外抗真菌藥物敏感性試驗(yàn)方法主要為瓊脂稀釋法、瓊脂擴(kuò)散法及美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會（CLSI）的M27-A、M38-A方案。瓊脂稀釋法是目前較為廣泛應(yīng)用的初篩方法，其方法是在瓊脂平板內(nèi)摻入不同濃度的抗真菌藥物，以多點(diǎn)接種法將相同量的待測真菌接種于瓊脂表面，以菌不生長的最低濃度定為該藥對真菌的最小抑菌濃度(MIC)。多數(shù)研究者在試管內(nèi)或在平皿內(nèi)進(jìn)行,此方法適合于大量菌株測定實(shí)驗(yàn)。胡圣愛等［12］應(yīng)用固體培養(yǎng)基試管內(nèi)藥基法測定了膚癬消搽劑（連翹、苦參、大風(fēng)子、鴉膽子、黃柏、蛇床子等）對石膏樣小孢子菌有抑制作用,其MIC為1:100倍。楊志波等［13］采用沙氏培養(yǎng)基試管內(nèi)藥基法觀察到復(fù)方二礬浸液（枯礬、皂礬、兒茶、側(cè)柏葉、地骨皮、土槿皮、黃精、公丁香、血竭、食醋）對紅色毛癬菌、須癬毛癬菌、石膏樣小孢子菌的最小抑菌濃度分別是0.25%、0.5%、0.5%。謝淑霞等［14］采用沙氏培養(yǎng)基試管內(nèi)藥基法觀察到祛癬洗劑（白蘚皮、苦參、地膚子、土槿皮、羌活、紫地榆、黃柏、椒目、百部、蛇床子等）對我國南方常見的9種致病真菌均有抑制作用，其最小抑菌濃度6.25％～50％，對癬菌的抑制作用優(yōu)于白念珠菌。盧全德等［15］報道采用試管內(nèi)藥基法測得膚疾安噴霧劑（金銀花、野菊花、苦參、血竭、薄荷腦等）對絮狀表皮癬菌、紅色毛癬菌的MIC為0.39mg/ml，對須癬毛癬菌、羊毛狀小孢子菌的MIC為0.78mg/ml，對白念珠菌、青霉菌為1.56mg/ml。陳超等［16］以瓊脂稀釋法觀察到復(fù)方黃連皮康酊（黃連100g、苦楝皮50g、海桐皮50、藁本30g、檳榔50g、大風(fēng)子15g、郁金30g、白礬30g、蘆薈30g、地膚子50g、蕪荑30g組方制成酊劑）對皮膚癬菌（紅色毛癬菌、須癬毛癬菌和絮狀表皮癬菌）及深部真菌（白念珠菌）均有明顯的抗菌作用，使菌落縮小，與克霉唑癬藥水差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，并且得出復(fù)方黃連皮康酊對表皮真菌的抗菌作用大于對深部真菌（白念珠菌）的結(jié)論。魏蓉［17］用試管瓊脂稀釋法觀察到祛癬止癢洗劑（丁香、黃精、龍膽草、明礬、百部、藿香、黃連、土槿皮、薄荷腦、冰片水煎液）對9種真菌均有抑制作用，抑菌濃度分別為0.39%(紅色毛癬菌)、0.195%(須癬毛癬菌、斷發(fā)毛癬菌、紫色毛癬菌、許蘭毛癬菌、羊毛狀小孢子癬菌、絮狀表皮癬菌)、0.75%(石膏樣小孢子菌)、1.56%(白念珠菌)。張玲等［18］采用試管稀釋法，進(jìn)行蟹黃膚寧軟膏對犬小孢子菌、須癬毛癬菌、絮狀表皮癬菌、紅色毛癬菌的體外藥效學(xué)研究，結(jié)果蟹黃膚寧軟膏對8株淺部毛癬菌屬的MIC均在0.03125～0.25mg/mL之間，顯示了蟹黃膚寧軟膏較好的體外抗真菌活性。瓊脂擴(kuò)散法是通過測量真菌生長被抑制的范圍大小來確定抗真菌活性，也是一種簡單、易行的初篩方法。楊國晶等［19］用瓊脂擴(kuò)散法觀察了復(fù)方苦槿霜（苦參150g、土槿皮150g、黃柏150g、白蘚皮150g、地膚子150g、川芎150g、兒茶100g）及其原料藥對紅色毛癬菌、須癬毛癬菌、絮狀表皮癬菌、犬小孢子癬菌、白念珠菌的抑菌作用，結(jié)果10%、20%復(fù)方苦槿霜及10%、20%原料藥抑菌效果相同，與達(dá)克寧相當(dāng)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，明顯優(yōu)于5%復(fù)方苦槿霜及5%原料藥的抑菌效果，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。何定淑等［20］采用紙片濃度梯度法研究硝礬散（枯礬、芒硝）對紅色毛癬菌和須癬毛癬菌株的體外抑菌作用，結(jié)果2%硝礬散對紅色毛癬菌、須癬毛癬菌的MIC范圍分別為0.0625～0.125mg/ml、0.03125～0.125mg/ml。林靜瑜等［21］采用打孔藥物瓊脂擴(kuò)散法觀察到癬藥膏(由丁香、蜂房等8味中藥組成)5%濃度以上對須癬毛癬菌、絮狀表皮癬菌、紅色毛癬菌均有明顯的抗菌作用，1%濃度僅對須癬毛癬菌有抗菌作用，但各濃度均對白念珠菌感染無效。曾嶸等［22］采用管蝶法對玉陰潔沖洗劑進(jìn)行了藥效學(xué)研究，結(jié)果表明，1g生藥/ml玉陰潔洗劑體外對白念珠菌有一定的抑制作用，抑菌圈為(20.0±0.8)mm，MIC為12.5%(1:8稀釋度)。徐文躍等［23］采用改良的平皿挖洞灌藥法觀察到白蓮洗劑(由白頭翁、半邊蓮、蛇床子、黃連、黃柏、百部、地膚子等組成)對白念珠菌有明顯抑制作用，其作用強(qiáng)度與潔爾陰相當(dāng)。瓊脂稀釋法和瓊脂擴(kuò)散法的試驗(yàn)結(jié)果受許多因素的影響，包括菌接種液的濃度及準(zhǔn)備、培養(yǎng)基成分及pH值，孵育時間和溫度及不同的終點(diǎn)判定方法等，重復(fù)性差，不利于各實(shí)驗(yàn)室之間的比較，美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會（CLSI）在1997年、1998年和2003年先后提出了酵母菌的液基稀釋法抗真菌藥物敏感性試驗(yàn)方案（M27-A）、產(chǎn)孢絲狀真菌的抗真菌藥敏試驗(yàn)倡導(dǎo)方案（M38-P）和M38-A方案，這些方案準(zhǔn)確性好、重復(fù)性高，實(shí)驗(yàn)室間結(jié)果的一致性可與抗細(xì)菌的藥物敏感試驗(yàn)相媲美。鄭瑋清等［24］參照CLSIM38-A液基試管法進(jìn)行改良，觀察甲癬中藥洗劑（龍膽草40g、黃連30g、射干20g、半枝蓮30g、地膚子50g、紫草10g和花椒10g）蒸餾水提取液和乙醇提取液對紅色毛癬菌、須癬毛癬菌、羊毛狀小孢子菌、絮狀表皮癬菌和白念珠菌的抗真菌作用。結(jié)果甲癬中藥洗劑對皮膚癬菌的敏感性較好，而對白念珠菌的敏感性較差，同時可明顯看出，醇提液的MIC值低于水提液的MIC值，說明中藥的抗真菌藥物成分不僅包括水溶性物質(zhì)，而且包括脂溶性物質(zhì)。尤力都孜·買買提等［25］采用CLSIM-38P方案測定維藥雅麗蔓制劑對臨床常見皮膚癬菌的抗菌作用，結(jié)果，對須癬毛癬菌的MIC90為190.46μg/ml(平均MIC128μg/ml)，對紅色毛癬菌的MIC90為148.57μg/ml(平均MIC93.42μg/ml)，對絮狀表皮癬菌的MIC90為311.27μg/ml(平均MIC128μg/ml)，對石膏樣小孢子菌的MIC90為429.54μg/ml(平均MIC194.01μg/ml)。雅麗蔓制劑對真菌中不同菌種的MIC90值范圍為148～429μg/ml，表明雅麗蔓制劑對臨床常見皮膚癬菌具有顯著的抗真菌作用。鄭瑋清等［26］以美國CLSIM27-A液基法并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行改良，檢測硝礬洗劑（硼砂、芒硝、明礬1:1水溶液）及其單味藥物對紅色毛癬菌15株、須癬毛癬菌9株的MFC和MIC，結(jié)果硝礬洗劑的MFC為1.25～20mg/ml(平均為5.26mg/ml)，低于芒硝的MIC和明礬的MFC值。

2動物實(shí)驗(yàn)

部分學(xué)者利用動物真菌病模型進(jìn)行了抗真菌中藥的研究，相比僅在試管內(nèi)進(jìn)行抗真菌試驗(yàn)得到的結(jié)果應(yīng)更有意義。徐洪波等［27］用紅色毛癬菌制作豚鼠皮膚真菌感染模型，將25％藿黃散洗劑（藿香、黃精、苦參、茵陳、枯礬等）水煎液涂布感染皮膚，給藥2次/d，連續(xù)給藥21d。豚鼠在用藥6d后鱗屑減少，12d后鱗屑逐漸消失，呈淺紅色斑，真菌檢查均為陰性，18～21d皮膚外觀恢復(fù)正常。何定淑等［20］用2%和4%硝礬散溫水浸泡治療豚鼠須癬毛癬菌感染的足癬、體癬，1次/d，30min/次，共7d，顯示具有較好療效，與1%足光粉比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與蒸餾水組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。曾勇等［28］研究消炎抗癬霜(由升藥底、蛇床子、冰片、樟腦等中藥組成)對石膏樣小孢子菌、須癬毛癬菌導(dǎo)致的豚鼠體癬模型的治療作用，結(jié)果，2周后觀察到消炎抗癬霜能夠減輕真菌所致豚鼠皮膚病變程度，提高真菌鏡檢和真菌培養(yǎng)的轉(zhuǎn)陰率。楊小潔等［29］觀察了中藥真菌安膠囊對白念珠菌深部感染小鼠的治療作用，結(jié)果治療組、預(yù)防組深部真菌感染的小鼠病死率和血液內(nèi)的真菌數(shù)，與非治療組相比明顯降低，實(shí)驗(yàn)表明中藥真菌安膠囊有治療白念珠菌深部感染的作用。譚元生等［30］對復(fù)方苦參液的藥效學(xué)進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)研究表明，復(fù)方苦參洗液具有較好的抗家兔陰道黏膜人工白念珠菌感染作用，其治療后陰道涂片、真菌學(xué)培養(yǎng)、病理切片檢查結(jié)果與潔爾陰組相比無差異。梁君兒等［31］制成大白兔白色念珠菌陰道炎模型，并使用香荷藥條(由黃連、黃柏、丁香、薄荷等7味藥組成)治療，實(shí)驗(yàn)表明香荷藥條能有效抑制白色念珠菌的生長，使大白兔陰道白色念珠菌的轉(zhuǎn)陰率與對照組達(dá)克寧栓無顯著性差異。

3中藥復(fù)方制劑與單味藥物的體外抗真菌活性比較

邱瑩等［32］觀察大風(fēng)子、皂角、川椒、百部、蛇床子、大黃、地骨皮、黃柏、苦參、白蘚皮、地膚子、紅花、桃仁、姜黃、藿香、芒硝、明礬、硼砂、荊芥、防風(fēng)20種中藥水煎液及根據(jù)單味中藥抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取的6種（大風(fēng)子、皂角、川椒、明礬、藿香、地骨皮）抑菌效果最好的中藥組成的復(fù)方水煎液對皮膚癬菌和白念珠菌的抑菌作用，結(jié)果復(fù)方抑皮膚癬菌MIC:0.625%,對白念珠菌MIC:2.5%，抑菌強(qiáng)度好于單味藥，說明這些藥物之間有協(xié)同作用。鄭瑋清等［26］檢測硝礬洗劑（硼砂、芒硝、明礬1:1水溶液）及其單味藥物對紅色毛癬菌和須癬毛癬菌MIC，結(jié)果硝礬洗劑、硼砂、芒硝、明礬的平均MIC（或MFC）分別為5.26mg/ml、2.313mg/ml、20.19mg/ml、12.13mg/ml，硝礬洗劑的抗真菌活性強(qiáng)于芒硝組和明礬組，弱于硼砂組。黃寧等［33］觀察方劑1（白蘚皮、生姜、大蒜、川椒、斑蟊、丁香即復(fù)方白蘚皮）、方劑2為復(fù)方白蘚皮的拆方（丁香、白蘚皮、斑蝥、川椒）和復(fù)方白蘚皮的各單味中藥的醇提液對紅色毛癬菌、須癬毛癬菌、絮狀表皮癬菌、白念珠菌、短帚菌5種甲真菌病常見致病菌的MIC，結(jié)果方劑2的抑菌效果明顯優(yōu)于方劑1及各單味中藥(P<0.05)。作者認(rèn)為這可能復(fù)方白蘚皮酊中各組分藥物間還存在一定相互拮抗的作用，因此拆方后表現(xiàn)出更優(yōu)的抗真菌作用，但因部分中藥抗真菌機(jī)制多樣性，有的可能通過增強(qiáng)機(jī)體免疫力而抗真菌，故復(fù)方白蘚皮酊的臨床效果也很顯著，這有待在臨床中做進(jìn)一步的研究。中藥復(fù)方制劑藥物之間具有相互協(xié)同、提高單味中藥的抗真菌活性，或是相互拮抗、降低抗菌作用，或是中藥在體內(nèi)通過其他途徑發(fā)揮抗真菌作用，如提高機(jī)體免疫力，這也需今后進(jìn)一步的研究。

4作用機(jī)制探討

中草藥抗真菌的機(jī)制尚不十分清楚，不少學(xué)者研究認(rèn)為，中草藥對真菌的作用機(jī)制主要在于破壞其細(xì)胞壁、細(xì)胞膜的完整，或影響其核酸、脂質(zhì)代謝等方面。楊國晶等［19］在進(jìn)行復(fù)方苦槿霜及其原料藥對常見皮膚癬菌和白念珠菌的體外抑制試驗(yàn)時，通過電鏡觀察到未經(jīng)藥物作用的紅色毛癬菌細(xì)胞菌絲體外形充盈，飽滿，表面光滑，大、小分生孢子生長良好，經(jīng)10%復(fù)方苦槿霜作用后的紅色毛癬菌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變：細(xì)胞明顯變性，細(xì)胞膜皺縮，細(xì)胞漿中大部分被電子薄區(qū)占據(jù)，細(xì)胞器消失。說明復(fù)方苦槿霜具有較強(qiáng)的抗真菌作用，推測其可能通過抑制胞壁和胞膜成分的合成，引起菌體破裂，內(nèi)容物滲出而發(fā)揮抗真菌作用。另外，近年來提出，一些反復(fù)發(fā)作的淺部及深部真菌感染，機(jī)體常伴有免疫功能的紊亂或低下，中藥復(fù)方制劑可能通過提高機(jī)體免疫功能而起抗真菌作用。太加斌等［34］研究發(fā)現(xiàn)竹葉石膏湯能使免疫抑制狀態(tài)下白念珠菌系統(tǒng)感染小鼠的生存時間延長，腎臟內(nèi)活菌數(shù)減少,對免疫功能正常的白念珠菌系統(tǒng)感染小鼠則無顯著性療效，但與氟康唑合用比單用氟康唑療效好,能使小鼠的存活時間延長，腎臟內(nèi)的活菌數(shù)減少，即有協(xié)同氟康唑療效的作用。通過實(shí)驗(yàn)認(rèn)為竹葉石膏湯對深部念珠菌感染有一定的保護(hù)作用，尤其是免疫功能低下時效果更顯著，與氟康唑合用能顯著提高療效，其作用可能與調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能有關(guān)。劉春英等［35］的研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)中益氣湯是良好的免疫激活劑，能顯著提高抗體水平及細(xì)胞免疫功能，表現(xiàn)對下降的T淋巴細(xì)胞α-醋酸萘酯酶(ANAE)陽性率、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)形率、巨噬細(xì)胞Fc受體活性(EA花環(huán)率)、溶血素、脾臟抗體形成細(xì)胞(PFC)具有升高作用，與未經(jīng)藥物治療組比較有顯著性差異。作者認(rèn)為，補(bǔ)益類中藥可促進(jìn)和調(diào)節(jié)白念珠菌感染所引起的小鼠免疫功能紊亂的恢復(fù)，可作為抗真菌治療的輔助手段。

5問題與展望

近年來，在中藥抗真菌實(shí)驗(yàn)研究中，主要集中在對單味中藥及提取的單一成分上，有利于明確中藥抗真菌的作用位點(diǎn)，但中藥應(yīng)用于臨床的多為復(fù)方制劑，作用于人體的為多種成分的復(fù)合物，對復(fù)方中藥制劑的研究也十分必要，特別是作用機(jī)制的研究，但與單味中藥研究相比，復(fù)方中藥制劑成分復(fù)雜，給抗真菌作用機(jī)制研究帶來了困難。復(fù)方中藥制劑抗真菌機(jī)制研究將成為今后研究的重點(diǎn)與難點(diǎn)。目前中草藥的體外抗真菌活性研究多采用瓊脂稀釋法和瓊脂擴(kuò)散法，由于該方法影響因素多，實(shí)驗(yàn)結(jié)果不穩(wěn)定，差異較大，無法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室之間的比較?？偨Y(jié)這些方法，尋找可靠、簡便、易行的測定方法及實(shí)驗(yàn)室條件,盡快進(jìn)入標(biāo)準(zhǔn)化軌道，在尋找有體外抗真菌活性的中草藥的研究中具有重要意義。

體外抗真菌試驗(yàn)有利于篩選具有抗真菌活性的方藥，但體外抗真菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果與體內(nèi)差別頗大，而動物實(shí)驗(yàn)是檢驗(yàn)中草藥對真菌感染的療效及了解其毒性、吸收、分布、代謝和排泄等情況不可缺少的環(huán)節(jié)。因此,應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)利用動物真菌病理模型進(jìn)行體內(nèi)研究。

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