凝血酶原提取分析論文

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1材料與方法

1.1材料

檸檬酸鈉抗凝的新鮮豬血漿。

1.2主要試劑

纖維蛋白原和凝血酶標(biāo)準(zhǔn)品購自美國SIGMA公司，Bradford蛋白質(zhì)定量檢測(cè)試劑盒購自美國BioRad。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

檸檬酸鋇吸附法使用的四種溶液分別為，溶液A：1.0mol/LBaCl2溶液；溶液B：0.02mol/LTris，0.15mol/LBaCl2，0.10mol/LNaCl，pH7.4；溶液C：0.02mol/LTris，0.10mol/LNaCl，0.20mol/LNa2EDTA，pH7.4；溶液D：0.02mol/LTris，0.15mol/LNaCl，pH6.5.

1.3主要儀器

GEGeneQuant1300核酸蛋白分析儀

1.4方法

1.4.1凝血酶原提取將收集到的5份豬血漿按1～5編號(hào)，各均分為2份，其中1份采用等電點(diǎn)沉淀法提取凝血酶原，另1份采用檸檬酸鋇吸附法提取凝血酶原。

1.4.1.1等電點(diǎn)沉淀法豬血漿用蒸餾水稀釋10倍，用5%冰乙酸將其pH調(diào)至5.3，4℃靜置過夜，3000r/min離心15min，棄上清，沉淀用生理鹽水溶解，過濾備用。

1.4.1.2檸檬酸鋇吸附法豬血漿中加入溶液A，體積比為10∶1，4℃攪拌30min，靜置30min后，3000r/min離心30min，棄上清。沉淀用溶液B洗滌，3000r/min離心15min，棄上清。重復(fù)洗3次。沉淀用溶液C解吸附，4℃攪拌0.5～1h，3000r/min離心15min取上清。上清液用溶液D于4℃透析過夜。3000r/min離心15min取上清液，即為凝血酶原溶液。

1.4.2凝血酶原激活用2%Na2CO3溶液將凝血酶原溶液的pH調(diào)至7.1，加入0.25mol/LCaCl2溶液，使Ca2+終濃度為0.03mol/L，再用2%Na2CO3溶液將凝血酶原溶液的pH調(diào)至7.1，室溫靜置2h，過濾即得凝血酶溶液。

1.4.3凝血酶比活性測(cè)定根據(jù)文獻(xiàn)［4］提供的方法配制0.1%纖維蛋白原溶液。

凝血酶效價(jià)測(cè)定［4,5］：取凝血酶標(biāo)準(zhǔn)品，用生理鹽水配制成效價(jià)(U/mL)分別為5、6、7、8、9、10的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。另取1×10cm的塑料試管6支，各加入0.1%纖維蛋白原溶液450μl，置37℃水浴預(yù)熱5min，再分別取已37℃預(yù)熱的上述6個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液各50μl，迅速加入上述各試管中，立即計(jì)時(shí)并搖勻，記錄凝固時(shí)間。每個(gè)濃度測(cè)2次，求平均值，做標(biāo)準(zhǔn)曲線。待測(cè)樣品用生理鹽水稀釋適當(dāng)濃度，取50μl，按標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定方法平行測(cè)定2次，求平均值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線或回歸方程計(jì)算樣品的效價(jià)。

根據(jù)文獻(xiàn)［6］，采用Bradford法測(cè)定樣品的蛋白質(zhì)濃度，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)樣本平行測(cè)2次，取平均值。根據(jù)公式：酶比活性=酶效價(jià)/溶液蛋白質(zhì)濃度，計(jì)算凝血酶溶液的比活性。

2結(jié)果與分析

以凝血酶標(biāo)準(zhǔn)品溶液效價(jià)(U/mL)為X，對(duì)應(yīng)的凝固時(shí)間（sec）為Y進(jìn)行直線回歸處理，并求得直線回歸方程，所得方程式為：Y=62.9135.994X，r≈0.9948.將凝血酶樣品的凝固時(shí)間代入回歸方程，即可計(jì)算得出樣品的凝血酶效價(jià)(見表1、圖1)。

采用等電點(diǎn)沉淀法得到的凝血酶原經(jīng)激活后，凝血酶的比活性為11.01±1.54U/mg，而采用檸檬酸鋇吸附法提取得到的凝血酶原經(jīng)激活后，凝血酶的比活性可達(dá)到130.17±12.30U/mg。其比活性經(jīng)配對(duì)樣本t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后，其概率P=3.54×105＜0.01，說明兩種方法得到的凝血酶比活性有顯著性差異，后者約為前者的11.8倍。從兩種方法所得到的凝血酶溶液的酶活性和蛋白質(zhì)濃度分析，造成兩者酶比活性差異的主要原因在于凝血酶的純度差異，凝血酶純度越高，比活性就越高。等電點(diǎn)沉淀法提取的凝血酶原溶液含雜蛋白較多，需要進(jìn)一步純化，以提高酶的比活性。因而，采用檸檬酸鋇吸附法從豬血漿中提取凝血酶原大大優(yōu)于等電點(diǎn)沉淀法，得到的凝血酶純度較高。

3討論

從血漿中提取的凝血酶可應(yīng)用于臨床，作為局部止血的首選藥物，具有止血快、無副作用的優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)，凝血酶也是纖維蛋白原定量檢測(cè)試劑盒的主要成分，應(yīng)用于出凝血疾病和血栓性疾病的臨床檢測(cè)［7］。由于人血漿資源的限制性，目前國內(nèi)采用豬血漿提取凝血酶的報(bào)道較多，等電點(diǎn)沉淀法和檸檬酸鋇吸附法是兩種主要的凝血酶原提取方法，凝血酶原經(jīng)單獨(dú)的鈣離子激活即可得到凝血酶。表1兩種提取方法所得到的凝血酶比活性

等電點(diǎn)沉淀法根據(jù)蛋白質(zhì)在溶液pH為其等電點(diǎn)的條件下溶解度最低的原理，用1%的醋酸將適當(dāng)稀釋后的血漿pH調(diào)至凝血酶原的等電點(diǎn)5.0～5.5之間，即可使凝血酶原析出。該方法雖然操作簡便，成本較低，但得到的凝血酶含雜蛋白較多，比活性低，達(dá)不到臨床藥物和檢測(cè)試劑的純度要求，還需要進(jìn)一步的純化，而純化步驟越多，酶的回收率則相應(yīng)降低，不能有效的利用資源。

檸檬酸鋇吸附法則根據(jù)檸檬酸鋇能吸附依賴于維生素K的凝血因子這一特性，在檸檬酸鈉抗凝獲得的血漿中加入氯化鋇產(chǎn)生檸檬酸鋇，凝血酶原等因子隨之沉淀分離出來，沉淀用EDTA解吸附，離心去沉淀，上清液經(jīng)透析后獲得凝血酶原溶液。雖然該方法看似操作較為復(fù)雜，但得到的凝血酶純度較高，可直接用于檢測(cè)試劑的制備，也可根據(jù)目的選擇進(jìn)行中度純化，相比等電點(diǎn)沉淀法其回收率更高，實(shí)際上節(jié)約了成本。

另外，無論是等電點(diǎn)沉淀法還是檸檬酸鋇吸附法，最后含有凝血酶原的蛋白沉淀的復(fù)溶過程是影響凝血酶得率的一個(gè)關(guān)鍵步驟。在檸檬酸鋇吸附法中，用EDTA解吸附凝血酶原應(yīng)在冰浴中攪拌0.5h以上，直至溶液呈現(xiàn)膠凍狀態(tài)為止，使凝血酶原充分溶解于緩沖液中。

【參考文獻(xiàn)】

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【摘要】目的比較等電點(diǎn)沉淀法和檸檬酸鋇吸附法從豬血漿中提取凝血酶原的純度。方法分別采用等電點(diǎn)沉淀法和檸檬酸鋇吸附法從豬血漿中提取凝血酶原，凝血酶原經(jīng)單獨(dú)鈣離子激活得到凝血酶，通過凝血酶效價(jià)測(cè)定、蛋白質(zhì)濃度測(cè)定，計(jì)算出凝血酶的比活性。結(jié)果采用等電點(diǎn)沉淀法提取的凝血酶原經(jīng)激活后得到的凝血酶比活性為11.01±1.54U/mg，采用檸檬酸鋇吸附法提取的凝血酶原經(jīng)激活后得到的凝血酶比活性為130.17±12.30U/mg，經(jīng)配對(duì)T檢驗(yàn)，P＜0.01.結(jié)論與等電點(diǎn)沉淀法相比，采用檸檬酸鋇吸附法從豬血漿中提取得到的凝血酶原純度更高。

【關(guān)鍵詞】凝血酶原；凝血酶；等電點(diǎn)沉淀法；檸檬酸鋇吸附法