細胞凋亡研究論文

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【關鍵詞】細胞凋亡

1900年，Regand首次認識到精子發生過程中存在著生殖細胞的退化。對大鼠等嚙齒目動物的研究表明，生精過程中實際產生的精子數量比理論預測減少25%～75%［1］。20世紀70年代，Kerr等提出細胞凋亡（apoptosis）的概念，包括程序化細胞死亡（programmedcelldeath,PCD）和非程序化細胞死亡（nonprogrammedcelldeath,NPCD），提示細胞凋亡在男性生殖中具有重要影響［2］。現已證實，睪丸生殖細胞退化是通過細胞凋亡實現的。在精子發生各個階段，都存在自發性的生精細胞凋亡。但不同時期凋亡細胞數目有很大差異，原位檢測表明，在精子發生過程中主要是精原細胞和精母細胞發生凋亡，而精子細胞凋亡很少發生。精原細胞特別是A精原細胞凋亡是導致精子數少的主要原因，其凋亡均發生在有絲分裂期間。精母細胞凋亡發生在減數分裂過程中的細線前期、偶線期，特別是粗線期。睪丸就是通過精原細胞不斷增殖，同時過量的受到損傷的生精細胞不斷凋亡，來控制精子細胞數目，維持精子發生的動態平衡。本文就睪丸生殖細胞凋亡的生理意義、機制和影響因素作一綜述。

1生精細胞凋亡及其生理意義

生精過程是指精原細胞經過多次有絲分裂，最后發育成精子，其中存在精細復雜的調節機制。生精細胞凋亡主要發生在三個階段：首先是在A型精原細胞的有絲分裂；其次是精母細胞的減數分裂；最后是精子發生的過程［3］。生精細胞的凋亡還與生精上皮處于生精周期階段有關，不同發育階段的生精細胞對相同刺激因素反應性不同，由此推測生精細胞凋亡有多種調節機制。現研究較多的是在激素和睪丸局部加熱誘導下，生精細胞凋亡的調控機制，著也是目前較有希望的男性節育調節手段［4］。生精細胞凋亡具有重要生理意義，參與維持精子發生過程的動態平衡，維持支持細胞與生精細胞的最佳比例，清除基因異常生殖細胞，調節生精過程中精子數量和質量，是機體保持生殖遺傳穩定的重要防御機制。在病理狀態下，細胞凋亡則導致少精或無精子癥發生［5，6］。

2生精細胞凋亡機制

2.1Bcl-2蛋白家族它包括促凋亡的蛋白（Bax、BAD、Bak、Bik、Bok、Diov、Hrk、BID和抑制凋亡的蛋白（Bcl-2、Bcl-xlr、Mcl-1、Bcl-w、Bfl-1/A1）。他們分別控制著細胞死亡通路的各個階段。Furuchi和Rodriguez發現［7，8］，過分表達Bcl-2的轉基因大鼠，會出現精原細胞增生，并且生精細胞凋亡的機會也減少。Bax缺失的大鼠會導致減數分裂前期生精細胞不正常積累，從而造成生精過程紊亂，以致沒有生育能力。另外一些Bcl-w缺失的大鼠也沒有生育能力［9］。這些資料都證實了Bcl-2蛋白家族的選擇性表達對生精過程異常重要。

2.2腫瘤抑制蛋白P53P53蛋白和Bcl-2蛋白家族一樣調控著細胞內的死亡信號途徑。許多研究報告證明P53在生精細胞的凋亡中起著關鍵的作用，包括自發性的和損傷誘使的生精細胞的凋亡［10］。缺P53基因的大鼠雖然生長發育正常，也有生育能力，但是在射線作用或實驗性隱睪后表現出生精細胞凋亡的滯后，并且凋亡數目也減少［11，12］。盡管大多數的資料表明P53僅調節有絲分裂的生精細胞的活性來控制細胞凋亡，近來也有資料表明它也在生精細胞的減數分裂和減數分裂后期起著關鍵的作用，從而影響細胞凋亡。

2.3caspase-3蛋白酶caspase-3是一種活化胞漿的蛋白酶，它是一種死亡蛋白酶，凋亡細胞通過它的數目的增多從而啟動凋亡的級聯反應。Kumi-Diaka用5，7，45-三羥異黃銅（genistein）作用于TM4細胞株后［13］，同時發現了細胞的凋亡和壞死并且caspase-3的酶活性提高，因此表明在用genistein引起的睪丸內生精細胞和支持細胞的凋亡可能包括啟動caspase-3蛋白激酶這一信號通路的作用。

2.4Fas/CD95系統Fas信號系統由相互作用的蛋白Fas（CD95/APO-1）和FasL（CD95L/APO-1L）組成。Fas是屬于TNF受體家族的一種I型跨膜蛋白，它廣泛存在于各種組織中。FasL是II型的膜蛋白，它以跨膜和可溶性的分泌形式（sFasL）存在［14，15］。sFasL可以在遠距離范圍內調控表達Fas蛋白的細胞凋亡。免疫組化的結果證明，支持細胞在它們的質膜上表達FasL，而生精細胞則選擇表達Fas［16］。現在已有多種證據證明Fas信號系統啟動生精細胞的凋亡：（1）在混合培養的支持細胞和生精細胞中加入FasL的反義核苷酸（阻斷了FasL的翻譯），明顯看到生精細胞凋亡數目的減少；（2）Fas和FasL的mRNA的表達量隨著動物年齡的不同而不同，在大鼠中是16～33天最多，而此時剛好是大鼠生精細胞凋亡的高峰；（3）加入模擬FasL功能的Fas的激動劑（一種抗Fas的抗體，Jo-2），生精細胞的數目大大減少。此外，在一些有害化合物引起的睪丸損傷中，Fas系統也與生精細胞的凋亡密切相關。Boekelheide［17］用MEHP誘使睪丸損傷的實驗表明，隨著生精細胞凋亡數目的增多，Fas和FasL的表達量也提高，并相應達到峰值。而且，Fas的活性部分RIP和FAP-1的表達也增多。因此，Fas/FasL是一個重要的旁分泌系統，它不僅影響生精細胞生理條件的凋亡，控制著生精過程的穩態，而且也在有毒物質誘使的睪丸損傷中極大地影響了生精細胞數目。

3生精細胞凋亡與激素

3.1睪酮（testosterone,T）又稱生精激素，由睪丸間質細胞合成、分泌。大量研究表明，睪酮水平的降低是生精凋亡的重要原因。利用間質細胞毒性物質——乙基二甲基磺酸鹽（EDS）處理大鼠，2天后睪丸中檢測不到3β-羥類固醇脫氫酶，8天后凋亡指數增加，長時間EDS處理，粗線期精母細胞和精子細胞的凋亡明顯增加［18］。睪酮是通過與支持細胞合成的雄激素受體（AR）特異結合發揮其生物學效應的。睪酮在精原細胞、精母細胞的發育及精子細胞的變態過程起作用，較高水平的睪酮對精原細胞的發育是必須的。睪酮有選擇地在生精周期VII-VIII階段起調節作用。抑制睪酮分泌、VII-VIII期的生精細胞首先發生凋亡［19］。另有研究結果顯示，切除大鼠垂體后，睪丸體積明顯縮小，精子發生停滯在初級精母細胞階段，給予大劑量的外源睪酮可重新誘導精子發生。給予成年大鼠甲氧乙酸選擇性破壞間質細胞，睪酮血清水平降低，生精細胞凋亡明顯增加［20］。

3.2促卵泡激素正常精子發生過程需要促卵泡激素（folliclestimulatinghormone,FSH）存在。大量研究表明，FSH是靈長類精子發生啟動的主要調節者之一，促卵泡激素被拮抗或其水平降低，都能使生殖細胞發生凋亡。FSH通過支持細胞上其唯一的受體FSHR發揮其作用。陳雪雁等［21］提取RNA進行斑點雜交發現FSHRmRNA的雜交信號全部位于支持細胞，于XIII-I期最強，VII-VIII期最弱，在II-VII期處于中等水平。可推測FSH主要作用于XII-I期，調節精原細胞的分裂和精母細胞的減數分裂過程，決定進入精子形成期的圓形精子細胞的數量。缺乏FSH導致粗線期精母細胞凋亡。Tesarik等［22］體外培養生殖細胞和支持細胞發現FSH和睪酮有作用的交叉點，睪酮可增強FSH對生殖細胞凋亡的調控作用，二者協同作用，共同維持正常的精子發生過程。

3.3促性腺激素釋放激素丘腦下部分泌的促性腺激素釋放激素（gonaditrophin-releasinghormone,GnRH）使垂體釋放FSH和LH，FSH、LH分別刺激支持細胞和間質細胞做出應答，為精子發生創造微環境。用GnRH拮抗劑處理大鼠，生精周期特異階段生殖細胞凋亡明顯增加。Sinha-Hikin等［23］發現，給成年大鼠-GnRH拮抗劑后5天（VII-VIII階段）和7天（VII-VIII和IX-XI階段）生精細胞凋亡DN段明顯增加，14天（I、II-IV、V-VI和VII-XIV階段）達最高值。

3.4催乳素關于催乳素（prolactin，PRL）對生精細胞凋亡的研究相對較少，Yazawa等［24］對日本紅腹蠑螈睪丸的研究發現，PRL水平提高只會導致生精周期中倒數第2期凋亡發生，推測可能是時間和細胞類型的特殊性引起的，也可能是PRL受體（PRLR）只在倒數第2期表達，或者PRLR全程都表達，只不過在倒數第2期細胞信號系統的組成跟其他期不同所致。他凋亡作用，這主要取決于FSH/PRL的比例。在分子水平上對PRL促進生精細胞凋亡的研究相當匱乏。用PRL類似物質（CHX）處理后，睪丸內caspase活性有高表達，并且可能由一種新的未經確定的caspase來介導［25］。PRL的許多功能表現為促進增生，但其促進凋亡的機制還有待進一步深入研究。

【參考文獻】

1BillingAD.Apoptosisinthetestisgermcells:developmentalchangesingonadotropindependenceandlocalizationtoselectivetubulestages.Endocrinology,1995,136（2）:15-17.

2SaidTM,PaaschU,GlanderHJ，etal.Roleofcaspasesinmaleinfertility.HumReprodUpdate,2004,10（1）:39-51.

3KilincF,GuvelS,KayaselcukF,etal.p53expressionandapoptosisinvaricoceleintherattestis.JUrol,2004,172（6pt1）:2475-2478.

4JMorettiE,DiCairanoG,CapitaniS，etal.Ctyptorchidismandsemenquality:TEMandmolecularstudy.Andrology,2007,28（1）:194-199.

5TheasMS,RivalC,DietrichSJ,etal.Deathreceptorandmitochondrialpathwaysareinvolvedigermcellapoptosisinanexpcrimentalmodelofautoimmuneorchitis.HumReprod,2006,21（7）:734-1742.

6AssinderS,DavisR,FenwickM,etal.Adult-onlyexposureofmaleratstoadietofhighphytoestrogencontentincreasesapoptosisofmeioticandpost-meioticgermcells.Reproduction,2007,133（1）:11-19.

7FuruchiT,MasukoK,NishimuneY，etal.Development,1996,122:1703-1709.

8RodriguezI,OdyC,ArakiK，etal.EMBOJ,1997,16:2262-2270.