細胞研究論文

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骨缺損(尤其是大型骨缺損)的治療，由局部傷情復雜和缺乏理想的修復材料，一直是困擾臨床醫生和基礎醫學工作者的一大難題，而尋找一種盡可能達到或接近自體骨移植效果的理想的骨替代材料更是無數學者熱切探索、孜孜以求的目標。近年來日趨活躍的骨組織工程(bonetissueengineering)技術為這一課題的研究帶來了新的亮點和希望。目前動物實驗已能從骨膜、骨髓等定向性骨祖細胞(determinedosteogenicprecursorcells,DOPC)密集處分離培養出成骨細胞，經體外擴增并與載體結合，回植體內骨缺損處取得骨缺損修復的成功［1］。與此同時，基于對患者易接受性、可操作性和更簡單易行性等方面的考慮，研究者又開始把目光投向誘導性骨祖細胞(inducibleosteogenicprecursorcells,IOPC)。其中，在體內分布廣泛、數量巨大、部位表淺、取材方便、培養傳代易行、分裂增殖迅速的成纖維細胞首先成為了研究的焦點。由于目前許多相關研究尚處于實驗階段，為此，本文著重就成纖維細胞的生物學特性及其成骨作用等作一綜述。

1成纖維細胞的來源及其生物學特性

成纖維細胞(fibroblast)是結締組織中最常見的細胞，由胚胎時期的間充質細胞(mesenchymalcell)分化而來。在結締組織中，成纖維細胞還以其成熟狀態—纖維細胞(fibrocyte)的形式存在，二者在一定條件下可以互相轉變。

不同類型的結締組織含成纖維細胞的數量不同。通常，疏松結締組織中成纖維細胞的數量比同樣體積的致密結締組織中所含成纖維細胞的數量要少，故分離培養成纖維細胞多以真皮等致密結締組織為取材部位［2，3］。

成纖維細胞形態多樣，常見的有梭形、大多角形和扁平星形等，其形態尚可依細胞的功能變化及其附著處的物理性狀不同而發生改變。成纖維細胞胞體較大，胞質弱嗜堿性，胞核較大呈橢圓形，染色質疏松著色淺，核仁明顯。電鏡下，其胞質可見豐富的粗面內質網、游離核糖體和發達的高爾基復合體，表明它具有合成和分泌蛋白質的功能。成纖維細胞尚可合成和分泌膠原纖維、彈性纖維、網狀纖維及有機基質。它合成的前膠原蛋白分子經內切酶作用，聚合和重排，可形成與成骨細胞合成分泌的膠原原纖維一樣具有64nm(640?)周期橫紋的膠原原纖維，膠原原纖維經互相粘合形成膠原纖維。經檢測，這兩種細胞合成分泌的膠原纖維均是Ⅰ型膠原纖維，在形態和生化結構上完全相同［4,5］。

處于成熟期或稱靜止狀態的成纖維細胞，胞體變小，呈長梭形，粗面內質網和高爾基復合體均不發達，被稱為纖維細胞。在外傷等因素刺激下，部分纖維細胞可重新轉變為幼稚的成纖維細胞，其功能活動也得以恢復，參與組織損傷后的修復。另外，在結締組織中，仍保留著少量具有分化潛能的間充質細胞，它們在創傷修復等情況下可增殖分化為成纖維細胞。

2成纖維細胞在一般創傷修復中的表現

各種創傷均會造成不同程度的細胞變性、壞死和組織缺損，必須通過細胞增生和細胞間基質的形成來進行組織修復。在此修復過程中，成纖維細胞起著十分重要的作用。以傷口愈合過程為例，成纖維細胞通過有絲分裂大量增殖，并從4～5天或6天開始合成和分泌大量的膠原纖維和基質成分，與新生毛細血管等共同形成肉芽組織，填補傷口組織缺損，為表皮細胞的覆蓋創造條件。在傷口愈合中，成纖維細胞主要來源于真皮乳頭層的局部成纖維細胞和未分化的間充質細胞，以及血管周圍的成纖維細胞和周細胞。內臟損傷時，參與修復過程的成纖維細胞多來自間質和包膜，以及粘膜下或漿膜下層的結締組織。有人認為創傷愈合過程中傷處聚集的大量成纖維細胞，一方面是由成纖維細胞通過分裂增殖而來，另一方面，更多地是由鄰近的間充質細胞、纖維細胞和毛細血管周細胞等演變或游走到傷處。在創傷修復的后期，成纖維細胞通過分泌膠原酶參與修復后組織的改建。在某些病理條件下，以成纖維細胞為主要細胞成分的肉芽組織或增生組織塊還可以在非骨組織內發生鈣化，引起異位骨化(ectopicossification)。但對于異位骨化的參與細胞及其機制尚不十分清楚，未分化間充質細胞、成纖維細胞、內皮細胞和毛細血管周細胞等可劃歸為誘導性骨祖細胞的細胞都有可能參與這一過程［6，8］。

3成纖維細胞在骨創傷修復過程中的表現

最簡單和常見的骨創傷即是骨折，其愈合過程須經過炎性反應、清掃、纖維骨痂和骨性骨痂4個階段［4］。不同階段參與的細胞主體不同。成纖維細胞從骨折第3天起就出現于骨折局部血腫中［6］，骨折后5天即在機化血腫及骨折斷端的間隙及其周圍大量存在，是參與纖維骨痂階段的主要細胞成分［4，5］。在此階段成纖維細胞一方面大量分裂增殖，一方面又合成和分泌大量Ⅰ型膠原，使肉芽組織逐步變成疏松的結締組織，將骨斷端包圍起來，形成接合兩骨折斷端的巨大的纖維骨痂。然而，這種由無數成纖維細胞和豐富的肉芽組織為主體構成的纖維結締組織卻不會演變為在其它組織創傷修復時常見的瘢痕組織，而是通過鈣鹽結晶在其內部不斷沉積，逐漸演變為骨性骨痂，使骨折局部的修復達到骨性愈合，恢復骨組織的結構。此時，骨折愈合部只有骨組織而不再存在成纖維細胞［4，5，9～11］。

4成纖維細胞的成骨作用

成纖維細胞在骨折愈合過程中不同于其它組織創傷修復的表現，以及在某些病理條件下可以參與異位骨化［6，7］，使人們對成纖維細胞的分化能力、鈣化骨化能力以及在成骨過程中其成骨能力如何發揮、細胞演變的最終歸宿如何等等問題產生了濃厚的興趣。對成纖維細胞成骨能力的研究也正是開始于對骨折愈合過程中成纖維細胞表現的觀察。

對骨折局部骨形成區的電鏡觀察顯示，除了成骨細胞在此發揮成骨作用外，成纖維細胞確實也存在著類似的成骨表現［4，5，9～13］。例如，在其線粒體內可清晰見到鈣鹽顆粒，部分內質網腔內可見成熟的膠原纖維，分泌到其四周的膠原纖維內可見高密度的鈣鹽結晶沉積。不僅如此，成纖維細胞還能象成骨細胞一樣產生基質小泡并引起小泡內的鈣鹽沉積。鈣化的基質小泡形成叢毛球狀的鈣球，鈣球隨后合并、融合為骨組織。以上種種現象表明，成纖維細胞與成骨細胞一樣具備提供鈣鹽沉積及骨形成所必需的條件。在從纖維性骨痂到骨性骨痂的演變過程中，成纖維細胞也隨之演變為骨細胞，與成骨細胞的歸宿相一致。但二者在演變過程中的表現又不盡相同，主要有以下幾點可資鑒別［9，13］：①成纖維細胞及其細胞核均呈不規則的橢圓形或長方形，而成骨細胞及其細胞核則為邊緣比較光整的橢圓形；②成纖維細胞均單獨存在，細胞之間有眾多的膠原纖維相隔，成骨細胞則以連續排列的形式出現；③成纖維細胞的細胞質內溶酶體少見，而成骨細胞的細胞質內則常有溶酶體可見；④成纖維細胞四周的骨組織都由叢毛球狀鈣球或針狀鈣鹽結晶組成，成骨細胞則都有一面緊貼比較成熟與致密的骨組織；⑤成骨細胞是一個一個地被骨組織(類骨質)包圍變為骨細胞，而成纖維細胞則可以是兩個或兩個以上同時被骨組織包圍在一個陷窩內，然后再隨著細胞之間基質的鈣化而分隔為各占一個骨陷窩。

對成纖維細胞的成骨作用，有學者認為這是成纖維細胞的固有特性在骨折這一特定情況下得以表達的結果［9，11］。骨折局部活的和失活的骨組織及軟骨組織，以及骨基質中的某些大分子都有可能誘導成纖維細胞表達其成骨作用進而演變為骨細胞［14，15］。較早在骨基質中發現的骨形態發生蛋白(bonemorphogeneticprotein,BMP)即對成纖維細胞有一定的誘導作用。對骨折愈合中BMP作用的研究［16，17］，表明創傷使內源性BMP呈階段性合成與釋放，并誘導周圍軟組織中的間充質細胞或/和成纖維細胞等向成骨方向轉化。應用PAP法發現［16］，骨折后第3、5天局部纖維肉芽組織中的成纖維細胞樣間充質細胞內以及第14天新生骨小梁間纖維組織中的成纖維細胞樣間充質細胞內，都與成骨細胞、軟骨細胞和骨基質一樣存在BMP，表明這些成纖維細胞樣間充質細胞已被誘導為可合成分泌BMP、具有成骨作用的細胞。而Sampath［15］從牛骨基質中分離提純得到的成骨素對成纖維細胞的骨誘導能力更是超過了BMP和當時已知的其它骨生長因子。

成纖維細胞在其成骨作用得以表達后，可能通過兩種方式成骨：①膜內成骨；②在環繞軟骨的纖維層內成骨。開始分泌膠原纖維后，參與成骨的成纖維細胞只有兩個歸宿［4，5，9，13］：①變性、死亡、碎裂直至消失，這種演變發生早、范圍廣，故從纖維性骨痂形成開始，就逐漸有基質成分發生鈣化，進而轉變為骨基質；②演變為骨細胞，這一過程出現較晚，并穿插在前一過程之中，故在形成骨組織的細胞成分的同時，還使豐富的纖維骨痂演變為骨性骨痂，形成骨組織。但這種由成纖維細胞演變成的骨細胞，其結局如何、其生物學特性與由成骨細胞演化而來的骨細胞是否相同仍不清楚。例如，骨細胞從骨陷窩脫離后，可恢復為功能活躍的成骨細胞，再次參與骨組織的形成；而由成纖維細胞演變成的骨細胞在脫離骨陷窩后，是成為成骨細胞還是恢復為成纖維細胞、此時是否還具備成骨作用等一系列問題尚缺乏研究。

5成纖維細胞體外培養的生物學特性［18］

成纖維細胞的分離培養一開始并不涉及成骨作用，而主要是用于研究細胞的老化、各種外來因子對細胞的損傷、細胞在體外條件下的惡性轉化、以及某些先天性代謝異常、酶缺陷等。由于皮膚成纖維細胞易于獲取，又易于在體外生長，故目前皮膚成纖維細胞培養已在基礎醫學和臨床醫學研究中得到較廣泛的運用，其分離培養技術已相對成熟，對其體外生長規律也有了較全面的認識。

成纖維細胞的原代培養可用酶消化法或組織塊法，其中組織塊法又因其操作簡便、條件易于控制而應用更為普遍。通常，以酶消化法獲得的成纖維細胞懸液在接種后5～10min即可見細胞以偽足初期附著，與底物形成一些接觸點；然后細胞逐漸呈放射狀伸展，胞體的中心部分亦隨之變扁平；最快者大約在接種后30min，細胞貼附底物即較為完全，呈現成纖維細胞的形態。采用組織塊法則大約在接種后2～3天［2，3］到1周左右，在接種的皮膚組織塊周圍長出細胞。待細胞融合成片，鋪滿培養容器底壁大部分時即可進行傳代。一般都采用胰蛋白酶(trypsin)，將成纖維細胞從底壁消化下來后分瓶作傳代培養。成纖維細胞在體外培養條件下能保持良好的分裂增殖能力。細胞分裂時變為球形；分裂后又平鋪在附著物的表面成為有突起的扁平細胞。體外培養的成纖維細胞，其生命期限與物種等因素有關。例如：人胚成纖維細胞約可培養50代；恒河猴皮膚成纖維細胞能傳代超過40代；雞胚成纖維細胞則只有少數能培養30代；而小鼠成纖維細胞多數只能生長8代左右。另外，從老年個體取得的成纖維細胞的壽命要比取自年輕者短。由于在細胞傳代和進行體外培養時，細胞的生物學特性會逐漸發生一些不同于體內的改變，故通常只將前10代視這正常細胞，可在此時將生長旺盛的成纖維細胞凍存起來，以備將來復蘇使用，這在將培養的細胞由動物實驗向人體實驗過渡的過程中必須給予足夠的重視。

6成纖維細胞在體外培養中的成骨作用

徐榮輝［2］等通過體外培養家兔皮膚成纖維細胞發現，經傳代培養的成纖維細胞至第8天時，其細胞集落中有不透光的骨小結節形成；到37天時，小結節擴大、延伸，形成骨小梁樣結構。經活體四環素標記顯示，所形成的結構為新生骨組織。他們還注意到，成纖維細胞在參與骨形成的過程中并無分化為成軟骨細胞或成骨細胞的明確跡象，故推測并未發生此種分化，而成纖維細胞之所以能發揮成骨作用，很可能是受某些誘導因素作用的緣故。他們認為用以培養成纖維細胞的中厚皮片中混雜存在的上皮細胞(或/與內皮細胞)，可能是誘導成纖維細胞形成骨組織的一種誘導因素。而Friedenstein［6，19］較早的實驗則認為，屬于誘導性骨祖細胞之一種的成纖維細胞，在上皮細胞(如膀胱上皮)或脫鈣骨基質等誘導因子作用下，可以分化為成骨細胞進而形成骨組織。鄧廉夫［20］等分離培養取自關節內的損傷性和晚期骨關節炎性的滑膜細胞，發現其中的成纖維細胞樣細胞增殖迅速，呈束狀或交叉鋪展并可形成多層結構，細胞表面有其分泌物形成的不透光結節，經四環素標記、ARS(Alizarinreds)和甲苯胺藍(Toluidineblue)染色，顯示結節為新生骨組織。在缺乏常規的誘導因子——上皮細胞的作用下，取自滑膜的成纖維細胞樣細胞也能發生成骨作用，他們推測是在關節損傷后或骨關節炎的發生與發展過程中，改變的關節微環境(如TNF樣活性物質增多等)可能會觸發滑膜的成纖維細胞與骨形成相關的多基因表達，使其向成骨型細胞分化，這樣，滑膜成纖維細胞樣細胞在體內時即已具備成骨性能，故在培養條件下可發揮成骨作用。Dodda［21］等的研究則指出，變性滑膜細胞多種細胞因子和生長因子的表達、關節液內多種細胞因子的出現，可能是滑膜成纖維細胞樣細胞成骨表型表達的重要始動因素。這些相關的研究表明成纖維細胞成骨表型的表達可能存在著較復雜的調控機制，而其誘導因素也是多樣的。

為獲取大量具有成骨表型的成纖維細胞并了解其轉化機制，鄧廉夫［22］等將分離純化的人皮膚成纖維細胞置于加有不同濃度EGF、IL-6、TNF-α、BMP-2的培養液中進行體外培養，采用生物化學、組織化學和電鏡觀察等方法檢測成纖維細胞成骨性標記物的形成狀況，發現TNF-α和BMP-2聯合應用，可使成纖維細胞分泌堿性磷酸酶、骨鈣素及膠原纖維的量增加；成纖維細胞可由梭形向圓形或多突形轉化，蛋白分泌旺盛；細胞外基質中，豐富的膠原纖維定向或雜亂排列，其間散在較多的鈣顆粒；細胞可重疊交織形成多層結構，其表面有分泌顆粒和鈣鹽結晶堆積，并不斷融合擴大成骨結節，表明TNF-α和BMP-2可以誘導成纖維細胞成骨。但這種完全由成纖維細胞經誘導而形成的骨組織，在缺乏典型的成骨細胞參與下是否能在體外或植入體內后經改建成為成熟的板層骨及其改建過程如何?仍有待進一步研究。

7展望

盡管成纖維細胞受哪些因素誘導可以產生成骨作用、這些因素的誘導方式及其機制如何以及成纖維細胞在骨形成中是否分化為成骨細胞等等問題尚未完全解決，但成纖維細胞經誘導可以形成骨組織這一現象已逐漸為廣大科學工作者所接受。由于成纖維細胞直接參與了骨折愈合過程中纖維性骨痂的形成，其自身又具備被誘導成骨的能力，可以設想，利用成纖維細胞分布廣泛、取材方便、對機體損傷較小、體外培養容易成活、增生繁殖較快等較其它具有成骨作用的細胞(如骨膜成骨細胞、骨髓基質細胞等)優越之處，在體外大量培養擴增成纖維細胞，并施以有效的誘導因素(如上皮細胞、TNG-α和BMP等)使其具備成骨效能，然后與合適的生物材料載體復合，同時使該復合體在體外或體內保持良好的成骨能力并進行一定程度的成骨，則有望獲得具有一定的生物力學支撐強度而成骨作用又保持活躍的“活骨”復合體，用以替代自體骨或異體骨回植體內治療難以自身修復的較大的骨缺損，這無疑將為骨缺損的修復治療開辟一條新的有輝煌前景的道路。在組織工程技術和生物材料科學已有較大發展的今天，這一設想是極有可能實現的。當然，從目前所處的實驗階段過渡到臨床應用尚有很大一段距離，需要解決的問題還很多，而且隨著研究的展開和深入，問題可能還會越來越多，但這確實是一項很有臨床應用價值和社會、經濟效益的重大課題，值得廣大基礎醫學工作者和臨床科研人員為之而努力。