中醫(yī)證候基因芯片研究論文

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【摘要】用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)研究中醫(yī)證候是中醫(yī)研究的重要課題。文章簡要介紹了用基因芯片探討中醫(yī)證候本質(zhì)的研究近況，主要包括腎陽虛證、虛寒證、心陽虛證、肺虛證、脾虛證和寒熱證差異基因表達(dá)譜的研究，從而為從基因水平上闡釋中醫(yī)證候的本質(zhì)特征和進一步建立中醫(yī)證候的基因組學(xué)做了有意義的探索。

【關(guān)鍵詞】中醫(yī)證候基因芯片生命科學(xué)

近年生命科學(xué)最熱門的三大領(lǐng)域是基因組研究、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。相應(yīng)地也有三大生物技術(shù)給予支持，這就是DNA測序、PCR技術(shù)和生物芯片技術(shù)。自1991年美國加州舊金山Affymetrix公司創(chuàng)造了世界上第一塊DNA芯片、1995年Stanford大學(xué)發(fā)表第一篇基因表達(dá)芯片文章以來，基因芯片技術(shù)已廣泛地被用于基因功能的研究［1］。基因芯片是生物芯片中應(yīng)用最廣泛、技術(shù)最成熟的分支，又叫DNA芯片、DNA微陣列，其是在面積不大的基片表面上以點陣的方式有序排列一系列固定于一定位置的可尋址的識別分子（DNA和RN段），并以此作為探針，在一定條件下與樣品待測的靶基因片段進行結(jié)合或反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)果用同位素法、化學(xué)發(fā)光法或酶標(biāo)法顯示，然后用精密的掃描儀掃描記錄，通過計算機軟件分析，綜合可讀信息，最終實現(xiàn)對靶基因的存在、含量及變異等信息的快速檢測。

1中醫(yī)證候及其證候基因組

辨證論治是中醫(yī)學(xué)理論的特點之一，論治取決于辨證。中醫(yī)的“證”是生命物質(zhì)在疾病過程中具有時相性的本質(zhì)反映。“候”的原意則是用以說明事物變化的情狀，即所謂的疾病的臨床表現(xiàn)。由于中醫(yī)學(xué)對于疾病的認(rèn)識側(cè)重于整體、宏觀、司外揣內(nèi)，重視疾病某階段機體的整體狀態(tài)，辨證論治也即是通過對疾病表現(xiàn)在外的征象，進而推測演繹疾病的病因、病性和病位，由此歸納出證的概念［2］。用現(xiàn)代科技研究中醫(yī)“證候”是中醫(yī)研究的重要課題，證候病機及其與疾病和方劑的相關(guān)性是證候研究的重要科學(xué)問題［3］。中醫(yī)證候是中醫(yī)藥研究的核心，“證候”本質(zhì)的研究是中醫(yī)現(xiàn)代化研究的熱點和難點，如能獲得突破性進展，必將使中醫(yī)理論研究取得質(zhì)的飛躍。應(yīng)用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論和分子生物學(xué)技術(shù)闡明中醫(yī)“證候”本質(zhì)是實現(xiàn)中醫(yī)藥現(xiàn)代化的基礎(chǔ)和關(guān)鍵，具有重大科學(xué)意義。中醫(yī)“證候”本質(zhì)研究雖經(jīng)歷幾十年至今未能實質(zhì)性突破，其根本原因在于以前沒有一種像基因芯片那樣十分有效地研究手段能同時檢測許多機體、組織和細(xì)胞的變化，并比較變化以識別其規(guī)律［4］。中醫(yī)證候的現(xiàn)代研究從以癥狀、疾病、組織、細(xì)胞等為主體，逐漸發(fā)展至分子水平、基因水平，并已由單個基因向多基因，由個別基因向基因組發(fā)展，由個別基因研究積累到研究基因表達(dá)譜，當(dāng)今在引入基因芯片技術(shù)后，建立起證候的功能基因組表達(dá)譜［5］，旨在尋找一些與證候相關(guān)的基因，然后根據(jù)這些基因與證候的關(guān)系密切程度用于證候的基因診斷和療效評價［6］。從中醫(yī)理論看，證候的形成是由先天的體質(zhì)因素和后天的環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，因而對證候的研究可能要繪制3張圖譜：基因組圖譜、單核苷多態(tài)性（SNP）圖譜和蛋白質(zhì)組學(xué)圖譜。而SNP譜體現(xiàn)了不同人種和同一人種不同個體之間的基因組差異，并決定人類個體體質(zhì)差異和疾病易感性，也可能是中醫(yī)稟賦學(xué)說的基因組背景。

2中醫(yī)證候的基因芯片研究

2.1腎陽虛證

倪紅梅等［7］對腎陽虛體質(zhì)青少年差異表達(dá)基因的基因芯片研究，選取上海16～24歲青少年154例進行腎陽虛體質(zhì)篩查，篩查出6例腎陽虛體質(zhì)者，男性1例，女性5例，余148例為對照，分別采集兩組的外周血，分離白細(xì)胞并抽提RNA。基因芯片采用上海博星公司的H80S型，可做人標(biāo)本的8465點雜交,結(jié)果篩選出127條差異基因，其中63條上調(diào)基因，64條下調(diào)基因，其涉及免疫相關(guān)、細(xì)胞周期蛋白、發(fā)育相關(guān)、細(xì)胞生長、細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白、代謝、離子通道、轉(zhuǎn)運蛋白、轉(zhuǎn)錄因子，以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)。由此說明體質(zhì)的本質(zhì)是人體防御免疫功能、自我代償修復(fù)和自我調(diào)節(jié)的反映，其物質(zhì)基礎(chǔ)是建立在人體各系統(tǒng)形態(tài)、機能及代謝活動之上的，其內(nèi)在機理也是多系統(tǒng)多環(huán)節(jié)的。譚從娥等［8］對篩選出1例骨關(guān)節(jié)炎（OA）腎陽虛證行溫針治療（取穴：氣海、關(guān)元、足三里、內(nèi)外膝眼、陽陵泉），于治療前后采集其外周血，做白細(xì)胞RNA抽提，以基因芯片研究其治療前后的基因表達(dá)譜。結(jié)果：在70條差異表達(dá)基因中，上調(diào)基因49條，下調(diào)基因21條，并對34條基因初步分類分析：與免疫相關(guān)基因10條，主要表現(xiàn)為上調(diào)。如退火素A1基因（NM-000700），OA早期一些患者滑膜液中可有T細(xì)胞浸潤，OA晚期某些細(xì)胞因子（IL-1,TNF-α）參與局部組織損傷，其與炎癥免疫和自身免疫發(fā)生有關(guān)，致使關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生退行性變，故認(rèn)為溫針治療后，免疫相關(guān)基因上調(diào)，提示溫針治療后可通過調(diào)節(jié)機體的免疫反應(yīng)來干預(yù)OA的發(fā)病過程,還有熱休克90KDβ鏈蛋白1基因（NM-007355）與基礎(chǔ)代謝相關(guān)的基因5條,如II型cAMP依賴性調(diào)節(jié)蛋白酶β鏈基因(NM-002736),經(jīng)針刺后上調(diào)了2.43倍,已知cAMP為調(diào)節(jié)新陳代謝的第二信使，其受cAMP依賴性蛋白激酶(PKA)調(diào)節(jié)，可誘導(dǎo)蛋白質(zhì)酶，加速新陳代謝，升高體溫，調(diào)節(jié)機體能量平衡。提示溫針可調(diào)節(jié)與基礎(chǔ)代謝相關(guān)基因表達(dá)來改善患者基礎(chǔ)代謝低的臨床癥狀。與肌肉運動相關(guān)的基因5條,主要為下調(diào)基因,如膽堿能受體、煙堿性、α多肽1基因（NM-000079），此基因是突觸內(nèi)神經(jīng)信息傳遞的基礎(chǔ)，與骨骼肌運動、肌肉收縮直接相關(guān)。與生長發(fā)育相關(guān)基因9條，人體各組織均有轉(zhuǎn)化生長因子β（TGFβ）誘導(dǎo)早期生長反應(yīng)基因（NM-005655），上調(diào)了2.8倍，其可調(diào)節(jié)細(xì)胞生長分化。與信息相關(guān)的基因5條，主要表現(xiàn)為下調(diào)，如G蛋白信號調(diào)節(jié)因子1（RGS1）基因（NM-002922）下調(diào)了0.35倍，其是G蛋白結(jié)合受體復(fù)合物的重要調(diào)節(jié)和組成部分。溫針可促進氣血流通，使機體協(xié)調(diào)，起到全身調(diào)節(jié)作用。楊麗萍等［9］也以溫針治療腎陽虛骨關(guān)節(jié)炎,篩選出與免疫相關(guān)基因,其中上調(diào)基因5條,下調(diào)基因4條,上調(diào)基因主要有NCF1基因和CCR7基因,前者編碼嗜中性細(xì)胞因子,后者編碼G蛋白受體家族成員-趨化因子受體7。溫針治療下調(diào)基因CD97,其編碼一個EGF-TM7家族成員,并存在于大部分活化的白細(xì)胞表面的糖蛋白,有G蛋白偶聯(lián)特征。陳曉玲等［10］對一個典型的腎陽虛家系15個成員,以寡核苷酸雜交技術(shù)對其外周血單核細(xì)胞的差異表達(dá)譜分析研究,同時對血樣本進行血液生化、免疫指標(biāo)檢測,還設(shè)正常人10人作為對照,比較二者結(jié)果。盡管存在普遍的血液生化與免疫學(xué)指標(biāo)異常,但該腎陽虛寒證家族患者作為一個典型的陽虛寒證抽樣,經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理均未見顯著性差異。此提示檢測眾多血液生化、免疫指標(biāo),對整體性失調(diào)的證侯群,其臨床意義不大,故作為西醫(yī)臨床診斷所依仗的血液生化與免疫學(xué)指標(biāo),在諸如腎陽虛寒證等中醫(yī)證的診斷方面,參考意義不明顯。用5張北京博奧生物芯片中心生產(chǎn)的人全基因組表達(dá)譜芯片(2200個雜交點),來研究腎陽虛患者外周血紅細(xì)胞基因表達(dá)譜,結(jié)果:①典型腎陽虛證/正常對照組:上調(diào)基因100條,下調(diào)基因33條;②腎陽虛證/正常對照組:上調(diào)基因148條,下調(diào)基因31條;③典型腎陽虛證治療顯效者治療前/治療后:上調(diào)基因12條,下調(diào)基因47條;④典型腎陽虛證/正常配偶:上調(diào)基因66條,下調(diào)基因44條。這些基因主要為：物質(zhì)代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、能量代謝和免疫調(diào)節(jié)等,初步反映出腎陽虛證患者惡寒喜暖、肢冷倦臥、面色白等宏觀證候在微觀基因表達(dá)的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

2.2虛寒證

為了研究虛寒證與能量代謝的關(guān)系，陸明等［11］分別在四川和陜西選擇臨床較常見的虛寒證肢冷患者10例和4例，前者溫針治療（取穴同譚從娥等［8］）14d后，與對照組比較及治療前后自身比較，結(jié)果在4張芯片中患者1，2，3，4的差異表達(dá)基因分別為41條、246條、57條和70條。后者以有明顯肢冷者為實驗組，無肢冷者為對照組，比較二者，結(jié)果差異表達(dá)基因101條。在5張芯片中，共有重復(fù)差異表達(dá)基因30條，可查庫基因19條，其中與能量代謝相關(guān)基因占21.43%，說明肢冷與新陳代謝密切相關(guān)。吳斌等［12］對一虛寒證典型家系（3代16人）篩選出虛寒證患者5人作為實驗組，正常人5人做對照組，采集其外周血，抽提其細(xì)胞RNA行基因芯片檢測，芯片采用上海博星公司的BiostarH-40ScDNA表達(dá)譜芯片。結(jié)果：篩選出差異基因79條，主要有與新陳代謝有關(guān)的基因占56.04％，與細(xì)胞生理過程有關(guān)的占40.66％，與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的占29.67%,與生物的生理過程有關(guān)的占15.38%,表明虛寒證集中于代謝基因的異常表達(dá)。另外，還涉及15條路徑：其中人脂蛋白酶mRNA(Hs.180878)明顯低表達(dá)，其主要功能為水解循環(huán)乳糜微粒的三酰甘油和極低密度脂蛋白，涉及了脂肪代謝路徑。為研究OA虛寒證的基因表達(dá)譜，選擇患者8例，同時選8例正常人為對照，采血提取細(xì)胞mRNA以北京博奧公司的22000點基因芯片檢測,結(jié)果篩選出差異表達(dá)基因75條,其中上調(diào)基因23條,下調(diào)基因52條［13］。研究發(fā)現(xiàn)與免疫相關(guān)基因7條如與嚴(yán)重OA的自身免疫機制密切相關(guān)的中性粒細(xì)胞因子1基因（NM-000265），可促使免疫細(xì)胞穿過外周組織并進入次級淋巴器官的趨化因子受體7基因（NM-001838），與免疫抑制相關(guān)的環(huán)孢素B受體基因（NM-000942）等。還有調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞生長分化的生長因子相關(guān)基因4，如轉(zhuǎn)化生長因子β、胰島素樣生長因子等，其參與細(xì)胞的有絲分裂，促進軟骨細(xì)胞增殖、分化和合成軟骨基質(zhì)。如調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分化的早期關(guān)鍵生長反應(yīng)因子3基因（NM-004430），激活轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-β1）的早期生長反應(yīng)因子1基因（NM-001964）,具有抑制表皮生長因子受體并在其溶酶體降解中具有重要作用的選擇性連接蛋白（NM-003100）等。還有Ras誘導(dǎo)衰老因子基因（AF438313）上調(diào)。與能量代謝低下相關(guān)基因5條，如構(gòu)成線粒體、呼吸鏈結(jié)構(gòu)的線粒體ATP合成酶運輸H＋的F1復(fù)合體亞家族基因（NM-001697）GTP酶激活蛋白的G蛋白信號調(diào)節(jié)因子2基因（NM-002923）等。由腎主骨、藏精氣、主生長發(fā)育，故OA發(fā)病與腎虛有密切關(guān)系，而腎虛時亦可出現(xiàn)一系列生長發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)異常。王米渠等［14］對寒證基因芯片的檢測數(shù)據(jù)提出了分析方法：①縱向發(fā)展的聚類分析（個體用藥后的連續(xù)追蹤，進而研究家系寒證）；②橫向互比的聚類分析（利用樹狀分層圖等分析有關(guān)證候的調(diào)查數(shù)據(jù)）；③分證候的聚類分析（如肢冷單個證候的療效分析）；④合寒證聚類分析（研究寒證證候變異主因素及其主效基因組之關(guān)系）。楊麗萍等［15］也對上述家系進一步做了能量代謝相關(guān)基因異常表達(dá)的探討，結(jié)果涉及新陳代謝基因達(dá)70.73％。

2.3心陽虛證

用基因芯片探討冠心病心陽虛證特征性基因表達(dá)譜，各采集5例患者和正常人外周血，抽提白細(xì)胞RNA行基因芯片檢測，并對5例患者做溫陽通痹治療，1例顯效，比較這1例治療前后差異基因表達(dá)。結(jié)果：5例患者與正常人比較，差異表達(dá)基因231條，其與典型患者（1例）治療前后的基因芯片差異基因譜中有39條差異基因表達(dá)一致，兩條差異基因表達(dá)相異。說明這39條基因的差異表達(dá)可能是冠心病心陽虛證發(fā)生的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。差異基因的功能分析表明：主要涉及代謝、細(xì)胞發(fā)育、分化相關(guān)和免疫應(yīng)答相關(guān)基因，部分闡釋了冠心病心陽虛證的病理機制［16］。

2.4肺虛證

對慢性阻塞性肺疾病（COPD）肺氣虛和肺陰虛患者各4例及正常人4例采集其外周血，抽提淋巴細(xì)胞RNA行基因芯片檢測。結(jié)果篩選出肺氣虛/正常人45條差異表達(dá)基因，其中41條基因上調(diào)，4條基因下調(diào)；肺氣虛/肺陰虛差異表達(dá)基因43條，其中上調(diào)基因27條，下調(diào)基因16條。主要涉及免疫相關(guān)基因和酶相關(guān)基因。由此可見，肺氣虛證實質(zhì)主要是與免疫相關(guān)基因表達(dá)譜的改變［17，18］。

2.5脾虛證應(yīng)用基因芯片技術(shù)研究利血平脾虛證大鼠模型大腦皮層基因表達(dá)譜的改變，選取雌性的Wistar大鼠30只，分為造模組和對照組。造模組用利血平注射液背部皮下注射，于第14天處死，取大腦皮層，抽提mRNA行基因芯片檢測，結(jié)果篩選出差異表達(dá)基因145條，占檢測基因的3.54％。在已知的47條基因中,11條與免疫、應(yīng)激和炎癥反應(yīng)有關(guān)，7條與能量代謝有關(guān),與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)/轉(zhuǎn)錄有關(guān)和與細(xì)胞生長和分化有關(guān)的各為6條,5條與蛋白質(zhì)合成有關(guān)，各為3條的是與DNA合成、修復(fù)有關(guān)的，與神經(jīng)退行性疾病有關(guān)的，與神經(jīng)遞質(zhì)傳遞和釋放有關(guān)的基因，兩條基因與離子通道和轉(zhuǎn)運體有關(guān)的基因［19］。用4張基因芯片探討脾氣虛證免疫相關(guān)基因組學(xué)機制，選擇脾氣虛證慢性胃炎和潰瘍性結(jié)腸炎病例及正常人各3例，分別采集其外周血，提取白細(xì)胞RNA行基因芯片檢測，結(jié)果慢性胃炎脾氣虛證和潰瘍性結(jié)腸炎脾氣虛證異常表達(dá)的免疫相關(guān)基因分別為68條和57條，二者相同的差異表達(dá)基因為7條，主要是與免疫相關(guān)的基因。提示脾氣虛證發(fā)生有其免疫相關(guān)基因組學(xué)基礎(chǔ)，是細(xì)胞免疫、體液免疫以及非特異性免疫功能等方面發(fā)生功能紊亂［20］。

2.6寒熱證

2.6.1類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）在33例RA患者中探討活動期和非活動期RA寒熱證候的基因表達(dá)差異，分別采集患者和正常人靜脈血，純化得CD4＋T淋巴細(xì)胞，用基因芯片進行檢測。結(jié)果篩選出活動期和穩(wěn)定期差別基因63條，主要涉及免疫應(yīng)答，穩(wěn)定期RA寒熱證患者篩選出48條差異基因，只有4條基因與上述63條基因重復(fù)，活動期RA寒熱證有59條差異基因，但與上述基因不重復(fù)，二期均主要涉及功能代謝基因。提示RA患者穩(wěn)定期和活動期的表達(dá)基因差異與寒熱證候的基因表達(dá)差異不一致。說明RA分期與中醫(yī)寒熱證候分類都有各自的基因組學(xué)基礎(chǔ)［21］。在這些病例中還進行了RA類風(fēng)濕因子（RF）陰性和陽性與其寒熱證分類的比較，結(jié)果RF陰性和陽性間有55條基因表達(dá)差異，主要涉及免疫應(yīng)答；RF陽性和RF陰性RA寒熱證患者各有71條和70條基因異常表達(dá)，前者主要涉及功能代謝和免疫應(yīng)答，后者主要涉及功能代謝，與上述55條基因無重復(fù)，但與前者71條基因有兩條基因重復(fù)。說明以RF陽性和陰性分型與中醫(yī)寒熱證分類的基因表達(dá)并不一致，都有各自的基因組學(xué)基礎(chǔ)［22］。同樣還有以RA早期和非早期差異基因與正常人基因表達(dá)比較，結(jié)果RA早期和非早期患者外周血CD4+T淋巴細(xì)胞基因表達(dá)存在明顯差異,與正常人比較的差異基因與RA早期和非早期比較的差異基因不一致［23］。在5例活動期RA患者和3例正常人間比較RA患者外周血單核細(xì)胞基因表達(dá)差異,結(jié)果篩選出差異表達(dá)基因151條,主要涉及炎癥/免疫反應(yīng),特別是與IgG及其免疫復(fù)合物結(jié)合的Fc受體(FcγR)高表達(dá),其與RA初始階段炎癥激活及其后的炎癥級聯(lián)反應(yīng)、慢性持續(xù)性炎癥和關(guān)節(jié)破壞密切相關(guān)［24］。

2.6.2系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）對4例熱毒熾盛型、5例陰虛內(nèi)熱型的SLE患者和6例正常人采集外周血，抽提白細(xì)胞RNA行基因芯片（7500余雜交點）檢測，結(jié)果：篩選出差異表達(dá)基因89條，其中上調(diào)基因45條，下調(diào)44條，涉及細(xì)胞因子及其受體相關(guān)基因、免疫相關(guān)基因、信號傳導(dǎo)和傳遞蛋白、離子通道和轉(zhuǎn)運蛋白、蛋白翻譯合成等。總的表達(dá)模式為免疫細(xì)胞對干擾素應(yīng)答增高，免疫細(xì)胞蛋白質(zhì)合成受抑，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡增加等。9張芯片的聚類分析表明，4例熱毒熾盛型和5例陰虛內(nèi)熱型患者各歸為一類。前者處于SLE中、重度活動期，其代謝相關(guān)基因、急性時相炎癥反應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)水平明顯高于后者［25］，盡管不同患者存在個體差異［26］。

基因芯片研究是全景式研究，使人們從整個細(xì)胞的角度觀察已知基因在研究者設(shè)立的條件下整體表達(dá)情況，其與其他分子生物學(xué)方法結(jié)合起來將會使研究更廣闊［27］。中醫(yī)擅長宏觀的整體性功能調(diào)節(jié)，而在微觀其也是從整體上調(diào)節(jié)對立雙方的基因功能，亦即從修飾或改變基因的表達(dá)與基因產(chǎn)物的功能著手，而不是改變與糾正基因的結(jié)構(gòu)［28］。問題的關(guān)鍵是要找出不同證候的具有特征意義的差異表達(dá)基因，基因芯片技術(shù)為此提供了有力的工具。

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