細胞原位雜交方法研究論文

導語：細胞原位雜交方法研究論文一文來源于網友上傳，不代表本站觀點，若需要原創文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

摘要目的：建立NPYmRNA的細胞原位雜交檢測方法，并以NGF為誘導因子研究Dex對大鼠嗜鉻細胞瘤PC12細胞中NPYmRNA表達的影響。方法：采用細胞原位雜交方法。結果：NGF具有誘導NPY基因表達的生物學效應且呈劑量效應關系；Dex對NPYmRNA表達具有雙相調節效應，即早期(<8h)可促進NGF的誘導作用，而晚期(>16h)則具有抑制作用(P<0.01)，但單獨Dex對NPYmRNA表達無顯著影響。結論：可以用細胞原位雜交方法檢測NPYmRNA在細胞中的表達。

關鍵詞神經肽Y細胞原位雜交mRNA

TheexpressionofNeuropeptideYmRNAinPC12celllinesdetectedbyinsituhybridization

ZHANGLiang-Lin,YANGGui-Zhen.

DepartmentofImmunology,NormanBethuneUniversityofMedicalSciences,Changchun130021

AbstractObjective:TheexpressionofNeuropeptideY(NPY)mRNAwasdetectedinPC12.Method:Cellularinsituhybridization.Results:NGFcaninducetheexpressionofNPYmRNAinPC12cellswiththerelationshipsofdosage-effectandtime-effect.Dexamethasone(Dex)potentiatedsignificantly(P<0.01)thestimulationbyNGFatearlytimes(<8h),butstronglysuppressed(P<0.01)itatlatertimes(16h).TheresultsalsoappearedthatNPYmRNAabundancecouldntbeeffectedbyDexalone.Conclusion:ThedetectionofexpressionNPYmRNAcanusemethodofcellularinsituhybridization.

KeywordsNeuropeptideYInsituhybridizationmRNA

NPY具有廣泛的生物學活性并參與機體的多種病理生理過程，其在體內表達異常與許多疾病關系密切，但機制未明，因此開展NPY基因表達調控的研究對深入地認識其在疾病發生、發展和轉歸過程中的作用具有較重要的理論和臨床意義。在本室系列工作的基礎上［1-4］，本文建立了NPY基因表達的細胞原位雜交檢測方法，并初步開展NPY基因的表達調控研究。

1材料與方法

1.1材料PC12細胞(中科院上海細胞所細胞庫)。隨機引物標記試劑盒(Promega公司)；〔α-35S〕dATP(杜邦公司)；rhNGF(邦定生物醫學公司)，蛋白酶K、RNaseA(Sigma公司)，核4乳膠(北京原子能研究所)，地塞米松(Dex)、去離子甲酰胺、APES和多聚甲醛(華美公司)，小牛血清(杭州四季青)，馬血清(解放軍農牧大學)，IMDM(GIBCO公司)。OlympusPM-10AD顯微鏡。TA-NPY質粒由本室保存。

1.2探針制備常規方法擴增質粒后回收NPYcDN段，按隨機引物標記試劑盒說明制備35S-NPYcDNA探針，純化后-20℃保存備用。

1.3細胞培養PC12細胞置含5%小牛血清、10%馬血清的IMDM中培養后，接種于24孔培養板(1×106/孔)，加不同刺激物作用不同時間后，收集細胞用于標本制備。

1.4細胞內mRNA原位雜交

1.4.1載玻片和蓋玻片的預處理載玻片經清洗潔凈后于180℃烤4h以上，涂APES(按1∶49比例用丙酮配制)，室溫涼干后置-20℃保存備用。蓋玻片經硅化液浸泡10min，95%乙醇沖洗，180℃烘烤4h以上備用。

1.4.2細胞標本制備用0.01mol/LPBS(pH7.4)洗細胞懸液2次，調細胞數至1×105ml-1，混勻后取0.1ml用Cytospin離心涂片，室溫自然涼干后于4%多聚甲醛固定10min，轉移至0.01mol/LPBS(pH7.4)10min，經系列酒精脫水，-20℃保存備用。

1.4.3原位雜交標本過95%、80%、70%序列乙醇，DEPC處理過后用ddH2O沖洗，然后依次加入0.2mol/LHCl室溫20min、2×SSC70℃30min、蛋白酶K混合液(1μg/ml蛋白酶K、200mmol/LTrisHClpH7.4、20mmol/LCaCl2)37℃15min，序列乙醇脫水涼干。將雜交液〔50%甲酰胺、100mmol/LTrisHCl(pH7.5)、1mmol/LEDTA、600mmol/LNaCl、10×Denharts溶液、變性魚精DNA(10μg/ml)和tRNA(250μg/ml)、標記探針(1×105cpm)〕30μl滴于標本上，蓋上硅化的蓋玻片或用新的parafilm于濕盒中37℃保溫16～18h。雜交結束后用2×SSC洗蓋玻片，在50%甲酰胺和2×SSC混合液中于37℃洗3次，每次10min；換50%甲酰胺和1×SSC于37℃洗3次，每次10min；1×SSC室溫洗3次，每次10min，經序列乙醇脫水涼干。

1.4.4放射自顯影將標本涂核4乳膠，待干后于4℃自顯影5～7d，經D19顯影F5定影。流水沖洗后做HE染色，顯微鏡下鏡檢計數。

1.5結果判定及統計學處理結果判定以計數20個細胞內的銀粒數計算平均值，進行t檢驗。

2結果

2.1細胞原位雜交方法的特異性為確定本方法檢測NPYmRNA的特異性，特設立不同對照組包括未加刺激物的空白對照組、RNaseA消化組和無探針對照組(見圖1)。結果表明，未加任何刺激物的細胞內銀粒數較低(4.87±1.45)，而經NGF(50ng/ml)刺激(24h)后銀粒數顯著增高(38.61±7.76)(與對照組比P<0.01，n=20)；后者經RNaseA酶(25μg/ml)處理30min后發現銀粒數(16.88±5.26)顯著低于未經RNaseA消化組(P<0.01，n=20)；而雖然NGF刺激但未加NPYcDNA探針組則只有少數細胞出現了1～3個乳膠非特異顯影形成的銀粒(1.41±1.09)。

2.2NGF劑量與NPYmRNA表達的相關性PC12細胞經不同劑量NGF刺激24h后，雜交結果顯示：隨著劑量增高細胞質中的銀粒數相應增加，具有明顯的劑量效應關系(r=0.9950，P<0.01)，見圖2。提示NGF具有誘導PC12細胞NPY基因表達的生物學效應。另外亦觀察到隨著NGF濃度增加，PC12細胞軸突長出的長度增加。

2.3NGF誘導NPY基因表達的時間效應及Dex對NGF刺激的調節作用PC12細胞達50%融合度時用NGF(60ng/ml)和/或Dex(1μmol/L)處理不同時間，包括長時程(1、2、3、4、5、6d)和短時程(1、2、4、8、16、32h)，原位雜交結果顯示短時程時，NGF的刺激作用與NPYmRNA表達具有明顯的時間效應關系：Dex單獨作用不明顯，但對NGF的誘導作用具有雙相調節效應，即早期(<8h)具有顯著促進作用(P<0.01)，而晚期(>16h)則抑制NGF的刺激作用(P<0.01)，見圖3。長時程時，NGF的刺激作用仍具有時間效應關系，在第4天后出現“平臺”；Dex與NGF聯合作用時可下調NGF的誘導作用，而單獨Dex則提高NPYmRNA表達水平，但并無顯著差異，見圖4。

3討論

細胞原位雜交方法涉及細胞生物學和分子生物學兩方面技術，在保持細胞形態完整情況下與待檢細胞內特定的未知核酸序列相結合，直接觀察單個細胞內特定基因表達水平，所需樣品量少(104細胞即可)，mRNA表達相對較低時更為實用，故該方法用于體外較難培養的細胞(如神經細胞)中基因表達的研究則更實用。本文建立的NPYmRNA表達的細胞原位雜交檢測方法，通過建立陽性、陰性對照及RNaseA加NGF作用組，結果顯示這一方法的準確性和可靠性。目前檢測原位雜交結果(包括細胞和組織原位雜交)國外已較普遍使用圖像掃描分析進行定量；國內目前尚未普及，大多仍采用顯微鏡(油鏡)下計數銀粒的半定量方式統計原位雜交檢測結果。本文在研究過程中采用盲法以三人計數結果的平均值為準，每份標本計數20個細胞內的銀粒數，求均值后進行統計學分析，以排除主觀因素的干擾。

機體內NPY基因表達異常與多種疾病有關，如近年研究顯示NPY參與肥胖基因表達調控，提示對NPY基因表達調控研究具有重要的理論和臨床意義。本文建立NPYmRNA原位雜交檢測方法為進一步基因表達調控研究打下了基礎。

用細胞原位雜交方法檢測NPYmRNA在PC12細胞中的表達本課題受國家自然科學基金資助(39370622)

張亮林通信地址：中科院上海生化所55號信箱，上海200031

作者簡介：張亮林，男，33歲，醫學博士，現為中科院上海生化所博士后

作者單位：(白求恩醫科大學免疫教研室，長春130021)

4參考文獻

1麻彤暉，于永利，楊貴貞.大鼠NPY前體融合蛋白在大腸桿菌中的超表達.中國免疫學雜志，1994；10(5)：298

2張亮林，楊貴貞.大鼠神經肽YcDNA克隆、測序及哺乳動物細胞表達載體的構建.中國免疫學雜志，1996；12(2)：1

3張亮林，楊貴貞.截肢應激大鼠HPAA-脾靶器官中NPY陽性細胞數的變化.中國神經免疫學和神經病學雜志，1996；1(1)：23

4張亮林，楊貴貞.大鼠神經肽Y基因在COS-7細胞中的表達.中國免疫學雜志，1996；12(6)：331