骨髓內皮細胞增殖研究論文

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【摘要】本研究以內皮細胞培養液（EndoM）培養小鼠骨髓內皮細胞，探討粒巨噬系集落刺激因子（rmGMCSF）對骨髓內皮細胞增殖的影響。用EndoM培養小鼠骨髓內皮細胞，通過WrightGiemsa染色計數內皮細胞集落、應用免疫熒光法觀察內皮細胞表型；加入不同濃度的GMCSF，通過集落形成率、MTT法和流式細胞術檢測內皮細胞生長周期，觀察GMCSF對內皮細胞體外擴增的影響。結果表明：EndoM誘導的骨髓細胞可以生成內皮細胞集落，vWF檢測呈陽性；集落形成率檢測及MTT法測定均證實GMCSF對內皮細胞的增殖具有明顯的促進作用；生長周期檢測結果顯示，GMCSF處理組的細胞進入S期的比率為9.3%，而對照組為2.1%，說明GMCSF可以通過促使內皮細胞進入S期而加快細胞的分裂，促進細胞增殖；比較第1代和第4次傳代后細胞的生長曲線，兩者無明顯差別，說明多次傳代后的細胞仍保持傳代早期的增殖潛能。結論：GMCSF對內皮細胞的增殖具有促進作用，經多次擴增傳代后內皮細胞的增殖潛能無明顯改變。

【關鍵詞】骨髓內皮細胞GMCSF細胞增殖

EffectsofGranulocyteMacrophageColonyStimulatingFactoronGrowthofMurineBoneMarrowEndothelialCells

AbstractThepurposeofthisstudywastoinvestigatetheeffectsofgranulocytemacrophagecolonystimulatingfactor(GMCSF)onthegrowthofmousebonemarrowendothelialcells.Endothelialcellculturemedium（EndoM）wasusedtoculturemurinebonemarrowendothelialcells.EndothelialcellcolonieswerecountedundermicroscopebyWrightGiemsastaining.TheeffectofdifferentconcentriationofGMCSFontheproliferationofbonemarrowendothelialcellswasobservedbytheformationofendothelialcellcolonies,MTTandflowcytometry.TheresultsindicatedthattheendothelialspecificmarkervWFwasexpressedbythecolonycells,GMCSFpromotedtheproliferationofbonemarrowendothelialcellcoloniesandMTTconfirmedtheeffectofGMCSFonpromotingtheproliferationofbonemarrowendothelialcells.TheresultofdetectingcellcycleshowedthattherateofcellsenteringintoSphasewas9.3%inGMCSFaddedgroupandtherateofcellsenteringintoSphasewas2.1%incontrol.Therewasnosignificantdifferenceincellgrowthcurvebetweenthefirstpassageandfourthpassage.ItisconcludedthatGMCSFcanpromotetheproliferationofbonemarrowendothelialcells,theproliferationpotentialofbonemarrowendothelialcellsbetweenthefirstandfourthpassagenosignificantlychanges.

Keywordsbonemarrowendothelialcells;GMCSF;proliferation

JExpHematol2007;15(3):622-625

目前，已有許多報道證明內皮細胞（endothelialcells,EC）、內皮祖細胞（endothelialprogenitorcells,EPC）可以用來治療缺血性心臟病以及各種疾病引起的肢體缺血［1,2］也可以用于組織工程的血管構建［3］，并取得了一定的成果。Kawamoto等［4］報道，EPC對缺血心臟病進行治療具有良好的效果，一方面減少了缺血組織的面積，同時改善了心臟的功能。Kalka等［5］則報道了利用EPC對肢體缺血的小鼠模型進行治療，實驗結果表明了EPC能顯著增加缺血肢體的灌流，而且組織學檢查發現缺血部位毛細血管的數目也大大增加。內皮細胞的來源有多種，可以從外周血、臍血及骨髓中獲得［6］，而外周血中的內皮祖細胞來源于骨髓。從病人自體的骨髓中獲得內皮細胞，一方面來源比較方便，而且也可以避免GVHD的發生。但是由于骨髓基質細胞種類多，難以分離純化骨髓內皮細胞或內皮祖細胞。本研究用本實驗室配制的內皮細胞培養液（EndoM）體外培養小鼠骨髓細胞，分離純化骨髓內皮細胞及內皮祖細胞，并觀察粒巨噬系集落刺激因子（rmGMCSF）對小鼠骨髓內皮細胞體外增殖的影響以及體外增殖后內皮細胞增殖機能的改變，這對臨床運用內皮細胞或內皮祖細胞治療疾病有一定的指導意義。

動物

昆明小鼠，由中南大學湘雅醫學院動物學部提供，雌雄不限，普通飲食。

主要試劑和儀器

IMDM為Gibco公司產品；新生牛血清購自杭州四季清生物制品研究所；重組小鼠粒巨噬細胞集落刺激因子（rmGMCSF）為R&D公司產品；vWF抗體、CY3標記的羊抗兔IgG為Sigma公司產品；MTT、二甲基亞砜（DMSO）為Sigma公司產品；酶標儀為Awarens公司產品；CO2培養箱購自美國Forma。

小鼠骨髓內皮細胞及內皮細胞集落的培養

用頸椎脫臼法處死小鼠，在無菌條件下取出股骨，用IMDM沖出骨髓細胞，制成單細胞懸液，取1×106個小鼠骨髓單個核細胞種入1ml含有15%新生牛血清的EndoM培養體系，置于24孔板中，于37℃、5%CO2、飽和濕度下培養5天后,用胰蛋白酶消化，制成單細胞懸液，按每孔1×104個細胞種入24孔板，每組3孔。于二氧化碳培養箱內培養15天后計數內皮細胞集落數，以≥50個細胞的聚合計為1個集落。

內皮細胞的形態觀察及vWF的檢測

培養的骨髓內皮細胞集落經WrightGiemsa染色后，顯微鏡下觀察內皮細胞形態。用間接免疫熒光法檢測骨髓內皮細胞vWF。將內皮細胞培養于24孔板內放置的蓋玻片上，當細胞間沒有明顯的間隙時，取出蓋玻片，用PBS清洗，用4%的多聚甲醛固定30分鐘，用PBS洗3次：2%的正常羊血清封閉4小時，加入vWF抗體，4℃過夜，用PBS洗3次，加入二抗CY3IgG，37℃孵育60分鐘,PBS洗3次：置于熒光顯微鏡下觀察。以本室建的小鼠骨髓內皮細胞株［7］為陽性對照，骨髓成纖維細胞為陰性對照。

不同濃度的GMCSF對小鼠骨髓內皮細胞形成集落的影響

取純化的小鼠骨髓內皮細胞培養于24孔板中，每孔5000個細胞，在基本培養體系（含1%濃度EndoM）的基礎上分別加入5、10、25ng/ml的rmGMCSF，對照組不加入GMCSF，每組3孔。置于CO2培養箱培養15天，于倒置顯微鏡下記數集落數，≥50個細胞的聚合計為1個內皮細胞集落。

GMCSF對內皮細胞增殖影響的MTT法測定

將純化的小鼠骨髓內皮細胞按5000個/孔培養于96孔板，每孔0.2ml，每組3孔。實驗組培養體系中分別加入5、25、100ng/ml的rmGMCSF，對照組內不加。在37℃、5%CO2、飽和濕度下分別培養5天和10天，取出培養板吸去培養液，然后加入無血清的IMDM180μl和20μlMTT溶液，放入培養箱孵育4小時，吸去液體，各孔加入DMSO150μl，振蕩10分鐘，使結晶充分溶解。選擇492nm波長，在酶標儀上測定各孔的光吸收值（OD492）。

生長曲線

純化的小鼠骨髓內皮細胞培養于96孔板中，每孔5000個細胞，加0.2ml含15%新生牛血清的基本培養液，并加入25ng/ml的rmGMCSF。共種6組，每組3孔，培養5天后，分別于第7、9、11、13、15天用胰酶消化后計數細胞，每次3孔，求平均值，做出生長曲線。按公式DT=t×1g2/(1gN-1gN0)算出第1代內皮細胞生長的倍增時間。

細胞周期的流式細胞術檢測

無菌條件下取小鼠骨髓單個核細胞，按2×106個細胞種于6孔培養板中（2ml培養體系中含15%新生牛血清的EndoM），置于37℃、5%CO2、飽和濕度下培養5天，然后吸去培養液，加入兩種不同培養體系，對照組加含15%新生牛血清的IMDM，實驗組加15%新生牛血清的IMDM和100ng/ml的rmGMCSF，每組各10孔，置于CO2培養箱培養3天后，用胰酶消化細胞，200×g,離心5分鐘，用PBS洗滌細胞2次之后，用300μlPBS重懸細胞，加入冰冷的乙醇（-20℃）約700μl（終濃度為70%），將細胞放于-20℃過夜處理后，用流式細胞儀檢測細胞周期。

細胞傳代培養

取小鼠骨髓單個核細胞，按2×106個細胞種于6孔培養板中（2ml體系中含15%新生牛血清的EndoM），置于37℃、5%CO2、飽和濕度下培養5天，然后吸去培養液，加入15%新生牛血清的IMDM培養液和100ng/ml的rmGMCSF，促使細胞融合，再按1∶4傳代于6孔板中，同樣加入15%新生牛血清的IMDM和100ng/ml的rmGMCSF，等細胞生長至融合，按1∶4傳代，加入相同培養體系。按上述方法傳4代后，繪制生長曲線，方法同前。公式DT=t×1g2/(1gN-1gN0)算出第4代內皮細胞生長的倍增時間，并與第1代的倍增時間進行比較。

統計學處理

實驗數據為3次結果，以mean±SD表示。不同處理組兩組間比較采用t檢驗，應用SPSS軟件分析，P<0.05表示有統計學意義。

結果

細胞形態每孔種入小鼠骨髓內皮細胞5000個，對照組加基礎培養液,實驗組在基礎培養液的基礎上分別加入rmGMCSF5、10、25ng/ml。與對照組相比，實驗組集落數均明顯增多（圖3），說明rmGMCSF對小鼠骨髓內皮細胞的增殖有明顯刺激作用。

rmGMCSF對內皮細胞增殖的影響

小鼠骨髓內皮細胞培養5、10天，分別進行MTT的檢測，結果表明rmGMCSF對小鼠骨髓內皮細胞生長促進作用明顯，各組與對照組相比差異顯著（P<0.01）（圖4）。

GMCSF對EC細胞周期的影響

運用流式細胞儀檢測細胞周期，觀察GMCSF對EC細胞周期的影響。結果顯示GMCSF使細胞進入S期的比例為9.3%，與對照組2.1%相比有明顯差別。此結果說明GMCSF能夠促使細胞進入S期，加快細胞的分裂，從而促進了細胞的增殖（圖5）。Figure5.EffectofGMCSFoncellcycleofendothelialcells.A:grouptreatedbyGMCSF.B:controlgroup.

體外擴增傳代對內皮細胞增殖的影響

圖6為小鼠骨髓第1代和第4代內皮細胞的生長曲線。利用計算公式［DT=t×1g2/(1gN-1gN0)］計算出第1、4代細胞生長的倍增時間分別為30.25±0.55小時、31.67±0.26小時。第1代與第4代的細胞倍增時間相比，無明顯差異，表明經體外擴增傳代4次，仍能保持傳代早期的增殖潛能。

Figure6.Growthcurveofthefirstandfourthpassagegenerationsofmurineboneendothelialcells.討論

國內外對于骨髓內皮細胞的純化報道較少，但已經進行了一些關于細胞因子對內皮細胞增殖影響的研究，如Yonekura等［8］報道VEGF可以促進內皮細胞的增殖，Rieck等［9］則報道bFGF可促進角膜內皮細胞的生長。我們此前曾報道了VEGF、bFGF、SCF、IL6、GMCSF等對內皮細胞株的增殖有促進作用［10］。GMCSF對未經轉化的骨髓內皮細胞增殖的作用尚未見報道。本研究中，我們用本室配制的培養基在較短的時間內純化了小鼠的骨髓內皮細胞，vWF為陽性，并在此基礎上觀察了GMCSF對骨髓內皮細胞增殖的影響。應用基本培養基培養內皮細胞集落時，形成的集落數較少，加入rmGMCSF后，集落生成明顯增多。MTT的結果亦支持GMCSF對小鼠骨髓內皮細胞生長的刺激作用。細胞生長曲線的結果表明，在含GMCSF培養的條件下，內皮細胞生長的倍增時間為30.25±0.55小時，經4次傳代后細胞倍增時間無明顯延長，表明體外培養擴增4代后，細胞仍能保持早期的增殖能力，GMCSF對骨髓內皮細胞的體外增殖有明顯刺激作用。文獻報道內皮細胞表面有GMCSFR的存在，而內皮細胞本身也可以分泌GMCSF［11］。結合細胞周期測定的結果，可以認為，GMCSF促內皮細胞增殖的機制可能是GMCSF與GMCSFR結合，通過細胞內信號傳遞使更多的細胞進入S期來實現的。

【參考文獻】

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