骨髓干細胞修復研究論文

時間:2022-03-18 12:49:00

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骨髓干細胞修復研究論文

【摘要】探尋體外誘導骨髓基質干細胞成軟骨細胞的最佳細胞因子,尋求體內修復家兔軟骨缺損的最為有效方案。[方法]rhFGF1、rhTGF-β1、rhIGF-I單獨或聯合應用對骨髓基質干細胞進行體外誘導培養,應用常規染色、MTT、免疫組織化學染色的方法篩選誘導骨髓基質干細胞成軟骨細胞的最佳細胞因子,并將其與骨髓基質干細胞復合于纖維蛋白凝膠制成凝膠復合物,直接種植到兔膝關節實驗性關節軟骨缺損處,并與對照組相比較,觀察軟骨修復效果。[結果]常規形態學觀察,rhTGF-β1和rhIGF-I聯合應用誘導的細胞在形態上類似于軟骨細胞,免疫組化染色提示誘導細胞具有軟骨細胞表型。凝膠復合物直接種植在體內能誘導骨髓基質干細胞向軟骨細胞分化,修復缺損的軟骨,缺少細胞因子的對照組軟骨缺損修復效果差。[結論]rhTGF-β1和rhIGF-I聯合應用可作為誘導骨髓基質干細胞向軟骨細胞分化的最佳組合,骨髓基質干細胞凝膠復合物能修復軟骨缺損。

【關鍵詞】細胞因子骨髓基質干細胞軟骨細胞軟骨缺損

Abstract:[Objective]Toretrievalabestcellfactorwhichcaninducebonemarrowstromalcells(bMSCs)intochondrocyteinvitroandtoexploreaneffectiveplantorepairrabbit''''schondrocytedefect.[Method]IsolatedbMSCswereculturedinvitro.rhFibroblastGrowthFactor1(rhFGF-1)、rhTransformingGrowthFactor-β1(rhTGF-β1)、rhInsulinlikeGrowthFactor-Ⅰ(rhTGF-Ⅰ)wereutilizated.TheproliferationofcellswasdetectedbyMTTassay,andthemacroscopichistology,HEstainingandimmunohistochemicalexaminationswereperformedtoseekthebestcellfactor.Invivo,toinvestigatetherepairofthearticularcartilage,bMSCscombinedwithfibringlueandrhTGF-β1、rhIGF-Iwascomparedwithcontrolgroup.[Result]ThecellsinducedbyrhTGF-β1andrhIGF-Iweresimilartochondrocytesinmorphology,andimmunohistochemicalexaminationsshowedthecellspossessedphenotypeofchondrocytes.RhTGF-β1andrhIGF-Icoulddifferentiatebonemarrowstromalcellsintocartilagecellsinvivo,andrepairthearticularcartilagedefect.Thecontrolgroupcouldnotrepairthearticularcartilagedefectefficiently.[Conclusion]rhTGF-β1andrhIGF-IarebestgroupwhichstimulatebMSCstodifferenateintocartilagecells.BMSCscombinedwithfibringlueandrhTGF-β1、rhIGF-Icanrepairthearticularcartilagedefect.

Keywords:cellfactor;bonemarrowstromalcells;chondrocyte;cartilagedefect

作者簡介:童培建(1961-),男,杭州人,教授,主任醫師,在讀博士研究生,研究方向:關節外科,(電話)0571-87070956骨髓基質干細胞(BMSCs)中含有少量的多功能基質干細胞,能向成骨系細胞、成軟骨系細胞分化[1],為骨、軟骨組織的損傷提供了潛在的修復可能。臨床軟骨缺損自行修復的效果較差,可能跟軟骨損傷局部BMSCs的含量少有關。因此作者通過對BMSCs在體外擴增培養、應用不同的細胞因子進行誘導,從中尋找體外促進骨髓基質干細胞增殖分化的最佳條件,并將細胞因子與骨髓基質干細胞復合于纖維蛋白凝膠制成凝膠復合物,植入缺損處,探討體內修復家兔軟骨缺損的效果。

1材料與方法

1.1骨髓基質干細胞的取材與培養

取新生紅皮胎兔2只(24h內),置入濃度為75%的酒精中浸泡消毒5min,在超凈工作臺中,無菌分離四肢長骨骨干,剔除軟組織,在10%的DMEM培養液中剖開骨干,反復吹打髓腔。將細胞懸液移入離心管中,加入Hank''''s液至10ml,平衡,1500r/min離心10min,棄上清,加入10%DMEM,反復抽吸吹打均勻,計數,按1×107接種于25ml培養瓶中,37℃5%飽和濕度培養箱中常規培養。5d后首次全量換液,以后每3d換液1次,待細胞融合至80%時,0.25%胰蛋白酶常規消化,按1:3比例傳代培養。逐日倒置顯微鏡觀察培養細胞的生長情況。

1.2體外實驗分組

實驗分組如下:rhFGF-1組(簡稱F組);rhIGF-Ⅰ組(簡稱I組);rhTGF-β1組(簡稱T組);rhFGF-1rhIGF-I組(簡稱FI組);rhFGF-1rhTGF-β1組(簡稱FT組);rhIGF-IrhTGF-β1組(簡稱IT組);rhFGF-1rhIGF-IrhTGF-β1組(簡稱FIT組);對照組(不加任何試劑)。其中rhFGF-1濃度為10μg/L;rhIGF-I濃度為10μg/L;rhTGF-β1I濃度為5μg/L。

1.3MTT比色法測定

取第2代骨髓基質干細胞以1×104/ml接種到96孔培養板上,共4塊,常規培養24h。待細胞完全貼壁后,棄上清液,將每塊孔板隨機分組,每組8孔,按實驗分組添加相應的細胞因子,分別于第1、3、6、9d各取孔板1塊,進行MTT檢測:即每孔加50mg/ml的MTT液20μl,常規培養4h,棄廢液,0.1%PBS液清洗1次,加入二甲亞砜,每孔150μl,靜置20min后,用酶標儀測定波長為490nm的吸光度值。

1.4體外細胞形態學觀察

將細胞進行HE、Ⅱ膠原免疫組化測定(ABC法),倒置顯微鏡下觀察。

1.5纖維蛋白凝膠復合體的制備

傳代培養的骨髓基質干細胞經0.1%胰蛋白酶+0.02鞹A消化后,1000r/min離心10min濃集,進行細胞計數。制成單細胞懸液,與纖維蛋白原溶液混勻。使纖維蛋白原和骨髓基質干細胞的終濃度分別為2.5g/L和5×106/ml,每毫升再加入rhTGF-β15ng/5μl和rhIGF-I50ng/50μl。然后加入凝血酶20U/ml。制成凝膠備用(2h內使用)。

1.6體內實驗分組

32只家兔,雌雄不限,隨機分為4組。無菌條件下后肢右股骨髁滑車關節面鉆孔,直徑3.5mm、深3.0mm,達軟骨下骨。干細胞復合體組:缺損中直接種植纖維蛋白凝膠復合體;單純凝膠復合體組:缺損植入未加細胞因子的凝膠復合體;骨髓基質干細胞注射組:缺損單純注射濃度為5×106/ml骨髓基質干細胞懸液0.5ml;空白組:缺損不作處理。不固定術肢,自由活動。分別于4、8、12周處死取材。標本10%福爾馬林固定。行HE、Masson三色、甲苯胺藍染色檢查。第12周標本行透射電鏡檢查。

1.7體內組織形態學評分

參照O''''Driscoll,KeeleyandSalter組織形態學評分標準。對實驗組和對照組修復組織形態學進行半定量評分(表2)。

1.8統計學處理

實驗數據用±s表示,顯著性檢驗采用t檢驗。P<0.05為差異有顯著性。使用SPSS11.5統計軟件進行數據統計處理。

2結果

2.1體外細胞形態學觀察

貼壁細胞呈梭形、紡錘形、多角形等,有不規則的生長突生出,細胞基質折光性強;4~5d后細胞形成集落狀,形態比較單一,基本上呈梭形或多角形;7~8d后形成單層。

首次傳代的細胞呈圓形,24h后恢復梭形,折光性好,細胞呈均勻生長,形態更加單一,基本呈梭形。8d后可鋪滿瓶底,形成單層結構,排列呈有規律的方向性(圖1)。經生長因子誘導的細胞,對照組、T組生長速度有所減慢,10d左右形成單層結構;IT組形態由梭形變為以扇貝形或多角形為主,細胞核深染(圖2);F組生長加快,在5d形成單層,形態以長梭形為主(圖3)。免疫組化染色顯示:細胞基質呈棕黃色,染色較均勻,證明Ⅱ膠原存在[2],部分細胞不著色(圖4)。細胞經蘇木素復染后可見細胞核深染,免疫組化染色后的細胞形態在鏡下成圓形、橢圓形或多角形,不同于前2代的細胞形態(圖5)。免疫組化染色(隨機鏡野)陽性率面積接近50%(圖4、6)。圖1p1代4×10圖2HE(IT組)10×40圖3HE(F組)10×20圖4免疫組化(IT組)10×20圖5免疫組化(IT組)10×40圖6免疫組化(IT組)10×20

2.2誘導細胞增殖測定(MTT)

第1、3dMSCs細胞處于增殖靜止期;細胞在第3d開始進入對數增殖期,細胞增殖迅速,以F組增殖最為顯著,第6d達到高峰;第9d多數實驗組進入增殖平臺期,增殖速度相對減緩,而IT組仍保持增殖的趨勢(見表1)。MTT測定3d時各組細胞均有不同程度的增殖;6d時F組、I組、FI組、FT組細胞增殖較快,與對照組相比,P<0.01,其它組細胞增殖速度不明顯;9d時,F組、FT組、FIT組與對照組相比有統計學意義(P<0.01);FI組P<0.05。表1生長因子在不同時間對MSCs的增殖活性的影響注:*與對照組比較P<0.05;**與對照組比較P<0.01;

2.3修復軟骨的大體觀察

術后4周,干細胞復合體實驗組標本可見缺損處由白色、半透明類軟骨樣組織所填充,與正常軟骨組織界限清楚,表面不光滑。術后8周,缺損處修復組織變成乳白色,半透明光滑組織,與周圍軟骨組織邊界開始變模糊。術后12周,缺損修復組織與周圍正常軟骨組織已基本難區分,表面平坦(圖7)。單純凝膠復合體組12周缺損呈乳白色,表面平坦,邊界模糊。骨髓基質干細胞注射組12周缺損處凹陷,肉芽組織生長(圖8)。空白組12周缺損處肉芽組織填充表面仍稍凹陷,與周圍正常軟骨組織界限仍清楚。

2.4修復軟骨HE染色

第12周干細胞復合體實驗組的修復軟骨與正常軟骨整合良好,各層結構清晰,新生軟骨細胞數量明顯增多,排列已經類似正常軟骨,潮線明顯,表面未見裂縫(圖9)。空白組修復組織內見少量的細胞,細胞形態異常,纖維組織填充。單純復合體組見細胞數量增多,形態正常,與周圍組織整合良好。

2.5修復軟骨Masson三色

干細胞復合體實驗組12周,軟骨細胞數量多,排列較前規則,軟骨表面光滑,與周圍組織整合良好,可見亮綠色膠原纖維,修復的軟骨與軟骨下骨質緊密結合。

2.6修復軟骨甲苯胺藍染色

干細胞復合體實驗組12周時,甲苯胺藍染色與正常軟骨接近,修復的組織呈現出均勻的異染性著色,軟骨深層染色濃,細胞形態大。單純凝膠復合體組,基質染色淺,細胞陷凹少。骨髓基質干細胞注射組,細胞較少,基質呈淺藍色(圖10)。空白組,細胞少,基質染色顏色淺藍色。

2.7修復軟骨電鏡檢查

干細胞復合體實驗組軟骨細胞具有典型的褶皺狀小突起,細胞周圍還可見到許多長纖毛,并延伸到細胞外基質中。高倍電鏡顯示干細胞復合體實驗組的修復軟骨細胞細胞核增大,核內常染色體增多。細胞質內可見粗面內質網排列整齊、緊密,膜表面附有大量的核糖體顆粒。胞質內細胞器數量增加。軟骨細胞周圍的外基質中可見膠原纖維成束狀緊密排列,可見到周期性橫紋(圖11)。單純凝膠復合體組修復的軟骨細胞結構正常,但細胞表面未見纖毛。高倍鏡下軟骨細胞胞質內粗面內質網數量少,排列較稀疏,高爾基體數量也減少。細胞核較干細胞復合體實驗組明顯小。細胞周圍膠原纖維排列紊亂,稀疏。骨髓基質干細胞注射組電鏡下觀察基本類似于空白組。大多為凋亡軟骨細胞,細胞水腫脹大,細胞核固縮,細胞質內見不到細胞器(圖12)。偶爾可見未壞死的軟骨細胞,但細胞形態小,成梭形。細胞周圍纖維束排列稀疏。

2.8修復軟骨的組織形態學評分及統計分析(表2)表2修復后軟骨組織形態學分值注:*與干細胞復合體實驗組比較P<0.05,△與空白組比較P>0.05,▲與空白組比較P<0.05圖7術后12周,干細胞復合體組缺損修復組織大體照片圖8術后12周,單純骨髓基質干細胞組缺損修復組織大體照片圖9第12周干細胞復合體實驗組的修復軟骨與正常軟骨整合良好,新生軟骨細胞數量明顯增多,排列已經類似正常軟骨。HE100×圖10第12周單純骨髓基質干細胞組的修復軟骨細胞較少,基質呈淺藍色。甲苯胺藍100×圖11干細胞復合實驗組12周,軟骨細胞周圍的外基質中可見膠原纖維成束狀緊密排列。12500×圖12空白組12周,大多為凋亡軟骨細胞,細胞水腫脹大,細胞核固縮,細胞質內細胞器很少。1650×

3討論

許多證據表明[3],MSCs可以在不同理化環境的細胞因子的誘導下,定向的向成骨細胞或成軟骨細胞系方向分化,并最終形成骨或軟骨組織。在細胞生存微環境中,生長因子對細胞增殖、分化、發育和成熟過程起重要的調控作用。

bFGF對MSCs的作用還不是很明確,但主要認為促增殖作用。另外,bFGF能促進軟骨細胞合成Ⅱ型膠原,對維持軟骨細胞正常表型的表達具有重要的作用。IGF1能刺激細胞分裂增殖,而且增強細胞蛋白多糖(PG)及Ⅱ型膠原的合成[4]。TGFβ是一種多功能性的細胞因子,可以顯著提高軟骨細胞表型的表達,促進軟骨細胞Ⅱ型膠原和蛋白多糖的合成與分泌。TGF-β誘導MSCs后經連續培養,可以在體外形成軟骨結節,經證明具有軟骨的組織結構[5]。

本實驗中作者發現,細胞因子單獨應用時,bFGF-1的促增殖作用最顯著,倍增時間最短;其次分別是IGF1和TGFβ,這與以往的實驗研究相符[6]。然而,當聯合應用細胞因子時,發現bFGF1與其它因子組合的增殖作用部分受到抑制,不如單獨應用bFGF-1作用顯著。同時作者發現,IGF1和TGFβ聯合應用時,細胞的對數增殖期最長,誘導細胞呈持續的增殖狀態,這可能是IGF1和TGFβ聯合應用,使各自的半衰期延長,能夠更持久的調節細胞的生物學行為,使之保持生物學活性。IGF1和TGFβ聯合應用時,部分集落的骨髓基質干細胞呈大而圓形或多角形,通常認為,圓形、多角形的細胞體外能夠保持合成軟骨特異性Ⅱ型膠原及蛋白多糖的功能。免疫組化染色陽性面積較其它組大;而對照組與其它實驗組細胞集落多數呈長梭形,以往認為這是軟骨細胞去分化的表現(dedifferentiation)。Ⅱ型膠原蛋白是軟骨細胞所特有的膠原類型,是軟骨細胞重要的表型蛋白,免疫組化結果揭示MSCs經IGF1和TGFβ聯合誘導可以向軟骨細胞方向增殖分化。實驗研究結果表明,IGF1和TGFβ聯合應用是誘導骨髓基質干細胞向軟骨細胞方向分化的最佳組合,能促進Ⅱ型膠原合成和表達。在體內作者采用TGFβ及IGFⅠ作為骨髓基質干細胞向軟骨細胞轉化的誘導因子,以纖維蛋白凝膠作為前者的載體。纖維蛋白凝膠可通過釋放β轉化因子和血小板衍生生長因子等來促進細胞黏附、增殖并分泌基質,起到骨髓基質干細胞的支架作用,能很好地包埋骨髓基質干細胞和軟骨細胞。此外,IGFⅠ在體內可以通過與軟骨細胞膜上的受體結合以旁分泌和自分泌的方式起作用。因此IGFⅠ可以不進入血液,而在局部與細胞發生作用。

實驗表明在體內聯合應用IGF1和TGFβ,能誘導骨髓基質干細胞向軟骨細胞的分化。在12周時修復組織為透明軟骨,病理切片提示修復組織與正常軟骨組織結構類似,并且與周圍組織整合良好。電鏡觀察也發現,聯合應用TGFβ及IGF1修復組織的軟骨細胞形態正常,細胞活躍,基質內纖維組織結構符合軟骨特性。軟骨修復是一個復雜的過程,有多種細胞因子參與。缺少細胞因子的單純凝膠組和骨髓基質干細胞注射組均不能達到較好的軟骨修復效果。因此,TGFβ及IGF1聯合可作為組織工程學修復軟骨的首選細胞因子。

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