淋巴瘤研究論文

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【摘要】本研究探討78例非霍奇金淋巴瘤BCL-XL表達(dá)和突變的發(fā)生率及其臨床意義。應(yīng)用激光微切割技術(shù)從淋巴結(jié)組織中特異地分離淋巴瘤細(xì)胞，用實(shí)時(shí)定量RT-PCR法檢測(cè)淋巴瘤組織和淋巴瘤細(xì)胞中BCL-XL的表達(dá)，PCR直接測(cè)序法檢測(cè)BCL-XL的突變情況。結(jié)果表明：與淋巴結(jié)反應(yīng)性增生（15例）相比，濾泡性淋巴瘤（30例）組織和微切割的淋巴瘤細(xì)胞均高表達(dá)BCL-XL（P值分別為0.0064和<0.0001），而T細(xì)胞淋巴瘤（24例）和彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤（24例）中BCL-XL表達(dá)無明顯升高。在濾泡性淋巴瘤中，BCL-XL高表達(dá)的患者常伴多個(gè)淋巴結(jié)外器官累及（P=0.0004），血清乳酸脫氫酶水平升高（P=0.0019），國(guó)際預(yù)后指數(shù)分組多為高危組（P=0.0013），患者總生存期短（P=0.0451）。突變檢測(cè)發(fā)現(xiàn)1例濾泡性淋巴瘤BCL-XL的同義突變（密碼子109ACA→ACC）。結(jié)論：BCL-XL表達(dá)與濾泡性淋巴瘤的疾病進(jìn)展和患者預(yù)后密切相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】非霍奇金淋巴瘤；BCL-XL基因；基因表達(dá)；基因突變

BCL-XLExpressionandMutationinNon-Hodgkin′sLymphoma

AbstractThestudywasaimedtoinvestigatetheBCL-XLexpressionandmutation,anditsclinicalsignificanceinnon-Hodgkin′slymphoma.Lymphomacellswereselectivelyisolatedbylasermicrodissection.BCL-XLexpressionfromlymphomatissueandmicrodissectedlymphomacellswasmeasuredbyusingreal-timequantitativereversetranscription-polymerasechainreaction.BCL-XLmutationwasanalyzedbyusingdirectsequencingofPCRproducts.Theresultsshowedthatcomparedto15patientswithreactivehyperplasia,BCL-XLwasoverexpressedinfollicularlymphoma(n=30),bothinlymphomatissue(P=0.0064)andinmicrodissectedlymphomacells(P<0.0001).NosignificantriseofBCL-XLexpressionwasobservedinpatientswithT-celllymphoma(n=24)anddiffuselargeBcelllymphoma(n=24).Infollicularlymphoma,highBCL-XLlevelwasassociatedwithmultipleextranodalinvolvement(P=0.0004),elevatedlactatedehydrogenaselevel(P=0.0019),high-riskinternationalprognosticindex(P=0.0013)andashortoverallsurvivaltime(P=0.0451).Mutationanalysisrevealedonesynonymousmutation(Codon109ACA→ACC)inonecaseoffollicularlymphomapatient.ItisconcludedthatBCL-XLexpressioniscloselycorrelatedwithprogressoffollicularlymphomaandprognosisofpatientswithfollicularlymphoma.ThevalueofBCL-XLexpressionasaprognosticmarkerinfollicularlymphomashouldbeconsidered.

KeywordsNon-Hodgkin′slymphoma;BCL-XLgene;geneexpression;genemutation

淋巴瘤是一種起源于淋巴組織的惡性腫瘤，分為霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。近20年來，非霍奇金淋巴瘤在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率幾乎增長(zhǎng)了1倍，嚴(yán)重危害人類的健康［1］。因而探索淋巴瘤的發(fā)病機(jī)制、掌握淋巴瘤的疾病進(jìn)展相關(guān)基因，對(duì)于淋巴瘤的診斷治療前景，特別是開展個(gè)體化診治和基因靶向治療具有重要意義。

凋亡異常對(duì)于惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展起著相當(dāng)關(guān)鍵的作用。凋亡受阻致使腫瘤細(xì)胞壽命延長(zhǎng)，異常堆積，最終引起細(xì)胞轉(zhuǎn)化和腫瘤形成［2］。同時(shí)，誘導(dǎo)凋亡又是腫瘤治療，包括化療藥物治療、放射治療和免疫治療的重要機(jī)制之一。凋亡抑制可使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥，導(dǎo)致治療失敗或疾病復(fù)發(fā)［3］。細(xì)胞凋亡主要通過兩個(gè)途徑：外源性途徑和內(nèi)源性途徑。后者起始于線粒體細(xì)胞色素C的釋放，作用于凋亡蛋白酶激活因子（apoptoticprotease-activatingfactor-1，Apaf-1），誘導(dǎo)caspase-9活化，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［2］。BCL-2家族在調(diào)節(jié)凋亡的內(nèi)源性途徑中起著重要作用，按其功能不同主要分為兩類：一類是促凋亡蛋白，包括BAX、BAK、BOK、BCL-XS、BID、BAD等，另一類是抗凋亡蛋白，包括BCL-2、BCL-XL、BCL-W、MCL-1、A1等［4］。在非霍奇金淋巴瘤中，內(nèi)源性途徑受抑也是影響腫瘤細(xì)胞凋亡的重要因素［5］。BCL-XL是BCL-2家族的主要凋亡抑制因子，由BCL-X編碼，后者位于20q11.21，由3個(gè)外顯子組成。BCL-X缺陷的小鼠表現(xiàn)為幼稚淋巴細(xì)胞的凋亡明顯增加，同時(shí)亦證實(shí)BCL-XL在淋巴瘤中表達(dá)［6，7］。然而，它在不同類型淋巴瘤中的表達(dá)情況和與疾病進(jìn)展的關(guān)系尚缺乏系統(tǒng)的研究。本研究應(yīng)用實(shí)時(shí)定量RT-PCR法檢測(cè)78例患者淋巴瘤組織和細(xì)胞中BCL-XL的表達(dá)，應(yīng)用PCR直接測(cè)序法檢測(cè)是否存在BCL-XL突變，探討B(tài)CL-XL的表達(dá)及基因突變?cè)诹馨土霭l(fā)生發(fā)展中的意義。

材料和方法

患者

患者共78例,來自上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院和法國(guó)巴黎第七大學(xué)圣路易醫(yī)院，其中男38例，女40例，年齡21-88歲，中位年齡52歲。按WHO病理分型，78例中T細(xì)胞淋巴瘤24例，彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤24例，濾泡性淋巴瘤30例。對(duì)照組為淋巴結(jié)反應(yīng)性增生患者，共15例。兩組均經(jīng)患者知情同意后，留取部分淋巴結(jié)活檢組織，-80℃凍存，用于提取DNA和RNA。另有60例健康志愿者，采集其外周血，提取DNA，作為基因突變檢測(cè)對(duì)照。

激光微切割

用淋巴結(jié)冷凍組織制備7μm切片，70%酒精固定，蘇木素-伊紅染色。應(yīng)用激光微切割儀（LEICA公司產(chǎn)品）切割約1500個(gè)淋巴瘤細(xì)胞，自動(dòng)置入TRIzoL中，用于RNA提取。

DNA提取

按常規(guī)酚-氯仿抽提，冷無水乙醇沉淀法提取基因組DNA［8］，最后溶于適量TE中。紫外分光光度計(jì)測(cè)定樣品DNA含量。

RNA提取

淋巴結(jié)組織總RNA經(jīng)制備10-15片10μm冰凍組織切片后提取，淋巴瘤細(xì)胞總RNA直接從激光微切割的細(xì)胞中提取，操作參照TRIzoL試劑盒說明書進(jìn)行。

cDNA合成

通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)將RNA轉(zhuǎn)化為cDNA。25μl逆轉(zhuǎn)錄體系包括：5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液5μl；dNTP5μl；Oligo-dT2μl；逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV(Promega公司產(chǎn)品)1μl；RNasin0.5μl，淋巴結(jié)組織模板為1μg總RNA，激光微切割的淋巴瘤細(xì)胞模板為所有微切割產(chǎn)物提取的總RNA產(chǎn)物。反應(yīng)條件：42℃60分鐘，90℃5分鐘，4℃保存。

實(shí)時(shí)定量PCR

BCL-XL和TBP（humantranscriptionfactorIID/TATAbindingprotein）的TaqMan定量PCR試劑購(gòu)自PEAppliedBiosystems公司，通過ABIPRISM7700定量PCR儀檢測(cè)。TBP作為內(nèi)參校正樣本量，同時(shí)將表達(dá)BCL-XL的Jurkat細(xì)胞系［9］作對(duì)照。定量PCR結(jié)果參照2(-ΔΔCT)法計(jì)算［10］，所示數(shù)值為每個(gè)標(biāo)本BCL-XL表達(dá)量和Jurkat細(xì)胞BCL-XL表達(dá)量的比值。

PCR直接測(cè)序

采用Taq酶（購(gòu)自申友公司）通過PCR法擴(kuò)增BCL-XL各目的片段。PCR反應(yīng)體系為25μl。擴(kuò)增條件：預(yù)變性94℃5分鐘；循環(huán)條件為94℃變性30秒,退火溫度為54-60℃（根據(jù)各引物不同而改變）,退火時(shí)間為30秒，72℃延伸50秒，共35個(gè)循環(huán)；72℃7分鐘。擴(kuò)增啟動(dòng)子區(qū)與外顯子的引物序列如下：?jiǎn)?dòng)子區(qū)上游引物：5′TGCGGGGATGCCGGTAACTC3′；下游引物：5′GCCTCACCCTCACCCAGTCT3′；1號(hào)外顯子上游引物：5′TAATAGGGATGGGCTCAACC3′；下游引物：5′CTTCGCAATTCCTGTGTCGC3′；2號(hào)外顯子上游引物：5′AAGAAAAGGGACACACAAGG3′；下游引物：5′TGAGTGAGCAGGTGTTTTGG3′；3號(hào)外顯子上游引物：5′ATACCTGCCAGCCTCCTTTG3′；下游引物：5′TTTCCCCACCCACCTACATC3′。

PCR產(chǎn)物純化測(cè)序

采用蝦堿酶（shrimpalkalinephosphatase,SAP）和外切酶（exonucleaseI）純化PCR產(chǎn)物。反應(yīng)體系：4μlPCR產(chǎn)物（30ng/μl）；0.5μlSAP（3.3U/μl）；0.5μlExon1（20U/μl）；用ddH2O定容至10μl。反應(yīng)條件：37℃60分鐘，80℃15分鐘。純化產(chǎn)物經(jīng)電泳定量，將濃度調(diào)整至10ng/μl后采用ABI3700自動(dòng)測(cè)序儀（PEBiosystems公司）進(jìn)行直接測(cè)序。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±SD）表示，使用t檢驗(yàn)分析。患者隨訪截止期為2005年6月，總生存期（OS）即患者從診斷到死亡或隨訪截止期的時(shí)間。生存分析按照Kaplan-Meier法進(jìn)行，應(yīng)用Log-rank和χ2檢驗(yàn)，P值小于0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有處理均用SAS8.2統(tǒng)計(jì)軟件完成。

結(jié)果

非霍奇金淋巴瘤BCL-XL表達(dá)

與反應(yīng)性增生淋巴結(jié)相比，濾泡性淋巴瘤組織的BCL-XL表達(dá)顯著升高（P=0.0064），而在T細(xì)胞淋巴瘤和彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤與之相比無顯著差異（表1）。Table1.BCL-XLExpressioninNon-Hodgkin′sLymphoma（略）

濾泡性淋巴瘤細(xì)胞表達(dá)BCL-XL

運(yùn)用微切割技術(shù)從濾泡性淋巴瘤組織切片中直接分離淋巴瘤細(xì)胞，運(yùn)用定量PCR法檢測(cè)BCL-XL表達(dá)。結(jié)果表明，與反應(yīng)性增生的淋巴細(xì)胞相比（2.79±0.59），微切割的濾泡性淋巴瘤細(xì)胞高表達(dá)BCL-XL（9.00±4.26，P<0.0001）。

濾泡性淋巴瘤BCL-XL表達(dá)與疾病進(jìn)展和患者預(yù)后相關(guān)

在濾泡性淋巴瘤中，具有多發(fā)淋巴結(jié)外浸潤(rùn)、血清乳酸脫氫酶水平升高和國(guó)際預(yù)后指數(shù)分組（internationalprognosticindex,IPI）為高危組的患者BCL-XL表達(dá)顯著升高（P值分別=0.0004、0.0019和0.0013）（表2）。在T細(xì)胞淋巴瘤和彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤中無上述差異。Table2.BCL-XLgeneexpressionoffollicularlymphomapatientsinrelationtoclinicalcharacteristics（略）

根據(jù)淋巴結(jié)反應(yīng)性增生組BCL-XL的平均值（3.13）將濾泡性淋巴瘤患者分組，BCL-XL相對(duì)高表達(dá)的患者（>3.13，A組，n=20）2年和5年OS分別為94.74%和43.21%，顯著低于BCL-XL相對(duì)低表達(dá)的患者（<3.13，B組，n=10，2年和5年OS均為100%，P=0.0451）（圖1）。在T細(xì)胞淋巴瘤和彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤中，BCL-XL表達(dá)與患者生存無顯著相關(guān)。

BCL-XL基因突變分析

運(yùn)用PCR產(chǎn)物直接測(cè)序法，我們?cè)?8例非霍奇金淋巴瘤中發(fā)現(xiàn)1例濾泡淋巴瘤的BCL-XL基因伴不改變氨基酸的同義突變密碼子109ACA→ACC（圖2），突變發(fā)生率為1.28%,與NCBI的SNP數(shù)據(jù)庫和60例正常人比較后未見相同的變異。

討論

細(xì)胞凋亡是由于細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境變化或死亡信號(hào)觸發(fā)所引起的細(xì)胞主動(dòng)死亡過程，在細(xì)胞增殖和腫瘤發(fā)生等過程中起著十分關(guān)鍵的作用。然而，凋亡的調(diào)控基因根據(jù)腫瘤類型的不同而有所改變。與侵襲性較高的T細(xì)胞淋巴瘤和彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤相比，低度惡性的濾泡性淋巴瘤中高表達(dá)BCL-XL，說明凋亡異常在“惰性”淋巴瘤中的重要性［5］。淋巴瘤組織中除淋巴瘤細(xì)胞以外，還包含炎性細(xì)胞，基質(zhì)細(xì)胞以及正常細(xì)胞，后者可能影響基因研究的特異性和敏感性。本研究中，我們通過激光微切割技術(shù)直接選取了濾泡性淋巴瘤細(xì)胞進(jìn)行定量PCR檢測(cè)。結(jié)果表明，微切割的淋巴瘤細(xì)胞與反應(yīng)性增生的淋巴細(xì)胞相比，前者BCL-XL表達(dá)的水平更高，這進(jìn)一步證實(shí)了高表達(dá)的BCL-XL是濾泡性淋巴瘤細(xì)胞本身表達(dá)的。與BCL-2相似，BCL-XL可穩(wěn)定線粒體膜通透性，通過減少凋亡因子的釋放而抑制細(xì)胞凋亡。然而，BCL-XL除與BCL-2具有相同的抑制細(xì)胞凋亡的作用外，還可在功能上替代后者，挽救因BCL-2缺失而致的淋巴細(xì)胞凋亡，這在BCL-2-/-的BCL-XL轉(zhuǎn)基因小鼠中已被證實(shí)［11］。同時(shí)在高表達(dá)BCL-2的濾泡淋巴瘤細(xì)胞中，下調(diào)BCL-XL的表達(dá)，淋巴瘤細(xì)胞將隨之發(fā)生凋亡［12］。因此，BCL-XL是影響濾泡性淋巴瘤細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素［13］。深入的研究表明，BCL-XL高表達(dá)與患者的疾病進(jìn)展密切相關(guān)。腫瘤細(xì)胞凋亡受抑，浸潤(rùn)各臟器，表現(xiàn)為診斷時(shí)即具有多處淋巴結(jié)外累及；同時(shí)腫瘤負(fù)荷增加，表現(xiàn)為血清乳酸脫氫酶升高；相應(yīng)地，患者的國(guó)際預(yù)后指數(shù)分期多位于高危組。更重要的是，已知BCL-XL可抑制CD40和化療藥物介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞的凋亡［14，15］，BCL-XL高表達(dá)的患者預(yù)后不良，這從另一角度反映了腫瘤細(xì)胞的耐藥性。為探索其異常表達(dá)的機(jī)制，我們檢測(cè)了BCL-XL的突變情況。結(jié)果在78例非霍奇金淋巴瘤僅發(fā)現(xiàn)1例濾泡淋巴瘤存在突變，但為同義突變，不改變氨基酸序列。Yamaguchi等［16］在50例非霍奇金淋巴瘤中也僅發(fā)現(xiàn)1例彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤有BCL-XL突變。因此，BCL-XL在淋巴瘤細(xì)胞中具有高度保守性，其表達(dá)上調(diào)的原因有待于進(jìn)一步研究。綜上所述，BCL-XL的異常表達(dá)在濾泡性淋巴瘤發(fā)生進(jìn)展中具有一定的作用，可作為濾泡性淋巴瘤一個(gè)重要的預(yù)后指標(biāo)和基因治療靶點(diǎn)。

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