淋巴細胞分布研究論文

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【摘要】本研究應用小鼠GVHD模型探討異基因T淋巴細胞在移植受體體內的遷移和分布。將C57BL/6的骨髓細胞和轉基因熒光C57BL/6小鼠的脾淋巴細胞輸入經8Gy全身照射的BALB/c小鼠，建立eGFP標記供體淋巴細胞的GVHD小鼠模型；應用熒光顯微鏡和流式細胞術觀測GVHD模型中eGFP細胞的分布；ELISA法檢測GVHD靶組織中趨化因子MIP-1α水平的改變。結果表明：①輸入脾細胞和骨髓細胞第8天后出現GVHD臨床及病理表現;②GVHD模型中，受體鼠肝、皮膚、腸、脾、肺、舌有eGFP細胞浸潤;③GVHD小鼠肝、脾eGFP細胞中CD4、CD8細胞比例均逐漸升高;④GVHD鼠脾、肝組織中MIP-1α水平升高，脾中MIP-1α水平高峰出現于移植后第3天，肝中MIP-1α水平高峰出現于移植后第7天。結論：除肝、腸、皮膚外，肺、舌可能也是GVHD靶器官。肝、脾組織中供體淋巴細胞浸潤伴隨MIP-1α水平的升高。

【關鍵詞】小鼠GVHD模型;T淋巴細胞；增強型綠色熒光蛋白；巨噬細胞炎癥蛋白

MigrationandDistributionofAllogeneicTLymphocytesinOrgansofGraft-Versus-HostDiseaseMouseModel

AbstractThisstudywasaimedtoinvestigatethemigrationanddistributionprocessesofallogeneicdonorTlymphocytesintheorgansofrecipientmice.GVHDmodelwasestablishedbytransfusionofthesplenocytesofeGFPtransgeneicC57BL/6micetogetherwithbornmarrowcellsharvestedfromC57BL/6miceintoBALB/cmiceunderwent8.0Gytotalbodyirradiation.ThemigrationandhomingofeGFPcellsweretrackedbystereo-fluorescentmicroscopyorinvertedfluorescentmicroscopyandflowcytometry.Theenzymelinkedimmunosorbentassay(ELISA)wasperformedonsupernatantsfromthetissuehomogenatestodetecttheamountofMIP-1α.TheresultsindicatedthatGVHDclinicalmanifestationandpathologicalchangesoforgansappearedonday8posttransplantation.eGFP-positivedonorTcellsinrecipientorganswereobservedbyinvertedfluorescencemicroscopeinfrozensection,orbystereo-fluorescencemicroscopyinlivingorgans,suchasliver,spleen,skin,lungs,bowels,andtongue.ThehighestexpressionofMIP-1αwasonday7posttransplantationintheliver(491.3±32.1pg/ml),andday3posttransplantationinthespleen(881.5±45.2pg/ml)，respectively(P<0.05).ItisconcludedthatGVHDwasinducedbysplenocytesofeGFPtransgeneicC57BL/6mice.eGFPcellsintheorganscanbeobservedbyfluorescentmicroscopy.InthisGVHDmodel,donorTcellsproliferateandinfiltrateinliver,skin,bowels,aswellaslungsandtongue.MIP-1αmaybeinrelationwiththeinfiltrationofTlymphocytesinliverandspleen.

KeywordsmurinGVHDmodel;Tlymphocytes;splenocytes;enhancedgreenfluorescenceprotein;macrophageinflammatoryprotein-1（MIP-1α）

移植物抗宿主病（graft-versus-hostdisease,GVHD）是異基因造血干細胞移植（allo-HSCT）臨床應用的主要并發癥之一。目前公認GVHD是由供體T淋巴細胞在宿主體內被激活,并攻擊靶組織所引起，但對異基因T淋巴細胞在受體體內的遷移、組織分布及激活過程仍不甚清楚，GVHD累及器官的范圍也存在一定爭議。我們建立了增強型綠色熒光蛋白(enhancedgreenfluorescenceprotein,eGFP)標記供體淋巴細胞的GVHD小鼠模型，觀察了GVHD模型中eGFPT淋巴細胞的分布與激活，為GVHD防治研究提供基礎資料。

材料和方法

實驗動物

BALB/c（H-2Kd）雌性小鼠、C57BL/6雄性小鼠（H-2Kb）均為6-8周齡，購自上海生命科學院實驗動物中心。eGFP-Tg-C57BL/6雄性小鼠（H-2Kb），6-8周齡，由第二軍醫大學細胞生物學教研室提供。

實驗材料

PElabeledanti-mouseCD4，PE-cy5labeledanti-mouseCD8為Biolegend公司產品。小鼠MIP-1αELISA檢測試劑盒為R&D公司產品。

供體小鼠骨髓、脾細胞懸液的制備與檢測

頸椎脫位法處死C57BL/6及eGFP-Tg-C57BL/6小鼠，無菌取其雙側的股骨和脾。用不含有牛血清的RPMI1640培養液制備骨髓細胞懸液及脾細胞懸液。以PBS重懸細胞，調整濃度至107/ml。0.4%臺盼藍染色提示骨髓細胞懸液及脾細胞懸液中活細胞在95％以上。流式細胞術檢測骨髓細胞和脾細胞中CD4T、CD8T淋巴細胞百分比。

GVHD模型的建立

用60Co-γ線全身照射受體BALB/c雌性小鼠(8.0Gy,劑量率為0.5Gy/min)，于6-12小時內每只鼠經尾靜脈輸入8×106骨髓細胞(BMC)15×106脾細胞(SC)。分組如下：A組18只BALB/c鼠，輸C57BL/6鼠BMCeGFP-Tg-C57BL/6鼠SC；B組5只BALB/c鼠，輸C57BL/6鼠BMC；C組BALB/c鼠5只，輸eGFP-Tg-C57BL/6鼠BMCC57BL/6鼠SC。

造血重建

移植后第1、3、5、11、13天，檢測外周血細胞數。移植后第13天，制備骨髓細胞懸液片，在OlympusⅨ70倒置熒光顯微鏡下觀察。骨髓細胞懸液染色體檢查采用短期培養法，顯微鏡下計數Y染色體的分裂相比例，共觀察10個分裂相。

GVHD觀察

死亡時WBC<0.5×109/L為移植失敗，WBC>1.0×109/L并具有以下癥狀者為GVHD發生:倦怠、納差、體重減輕、弓背、亂毛、脫毛、腹瀉甚至死亡。以25天為觀察期限，觀察小鼠的GVHD發生情況和生存時間。取肝、腸、皮膚組織,用4%中性甲醛固定,石蠟包埋，常規切片,HE染色,光學顯微鏡下觀察。

eGFP淋巴細胞在小鼠體內的分布

取A組小鼠，麻醉后，去毛，切開鼠胸腹部，暴露肝、脾、腸、肺、腎，皮膚、舌、腦、骨等。用LeicaMZFLⅢ立體熒光顯微鏡觀察，拍照，曝光時間0.4-1.9秒。取A組小鼠，麻醉，PBS灌注后，切取小鼠的肝、脾、單個腎臟、腸、皮膚、肺、腦實質、舌、腎臟等，冰凍切片（厚10μm），在OlympusⅨ70倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光。以未輸入eGFP細胞小鼠的各組織及冰凍切片分別作對照，排除背景熒光。

MIP-1α水平和T細胞亞群檢測

取肝、脾、單個腎臟，置于200目不銹鋼網中輕輕碾碎，以1mlPBS分別收集細胞，500×g離心6分種，取上清，行MIP-1αELISA檢測，按試劑盒說明書操作，測450nmOD值。采用CurveExpert1.3軟件作標準曲線，計算樣本OD值對應的濃度值。流式細胞術檢測肝、脾、腎細胞懸液中eGFP細胞百分數及以eGFP細胞設門的CD4、CD8細胞百分數。

統計處理

數據用SPSS10.0統計軟件處理,生存分析采用Kaplan-Meier分析方法；樣本均數間比較采用獨立樣本t檢驗。

結果

小鼠骨髓細胞和脾細胞中CD4、CD8細胞百分比

檢測結果見表1。由表1可見，eGFP-Tg-C57BL/6小鼠脾細胞（SC）懸液中CD4T或CD8T淋巴細胞含量與C57BL/6小鼠相似，CD4T均在20％左右，CD8T均在13％左右。據此推測兩種小鼠在引發GVHD方面沒有區別。這兩種小鼠骨髓細胞中T淋巴細胞含量均極少，約為2％。因此，單輸骨髓細胞可能不足以引發GVHD。

移植后造血重建

移植后第3天WBC降至最低值，第8天后WBC恢復至大于1.0×109，第13天WBC恢復至3.0×109以上。移植后第13天后C組鼠的骨髓細胞大多為eGFP細胞(圖1)，說明其來源于供體eGFP-Tg-C57BL/6鼠。染色體檢查顯示受者雌性小鼠骨髓細胞10個分裂相中，8/10-10/10可見Y染色體。Table1.PercentagesofCD4,CD8cellsinbonemarrowcells(BMC)andsplenocytes(SC)ofthemice（略）

eGFP淋巴細胞在小鼠體內的分布

立體熒光顯微鏡、熒光倒置顯微鏡觀察顯示，A組小鼠肝、皮膚、腸、脾、肺、舌有eGFP細胞浸潤(圖2)；腎、腦、骨、心肌、骨骼肌等組織中均未見eGFP細胞浸潤。可見肝、皮膚、腸、肺、舌等組織第13天eGFP細胞多于第3天。而脾組織第13天eGFP細胞少于第3天(圖3)。

GVHD表現及轉歸

A組小鼠移植后第8天開始出現GVHD表現,主要為消瘦、弓背、脫毛、亂毛、體重減輕和腹瀉,最后全部在25天內死亡。出現GVHD表現小鼠的肝、腸符合急性GVHD的病理改變:肝組織顯著水腫，細胞濁腫、變性,可見灶性壞死，匯管區淋巴細胞浸潤；腸組織學表現黏膜脫落，腺體及絨毛水腫、壞死、糜爛，可見淋巴樣圓形細胞浸潤（圖4）。單輸骨髓細胞的B組小鼠無GVHD表現，肝、腸結構基本正常。A組、B組小鼠生存曲線比較表明，A組小鼠生存率明顯小于B組小鼠(圖5)(P<0.05)。

第3、7、13天，eGFP細胞比例，在肝細胞懸液中逐漸增多，從18.4±3.4%升高至70.8±5.3%；脾細胞懸液中逐漸減低，從60.7±8.3%降低至27.8±4.3%。肝、脾eGFP細胞中CD4T、CD8T淋巴細胞比例均逐漸升高（表2）。Table2.PercentagesofeGFPcellsinthecellsuspensionsandpercentagesofCD4,CD8cellsineGFPcells(略)

肝、腎及脾臟中MIP-1α的表達

與腎臟中MIP-1α水平相比，肝、脾中MIP-1α水平顯著升高（P<0.05）;移植后第3天脾MIP-1α水平最高，為881.5±45.2pg/ml，肝中MIP-1α高峰水平出現在第7天，達491.3±32.1pg/ml(圖6)。

討論

本研究將C57BL/6鼠骨髓細胞與轉eGFP基因的C57BL/6鼠脾細胞一起植入經8.0Gy照射的BALB/c鼠體內，成功建立了GVHD模型。eGFP可作為標記，用熒光顯微鏡或流式細胞儀可以直接檢測供體T淋巴細胞在受體鼠體內的浸潤、擴增情況。本實驗系統可用于觀察供體細胞的分布及動態變化，為GVHD的發生機理及防治研究提供了方法平臺。目前認為，激活的CD4T淋巴細胞分泌免疫應答發生必需的細胞因子，激活CD8T淋巴細胞，使其成為細胞毒性T淋巴細胞，從而攻擊受者細胞引發GVHD［1，2］。在本實驗模型中，由于供者小鼠骨髓中T淋巴細胞含量極少，單純輸注供者骨髓細胞，雖然也能實現植入和供者型造血重建，但無GVHD發生。同時輸注異基因脾細胞可使受者小鼠發生GVHD，在GVHD靶器官中出現受者T淋巴細胞的浸潤和增殖。我們觀察到受者脾與肝中eGFP細胞呈現不同的動態變化：肝中eGFP細胞逐漸增多，而脾中eGFP細胞逐漸減少。這一結果提示，供體T淋巴細胞在移植初期可能先進入脾等淋巴器官，在異基因抗原作用下，激活、擴增后，離開脾，進入肝、腸等GHVD靶器官。但不能排除肝、皮膚、腸等GHVD靶器官中存在供體T淋巴細胞的激活與擴增。例如最近有學者研究表明，供體T淋巴細胞可在肝、脾、肺中直接與抗原呈遞細胞相互作用而激活、擴增［3］。經典GVHD靶器官主要是肝、腸和皮膚組織，GVHD的臨床分級也主要根據這3個組織的損傷程度。臨床資料表明，GVHD與移植后的許多并發癥均有聯系，如間質性肺炎、黏膜炎癥或潰瘍、出血性膀胱炎、味覺喪失等。有研究顯示，腦、腎、牙齦、結締組織、舌、鼻腔等組織中均可見供體淋巴細胞浸潤，并將它們稱之為非經典GVHD靶器官［4-6］。本研究采用熒光顯微鏡觀測eGFP細胞的分布，在肝、腸、皮膚、肺、舌中發現eGFP細胞浸潤，這提示除肝、腸和皮膚等傳統GVHD靶器外，肺、舌也是潛在GVHD靶器官。我們在腎、腦、肌肉等組織中未觀察到明顯的eGFP細胞浸潤，可能與腎、腦中供體淋巴細胞浸潤較少或實驗觀測方法的敏感性有關。MIP-1α是一種重要的趨化因子，活化后的T淋巴細胞、B淋巴細胞、單核細胞和肥大細胞均可產生MIP-1α。T淋巴細胞有MIP-1α的受體CCR5、CCR7等的表達，MIP-1α對T淋巴細胞有趨化作用［7］。有研究表明，異基因造血干細胞移植的動物的肝、脾組織中MIP-1α,MIP-2和MIG水平升高；皮膚組織中可見MIP-1α,MIP-2,MCP-1和MCP-3水平升高［8，9］。本研究發現，GVHD模型中肝、脾組織的MIP-1α水平升高，表達高峰分別出現在第7天和第3天。國外有研究也顯示，移植后第3天淋巴組織中趨化因子MIP-1α表達上調，在脾中MIP-1α由激活的T淋巴細胞產生。肝中MIP-1α表達晚于淋巴組織，由激活的T淋巴細胞產生，并與供者T淋巴細胞浸潤一致，用MIP-1α單克隆抗體或輸入MIP-1α-/-供體T淋巴細胞的方法,均可減少受體肝中CD8T淋巴細胞浸潤，而且血清丙氨酸氨基轉移酶(ALT)水平和肝GVHD特異性病理表現均較輕［9-12］。這說明可能存在一個反饋機制，肝浸潤T淋巴細胞產生MIP-1α，吸引CD8T細胞毒性T細胞進入肝臟。

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