生長抑素類似物對人肝癌細(xì)胞株MHCC97

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【關(guān)鍵詞】MHCC97

InfluenceofsomatostatinanalogueonhumanhepatocellularcancercelllineMHCC97H

【Abstract】AIM:TostudytheinfluenceofsomatostatinanalogueoctreotideonhumanhepatocellularcancercelllineMHCC97Handitsmechanismsinvivo.METHODS:Twentysevennudemice,ofwhichMHCC97Htumormasswasplantedinliver,weredividedinto3groupsrandomly:negativecontrolgroup,lowdoseinterferedgroup,largedoseinterferedgroup,andraisedatsimilarconditionfor35dthesurvivaltime,theweightatthedeathpointwereracordedandthepathologicailchangesofliversandlungswerechanged;theexpressionofmatrixmetalloproteinases2（MMP2）inhepatocellularcarcinomawasdetectedbyimmunohistochemicaltechnique.RESULTS:Comparedwiththeanimalmodelsofnegativecontrolgroup,theanimalmodelsofinterferedgroupswereheavierinmeanweightatdeathpointandlowerinmetastasisrate(P<0.05);whiletherewasnostatisticaldifferencebetweenthe2interferedgroups(P>0.05);theexpressionofMMP2inhepatocellularcarcinomaofinterferedgroupswasgraduallyincreasedthanthatincontrolgroup（P<0.05）;whiletherewasnostatisticaldifferencebetweeninterferedgroups(P>0.05).CONCLUSION:OctreotidecanimprovethelivingqualityofanimalmodelsandinhibitthemetastasisofhumanhepatocellularcancercelllineMHCC97Hinvivo,whichmightberelatedtothedownregulationoftheexpressionofMMP2.

【Keywords】MHCC97H,octreotide,inhibition

【摘要】目的：探討生長抑素類似物奧曲肽對人高轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞株mhcc97H的影響及可能機制.方法：MHCC97H腫瘤組織種植于裸鼠肝臟建立肝癌動物模型27只，隨機分為3組：陰性對照組和小、大劑量干預(yù)組，同等條件下飼養(yǎng)35d，記錄動物模型生存期，死亡時質(zhì)量；觀察肝臟，肺臟病理改變；免疫組化方法檢測肝臟腫瘤組織基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)表達變化.結(jié)果：奧曲肽干預(yù)組動物模型較陰性對照組動物模型死亡時平均體重增加,肝癌轉(zhuǎn)移率下降(P<0.05)；干預(yù)組間對比未見統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；免疫組化顯示干預(yù)組肝臟腫瘤細(xì)胞MMP2表達較陰性對照組下調(diào)（P<0.05）；干預(yù)組組間比較未見統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05).結(jié)論：奧曲肽可改善荷MHCC97H細(xì)胞裸鼠肝癌模型生存質(zhì)量，抑制MHCC97H細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移，下調(diào)腫瘤組織MMP2的表達是奧曲肽抑制MHCC97H細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的可能機制之一.

【關(guān)鍵詞】MHCC97H細(xì)胞株；奧曲肽；抑制

0引言

原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌(primaryhepatocellularcarcinoma,PHC)PHC根治性切除后5a復(fù)發(fā)率為54.1%～61.5%，小肝癌(≤5cm)為43.5%，而局部治療的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率則更高.常規(guī)化療及放療效果不佳，副作用大，基因治療、生物治療等作用亦不明顯.因此，深入研究肝細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)機制和積極探索有效的抗復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移治療措施是當(dāng)前PHC診治中的重點和難點.

1材料和方法

1.1材料主要試劑和儀器:善寧注射液(0.1mg/支)由瑞士諾華公司生產(chǎn)提供.鼠抗人MMP2抗體AntibodyDiagnosticaInc.

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)人高轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞株MHCC97H由上海中山醫(yī)院腫瘤研究所購得，100mL/L胎牛血清（fetalcalfserum,FCS）加達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基（dulbeccosmodifiedeaglesmedium,DMEM）于50mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)37℃，50mL/LCO2及飽和濕度下CO2孵育箱內(nèi)培養(yǎng).

1.2.2動物模型取對數(shù)生長期MHCC97H肝癌細(xì)胞株，充分吹打至單細(xì)胞懸液，細(xì)胞沖洗液沖洗3次，DMEM調(diào)整細(xì)胞濃度至2×107/mL，取0.2mL于4～6周齡的雄性裸鼠背部皮下注射，實驗動物于層流室內(nèi)飼養(yǎng)28d，至皮下結(jié)節(jié)直徑約1cm，無菌條件下取出腫瘤組織保存于37℃含20g/LFCS的DMEM中，粉碎至2mm×2mm×2mm.4～6周齡的雄性裸鼠30只，戊巴比妥鈉45mg/kg腹腔注射麻醉后，手術(shù)野皮膚消毒，左肋緣下斜切口進腹，顯露肝左葉，腫瘤組織塊2mm×2mm×2mm大小，接種于肝左外葉，壓迫止血，關(guān)腹.同等條件下，動物模型層流室內(nèi)飼養(yǎng)3d，剔除因麻醉意外、感染及出血死亡動物模型3只，余動物模型隨機分為3組，動物模型體質(zhì)量及周齡組間均衡性檢驗無統(tǒng)計學(xué)差異.A組：陰性對照組（等體積生理鹽水腹腔注射，n=8）；B組：小劑量干預(yù)組（Oct50μg/kg・d腹腔注射，n=9）；C組：大劑量干預(yù)組（Oct200μg/kg・d腹腔注射，n=10），同等條件下層流室內(nèi)飼養(yǎng)35d.

1.2.3標(biāo)本檢測記錄每只動物模型生存時間，死亡時體質(zhì)量，取肝臟，肺臟40g/L多聚甲醛，0.1mol/L磷酸緩沖液固定48h，組織石蠟包埋，HE染色，免疫組化方法檢測對比組間肝臟腫瘤組織MMP2表達變化.染色結(jié)果判定參照Mattern方法［1］：陽性染色深度:未見染色為0，輕度染色(染成淺黃色)為1，中度染色(染成棕黃色)為2，深度染色(染成棕褐色)為3；陽性細(xì)胞百分比:未見染色為0，染色細(xì)胞<25%為1，25%～50%為2，>50%為3.將這兩方面得分相加，得分0～2分判為陰性表達，>2分(3～6)判為陽性表達，隨機選擇10個高倍視野，記數(shù)1000個細(xì)胞.

統(tǒng)計學(xué)處理：實驗計量結(jié)果以x±s表示,計量資料組間比較經(jīng)SAS軟件進行方差分析及Dunnett檢驗，計數(shù)資料組間比較采用Fisher確切概率法.

2結(jié)果

人高轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞株MHCC97H種植于裸鼠皮下，層流室飼養(yǎng)35d后發(fā)現(xiàn)原注射點皮下形成約1.1×0.9cm包塊，實驗動物呈現(xiàn)衰竭狀態(tài).動物模型建立后，待實驗動物自然清醒，觀察3d后，實驗動物活動靈敏，覓食積極，并未發(fā)現(xiàn)因出血和感染死亡動物.動物模型建立后10d發(fā)現(xiàn)陰性對照組動物模型較干預(yù)組動物模型活動減少，同時發(fā)現(xiàn)對照組動物模型死亡時體重明顯減輕（P＜0.01），生存時間組間對比未見統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）,但是大劑量干預(yù)組動物模型中位生存期較小劑量干預(yù)組延長（26.7~21.5d），同時小劑量干預(yù)組動物模型中位生存期較陰性對照組延長（21.5~19.3d）.

肝臟病理改變可見兩種類型.A型肉眼見裸鼠肝體積明顯減小，色澤晦暗，質(zhì)地變硬，表面滿布1~2mm大小結(jié)節(jié)，呈“粟粒”樣，與正常肝臟組織分界不清.鏡下見裸鼠肝細(xì)胞大量變性壞死，組織結(jié)構(gòu)消失，正常肝小葉結(jié)構(gòu)消失，殘存裸鼠肝細(xì)胞腫脹，胞漿內(nèi)氣球樣改變，水腫明顯；腫瘤細(xì)胞胞核淡染，異型性明顯，聚集成團，呈現(xiàn)“癌巢”狀，可見腫瘤細(xì)胞侵入管型結(jié)構(gòu).B型肉眼見裸鼠肝變化不明顯，色澤鮮紅，質(zhì)地柔軟，光滑，與正常肝臟組織分界明顯.鏡下見壞死區(qū)范圍明顯縮小，腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)“癌巢”改變，裸鼠殘存肝細(xì)胞腫脹壞死明顯減輕.肺臟病理改變：肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡間質(zhì)內(nèi)可見炎性細(xì)胞聚集，并可見肺泡間質(zhì)內(nèi)腫瘤細(xì)胞聚集成團，胞核淡染，異型性明顯.

陰性對照組87.5%動物模型肝臟呈現(xiàn)“A”型形態(tài)改變，干預(yù)組77.8%動物模型肝臟肉眼觀呈現(xiàn)“B”型形態(tài)改變，而且在大劑量干預(yù)組出現(xiàn)B型形態(tài)改變的動物比例大于小劑量干預(yù)組（44.4%~100%）.肺臟組織連續(xù)切片HE染色判斷肝癌肺轉(zhuǎn)移率可見陰性對照組轉(zhuǎn)移率87.5%，小劑量干預(yù)組轉(zhuǎn)移率33.3%，大劑量干預(yù)組轉(zhuǎn)移率10.0%（表1，P<0.05）.大劑量干預(yù)組MMP2表達明顯下調(diào)，陽性表達腫瘤細(xì)胞幾乎不可見，在小劑量干預(yù)組MMP2表達較大劑量干預(yù)組表達上調(diào)，可見少量陽性及弱陽性腫瘤細(xì)胞，散在分布；在陰性對照組MMP2表達明顯較干預(yù)組強，可見陽性及強陽性細(xì)胞出現(xiàn).而干預(yù)組間未見統(tǒng)計學(xué)差異（表2）.

表1組間動物模型一般狀況(略)

aP<0.05vs陰性對照.

表2MMP2,MMP9在肝癌組織中的表達（略）

aP<0.05vs陰性對照.

3討論

HCC的高復(fù)發(fā)高轉(zhuǎn)移特性嚴(yán)重影響HCC的遠期療效,部分腫瘤在體積很小時就已發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，臨床就診者多屬中晚期，因此如何控制HCC的高侵襲性，降低復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率是當(dāng)今治療HCC的重點.SS及其類似物對腫瘤的抑制作用近來受到關(guān)注.Oct為人工合成的生長抑素類似物，臨床上發(fā)現(xiàn)Oct對多種實體腫瘤存在抑制作用，包括胃癌，肺癌，胰腺癌等［2］.隨著臨床研究的進展，Oct被逐步應(yīng)用于HCC治療領(lǐng)域，眾多實驗表明在人肝癌細(xì)胞表面存在SSTR表達［3］，而且這一現(xiàn)象已被利用于腫瘤的診斷［4-5］.

文獻報道［6］于裸鼠肝內(nèi)種植MHCC97H細(xì)胞株建立肝癌模型，飼養(yǎng)35d后，肝癌肺轉(zhuǎn)移率高達100%，而且MHCC97H細(xì)胞株體外連續(xù)培養(yǎng)傳代120余代，生物性狀保持穩(wěn)定，是研究肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的良好模型.試驗中發(fā)現(xiàn)在組間均衡性檢驗未見統(tǒng)計學(xué)差異以及同樣的飼養(yǎng)條件下，陰性對照組動物模型肝癌肺轉(zhuǎn)移87.5%，明顯高于小劑量干預(yù)組(33.3%)和大劑量干預(yù)組(10.0%)，Oct對肝癌肺轉(zhuǎn)移存在抑制作用.

MMP2在癌組織內(nèi)表達于肝癌細(xì)胞胞漿內(nèi)，呈淡黃色至棕褐色細(xì)顆粒狀.MMP2陽性細(xì)胞常散在分布，也有呈巢團狀，在浸潤灶前沿處MMP2表達加強，陽性及強陽性細(xì)胞數(shù)目增多.而位于腫瘤邊緣、近血管處、浸潤灶前沿等處腫瘤細(xì)胞常是高侵襲性克隆聚集處，提示MMP2可能于高侵襲性克隆中表達加強.在組間比較中發(fā)現(xiàn)陰性對照組MMP2表達明顯強于干預(yù)組，干預(yù)組組間比較未見統(tǒng)計學(xué)差異；MMP2主要降解作為基底膜的主要成分的Ⅳ型膠原、同時也具有降解明膠、Ⅶ和Ⅹ型膠原的能力，MMP2的異常高表達與腫瘤的惡性程度和腫瘤的血管生成呈正相關(guān)，二者均與腫瘤的生長轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，Oct可以降低動物模型肝癌轉(zhuǎn)移率，可能通過下調(diào)促轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白MMP2的表達得以實現(xiàn)，是其抑制HCC遠處轉(zhuǎn)移的機制之一［7］.

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