大鼠肝卵圓細胞細胞間黏附分子論文

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【摘要目的摘要:探索細胞間黏附分子1(ICAM1)在肝卵圓細胞(HOCs)中的表達,及核因子(NFκB)對其表達的調控功能.方法摘要:0.6g/kg3′甲基4二甲基胺偶氮苯（3′methyldimethylaminoazobenzene,DAB）飼喂Wistar大鼠4wk,制作肝損傷模型.利用Percoll密度梯度離心法分離HOCs,免疫細胞化學檢測HOCs對ICAM1的表達；體外培養HOCs并分別用NFκB激動劑TNFα和NFκB抑制劑TGFβ1干預,RTPCR對ICAM1mRNA進行半定量分析,比較在TNFα和TGFβ1的調控下ICAM1mRNA表達的變化.結果摘要:HOCsICAM1免疫細胞化學檢測明顯陽性.和對照組比較,體外培養HOCs時TNFα促進HOCs的增殖(P%26lt;0.01),TGFβ1對HOCs的增殖能力無明顯影響；RTPCR半定量分析,和對照組比較，TNFα組ICAM1mRNA相對灰度值增高(P%26lt;0.01),而TGFβ1組ICAM1mRNA相對灰度值降低(P%26lt;0.01).結論摘要:在肝損傷組織中HOCs表達ICAM1,TNFα和TGFβ1分別通過對NFκB活性的促進和抑制來調控ICAM1的表達.

【細胞間黏附分子1;肝卵圓細胞；核因子κB

0引言

近年來,肝卵圓細胞（hepaticstemcells,HOCs）的探究受到重視［1］.在大鼠肝損傷和肝癌模型的肝組織中存在HOCs大量增生［2］,但哪種細胞表達ICAM1還不完全清楚.骨髓造血干細胞（hemopoieticstemcells,HSCs）表面存在一組以ICAM1為主的黏附分子,能介導HSCs和骨髓基質的黏附,從而使HSCs產生一種定向遷移的功能［3］.探究表明,HOCs可以來自于HSCs.既然HOCs可以來自于HSCs,且HSCs表達ICAM1,那么HOCs也應象HSCs一樣能表達ICAM1.為此,我們探究HOCs表達ICAM1的證據及其調控.

1材料和方法

1.1材料

Wistar大鼠6只,雌雄不限,體質量(110±10)g,由南方醫科大學(原第一軍醫大學)實驗動物中心提供.3′甲基4二甲胺基偶氮苯（3′methyldimethylaminoazobenzene,DAB）購于日本東京化成株式會社；Percoll分離液購自Pharmacia公司；兔抗鼠ICAM1，即用型SABC試劑盒及DAB顯色劑購自武漢博士德生物工程有限公司；引物由上海生工生物工程公司設計合成,βantinsenseprimer5′GCATTGTAACCAACTGGGACG3′,antisenseprimer5′TTGCCGATAGTGATGACCT3′,擴增產物長度為535bp；ICAM1senseprimer,5′CGTGCTGTATGGTCCTCG3′,antisenseprimer5′GGGCTTGTCCCTTGAGTT3′,擴增產物長度422bp；Marker購于上海生工生物工程公司；總RNA提取試劑盒、mRNA逆轉錄酶、Taq聚合酶購于Promega公司；Ⅳ型膠原酶、TNFα,TGFβ1購于Sigma公司.

1.2方法

Wistar大鼠正常飼喂1wk后,給予含0.6g/kgDAB飼料飼養,正常飲水,于4wk后大鼠1只,戊巴比妥鈉麻醉(25mg/kg,ip),開腹,門靜脈切開插管,25mL/min灌注DHanks液至肝表面淡黃除去肝組織里的血液,灌注0.6g/LⅣ型膠原酶至肝組織黃色糜狀,將整塊肝組織移入燒杯搗碎,于震蕩箱37℃恒溫震蕩消化40min,經100目篩網過濾,未過濾的組織塊繼續搗碎,加入0.6g/LⅣ型膠原酶繼續震蕩消化40min,收集過濾液分裝于離心管中4℃100g離心10min,取上清液分裝于離心管4℃1000g離心30min,棄上清液,用DMEM基礎培養液稀釋細胞懸液.高速離心管分裝Percoll梯度離心液,細胞液鋪于上層,4℃12000g離心30min,吸取700mL/L和500mL/L之間細胞液,DMEM基礎培養液稀釋,4℃1000g離心30min,棄上清液,用150mL/L胎牛血清稀釋細胞密度至1.0×109/L.取4個12孔培養板分別標記為A，B，C，D4組,每組又分為Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ亞組,每亞組4孔,各孔加入上述細胞懸液0.5mL,然后加適量細胞培養基,Ⅰ亞組為空白對照組,Ⅱ亞組和Ⅲ亞組分別加入2.0×105U/L的TNFα和10mg/L的TGFβ1.分別于3，6，9，12d計數A，B，C，D組中各1組的細胞數.

1.2.1ICAM1免疫細胞化學上述細胞液適量滴于防脫片處理的清潔載玻片上,培養8h后細胞黏附貼壁.具體操作按SABC法試劑盒說明進行.光鏡下觀察結果.

1.2.2ICAM1的RTPCR取上述培養6d的3組培養細胞分別加入不同離心管,參照試劑盒說明書按常規方法提取總RNA，將RNA沉淀于室溫晾干,溶于適量無RNA酶水中.在3支0.2mLEppendorf管中依次加入上述總RNA1μL,10×逆轉錄酶緩沖液2μL,AMV逆轉錄酶2μL,10mmol/L4×dNTPs2μL,RNA酶抑制劑1μL,ICAM1和βactinantisenseprimer等量1μL,然后加入無RNA酶水至20μL,充分混勻,42℃反應60min,99℃5min.PCR擴增反應摘要:在0.2mLEppendorf管依次加入10×PCR緩沖液2μL,上述逆轉錄產物1μL,ICAM1和βactinsenseprimer1μL,TaqDNA聚合酶0.5μL,加三蒸水補至20μL,混勻后10000g離心30s,加液體石蠟20μL.在72℃下擴增35個循環,末次循環后延伸6min.取各擴增產物、marker各4μL,于瓊脂糖凝膠電泳.紫外檢測儀下觀察并拍照結果,電泳圖用GelProanalyzer3.1進行分析.重復檢測.

統計學處理摘要：數據以x±s表示，并采用SPSS10.0統計軟件進行析因設計資料的方差分析和單因素方差分析.

2結果

2.1HOCs體外培養Porcoll密度梯度離心法分離出HOCs,呈圓形或卵圓形,大小約為正常肝細胞的1/3(Fig1).ICAM1呈明顯陽性表達(Fig2).用TNFα和TGFβ1干預3，6，9和12d計數觀察HOCs增殖情況,用SPSS10.0統計軟件行析因設計資料的方差分析(Tab1),和對照組比較,TNFα干預組HOCs增殖更顯著(P%26lt;0.01),而TGFβ1干預組無顯著差異(P%26gt;0.05).3組的增殖在12d內均隨時間的增多而增加(P%26lt;0.01).表1TNFα和TGFβ1對HOCs增殖能力的影響（略）

2.2HOCs的ICAM1RTPCR半定量檢測和對照組比較，TNFα組ICAM1mRNA相對灰度值增高(P%26lt;0.01,Tab2，Fig3),而TGFβ1組ICAM1mRNA相對灰度值降低(P%26lt;0.01).TNFα組ICAM1表達較對照組增強,而TGFβ1組較對照組減弱.表2ICAM1mRNA灰度值（略）

3討論

ICAM1是黏附分子免疫球蛋白超家族的一種重要糖蛋白.在生理狀態下,肝臟中的內皮細胞、上皮細胞、白細胞等多種細胞均可表達ICAM1,但表達數量不多.肝臟損傷時,肝組織中ICAM1表達明顯增多,并且,肝損傷時HOCs大量增生［2］.本結果表明,HOCs表達ICAM1.據此,我們認為,肝損傷時肝組織中ICAM1表達增多的原因,除炎癥因子刺激使上皮細胞、白細胞等表達ICAM1增多外,主要是因為HOCs增生,從而使肝組織中ICAM1的表達增多.肝損傷組織中ICAM1表達增強,有二種原因摘要:一是能表達ICAM1的細胞增多；二是受某些因素的調控,細胞對ICAM1的表達增強.Melotti等［4］發現ICAM1的表達受核因子κB(NFκB)的調控,阻斷NFκB的活性則可抑制細胞對ICAM1的表達.Hill等［5］發現,TNFα能激活成纖維細胞的NFκB,并使ICAM1的表達增加.我們發現,TNFα干預下的HOCs對ICAM1的表達能力增強,而TGFβ1則抑制HOCs對ICAM1的表達.據此我們認為,TNFα和TGFβ1對HOCs表達ICAM1的調控可能也是通過調節NFκB的活性來實現的,但TGFβ1的抑制功能明顯弱于TNFα的促進功能.總之,肝損傷時肝組織中HOCs增生,并表達ICAM1,其表達強度受NFκB的調控.

【參考文獻

［1］龔家慶,方馳華.成人肝臟干細胞探究目前狀況及展望［J］.中華外科雜志，2002；40(5)摘要：385-387.

GongJQ,FangCH.Thestatusandprospectofadulthepaticstemcells［J］.ChinJSurg,2002；40(5)摘要:385-387.

［2］龔家慶,方馳華,李雅,等.卵圓細胞參和實驗性肝癌形成過程的探究［J］.中華外科雜志,2004；42(5)摘要：291-295.

GongJQ,FangCH,LiY,etal.Theexperimentalstudyontheovalcellsparticipatinginhepatocarcinogenesis［J］.ChinJSurg,2004；42(5)摘要:291-295.

［3］SammonsJ,AhmedN,KhokherMA,etal.Mechanismsmediatingtheinhibitoryeffectofalltransretinoicacidonprimitivehematopoieticstemcellsinhumanlongtermbonemarrowculture［J］.StemCells,2000；18(3)摘要:214-219.

［4］MelottiP,NicolisE,TamaniniA,etal.ActivationofNFκBmediatesICAM1inductioninrespiratorycellsexposedtoanadenovirusderivedvector［J］.GeneTher,2001；8(18)摘要:1436-1442.

［5］HillRP,MacNeilS,HaycockJW.αmelanocytestimulatinghormoneantiinflammatoryactioninhumandermalfibroblastcells［J］.EurCellMater,2002；4(2)摘要:50.