亞硒酸鈉對大鼠腎小球系膜細胞表達論文

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【摘要目的摘要：觀察亞硒酸鈉對大鼠腎小球系膜細胞系HBZY1表達p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）和單核細胞趨化蛋白1(MCP1)的影響，從而探究硒在防治糖尿病腎?。―N）中的功能機制.方法摘要：分別以高葡萄糖、高胰島素、過氧化氫和糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）刺激HBZY1細胞；先給予100nmol/L亞硒酸鈉預(yù)處理后，再分別以上述4種刺激因素孵育HBZY1細胞，分別檢測HBZY1細胞p38MAPK和MCP1的表達并比較.結(jié)果摘要：4種刺激因素均可作為獨立因素，導(dǎo)致HBZY1細胞p38MAPK和MCP1表達量增加；亞硒酸鈉能抑制上述4種因素所致的p38MAPK和MCP1的表達.結(jié)論摘要：亞硒酸鈉通過抑制p38MAPK和MCP1在HBZY1細胞的表達,從而有效防治DN的發(fā)生發(fā)展，表明硒在DN的防治過程中發(fā)揮積極功能.

【亞硒酸鈉；p38絲裂原活化蛋白激酶；單核細胞趨化蛋白1；系膜細胞；糖尿病腎病

【中圖號R587.24

0引言

近年來國外探究表明單核細胞趨化蛋白1(monocytechemoattractantprotein1，MCP1)和糖尿病腎?。╠iabeticnephropathy,DN）有密切關(guān)系［1］.p38MAPK是細胞信號傳遞的交匯點或共同通路［2-3］，但它在DN發(fā)生中的功能及其和MCP1關(guān)系仍不十分清楚；硒是機體必需微量元素之一，其缺乏可加劇DN的氧化應(yīng)激，并可產(chǎn)生擬高血糖病理狀態(tài)，從而加劇DN的發(fā)生發(fā)展［4］.但其是否功能于p38MAPK和MCP1國內(nèi)外未見文獻報道.我們分別給予高葡萄糖(HG)、高胰島素(HI)、過氧化氫(H2O2)和糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)孵育HBZY1細胞，觀察HBZY1細胞p38MAPK和MCP1的表達以及亞硒酸鈉對HBZY1細胞p38MAPK和MCP1表達的影響.從而明確二者在DN形成中的功能及硒在防治DN中的功能機制.

1材料和方法

1.1材料大鼠腎小球系膜細胞系（HBZY1，中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC）；新生牛血清、RPMI1640培養(yǎng)液、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG（二抗）（北京中山生物技術(shù)有限公司）；亞硒酸鈉(KarolinskaInstitute贈予)；柱離心式總RNA抽提試劑盒、RTPCR兩步法試劑盒、PCR相對分子量標(biāo)準(zhǔn)（TaKaRa公司）；PCR引物合成（上海博亞生物技術(shù)有限公司），蛋白質(zhì)相對分子量標(biāo)記物（BioRad公司）；磷酸化p38MAPK兔多抗（(Promega公司).

1.2方法

1.2.1細胞系HBZY1的培養(yǎng)HBZY1細胞常規(guī)培養(yǎng)于200mL/LRPMI1640培養(yǎng)液中，培養(yǎng)條件為37℃，飽和濕度50mL/LCO2，每2~3日用0.2g/L乙二胺四乙酸（EDTA）消化傳代.HBZY1細胞長滿培養(yǎng)瓶底40%后分為9組，以無血清培養(yǎng)液饑餓24h,然后按實驗分組加入刺激（及干預(yù)）因素.

1.2.2體外制備AGEs參考文獻［5］，按牛血清白蛋白（bovineserumalbumin,BSA）50g/L，和葡萄糖90g/L，0.5mmol/LEDTA及0.2mmol/LPBS（pH7.4）混勻后過濾除菌，37℃恒溫培養(yǎng)箱卵孵育60d.0.1mol/LPBS（pH7.4）中透析48h，測定蛋白含量及熒光強度，分裝后存于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?

1.2.3實驗分組分別以一定濃度HG,HI,H2O2和AGEs刺激細胞系HBZY1一定時間；先給予亞硒酸鈉100nmol/L預(yù)處理HBZY1細胞48h后，再分別以上述4種刺激因素（濃度、時間同前）孵育HBZY1細胞，同時設(shè)對照組.分組情況如下摘要：①對照組摘要：用等體積PBS培養(yǎng)細胞;②HG組摘要：用25mmol/L葡萄糖刺激HBZY1細胞72h;③HI組摘要：用100nmol/L胰島素刺激HBZY1細胞24h;④H2O2組摘要：用100μmol/LH2O2刺激HBZY1細胞1h;⑤AGEs組摘要：用100mg/LAGEs刺激HBZY1細胞6h;⑥亞硒酸鈉+HG組摘要：依次以100nmol/L亞硒酸鈉和25mmol/L葡萄糖分別刺激HBZY1細胞48h和72h;⑦亞硒酸鈉+HI組摘要：依次以100nmol/L亞硒酸鈉和100nmol/L胰島素分別刺激HBZY1細胞48h和24h;⑧亞硒酸鈉+H2O2組摘要：依次以100nmol/L亞硒酸鈉和100μmol/LH2O2分別刺激HBZY1細胞48h和1h;⑨亞硒酸鈉+AGEs組摘要：依次以100nmol/L亞硒酸鈉和100mg/LAGEs分別刺激HBZY1細胞48h和6h.

1.2.4RTPCR法檢測MCP1mRNA表達以柱離心式總RNA抽提試劑盒提取細胞系HBZY1總RNA，測定總RNA濃度，計算純度，A260nm/A280nm均在1.8～2.0之間.MCP1引物序列按文獻［6］摘要：上游引物摘要：5′ATCACCAGCAGCAGGTGTCCCAAAGAAGCT3′；下游引物摘要：5′AGAAGTGCTTGAGGTGGTTGTGGAAAAGAG3′，擴增片段長度258bp.βactin引物序列摘要：上游引物摘要：5′TCCTCTGACTTCAACAGCGACACC3′;下游引物摘要：5′TCTCTCTTCCTCTTGTGCTCTTGG3′，擴增片段長度228bp.以兩步法RTPCR試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄擴增，擴增條件摘要：94℃變性30s，55℃退火1min,72℃延伸1min,共35個循環(huán)，72℃最后延伸7min.每次PCR反應(yīng)至少重復(fù)3次.PCR產(chǎn)物于15g/L瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果經(jīng)圖象分析系統(tǒng)掃描存圖，并對目的條帶進行密度分析.

1.2.5Westernblot法檢測p38MAPK蛋白表達培養(yǎng)的細胞系HBZY1，經(jīng)4℃胞漿蛋白提取液裂解，提取物在冰上孵育2h，然后12000g4℃離心10min，沉淀加入4℃預(yù)冷核蛋白提取液，震蕩混勻，冰浴1h，再12000g4℃離心30min，取上清為核蛋白，其蛋白濃度經(jīng)考馬斯亮藍法定量.磷酸化p38MAPK表達量采用Westernblot法檢測，核蛋白中加入等體積2×上樣緩沖液煮沸5min.進行10mol/LSDSPAGE，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜后用5g/LBSA室溫下封閉2h，分別用1∶2000抗磷酸化p38MAPK兔多抗4℃孵育過夜，用PBS充分洗滌，再用辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG1∶5000，37℃孵育1h，用PBS充分洗滌，DAB顯色試劑盒顯色.結(jié)果經(jīng)圖象分析系統(tǒng)對目的條帶進行掃描存圖并進行密度分析.

統(tǒng)計學(xué)處理摘要：資料采用SAS8.0進行統(tǒng)計分析，組間兩兩比較用非參數(shù)統(tǒng)計分析，P%26lt;0.05即認為有統(tǒng)計學(xué)差異.

2結(jié)果

2.1細胞系HBZY1MCP1mRNA表達細胞系HBZY1MCP1mRNA表達以βactin作為內(nèi)參照物調(diào)整后進行半定量分析，HG，HI，H2O2和AGEs均可作為獨立因素使細胞系HBZY1MCP1mRNA表達量均明顯增加（P%26lt;0.01，表1，圖1）.

表1各組細胞系HBZY1MCP1RTPCR和磷酸化p38MAPKWesternblot半定量結(jié)果（略）

2.2細胞系HBZY1磷酸化p38MAPK蛋白表達細胞系HBZY1磷酸化p38MAPK蛋白表達以βactin作為內(nèi)參照物調(diào)整后進行半定量分，HG，HI，H2O2和AGEs均可作為獨立因素激活p38MAPK，使細胞系HBZY1磷酸化p38MAPK蛋白表達明顯增加（P%26lt;0.01，表1，圖2）.

圖1RTPCR法檢測各組細胞系HBZY1MCP1mRNA和βactinmRNA表達（略）

圖2Westernblot法檢測各組細胞系HBZY1磷酸化p38MAPK蛋白和βactin蛋白表達（略）

2.3細胞系HBZY1MCP1mRNA表達細胞系HBZY1MCP1mRNA表達以βactin作為內(nèi)參照物調(diào)整后進行半定量分析.亞硒酸鈉預(yù)處理后，再分別給予以上4種刺激因素孵育細胞系HBZY1，可見MCP1mRNA表達量分別較相應(yīng)未經(jīng)亞硒酸鈉預(yù)處理各組明顯減少（P%26lt;0.01，表1，圖1）.

2.4細胞系HBZY1磷酸化p38MAPK蛋白表達的影響HBZY1細胞磷酸化p38MAPK蛋白表達以βactin作為內(nèi)參照物調(diào)整后進行半定量分析.先以亞硒酸鈉預(yù)處理細胞系HBZY1后，再分別給予上述4種刺激因素刺激細胞系HBZY1，可見磷酸化p38MAPK蛋白表達量分別較相應(yīng)未經(jīng)亞硒酸鈉預(yù)處理各組顯著減少（P%26lt;0.01），但和對照組比較仍有顯著差異（P%26lt;0.01，表1，圖2）.

3討論

本探究結(jié)果顯示HG,HI,H2O2和AGEs均可單獨誘導(dǎo)細胞系HBZY1，使其MCP1mRNA表達量明顯增加.4種刺激素誘導(dǎo)HBZY1細胞MCP1mRNA表達增加的機制，結(jié)合文獻和實驗結(jié)果我們認為有以下幾點摘要：①高糖有直接刺激MCP1mRNA及蛋白表達增高的功能，該功能是PKC，MAPKs所介導(dǎo)，這可能是DN時腎小球中單核巨噬細胞浸潤的重要原因;②大量AGEs可以和系膜細胞上的AGEs受體（RAGE）相互功能，使IκB磷酸化而導(dǎo)致NFκB激活；新近的探究表明［8］，AGEs和AGEs受體（RAGE）相互功能可消耗細胞內(nèi)谷胱甘肽，產(chǎn)生大量的氧自由基，從而導(dǎo)致細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)改變，激活核轉(zhuǎn)錄因子NFκB/AP1.同時NFκB也是調(diào)節(jié)RAGE表達的一個啟動子，它的位點1和位點2的激活可使RAGE表達上調(diào)，NFκB的激活作為一種正反饋，又進一步促進了AGEs和RAGE的結(jié)合，導(dǎo)致NFκB的持續(xù)活化，而活化的NFκB可以上調(diào)MCP1mRNA和蛋白表達，從而在糖尿病所致腎臟損害中發(fā)揮重要功能;③過氧化氫可導(dǎo)致系膜細胞氧化應(yīng)激加劇，誘導(dǎo)細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生，從而迅速激活NFκB，上調(diào)MCP1表達，在DN發(fā)生發(fā)展早期起重要功能［8］;④HI可能是通過激活PKC，MAPKs信號通路，引起系膜細胞氧化還原狀態(tài)發(fā)生變化，使細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生增加，導(dǎo)致NFκB激活，從而使MCP1表達上調(diào).

MCP1介導(dǎo)糖尿病腎小球損傷.MCP1不僅對血液中單核細胞有很強的趨化活性，也能通過激活轉(zhuǎn)錄因子NFκB和AP1來誘導(dǎo)非炎癥細胞產(chǎn)生細胞因子和黏附分子，在誘導(dǎo)單核細胞遷入內(nèi)皮下間隙及滲入腎小球的過程中起重要功能［7-8］；同時，滲入到腎小球的單核巨噬細胞反過來又刺激局部腎小球細胞，在巨噬細胞衍化生長因子如PDGF和TGFβ等功能下導(dǎo)致系膜增生和細胞外基質(zhì)聚集；此外通過炎癥細胞因子功能，還可上調(diào)黏附分子和趨化因子的分泌，從而進一步有利于白細胞滲入到腎小球［7］.近年來通過細胞實驗及對人和實驗動物DN的探究發(fā)現(xiàn)，MCP1在DN的發(fā)病機制中起重要功能.

p38MAPK可被多種細胞外刺激激活，導(dǎo)致細胞生長、增殖、分化和調(diào)控某些因子表達［9-11］.本探究以糖尿病時存在的4種應(yīng)激因素孵育大鼠腎小球系膜細胞系HBZY1，可見p38MAPK被激活，磷酸化表達增加.

硒是機體必需微量元素之一，是谷胱甘肽過氧化物酶的重要組成部分，缺硒可出現(xiàn)擬高血糖癥病理狀態(tài)，引起白蛋白尿和腎小球硬化，從而加劇DN的發(fā)生發(fā)展；補充硒不僅可預(yù)防氧化應(yīng)激，而且可防止腎臟損傷［4,12］.本探究結(jié)果還顯示，亞硒酸鈉具有類似p38MAPK抑制劑所產(chǎn)生的功能，其機制可能是摘要：①通過保護系膜細胞免遭氧化損傷而抑制MCP1的分泌；②通過抑制p38MAPK信號通路而抑制MCP1在系膜細胞的表達.表明亞硒酸鈉可能通過抑制p38MAPK而延緩DN的發(fā)生發(fā)展，但亞硒酸鈉是否通過抗氧化而抑制p38MAPK亦或功能于信號通路的其它環(huán)節(jié)尚需進一步深入探索，提示硒在防治DN發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著積極功能.

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