中藥復方腦藥動學研討方式

導語：中藥復方腦藥動學研討方式一文來源于網友上傳，不代表本站觀點，若需要原創文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

中藥復方是中醫臨床用藥的基本形式，研究中藥復方的藥代動力學規律可以闡明中藥復方的組方原理與配伍規律，同時也為中藥新藥研究奠定基礎。關于中藥復方藥代動力學研究，國內外學者已經提出了一些新方法和新思路，如“復方效應成分動力學”假說和“血清藥理學”方法［1］。

中藥復方藥代動力學研究的關鍵問題是根據其指標成分(Markers)的體內動力學過程來反映整體的動力學規律，在選擇Markers的同時，對其藥效作用規律探討也是工作的重點所在。杜力軍等［2］利用PK-PD線性模型對清熱復方中3種Markers與發熱大鼠體溫變化進行相關分析，確定了其中黃芩苷有較高的相關性，由此以黃芩苷體內動力學變化表征該清熱復方的體內動力學過程;同時對活血化瘀復方中葛根素和人參皂苷Rg1與所測的藥效指標間進行分析，發現葛根素和人參皂苷Rg1僅在給藥后5～10min體內濃度與血小板抑制率呈正相關(r=0.999和0.996)，且符合線性效應模型(對數濃度-效應)。但葛根素和人參皂苷Rg1在體內的整個濃度變化區間與所測的藥效指標之間無明顯的全程相關性。分析原因，本文作者認為:一方面可能與所選的藥效指標的非即時性(存在作用時間的延遲效應)有關;另一方面，也可能由于中藥復方中藥效物質在體內存在多途徑和多靶點的協同或拮抗作用，以單一的Marker(即使是有效成分)與整體藥效學指標的變化難以直接相關。為此，本文作者提出“組合血藥濃度”的概念，即將Markers的血藥濃度，以對藥效學指標的貢獻大小作為權重，進行加權組合，以“組合血藥濃度”(或稱“表觀藥效濃度”)替代單一Marker的血藥濃度，進行“組合藥代動力學”(combinatorialpharmacokinetics，CPK)研究，并進行CPK-PD線性模型擬合。以活血化瘀中藥復方腦得生為例，以腦得生中的Markers與大鼠全血黏度(bloodviscosity，BV)、紅細胞聚集指數(erythrocyteaggregationindex，EAI)和紅細胞壓積(hematocrit，HCT)等血液流變學特性的改變進行相關分析，探索中藥復方藥效物質基礎及其藥代動力學研究的新方法。

1儀器與材料

LCMS2010EV高效液相色譜質譜儀(日本Shimadzu公司)，LCMSsolution3.0色譜工作站(日本Shimadzu公司)，LC-10ATvp高效液相色譜儀(日本Shimadzu公司)，ANASTAR色譜數據處理系統(美國SuntekScience公司)，微量取樣器(上海求精生化試劑儀器有限公司)，XW-80A型旋渦混合器(江蘇海門市麒麟醫用儀器廠)，TGL-16C臺式離機(上海安亭科學儀器廠)，LG-R-80F血液流變儀(北京世帝公司)，TDZ4-WS低速自動平衡離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司)。甲醇(色譜純，天津康科德科技有限公司)，磷酸(分析純，天津市大茂化學試劑廠)，丙酮(分析純，天津市大茂化學試劑廠)，肝素鈉注射液(上海生物化學制藥廠)。人參皂苷Rg1對照品(0703-200221)、人參皂苷Rb1對照品(110704-200216)、葛根素對照品(752-200108)、黃芩苷對照品(0715-9708，LC/MS內標物)(中國藥品生物制品檢定所)，大豆苷元對照品(美國Sigema公司)，人參皂苷Rd、三七皂苷R1(HPLC法檢測純度質量分數均＞96%)、葛根異黃酮(總黃酮含量質量分數為70%)(沈陽藥科大學天然藥物化學教研室)，紅花黃色素A(紅花黃色素含量質量分數為90%)、腦得生注射液(含紅花黃色素A0.10μg•L－1、葛根素0.76μg•L－1、人參皂苷Rg10.42μg•L－1)(本實驗室自制)，香蘭素(HPLC-UV內標物，分析純，沈陽市試劑廠)。健康Wistar大鼠，體質量200～220g〔沈陽藥科大學動物中心，實驗動物生產許可證號:SCXK(遼)2003-008;實驗動物使用許可證號:SYXK(遼)2003-0012〕;體質量180～220g(中國醫科大學實驗動物室提供)。實驗期間自由飲水，大鼠靜脈給藥試驗前禁食12h。

2方法與結果

2.1指標成分藥代動力學

2.1.1色譜條件血漿中紅花黃色素A與葛根素及其相關異黃酮的HPLC測定［3］.色譜柱:KromasilC18柱(250mm×4.6mm，5μm，Scienhome公司)，流動相:乙腈-體積分數為0.1%的磷酸溶液-四氫呋喃(體積比為8∶92∶2)，流速:1.0mL•min－1，檢測波長:250nm。血漿中大豆苷元、人參皂苷Rg1、Rb1、Rd與三七皂苷R1的LC-MS測定［4］.色譜柱:LunalC18柱(150mm×4.6mm，5μm，Phenomenex公司)，流動相A:體積分數為0.1%的甲酸溶液，流動相B:甲醇，梯度洗脫程序:0～5min［30%(φB)～40%(φB)］、5～20min［40%(φB)～80%(φB)］，流速:0.8mL•min－1，大氣壓化學電離，負離子方式，選擇離子監測。

2.1.2血漿樣品處理方法取肝素抗凝血漿100μL，置2.0mL具塞離心試管中，加入內標溶液50μL、甲醇50μL和丙酮400μL，渦旋混合2min，離心(4000r•min－1)15min。分取上清液，于40℃氮氣流下吹干。殘渣加入甲醇-水(體積比為1∶1)溶液100μL，超聲溶解1min，渦旋混合1min，離心(12000r•min－1)3min，取上清液10μL進樣，記錄色譜圖，根據標準曲線計算血漿藥物濃度。

2.1.3給藥方案與血漿樣品采集Wistar大鼠6只，以10mL•kg－1劑量尾靜脈注射給予腦得生注射液，于給藥前(0h)和給藥后0.033、0.170、0.330、0.670、1.000、2.000、(3.000)、4.000、8.000h由眼眶后靜脈叢取血約0.3mL，置于肝素化試管中，混勻，離心(10000r•min－1)5min，分離血漿，于－20℃冰箱中保存，直至分析測定。

2.1.4數據處理以待測物峰面積與內標物峰面積比值，用標準曲線計算各指標成分的血藥濃度，并將各血藥濃度-時間數據用3p87藥動學程序進行曲線擬合。

2.1.5藥代動力學結果經測定，除3''''-羥基葛根素(3''''-hydroxypuerar-in，P3)表現為類似口服給藥的一級吸收過程，紅花黃色素A(saffloryellowA，SyA)和葛根素(puer-arin，Pu)及其相關異黃酮大豆苷元(daidzein，Da)、大豆苷元-7，4''''-二葡萄糖苷(daidzein-7，4''''-O-glucoside，P2)、3''''-甲氧基葛根素(3''''-methoxypu-erarin，P4)、葛根素芹菜糖苷(puerarinapioside，P5)、未知物I(unknown1，U1)及代謝物I(metab-olite1，M1)在大鼠體內的藥動學過程均符合二室模型;三七皂苷中，人參皂苷RbRb1，GRb1)、人參皂苷Rd(ginsenosidesRd，GRd)、人參皂苷Rg1(ginsenosidesRg1，GRg1)、三七皂苷R1(notoginsenosideR1，NGR1)等動力學過程亦符合二室模型。其中，與藥效動力學過程呈正相關的大豆苷元以及葛根異黃酮代謝物M1的藥-時曲線(根據文獻［3－4］擬合)如圖1、2所示。

2.2藥效動力學文

2.2.1給藥方案與血漿樣品采集Wister大鼠，隨機分為給藥前(對照)、給藥后0.5、1.0、1.5、2.5、4.0h6組，每組5只。對照組不經處置，其他各組大鼠以10mL•kg－1劑量尾靜脈注射給藥后，分別于不同時間心臟穿刺取血4mL，進行血液流變學測定［5］。

2.2.2血液流變學與凝血因子活力測定血液流變學的測定.取肝素抗凝血樣，置血液流變儀中測定BV、HCT和EAI。

2.2.3藥效學結果Markers對BV的影響.對4個切變率(200/s、30/s、5/s、1/s)下的大鼠BV均具有隨時間變化的趨勢，在低切變率下的BV下降幅度大于高切變率。1.0h時BV開始下降，1.5h時下降非常顯著，4.0h時BV同步恢復。時-效曲線見圖3。Markers對HCT的影響在0.5h時HCT開始出現下降趨勢;1.5h時下降顯著，作用持續至4.0h以上。時-效曲線見圖4。Markers對EAI的影響對EAI的影響具有時間依賴性，其變化規律與對BV的影響基本一致。在1.0h以前呈現上升趨勢，1.5h時EAI時顯著下降，作用持續至2.5h，在4.0h時開始恢復。時-效曲線見圖4。

2.3藥代動力學與藥效動力學擬合

2.3.1PK-PD擬合在藥效學檢測指標發生改變的時間區間內(各時間點)，將腦得生中各指標成分的血漿濃度數據(取自然對數值)與藥效學指標數據進行線性擬合，相關系數(R2)和曲線斜率(k)見表1。以R2=的大小作為其相關性評價指標;k作為其貢獻評價指標。Markers與BV的相關性由表1數據可見，Da對BV的下降呈正相關(R2=0.7801～0.9429);GRg1(R2=0.5941～0.8146)和NGR1(R2=0.5594～0.7390)呈負相關;其他各成分無顯著相關性。Markers與EAI的相關性各指標成分與EAI的相關性和與BV的相關性一致。Da對EAI的下降呈顯著正相關(R2=0.9939，r23，0.05=0.994);GRg1(R2=0.9430)和NGR1(R2=0.7305)呈負相關。Markers與HCT的相關性M1對HCT的下降呈一定的正相關(R2=0.6435);P2(R2=0.8245)、SyA(R2=0.7091)、Pu(R2=0.6957)、P5(R2=0.6781)、U1(R2=0.6780)和P4(R2=0.6547)呈負相關;P3(R2=0.5496)、GRb1(R2=0.5168)和GRd(R2=0.4899)呈一定的負相關。經PK-PD線性模型擬合，Da是大鼠BV下降(特別是BV1的下降，EAI=BV1/BV200)的主要藥效物質，M1是HCT下降的主要藥效物質;GRg1和NGR1對BV的下降存在拮抗作用，對HCT下降表現拮抗作用的Markers主要是SyA和葛根黃酮。

2.3.2CPK-PD擬合以藥效學指標發生改變的時間區間內的PK-PD相關曲線的斜率(k)為權重，用公式(1)將不同時間點的大鼠血漿中Markers的濃度(取自然對數)進行加權組合，繪制“組合血藥濃度”-時間曲線、計算“組合藥代動力學”參數，并以“組合血藥濃度”(ρcombinatory)與相同時間點的藥效學指標的相對值(以給藥前指標值為基數的比值)進行CPK-PD線性模型相關分析。lnρi=∑nj=1［kjlnρij］(1)式中，ρi為第i時間點血漿中相關Markers(包括正相關和負相關成分)的“組合血藥濃度”;ρij為第i時間點血漿中第j相關Markers的濃度;kj為第j相關Markers的PK-PD相關曲線的斜率，當正相關(藥理指標的變化趨勢與效應一致)時，其符號不變;當負相關(藥理指標的變化趨勢與效應相反，如本研究中的全血黏度下降表示藥理效應增強)時，其符號相反。經“組合血藥濃度”計算和CPK-PD擬合，上述各項“組合血藥濃度”-時間曲線與藥理效應-時間曲線存在全程相關性。

3討論

a.以其相關系數(R2)作為藥效物質基礎的評價指標、曲線斜率(k)作為其對藥效貢獻大小(包括協同與拮抗作用)的評價指標是可行的。與BV和EAI相關的“組合血藥濃度”-時間曲線見圖5-7;與HCT相關的“組合血藥濃度”-時間曲線見圖8;Da血漿濃度與BV的全程PK-PD相關曲線見圖9(n=5，R2=0.0013～0.0365)，“組合血藥濃度”與BV的全程CPK-PD相關曲線見圖10(n=5，R2=0.7969～0.9085);Da、M1血漿濃度與EAI、HCT的全程PK-PD相關曲線見圖11(n=5，R2=0.1380和0.1165)，“組合血藥濃度”的CPK-PD相關曲線見圖12(n=5，R2=0.8170和0.7948)。3討論a.中藥復方“腦得生”中的指標成分Da是引起大鼠BV和EAI下降的主要藥效物質基礎，而GRg1和NGR1對該藥理指標具有拮抗作用。由表1可見，在大鼠BV發生改變的時間段(1.5～4.0h)內，Da與BV下降存在相關性(R2=0.7801～0.9429，r23，0.05=0.993)，但無全程(0.5～4.0h)相關性(見圖9，R2=0.0013～0.0365，r25，0.05=0.771)。說明:在0.5～1.5h區間，雖然Da血漿濃度較高，但由于GRg1和NGR1的抑制作用，使“組合血藥濃度”處于低水平狀態(圖5-7)，因而不能產生應有的藥理作用。同理，M1是大鼠HCT下降的主要藥效物質，但進行全程PK-PD相關分析時，卻表現出負相關(對HCT下降有抑制作用)。在0.5～1.5h時段內M1濃度雖然處于高水平下降階段，但因受到葛根黃酮的強烈抑制作用(且該抑制作用隨其濃度的下降而逐漸減弱)，表現為“組合血藥濃度”處于低水平、并逐漸升高的變化趨勢(圖8)，該變化趨勢與HCT的變化趨勢一致，故而在CPK-PD擬合中表現出顯著的全程相關性(見圖12，R2=0.7948，r25，0.05=0.771)。b.CPK-PD相關分析中，以PK-PD相關曲線的相關系數(R2PK-PD)的大小為秩序，以CPK-PD相關曲線的相關系數(R2CPK-PD)為指標，可確定中藥復方中對該藥理指標具有協同或拮抗作用的藥效成分，或無該藥理作用的無關成分。通過對多個不同的藥理指標的相關分析，可闡明中藥復方多途徑、多靶點作用的藥效物質基礎及其配伍規律。c.進行CPK-PD相關分析與PK-PD相關分析時，均應首先確定該藥理指標的藥效響應是否存在作用時間的延遲效應。若存在時間滯后，在進行相關分析時，應引入時間差，即將“組合血藥濃度”與藥理指標變化進行時間錯位匹配。d.若對所監測的指標成分(Markers)經CPK-PD相關分析，不能獲得較高的相關系數。說明，所選擇的Markers可能并非該復方中對該藥理指標的藥效物質(群)。其原因可能是藥理指標選擇不恰當，或起藥效作用的物質基礎并非復方中Markers的原形結構。正如本文中，大鼠HCT下降的主要藥效物質并非腦得生中的原形物質，而是葛根黃酮的活性代謝物M1，其結構有待進一步確證。