探析大黃靈仙膠囊的藥理功用

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【摘要】目的探討大黃靈仙膠囊對慢性肝損傷家兔膽結石形成的干預作用及其作用機制。方法將46只家兔隨機分為正常組、慢性肝損傷組、肝硬化組、大黃靈仙膠囊大劑量組、大黃靈仙膠囊小劑量組。采用皮下注射CCl4方法進行慢性肝損傷造模,各組同時進行不同處理。最后觀察各組膽囊成石率，肝臟功能生化指標，肝組織病理改變、超微結構改變，膽汁成分改變。結果慢性肝損傷組、肝硬化組膽石形成陽性檢出率較正常對照組顯著增加（P＜0.05或P＜0.01）。

大黃靈仙膠囊大劑量組、大黃靈仙膠囊小劑量組膽石陽性檢出率較肝硬化組有顯著降低(P＜0.01或P＜0.05)。各模型組中肝臟超微結構均發生不同程度異常改變，大黃靈仙膠囊大、小劑量治療組肝臟病理改變、肝細胞超微結構改變較模型組比較均有改善，大劑量組尤為明顯。大黃靈仙膠囊大、小劑量組血清AST，ALT，γ-GT，非結合膽紅素均明顯低于肝硬化組（P＜0.05或P<0.01）；總膽紅素、間接膽紅素、鈣離子大黃靈仙膠囊大、小劑量組較肝硬化組明顯降低（P<0.01），大劑量組較小劑量組明顯降低（P<0.01）。結論大黃靈仙膠囊對慢性肝損傷后膽結石形成具有明顯的預防效果，其作用機制主要與抑制CCl4所致肝臟損傷的作用有關，同時與大黃靈仙膠囊在多層次、多途徑調節參與結石形成各因素關系密切。

【關鍵詞】慢性肝損傷；肝硬化；大黃靈仙膠囊；膽結石；肝臟超微結構

本實驗利用CCl4皮下注射誘發家兔慢性肝損傷，在此基礎上觀察膽囊結石形成率，并用大黃靈仙膠囊組方煎劑進行灌胃，通過觀察結石形成率，肝臟細胞超微結構的病理學改變，測定實驗動物肝功能及膽汁成分并進行膽汁培養，以探討大黃靈仙膠囊對家兔慢性肝損傷膽結石模型的干預治療作用。

一、材料與儀器

1.1材料、儀器健康家兔，體質量2.5～3.0kg，雌雄不拘，普通級，廣西中醫學院實驗動物中心提供，合格證號20060820。各生化試劑盒分別購于上海申能德賽診斷技術有限公司和伊利康生物技術有限公司。奧地利Biocell2010酶標儀、日立H-500透射電鏡、BX-50-32001奧林巴斯光學顯微鏡、HPIAS-1000P病理圖文分析系統等分別由廣西醫科大學中心實驗室、廣西中醫學院一附院病理實驗室提供。

1.2藥品造模用藥：CCl4分析純（將CCl4與花生油以1∶2.5比例混合，37℃加熱使充分溶解，制成40％CCl4溶液，）、膽固醇分析純，均為上海國藥集團產品。受試用藥：大黃靈仙膠囊(生大黃150g，威靈仙300g，芒硝100g，金錢草300g，枳殼120g，雞內金100g，澤蘭150g，柴胡120g，郁金120g，磁石120g，黃芪300g，甘草50g)，以上共計1930g生藥，由廣西中醫學院第一附屬醫院制劑室提取965ml濃縮藥液，并無菌密封瓶裝（生藥量為2g/ml）。

二、方法

2.1動物分組及處理方法健康家兔46只，體質量2.5～3.0kg，雌雄不拘，適應性喂養1周后隨機分為5組，即正常對照組10只、慢性肝損傷組8只、肝硬化組8只、大黃靈仙膠囊大劑量組10只（用藥量相當于成人用量的3倍）、大黃靈仙膠囊小劑量組10只（用藥量相當于成人用量）。正常對照組普食喂養，每日灌服生理鹽水4ml/kg；慢性肝損傷組采用“慢性肝損傷兔動物模型”的建立，普食喂養10周后，每日灌服生理鹽水4ml/kg；肝硬化模型組造模方法：家兔稱重后以2ml/kg體質量，將40％CCl4溶液頸后皮下注射，每4天1次，以形成皮下丘狀突起為宜。造模后第10周開始每日灌服生理鹽水8ml/kg；大黃靈仙膠囊大、小劑量組第10周起每日灌服膽通膠囊提取液8ml/kg，4ml/kg。普食喂養。

2.2檢測指標及方法

2.2.1膽囊結石成石觀察結石判定標準為正常膽囊膽汁內無有形成分。肉眼觀察膽汁內有無棕黑色成型顆粒或泥沙樣沉淀；鏡下觀察有無結石微粒或結晶。

2.2.2生化指標檢測天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）、丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、γ-谷氨酰轉肽酶(γ-GT)采用速率法檢測；血清中總膽紅素、直接膽紅素、間接膽紅素、血清總膽固醇、總膽汁酸、膽汁總膽汁酸、總膽固醇采用化學比色法檢測；鈣離子含量采用乙二胺四乙酸二鈉法檢測；磷脂含量酶顯色法檢測。

2.3統計學處理所有數據采用SPSS14.0統計軟件進行分析，計量資料以±s表示，兩組間均數比較用t檢驗；兩組間率的比較采用卡方檢驗；P＜0.05認為有統計學意義。

三、結果

3.1家兔膽囊結石發生情況。

3.2家兔肝臟病理改變光鏡下觀察，慢性肝損傷組（見圖1，2）：纖維組織增生，肝細胞水腫，局部氣球樣變，膽管增生，少許淋巴細胞浸潤，匯管纖維間隔稍增寬。肝硬化組（見圖3～4）：見假小葉形成，小葉內中央靜脈缺如，細胞排列紊亂，多數細胞水腫，局部氣球樣變，小膽管增生、伴有淋巴細胞浸潤。大黃靈仙大劑量組（見圖5～6）：細胞排列規則，少數肝細胞水腫，小葉結構清晰，匯管區結構正常，無炎性細胞浸潤，未見小膽管增生。大黃靈仙小劑量組（見圖7～8）：肝細胞排列規則，中度水腫，局部氣球樣變，匯管區纖維增寬，膽管增生，少量淋巴細胞浸潤。

3.3家兔電鏡肝細胞超微結構的改變電鏡觀察：大黃靈仙小劑量治療組圖（見圖9～12）：正常結構可見，大量滑面內質網、大量膠原纖維。線粒體固縮，嵴可見。大黃靈仙大劑量治療組(見圖13～16)：正常結構可見，糖原多，滑面內質網多，粗面內質網少，大量膠原纖維。核模較完整，線粒體多正常。

3.4家兔血清天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）、丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、γ-谷氨酰轉肽酶(r-GT)含量分析。

3.5血清總膽紅素（TBIL）、直接膽紅素（DBIL）、間接膽紅素（IBIL）含量分析結果見表3。表3血清TBIL，LDBI，LIBIL含量比較（略）

3.6家兔血清總膽固醇（TC）、總膽汁酸（TBA）、磷脂（PL）含量分析結果見表4。表4血清TC、TBA、PL含量比較（略）

3.7家兔膽汁總膽固醇（TC）、磷脂（PL）、鈣離子(Ca2+)含量分析結果見表5。表5膽汁TC、PL、Ca2+含量比較（略）

3.8家兔膽汁總膽汁酸（TBA）、總膽紅素（TBIL）、間接膽紅素（IBIL）的含量分析結果見表6。表6膽汁TBA、TBIL、IBIL含量比較（略）

四、討論

膽結石的發病機制至今仍未完全闡明，既往研究表明，膽結石的形成是多種因素綜合作用的結果。因此研究慢性肝損傷與膽石癥發生之間的關系有重要意義。膽結石伴有肝臟的組織學改變，尤其是膽管結石。可能的主要機制是膽道內壓力升高，通過膽道炎癥、膽道梗阻等原因，使膽囊內壓力升高，繼發膽道壓力升高，從而造成肝內膽汁淤滯，導致肝細胞損害。有學者認為膽囊結石病伴隨的肝臟損害，很可能是膽囊結石的成因，它可能先于膽囊結石而存在，而膽囊結石病的反復發作可能反過來加重原發性肝損害，ChignardN進一步提出肝細胞合成分泌膽汁機制受損有可能是膽囊結石患者所存在的一系列肝膽道病理狀態的啟動扳機。而肝臟的損害首先就表現在肝細胞的超微結構的改變上，滑面內質網的減少和代償性增生表明催化膽固醇轉化為膽汁酸的7α羥化酶數量和活力有可能受到影響，以致于膽汁酸合成減少，從而造成膽汁中膽固醇與膽汁酸比例增高，增加了成石的機率。本次實驗發現各模型組家兔的肝臟超微結構均伴有不同程度的改變，存在有不同程度的膜破裂，質漿中的粗面內質網和高爾基復合體水腫、變性，線粒體壞死，雙層模結構消失，部分甚至有空泡樣變，滑面內質網減少，粗面內質網部分斷裂，顆粒減少，溶酶體增加，肝細胞邊界模糊不清，細胞質電子密度減少等各種相應結構改變。肝硬化組表現尤其明顯，AST較慢性肝損傷組有著性差異（P＜0.01）；γ-GT較慢性肝損傷組有明顯差異（P＜0.05）。

本實驗結果顯示，肝硬化家兔膽囊結石發生率為83.3％，慢性肝損傷組膽囊結石發生率為63％，而正常對照組為0。前兩者與正常對照組比較均有顯著差異（P＜0.05，P＜0.01）。肝硬化組與慢性肝損組比較，膽囊結石陽性檢出率沒有明顯差異，但肝硬化組膽囊膽汁可見有形成分較慢性肝損組明顯居多，且后者膽汁中以膽泥為主。目前已有實驗證明膽泥形成是膽石形成的必經階段，肝硬化的病程越長，合并膽囊結石的危險性越大，本次實驗結果更進一步證實了這一結論。

本實驗光鏡、電鏡觀察發現：慢性肝損傷組與肝硬化組動物中形成的結石為棕綠色和黃褐色，膽石中存在較多的是膽色素顆粒而僅有少量膽固醇結晶，不同于高膽固醇膳食組，這一結論提示：在慢性肝損傷狀態下膽石的成因機制中，膽色素類結石是其形成機制之一。

實驗中發現慢性肝損傷組家兔膽囊幾乎均為針尖樣膽沙，而隨著造模時間的延長，肝硬化組家兔膽囊中出現1mm左右大小的結石，光鏡觀察不同于高膽固醇膳食組的膽固醇結晶。結合對其膽汁成分的分析，我們發現膽固醇組膽汁中的膽固醇含量顯著高于正常對照組（P＜0.05），慢性肝損傷組與肝損傷膽固醇組與正常組沒有明顯差異，而肝硬化組膽固醇含量低于正常組。肝硬化組膽汁膽紅素高于其他各組（P＜0.05）。此結果提示：飲食中的膽固醇過量，可導致膽汁中形成膽固醇過飽和，隨后膽固醇結晶，結晶析出逐漸形成結石。

中醫學認為肝膽互為表里，肝主疏泄，膽汁的排泄有賴于肝的疏泄功能，肝的疏泄功能直接控制和調節膽汁的排泄。肝失疏泄主要表現為氣機不暢、氣機郁結之病理變化，也稱“肝氣郁結”。情志不暢，飲食不潔、蟲積或痰濁瘀血內結于肝膽等原因均可引起肝膽疏泄失常，導致肝膽氣郁，郁久化熱，濕濁內生，濕熱內盛，蘊結肝膽，濕熱熏蒸，煎熬膽汁而導致膽石。此病機正同西醫認為的“肝臟功能障礙，特別是肝細胞功能障礙而致病理性膽汁分泌和排膽功能障礙是膽結石形成的基礎”之理論相一致。同時中醫認為膽汁排泄不暢，亦會影響肝之疏泄，即所謂的“膽病及肝”，這與西醫的“肝細胞功能損害與膽結石可能是互為因果”理論相一致。

大黃靈仙膠囊為治療膽石病的有效中藥制劑，方中大黃、芒硝攻下導滯、利膽排石；金錢草、郁金、柴胡、枳殼、澤蘭相伍，既有清熱利濕之功，又有理氣祛痰之效；雞內金、金錢草、威靈仙為排石佳品；威靈仙、磁石為經驗用藥；黃芪、甘草意在益氣補虛，保護胃氣。諸藥合用共奏疏肝利膽，攻下排石的功效。其預防色素性結石的作用與其在保護肝細胞和膽囊組織，維持膽汁有形成分代謝的正常化以及抑菌抗菌等多重作用有關。wWw.gWyoO

膽汁中膽汁酸含量降低，未結合膽紅素含量升高，可能是其形成結石的主要原因。本次實驗發現，大黃靈仙膠囊對肝損傷家兔膽汁中的膽汁酸、鈣離子和膽固醇水平有影響，可以明顯增加肝損傷家兔膽汁中膽汁酸的含量，降低鈣離子的含量且大劑量組較小劑量組增加膽汁酸的作用為優；中藥大黃靈仙膠囊對四氯化碳所致的肝損傷家兔的肝臟的損傷有一定的預防作用和對在肝損傷基礎上誘發的膽囊結石有明顯的干預作用。

慢性肝損傷在是臨床上較為常見的肝損傷。肝炎病毒性肝損傷、酒精性肝損傷、藥物性肝損傷、代謝性肝損傷、膽道疾病引起繼發性肝損傷以及環境污染食品引起的肝損傷等都屬于慢性肝損傷的范疇。但目前由膽道疾病引起的肝損傷卻從未引起人們的重視，慢性肝損傷與膽結石的關系尚未有人明確提出。因此，研究慢性肝損傷與膽結石的形成密切相關，從肝細胞損傷的角度治療膽石病具有十分重要的意義。

本次實驗僅對慢性肝損傷與膽結石的相關性、肝損傷家兔基礎上誘導建立膽石癥模型的可行性及中藥大黃靈仙膠囊的干預作用做了初步的探討和分析，隨著分子生物學的研究的深入，家族分析及家系研究的進展，人們對膽石成因的研究逐漸推向基因領域。目前對膽石基因的研究取得了一定的進展，對影響膽石形成各因素的基因調控也有了一定的認識，如以基因（或蛋白）表達為指標，以基因調控改變和功能修飾為研究方向，進行防止膽石病有效中藥復方多組分的多環節、多靶點調整的研究，可望對臨床有效中藥復方的作用機理研究取得突破性進展。

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