冷凍保存同種異體血管研究進(jìn)展

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隨著現(xiàn)代免疫學(xué)、冷凍生物學(xué)、分子生物學(xué)的發(fā)展，冷凍保護(hù)劑、免疫抑制

劑的應(yīng)用以及注重移植結(jié)構(gòu)及功能的完整。冷凍保存同種異體靜脈無(wú)論是基礎(chǔ)研究

還是臨床實(shí)踐都獲得相當(dāng)經(jīng)驗(yàn)，但存在移植物再狹窄及替代小口徑動(dòng)脈(＜2mm)

失敗率高的缺點(diǎn)。近年來(lái)，有關(guān)動(dòng)脈作為血管替代物逐漸被重視，取得一些進(jìn)展

，但尚需繼續(xù)長(zhǎng)期地探索和實(shí)踐。

1血管移植免疫進(jìn)展

大量的實(shí)驗(yàn)和臨床結(jié)果不但證實(shí)血管內(nèi)皮細(xì)胞(EC)是移植排斥重要的靶器官，

而且通過(guò)其抗原遞呈作用、表型變化和細(xì)胞因子合成等，主動(dòng)參與移植排斥過(guò)程

。EC表達(dá)多種抗原，如：ABO血型抗原，MHC抗原和血管內(nèi)皮細(xì)胞抗原系統(tǒng)。在排

斥過(guò)程中，EC上的抗原與其相應(yīng)的抗體結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物，激活補(bǔ)體釋放

趨化因子，白細(xì)胞在補(bǔ)體參與下溶解EC，使基底膜暴露，激活凝血系統(tǒng)，形成血

栓，激活的巨噬細(xì)胞釋放白介素-1、腫瘤壞死因子等可提高EC表面組織因子活性

，增加纖溶酶激活物抑制因子和減少血栓調(diào)理蛋白，EC在細(xì)胞因子刺激下可合成

和分泌單核細(xì)胞趨化因子MCP-1/JE，吸引單核巨噬細(xì)胞遷移至移植物局部。同時(shí)

表達(dá)ClassⅡ抗原，提供所有激活CD4+T細(xì)胞所必需的信號(hào)，并可產(chǎn)生各種細(xì)胞因

子，引起表型的變化。另外內(nèi)皮細(xì)胞膜還可作為血管緊張素轉(zhuǎn)化酶場(chǎng)所，以使血

管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化成血管緊張素Ⅱ，使血管收縮。近來(lái)，一些學(xué)者發(fā)現(xiàn)血管平滑肌

細(xì)胞也表達(dá)ClassⅠ和ClassⅡ抗原系統(tǒng)，參與排斥反應(yīng)全過(guò)程〔1〕。

2同種異體血管移植的基礎(chǔ)研究進(jìn)展

2.1移植前血管處理及冷凍復(fù)溫技術(shù)

2.1.1制備(1)供體選擇來(lái)源于新鮮尸體及創(chuàng)傷性截肢患者，采用美國(guó)組織

庫(kù)協(xié)會(huì)(AATB)制定的標(biāo)準(zhǔn)〔2〕。取血管應(yīng)在死后4h完成，所有操作均在無(wú)菌條

件下進(jìn)行。(2)制備技術(shù)的基本原則：從供體獲取血管應(yīng)嚴(yán)格遵循無(wú)創(chuàng)傷技術(shù)；獲

取血管前15～30min，供體給予平滑肌松弛劑(罌粟堿)及抗凝藥物(肝素)，以防

止血管痙攣和血栓形成；保持制備液和室溫37℃；灌注壓＜100mg。(3)理論上以

37℃自身含罌粟堿肝素化血液低壓灌注可最好保持血管的生物活性，但通常從供

體獲取血液是困難的。目前常采用37℃的生物培養(yǎng)液(如DMEM，1640)，Brocdban

k等獲得保存24h后80%內(nèi)皮細(xì)胞存活率和平滑肌收縮度最大限度的保持〔3〕。

2.1.2冷凍復(fù)溫隨著冷凍保護(hù)劑二甲基亞砜(DMSO)和甘油的應(yīng)用及控溫冷

凍技術(shù)的成熟，血管活性得以很好的保持。DMSO因穿透力強(qiáng)，研究較多，其濃度

以15%為最佳。控溫冷凍第二步溫值在-60～-80℃之間，冷凍速率為0.5～1℃/mi

n，復(fù)溫采用37℃水浴快速?gòu)?fù)溫。經(jīng)過(guò)這樣處理的靜脈獲得80%的內(nèi)皮細(xì)胞存活率

。Banbang等證實(shí)這些內(nèi)皮細(xì)胞具有與正常內(nèi)皮細(xì)胞相似的增值和抗凝血功能〔4

〕。Salomon等也從冷凍保存靜脈上獲得表達(dá)HLA抗原的平滑肌細(xì)胞〔1〕。

2.2實(shí)驗(yàn)性同種異體移植與自體移植的比較性研究同種異體血管移植的主

要障礙是受體的免疫排斥反應(yīng)。因此，研究在免疫缺陷的情況下在體冷凍保存血

管移植的變化是必需的。這樣自體冷凍血管不僅檢驗(yàn)血管制備及宿主對(duì)移植物產(chǎn)

生排斥反應(yīng)的冷凍保存技術(shù)的效果，而且通過(guò)與同種異體移植物移植后組織結(jié)構(gòu)

與功能的對(duì)比，了解同種異體移植物在整個(gè)過(guò)程中的變化。

自體移植物在移植過(guò)程中，可因離體缺血、牽拉、切割、吻合及在受體動(dòng)脈高

壓沖擊下，內(nèi)皮細(xì)胞可有不同程度的壞死，從而使位于內(nèi)皮細(xì)胞下的結(jié)締組織裸

露于血流，使附壁血栓形成。1周后殘留的附壁血栓向致密而平滑的纖維被膜演變

，同時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞再生開(kāi)始。內(nèi)膜增生和動(dòng)脈粥樣硬化是發(fā)生在內(nèi)皮下層兩個(gè)相關(guān)

聯(lián)的病理現(xiàn)象，或許是不可避免的創(chuàng)傷適應(yīng)性改變。移植血管中膜可見(jiàn)平滑肌細(xì)

胞壞死和纖維替代，外膜因部分膠原纖維束斷裂和血管滋養(yǎng)管栓塞，形成纖維瘢

痕，移植后72h，新的滋養(yǎng)血管出現(xiàn)，2個(gè)月后基本恢復(fù)正常，神經(jīng)再生于2～4周

后開(kāi)始。上述這些改變實(shí)質(zhì)上是導(dǎo)致自體靜脈移植后失敗的病理基礎(chǔ)。

相對(duì)于自體靜脈移植的內(nèi)膜增生，同種異體移植物動(dòng)脈化主要是中膜增生〔5

〕。當(dāng)在同種異體移植物中又觀察到的內(nèi)膜增生是由于局部血栓沉積后成纖維細(xì)

胞的重新排列，移植后10d內(nèi)皮細(xì)胞因免疫反應(yīng)而脫落，在隨后的6個(gè)月內(nèi)，裸露

的內(nèi)膜上纖維蛋白堆積減少并出現(xiàn)重新內(nèi)皮化，3～6個(gè)月移植物外膜的血管周?chē)?/p>

組織可見(jiàn)游離淋巴細(xì)胞并在9個(gè)月后消失。移植后5個(gè)月前列環(huán)素(PGI2)生成量與

受體動(dòng)脈PGI2生成量相比有顯著性差異(P＜0.001)〔6〕。新鮮靜脈的順應(yīng)性明顯

低于正常動(dòng)脈灌注壓下動(dòng)脈順應(yīng)性(P＜0.001)〔5〕，可以看出，盡管移植段靜脈

結(jié)構(gòu)發(fā)生動(dòng)脈化，但其內(nèi)膜功能和生物力學(xué)特性并未發(fā)生動(dòng)脈化。自體移植物與

異體移植物短期的不同在于異體移植物經(jīng)歷一個(gè)免疫反應(yīng)及內(nèi)皮細(xì)胞脫落的過(guò)程

，因此，減少或阻止受體免疫排斥反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)被嘗試。

2.3免疫抑制劑對(duì)同種異體移植物的影響移植物免疫反應(yīng)特點(diǎn)已見(jiàn)前述，

可以肯定免疫排斥反應(yīng)在移植過(guò)程中扮演極其重要的角色。Augelli分別用倒置異

體靜脈作為動(dòng)脈橋接物，結(jié)果顯示經(jīng)免疫抑制劑處理組與未用免疫抑制劑處理組

通暢率之比為7/11∶0/10，有顯著性差異(P＜0.001)，但長(zhǎng)期通暢率依賴(lài)于免疫

抑制劑的應(yīng)用〔7〕。Miller等移植術(shù)后受體行免疫抑制治療及抗血小板治療1月

后，血管平滑肌喪失功能〔8〕。可以看出盡管免疫抑制劑可能增加移植物通暢率

，并且不損害內(nèi)皮細(xì)胞的可能性也存在，但免疫抑制劑增加血小板聚集及血栓素(

TxA2)的釋放，減少前列環(huán)素(PGI2)的產(chǎn)生，同時(shí)潛在的免疫抑制特性可能導(dǎo)致感

染、神經(jīng)、腎毒、肝臟、血液、內(nèi)分泌等并發(fā)癥〔9〕。因此，移植物的治療代替

受體的治療能避免免疫抑制劑的并發(fā)癥，這建立在冷凍保存移植物免疫抑制劑術(shù)前

治療可能會(huì)減低免疫反應(yīng)和提高通暢率這個(gè)假設(shè)上，靜脈移植物術(shù)前治療能顯著提

高通暢率已作為一種方法被肯定。

2.4血管移植受體的抗凝血治療在藥物實(shí)驗(yàn)中抗血小板治療能減少移植物

血栓形成的觀點(diǎn)已被接受。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，經(jīng)抗血小板治療的異體移植物與未經(jīng)治

療移植物早期通暢率之比為83%∶58%〔10〕。近年來(lái)，對(duì)阿司匹林等抗凝藥物的作

用機(jī)制有新的看法，認(rèn)為其在抑制血小板釋放效應(yīng)的同時(shí)，也抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞P

GI2的合成〔11〕。因此，抗凝藥物使用與否，有待于進(jìn)一步的對(duì)比研究和臨床長(zhǎng)

期觀察。

3臨床應(yīng)用的初步結(jié)果

初期一些學(xué)者通過(guò)戊二醛、酒精浸泡、冷凍、射線照射等來(lái)降低移植物的抗原

性，以提高移植物的通暢率，這些研究結(jié)果從術(shù)后6～12個(gè)月15%至13～42個(gè)月78%

的不等通暢率。1971年D用改良的臍帶靜脈行下肢血管重建術(shù)后3年獲得76.4%(股

)～39.8%(股腓)的通暢率。Shan等列出了38個(gè)患者43條硫酸軟骨素保存的靜脈得到

9～17個(gè)月至12～18個(gè)月累積67.8%的通暢率。1994年Mestres報(bào)道用大口徑冷凍保

存動(dòng)脈得到8個(gè)月92.9%的通暢率〔12〕。另外，一些回顧性的隨機(jī)的臨床報(bào)告正著

手調(diào)查，這些研究包括失敗的機(jī)制以及猜測(cè)治療干涉手段或改善移植術(shù)的外科技術(shù)

，更多的臨床經(jīng)驗(yàn)和移植物的長(zhǎng)期觀察和積累，將決定是否在無(wú)合適的自體血管下

有限制的使用問(wèn)題。

4同種異體血管移植失敗的影響因素

影響移植段通暢率的因素，分為內(nèi)源性和外源性?xún)深?lèi)，影響移植段遠(yuǎn)期通暢率

的主要因素是內(nèi)源性因素。外源性因素包括：(1)手術(shù)技術(shù)缺陷：未遵循無(wú)創(chuàng)傷原

則，吻合技術(shù)所致吻合口狹窄、扭曲等；(2)流出道受阻：Mcnally報(bào)道在膝關(guān)節(jié)以

下動(dòng)脈旁路移植術(shù)后1年通暢率的結(jié)果，當(dāng)移植物處于0～1個(gè)流出道情況下得到44

%的通暢率，而在2～3個(gè)流出道時(shí)則獲得73%的通暢率〔13〕；(3)靜脈移植瓣膜；

(4)其他：如內(nèi)毒素、感染等。內(nèi)源性因素包括：(1)免疫排斥反應(yīng)；(2)管壁結(jié)構(gòu)

的病理性改變，如動(dòng)脈粥樣硬化；(3)生物力學(xué)的不匹配，如順應(yīng)性的改變；(4)移

植段功能的改變，如PGI2的釋放減少，TxA2的釋放增加。另外，血管內(nèi)膜釋放的內(nèi)

皮細(xì)胞血管舒張因子(EDRF)、內(nèi)皮素(ET)、抗凝血酶Ⅲ(ATⅢ)和肝素分子復(fù)合物、

血栓調(diào)理蛋白(TM)、蛋白激酶C(PC)以及纖溶酶原激活物(PA)也參與整個(gè)過(guò)程〔14

〕。近來(lái)一些生長(zhǎng)因子，如血小板衍生因子、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)

因子的作用也得到重視〔15〕。這些物質(zhì)如何相互作用，影響移植物通暢率，是今

后值得進(jìn)一步研究的課題。

5展望

盡管冷凍小血管異體移植已經(jīng)取得很大成績(jī)，并展示出令人激動(dòng)的前景，但仍

有許多尚未解決的問(wèn)題和難點(diǎn)，如移植段新生內(nèi)皮細(xì)胞的來(lái)源，冷凍保存能否降低

抗原性，冷凍保存動(dòng)脈移植能否成為合適的移植物應(yīng)用于臨床。大部分血管移植的

最終目的是保存完整肢體的成活，特別在創(chuàng)傷外科中，當(dāng)合并有其他嚴(yán)重創(chuàng)傷不能

耐受手術(shù)時(shí)，如果肢體能被冷凍保存直至能耐受手術(shù)時(shí)再植，肢體就能挽救。依靠

現(xiàn)代冷凍保存技術(shù)，肢體延遲重建將由夢(mèng)想變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)。而改進(jìn)HLA配型技術(shù)、提高

供體質(zhì)量、新的免疫抑制劑和生物制品的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用以及移植后準(zhǔn)確靈敏的免疫檢

測(cè)等，仍是移植免疫學(xué)研究的重要課題。

作者簡(jiǎn)介：孫煒(1970-)，男，安徽黃山人，主治醫(yī)師，現(xiàn)為第一軍醫(yī)大學(xué)博士

生，主要從事骨質(zhì)疏松和關(guān)節(jié)外科研究.

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