小議靈芝代謝對腫瘤細胞的影響

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摘要：目的了解靈芝代謝產物對腫瘤細胞的作用。方法①體質量為18～22g昆明140只小鼠隨機分為7組，其中6組左前腋皮下注射S180，然后分別給予生理鹽水、腹腔注射含靈芝代謝產物培養基、環磷酰胺、腹腔注射含靈芝代謝產物培養基加抗血清組、口服含靈芝代謝產物培養基組和單純腹腔注射抗血清組處理，未注射S180的20只給予生理鹽水，一周后處死各組動物觀察各組腫瘤質量大小、血清TNF-α水平、血清中谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶變化。結果腹腔注射含靈芝代謝產物培養基加抗血清組能有效減輕荷瘤小鼠的腫瘤質量，其質量減輕程度與環磷酰胺無差異。結論靈芝代謝產物中的羥基可能參與了抗腫瘤作用。

關鍵詞：靈芝代謝產物;TNF-α;腫瘤;羥基

靈芝是我國醫學寶庫中的靈芝屬藥、食兩用真菌。其在自然界生長過程中必然要與細菌等自然界其他微生物爭奪營養，而靈芝作為一種真菌，生長速度要遠慢于細菌，所以作為靈芝能獲勝的法寶之一可能就是其代謝產物，而真菌代謝產物的開發早已被證明是非常有價值的，比如歷史上青霉素的發現就是例證，在這方面我國的發展步伐卻比較慢，靈芝代謝產物藥理作用的開發也將豐富我國中藥的用途。對于靈芝代謝產物的研究目前并不多而且主要集中在其中靈芝多糖的測定上［1］。但靈芝的代謝產物是否能夠對腫瘤細胞有所作用？為解決這個問題，我們進行了如下實驗。

1材料與儀器

1.1試劑環磷酰胺（CTX）注射液由上海華聯制藥有限公司生產（生產批號為071002）。TNF-αELISA試劑盒購于渤海生物公司。肝功能檢測試劑盒購于上海榮盛公司。

1.2含靈芝的代謝產物培養基取生長于斜面固體培養基上的靈芝菌泥（約1cm2）接種于100ml液體培養基（含2%黃豆粉，2%蔗糖，0.075%的磷酸二氫鉀，0.03%的硫酸鎂），25℃100r/min條件下培養5d，用濾紙過濾后得到含靈芝的代謝產物培養基。將這些培養基在-20℃條件下保存待用。

1.3抗血清制備使用李麗華等［2,3］報道的琥珀酸酐法將含靈芝的代謝產物培養基中所有成分的羥基與小牛血清白蛋白（BSA）連接。使用連接后的化合物免疫昆明小鼠，制備抗血清。經瓊脂雙向擴散法測定該抗血清的效價是1∶16。

1.4腫瘤細胞株S180購自河北醫科大學動物中心。

1.5動物昆明小鼠(由河北醫科大學動物中心提供)146只，體質量為18～22g，雌雄各半。

1.6儀器微量加樣器（SOCOREX,瑞士）；電熱恒溫培養箱（上海福瑪實驗設備有限公司），離心機（國產）,Humalyzer2000型全自動生化儀，德國豪邁公司生產等。

2方法

2.1建立腫瘤模型選擇6只昆明小鼠腹腔接種S180，接種5d后的小鼠，消毒腹部皮膚，用無菌空針抽吸腹水放入無菌容器內，置冰塊保存。用0.4%臺盼藍染色后計數,在倒置式顯微鏡下計數，計算存活率，,用Hank''''s液稀釋細胞懸液使活細胞數達到1×109個·ml-1，隨機選取120小鼠，每只小鼠左前腋皮下注射0.2ml（活細胞數達到1×109個·ml-1）細胞懸液，另外20只小鼠不做任何處理作為正常組。

2.2動物分組將120只已經注射了S180的小鼠隨機分為6組，每組動物各20只，分為陰性對照組、腹腔注射含靈芝代謝產物培養基組（注射產物組）、環磷酰胺（CTX）組、腹腔注射含靈芝代謝產物培養基加抗血清組（注射產物加血清組）、口服含靈芝代謝產物培養基組（口服產物組）和抗血清組。陰性對照組和正常組胃飼生理鹽水0.2ml/（kg·d）；環磷酰胺組腹腔注射環磷酰氨0.075g/（kg·d）；腹腔注射含靈芝代謝產物培養基組給予腹腔注射靈芝代謝產物2ml/（kg·d），抗血清組給予腹腔注射抗血清2ml/（kg·d），腹腔注射含靈芝代謝產物培養基加抗血清組給予腹腔注射靈芝代謝產物2ml/（kg·d）同時腹腔注射抗血清2ml/（kg·d），口服含靈芝代謝產物培養基組給予口服含靈芝代謝產物培養基2ml/（kg·d）。

2.3動物處理以上各組在接瘤24h后開始給藥,連續給藥7d后，處死動物，取出腫瘤和肝臟，用電子天平稱出腫瘤質量。同時取血放入肝素抗凝素管內分離血清備用。

2.4ELISA法測定各組血清TNF-α水平應用TNF-αELISA試劑盒（購于渤海生物公司）按說明書測定保存血清中的TNF-α水平。

2.5使用全自動生化分析儀測定測量血清中谷草轉氨酶(AST)和谷丙轉氨酶(ALT)。

2.6統計學方法均采用SPSS10.0軟件，進行t檢驗。

3結果

3.1各組腫瘤質量如表1所示，陰性對照組與抗血清組腫瘤質量無差異（P＞0.05）；注射產物與血清組和環磷酰胺組無差異（P＞0.05）；陰性對照組與所有組均有差異（P＜0.05）；注射產物組與口服產物組有差異（P＜0.05），注射產物組與口服產物組有差異（P＜0.05）。

3.2各組血清中谷草轉氨酶(AST)和谷丙轉氨酶(ALT）如表1所示，谷草轉氨酶(AST)的結果中只有正常組與其他組有差異（P＜0.05），其余各組間谷草轉氨酶(AST)的結果均無差異；谷丙轉氨酶(ALT)的結果中只有正常組與其他組有差異（P＜0.05），口服產物組、環磷酰胺組與注射產物與血清組之間無差異（P＞0.05）；環磷酰胺與注射產物組有差異（P＜0.05），口服產物組與陰性對照組有差異（P＜0.05）。

3.3TNF-α水平如表1所示，環磷酰胺組TNF-α的水平與注射產物與血清組之間無差異（P＞0.05），正常組、陰性對照組與血清組無差異（P＞0.05），環磷酰胺組與陰性對照組有差異（P＜0.05）；注射產物與血清組與陰性組有差異（P＜0.05）。表1各組腫瘤質量、肝功能和細胞因子水平（略）

4討論

有的文獻報道［4，5］靈芝具有對抗腫瘤的作用，這次實驗結果顯示，含靈芝代謝產物的培養液也具有抗腫瘤的作用，在我們的實驗結果中不論口服與腹腔注射含靈芝代謝產物的培養液腫瘤的質量均縮小，其結果具有統計學差異。但作為陽性組的環磷酰胺組其腫瘤的質量要小于口服含靈芝代謝產物的培養液組，這說明可能經口服后存在首關消除，而肝功能的指標也顯示口服含靈芝代謝產物的培養液組的谷丙轉氨酶要低于陰性對照組和正常組。而在培養液中到底是何種化學集團起到抗腫瘤作用呢？我們根據劉文泰等人報道的琥珀酸酐法用小牛血清白蛋白封閉了代謝產物中的羥基后，用它作為免疫原免疫老鼠產生對抗除羥基外其他化學集團的抗血清，我們用這些抗血清封閉了含靈芝代謝產物的培養液的其他化學集團，只保留了部分羥基，實驗結果顯示用抗血清封閉的含靈芝代謝產物的培養液的抗腫瘤活性增強，這說明可能靈芝代謝產物中的羥基在對于抗腫瘤起了很大作用。而腹腔注射的作用強于口服的作用說明，這些代謝產物中的羥基可以被肝臟清除。

我們的結果還顯示同時含靈芝代謝產物的培養液與抗血清組與注射環磷酰胺組的小鼠血清TNF-α水平都很高。而環磷酰胺對腫瘤細胞有直接的殺傷作用，而這些死亡的腫瘤細胞可能刺激了小鼠血清TNF-α水平的升高。而同時含靈芝代謝產物的培養液與抗血清組的TNF-α水平也同樣升高說明，這些靈芝代謝產物中可能有直接殺傷腫瘤細胞的物質存在。

【參考文獻】

［1］單衛華,張玲,時延增,等．靈芝菌發酵液制劑中靈芝多糖及總糖含量測定［J］．時珍國醫國藥,2000,11（9）：797.

［2］李麗華，劉文泰．抗中藥成分的特異性抗體在中藥質量檢測中的應用探討［J］．中國中醫基礎理論雜志,2008，14（9）：686.

［3］YamazakiM,SatoA,SaitoK,etal.MolecularphylogenybasedonRFLPanditsrelationwithalkaloidpatternsinLupinusplants［J］．BiolPharmBull,1993,16(2):1182.

［4］劉高強，王曉玲．靈芝多糖的抗癌構效關系及其抗癌作用機制［J］．菌物學報,2006,25（3）：430.

［5］吳珍珠．靈芝孢子抗腫瘤的作用機制［J］．細胞與分子免疫學雜志,2006,22(6)：836.