顆粒溶素表達(dá)載體構(gòu)建論文

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【摘要】目的：構(gòu)建人顆粒溶素(Granulysin,GNLY)基因的表達(dá)載體并在大腸桿菌中表達(dá)。方法：抽提體外培養(yǎng)的單個(gè)核細(xì)胞總RNA，通過RTPCR的方法獲得含有222bp的顆粒溶素cDNA,克隆到pMD18T載體，測序正確后再亞克隆到質(zhì)粒pET28a(+)中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)GNLY，在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)并經(jīng)Ni親和層析純化。用SDSPAGE和Westernblot對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。采用MTT法檢測GNLY融合蛋白的生物學(xué)活性。結(jié)果：酶切結(jié)果證實(shí)，成功地構(gòu)建了GNLY原核表達(dá)載體，并在大腸桿菌中獲得穩(wěn)定的表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量(Mr)同預(yù)期值相一致。結(jié)論：成功構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)GNLY，并在大腸桿菌BL21(DE3)plysS中表達(dá)，獲得了具有良好的抗原性和特異性的GNLY融合蛋白，為下一步研究人GNLY的功能奠定了基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】顆粒溶素原核表達(dá)重組蛋白

Constructionofrecombinantexpressionvectorofgranulysingeneanditsprokaryoticexpression

QIANCheng,CHENSunXiao,KEJinShan,ZHOUYe,CHENYan,GUMingLi,LUHuiQi,DENGAnMei,ZHONGRenQian.

LaboratoryDiagnostics,ChangzhengHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,andClinicalImmunologyCenterofPLA,Shanghai200003,China

［Abstract］Objective:ToconstructarecombinantexpressionvectorofhumangranulysingeneandtoexpressitinEcoli．Methods：TotalRNAfromculturedcellsandobtaineda222bpcDNAsegmentwithgranulysinspecificprimersbyRTPCRwereextracted.ThenthecDNAsegmentofgranulysinwasinsertedintopET28a(+)plasmid.Expressionoftherecombinantproteinwasinduced,whichwaspurifiedbyNiNTAaffinitychromatographyandapprovedbySDSPAGEandWesternblot.ThebioactivityofgranulysinfusionproteinwasmeasuredbyMTTassay.Results:RestrictionenzymedigestionshowedthattherecombinantprokaryoticexpressionplasmidpET28a(+)GNLYwasconstructedandexpressedinEcoil．Therelativemolecularmass(Mr)oftheexpressionproductwasidenticalwiththepredictedvalue．Conclusion：TherecombinantexpressionplasmidpET28a(+)GNLYhasbeenconstructedsuccessfullyinEcoilBL21(DE3)plysSandthetargetproteinareexpressedwithafineantigenicity，whichishelpfulforthefurtherstudyofthebiologicalfunctionofgranulysin．

［Keywords］Granulysin;Prokaryoticexpression;Recombinantprotein

人顆粒溶素(Granulysin,GNLY)是由激活的T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞表達(dá)的一種溶細(xì)胞蛋白，對細(xì)菌、真菌、寄生蟲均具有殺傷功能，同時(shí)對哺乳動物細(xì)胞也有一定的毒性作用[1,2]。它屬于脂類結(jié)合蛋白皂角素(Saposin)樣蛋白家族的成員之一，與穿孔素、顆粒酶共存于CTL和NK細(xì)胞毒性顆粒中，最初由Jongstra等[3]學(xué)者在系統(tǒng)研究功能性細(xì)胞毒性細(xì)胞系的cDNA時(shí)發(fā)現(xiàn)，稱為519。1997年，Pena等[1]學(xué)者將其命名為顆粒溶素（Granulysin）。在機(jī)體免疫應(yīng)答過程中，GNLY與穿孔素、顆粒酶顆粒分子從細(xì)胞毒性顆粒中一起排出體外，參與抗菌、抗病毒和殺傷腫瘤細(xì)胞等過程。近年來，國外對顆粒溶素在殺傷腫瘤細(xì)胞及病原微生物各方面的研究越來越引起人們的重視。鑒于GNLY具有廣闊的應(yīng)用前景，我們構(gòu)建了GNLY的原核表達(dá)載體并在大腸桿菌中誘導(dǎo)其表達(dá)，為進(jìn)一步研究GNLY的功能及應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

pET28a(+)vector、BL21(DE3)plysS、DH5α為本科保存株；pMD18Tvector（TaKaRa公司）；限制性內(nèi)切酶NdeI、EcoRI、DNA膠回收試劑盒及T4DNA連接酶（TaKaRa公司）；RNeasyMiniKit(QIAGEN);TaqmanReverseTranscriptionRegents(AppliedBiosystem)；羊抗兔IgG抗體（KPL公司提供）；兔抗6His多抗（NOVUS公司）；HisBindResin（Novagen）。引物的設(shè)計(jì)與合成：根據(jù)檢索NCBI數(shù)據(jù)庫提供的GNLY基因的cDNA編碼序列（gi:49456672）進(jìn)行了PCR引物設(shè)計(jì)。設(shè)計(jì)擴(kuò)增3′引入終止密碼子（TGA）的GNLY9kD蛋白對應(yīng)編碼區(qū)的一對引物。其序列為：上游引物：5′CATATGGGCCGTGACTACAGGACC3′，5′引入NdeI酶切位點(diǎn)；下游引物：5′GAATTCTCACCTGAGGTCCTCACAG3′，5′引入EcoRI酶切位點(diǎn)。

1.2方法

1.2.1人外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離及體外培養(yǎng)

抽取正常人靜脈抗凝血5ml，用淋巴細(xì)胞分離液按常規(guī)操作方法分離單個(gè)核細(xì)胞。用含5%胎牛血清（FCS），5%人自體血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106～2×106ml-1，于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入1ml。加入卡介苗5μg和rIL250U用于誘導(dǎo)γδT細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞增殖情況適時(shí)擴(kuò)孔培養(yǎng)，同時(shí)每隔3～4天補(bǔ)充rIL250U/孔，以維持細(xì)胞生長需要。收集細(xì)胞（約106數(shù)量級），用冷的無菌的1×PBS(pH7.4)洗滌后，即可用于抽提總RNA。

1.2.2目的基因的擴(kuò)增與純化

按說明書操作，抽提培養(yǎng)12天的細(xì)胞總RNA。RTPCR反應(yīng)條件為42℃45分鐘，94℃3分鐘，94℃預(yù)變性3分鐘，以94℃變性30秒，56℃退火40秒，72℃延伸59秒,35個(gè)循環(huán)后，再于72℃延伸7分鐘。PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，將目的條帶切下，用DNA回收試劑盒回收純化。

1.2.3重組質(zhì)粒pET28a(+)GNLY的構(gòu)建與鑒定

將純化的PCR產(chǎn)物和載體pET28a(+)vector用NdeⅠ、EcoRⅠ雙酶切后，分別回收酶切產(chǎn)物。在T4DNA連接酶作用下定向?qū)NLY基因片段與pET28a(+)vector連接，以連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)菌，在LB(Kana+)培養(yǎng)基中篩選培養(yǎng),挑取陽性克隆，培養(yǎng)后小樣提取質(zhì)粒，用NdeI、EcoRI雙酶切篩選陽性重組質(zhì)粒，送聯(lián)合基因公司測序。

1.2.4重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定

1.2.4.1重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)及SDSPAGE分析

將鑒定成功的重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌E.coliBL21(DE3)plysS，在LB(Kana+)培養(yǎng)基中篩選培養(yǎng)。挑取陽性克隆，用NdeⅠ、EcoRⅠ雙酶切鑒定，將含有重組質(zhì)粒的E.coliBL21(DE3)plysS在LB(Kana+)中培養(yǎng)過夜。以1％接種于LB(Kana+)培養(yǎng)液中。于37℃培養(yǎng)至A600約為0.6時(shí)，加入1mmol/LIPTG繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，經(jīng)超聲碎菌后，提取融合蛋白，利用Hisbindresin親和層析純化柱進(jìn)行純化。將純化蛋白進(jìn)行SDSPAGE分析后，用考馬斯亮藍(lán)R250染色后觀察結(jié)果。另外，取誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后1、2、3、4、5、6小時(shí)過夜的裂解菌液及超聲裂解菌離心后的上清和沉淀，分別進(jìn)行SDSPAGE，分析目的蛋白的表達(dá)與誘導(dǎo)時(shí)間的關(guān)系，以及目的蛋白的表達(dá)形式。

1.2.4.2Westernblot分析

將表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDSPAGE電泳后，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用封閉液(含50g/L脫脂奶粉的TBST)室溫振搖封閉2小時(shí)。依次加入兔抗HIS抗體及HRP標(biāo)記羊抗兔IgG，二氨基聯(lián)苯氨(DAB)底物液顯色后，觀察結(jié)果。

1.2.5MTT法檢測蛋白生物活性

胰蛋白酶消化收集人胰腺癌細(xì)胞株SW1990細(xì)胞，用RPMI1640培養(yǎng)液配制細(xì)胞懸液，根據(jù)初篩結(jié)果，確定每孔接種的細(xì)胞數(shù)為2×104/孔，接種于96孔培養(yǎng)板，37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)24小時(shí)貼壁。將GNLY用RPMI1640完全培養(yǎng)基稀釋至實(shí)驗(yàn)所需濃度：0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0μmol/L共9個(gè)不同濃度。每板均設(shè)有純培養(yǎng)基空白對照組、癌細(xì)胞對照組及實(shí)驗(yàn)組(不同濃度GNLY)，每組5復(fù)孔。于接種細(xì)胞24小時(shí)后棄去舊培養(yǎng)基，加入含不同濃度GNLY的完全培養(yǎng)基200μl繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，換新鮮1640完全培養(yǎng)基后MTT法測OD值計(jì)算相對抑制率。按如下公式計(jì)算細(xì)胞相對抑制率：

相對抑制率（%）=對照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值對照組OD值×100%。

2結(jié)果

2.1重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

將重組質(zhì)粒pET28a(+)GNLY用NdeⅠ、EcoRⅠ雙酶切后，經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳，分別在5.4kb和222bp處有兩條清晰的條帶，表明目的基因已正確插入pET28a(+)載體中（圖1）。陽性重組質(zhì)粒測序結(jié)果與GenBank人GNLY基因序列完全一致。

2.2融合蛋白的表達(dá)與鑒定

以重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliBL21(DE3)plysS，挑取陽性克隆后進(jìn)行酶切鑒定。將經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的產(chǎn)物純化后，用SDSPAGE分析。結(jié)果表明，在分子量Mr為9000處有一條明顯的條帶，同預(yù)期的目的條帶相符。表達(dá)時(shí)間分析結(jié)果顯示，目的蛋白在誘導(dǎo)4～5小時(shí)表達(dá)量即達(dá)到最大，時(shí)間再延長，蛋白表達(dá)量無明顯變化，誘導(dǎo)過夜，蛋白表達(dá)量反而降低（圖2）。表達(dá)形式分析表明，目的蛋白大多以包涵體形式存在，少量以可溶形式存在于胞質(zhì)中（圖3）。將純化的融合蛋白經(jīng)SDSPAGE分析后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，Westernblot結(jié)果顯示，在Mr為9000處有一條明顯的條帶，說明目的蛋白具有良好的抗原性和特異性（圖4）。

2.3目的蛋白的活性鑒定

用MTT法檢測不同濃度GNLY對SW1990細(xì)胞生長抑制作用，結(jié)果顯示細(xì)胞的生長受到抑制且抑制作用呈濃度依賴關(guān)系（表1），說明GNLY的細(xì)胞毒作用具有劑量依賴性。表1MTT法測定不同濃度GNLY對人胰腺癌SW1990細(xì)胞的相對抑制率(略)

3討論

人顆粒溶素是存在于CTL和NK細(xì)胞毒性顆粒中的溶細(xì)胞蛋白,具有廣譜抗菌活性并且能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡[1,2]。GNLY不僅可以直接殺傷胞外結(jié)核桿菌，而且在穿孔素的協(xié)同作用下也可殺傷胞內(nèi)結(jié)核桿菌[4]。TakamoriY等[5]研究顯示顆粒溶素進(jìn)入靶細(xì)胞核后在核內(nèi)聚集，誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡。近幾年，國外學(xué)者研究證實(shí)了顆粒溶素在機(jī)體宿主免疫防御中起重要作用。Stegelmann等[6]研究CD8+Tcells中顆粒溶素與趨化因子配體5(CCL5)和穿孔素協(xié)同表達(dá)。在CCL5吸引含結(jié)核感染的巨噬細(xì)胞后，顆粒溶素和穿孔素發(fā)揮殺傷細(xì)胞內(nèi)病原菌的功能。Takemoto等[7]發(fā)現(xiàn)顆粒溶素不僅在宿主免疫防御中起重要作用，而且在亞急性硬化性全腦炎的發(fā)病機(jī)理和病理生理學(xué)中也起作用。GNLY在抗菌、抗病毒和殺傷腫瘤細(xì)胞中的重要作用，近年來在國內(nèi)外已經(jīng)逐漸形成一個(gè)研究熱點(diǎn)。

在本實(shí)驗(yàn)中，我們克隆的cDNA全長222bp，為活性GNLY9kD氨基酸對應(yīng)的基因序列。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，GNLY在結(jié)核桿菌刺激的T細(xì)胞中有高表達(dá)[8]，因此我們經(jīng)過體外培養(yǎng)，從活化的富含γδT細(xì)胞的殺傷細(xì)胞中提取GNLY的mRNA，用此為模板克隆GNLY基因的開放閱讀框的(ORF)中的目的基因序列，按正確讀碼框插入到pET-28a(+)原核表達(dá)載體中，構(gòu)建了pET28a(+)-GNLY表達(dá)載體。由于GNLY本身對大腸桿菌具有一定的毒性，因此我們用不含T7RNA聚合酶的宿主菌BL21（DE3）pLysS克隆目的基因，這樣就避免了由于GNLY對宿主細(xì)胞的毒性而造成的質(zhì)粒不穩(wěn)定。在E.coli中表達(dá)的重組蛋白經(jīng)常以聚集的形式表達(dá)（包涵體），但還是有一部分目的蛋白是溶解的。由于pET系統(tǒng)的高表達(dá)水平，即使有大量的目的蛋白聚集形成包涵體，也會有一部分可溶性目的蛋白存在。為了得到具有生物活性的GNLY，本實(shí)驗(yàn)采用非變性條件純化目的蛋白。從Westernblot檢測結(jié)果來看，GNLY融合蛋白具有良好的免疫反應(yīng)性，N端增加的6個(gè)組氨酸并不影響重組蛋白的抗原性。我們最終得到了具有生物學(xué)活性的GNLY融合蛋白，為研究GNLY蛋白的功能及進(jìn)一步應(yīng)用于臨床疾病診斷及實(shí)時(shí)監(jiān)測奠定了基礎(chǔ)。

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