中藥肝復健纖維影響論文

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引言

HBV感染患者和幾乎全部HCV攜帶者有可能發展為肝硬化，亦是造成肝硬化發病率居高不下的主要原因，而肝硬化中約30%患者可并發肝癌［1］.AFP升高、肝硬化伴細胞不典型增生或細胞增殖活性增高成為肝癌發病的高危因素［2］，因而慢性肝病、肝硬化的防治十分重要論文.如何延緩肝纖維化形成進程或逆轉至正常，已成為肝硬化及肝癌防治的中心問題.因此，研制有效且可長期服用的預防制劑也越來越引起人們的關注.健脾扶正法是中醫臨床防治肝硬化與肝癌常用的方法之一［3］.本科室根據中醫基礎理論及臨床實踐研制的以健脾益氣立法，由淮山藥、山楂、大棗等藥食同源中藥組成的肝復健沖劑，在臨床肝硬化防治過程中取得較好療效.

1材料和方法

1.1材料SD雄性大鼠，體質量150~180g，由第四軍醫大學實驗動物中心提供.二乙基亞硝胺(DEN)購自Sigma公司.天狼紅（解放軍第475醫院贈送）.PCNA檢測試劑盒購自DAKO公司.中藥飼料：肝復健沖劑按30.4g・kg-1均勻混合于基礎飼料中壓制而成（第四軍醫大學實驗動物中心提供）.

1.2方法

1.2.1模型建立大鼠適應環境3d隨機分為模型組（Model）及中藥組(Ganfujian，GFJ)，每組各30只，分別以0.1g・L-1DEN自由飲水，同時分別給予基礎飼料或含中藥的飼料喂養.16wk時停用DEN飲水及中藥飼料.考慮到造模過程大鼠有一定死亡率，分別于建模開始后每4wk兩組各處死5只大鼠，剩余大鼠留繼續觀察.取肝組織固定于100g・L-1甲醛溶液，石蠟包埋，切片厚4μm.常規HE染色、切片膠原特殊染色及免疫組化染色.

1.2.2切片膠原染色按天狼紅飽和苦味酸法［4］.普通石蠟切片,厚4μm;常規脫蠟至水,0.1mol・L-1天狼紅飽和苦味酸,避光室溫孵育20min;不洗,950mL・L-1乙醇脫水,二甲苯透明,封片.

1.2.3PCNA免疫組織化學染色取材肝組織固定于100mL・L-1緩沖甲醛溶液24h，常規石蠟包埋，切4μm厚切片，二甲苯、梯度乙醇脫蠟至水；染色方法為免疫ABC法.以0.1mol・L-1PBS取代一抗作陰性對照，以正常大鼠肝組織作正常對照.

1.2.4染色結果判定及計算機圖像分析肝臟背景為淡黃色，膠原陽性著色呈紅色,采用HPIAS1000高清晰度彩色病理圖文分析系統,隨機選擇5個匯管區進行染色膠原的定量分析(面積占視野面積),取其均值.PCNA陽性著色為覆蓋胞核的棕黃色顆粒.用網格（10×10）測試法計數陽性肝細胞.切片各選擇10個按同一方向移行、不重疊的高倍鏡視野（×40），記數陽性及陰性細胞數（100個細胞）.

統計學處理：采用SPSS統計分析軟件對所獲得的數據進行組間秩和檢驗.

2結果

2.1大鼠肝纖維化過程組織形態學變化模型組大鼠使用DEN4~8wk時肝表面由平滑逐漸變為粗糙，可見小顆粒，呈局灶性.光鏡下肝細胞腫脹，空泡變性，局灶性壞死，伴炎細胞浸潤，并逐漸出現纖維組織增生.12wk時40%大鼠已出現明顯肝硬化，肝表面更加粗糙，肝臟增大、腫脹，色暗或淡.16wk時大鼠均有肝硬化表現，結節增多變大，肝臟縮小，組織學有大量形態不一，大小排列不齊的假小葉形成.部分大鼠肝臟已出現早期癌結節，鏡下可見少量癌細胞增生.中藥組大鼠各時期肝臟損害均較單純誘導組輕，12wk無肝硬化大鼠，16wk50%大鼠出現肝硬化，但未發現癌變.

2.2大鼠肝纖維化過程肝內膠原沉積變化模型組大鼠4wk肝內即出現少量紅色膠原陽性染色，多集中于匯管區.隨著肝內病變加重，假小葉的形成，肝臟沉積的膠原逐漸增多，16wk病變以結節性肝硬化為主，切片膠原沉積量亦達到頂峰.中藥組大鼠肝內病變較模型組明顯減輕，肝硬化發生晚，肝內膠原沉積量少，在4wk及12wk兩組間差異有統計學意義(P<0.05,Tab1).

表1兩組大鼠肝臟膠原沉積的比較(略)

2.3大鼠肝纖維化過程肝細胞陽性表達PCNA情況在模型初期即可見少量肝細胞PCNA陽性著色，隨著模型進展，大鼠肝臟PCNA陽性表達的肝細胞數目逐漸增加，并在12～16wk呈明顯攀升趨勢.中藥組大鼠PCNA陽性的肝細胞數在各期均低于模型組，其中12～16wk差異顯著(P<0.05,Tab2).

表2大鼠肝細胞陽性表達PCNA的比較(略)

3討論

肝纖維化是許多慢性肝病重要的中間環節，是由于肝內纖維生成與降解失衡，致使過多的膠原在肝內沉積，常伴于炎癥并可發展為肝硬化.肝纖維化形成作為肝硬化發展過程中的一個重要現象，與肝硬變的發展是平行的［5］,因此肝纖維化程度的精確了解是慢性肝病研究不可少的.然而常用的血清學指標和組織學纖維化分級標準卻難以直接、準確反映肝臟內

膠原沉積變化.本文采用切片膠原圖像定量處理方法具有準確、客觀、數據可信度高等特點，能精確反映肝內膠原沉積（主要為I,III型膠原）變化［4］.本實驗中應用該法檢測DEN誘導大鼠肝纖維化過程中肝內膠原沉積的變化，結果顯示隨著肝細胞變性、炎癥高峰到橋接性壞死、肝硬化形成，肝臟形態學改變與膠原沉積呈同步變化.

細胞的異常增殖是癌變發生的主要特征.PCNA是一種從細胞核中分離純化出來的多肽鏈，直接參與細胞增殖過程中的DNA復制，其含量和陽性表達是反應G1晚期和S早期肝細胞增殖的常用指標［6-8］.在本模型中初期即出現少量肝細胞PCNA陽性著色，而隨著模型進展，尤其在12~16wk（肝硬化期）PCNA陽性肝細胞數明顯增加，與肝內病變進展呈一致變化.即隨著肝硬化的形成，異常增殖肝細胞數目呈明顯增加趨勢，提示從肝臟炎性改變、肝纖維化至肝硬化的形成，異常增殖的肝細胞數目不斷增加，癌變的可能性亦逐漸增加.

近年來中醫藥防治肝纖維化取得了不少進展，也積累了豐富的經驗，從單味藥、復方及其有效成份等入手，初步發現活血化瘀與扶正補虛兩類中藥具有良好的防治肝纖維化作用.由于采用中草藥治療慢性肝病在臨床上有肯定療效，且又具有無明顯毒性反應或副作用的優點，因此，是防治肝纖維化較有希望的治療手段，已引起國內外肝病研究人員的極大興趣［9］.健脾扶正法是防治肝硬化與肝癌最常用的方法之一，曾證明對肝硬化和DEN致大鼠肝癌前病變的發生可能有一定的預防作用［10-12］.肝復健沖劑以健脾益氣立法，組方均為藥食同源中藥，具有低毒、可長期服用的特點.本實驗結果顯示該沖劑可明顯減少肝內膠原沉積，延緩化學致癌物DEN所致大鼠肝纖維化過程，同時對肝硬化形成期陽性表達PCNA的肝細胞數目亦有顯著抑制作用.提示該沖劑可通過減輕化學物質引起的肝內炎性病變，減少肝內以I、III型為主的膠原沉積，延緩和減輕肝纖維化過程，同時可抑制肝硬化形成及演變期肝細胞可能的惡性增殖，達到阻抑肝硬化形成及其繼續發展為肝癌的作用.

【參考文獻】

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