阿托伐他汀治療腦脊髓炎研究

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作者：潘滿冬,譚利明,盧偉,黃繼義

【摘要】目的探討阿托伐他汀對Wistar大鼠實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)的治療作用。方法建立Wistar大鼠EAE模型,給予不同劑量阿托伐他汀處理,觀察大鼠發病程度、病理改變及血清白細胞介素4(IL4)、干擾素γ(IFNγ)水平的變化。結果阿托伐他汀可減輕大鼠發病程度,減少炎性病灶數,降低血清IFNγ水平升高幅度,使血清IL4水平在發病初期即升高,高劑量阿托伐他汀作用更顯著。結論阿托伐他汀在一定程度上可有效干預大鼠EAE發病,并呈劑量相關性,其機制可能與改變Th1/Th2類細胞因子比值有關。

【關鍵詞】吡咯類;腦脊髓類;自身免疫性,實驗性;腦脊髓炎;白細胞介素4;干擾素Ⅱ型

ABSTRACT:ObjectiveThisstudywasdesignedtoexploretheeffectsofatorvastatin,aninhibitorofHMGCoAreductaseontheexperimentalautoimmuneencephalomyelitis(EAE)inWistarrats.MethodsAtorvastatinwasadministeredattwodifferentdosestoWistarratsEAEmodel.Ascaleof0-5accordingtothesymptomsscoredtheseverityofEAE.Thenumbersofinflammationlesioninthebrainandspinalcordwerecountedbyopticalmicroscopy.Theserumlevelsofinterferonγandinterleukin4weredeterminedbyenzymelinkedimmunosorbentassay.ResultsComparedtotheuntreatedgroup,theatorvastatingroupsonlypartiallydevelopedEAEwithalighterdegreeofmalfunction.Thenumbersofinflammationlesionreducedsignificantlyinatorvastatintreatedgroups.TheserumlevelofinterferonγincreasedinatovarstatintreatedgroupswiththedevelopmentofEAE,butwaslowerthanthatintheuntreatedgroup.Theserumlevelsofinterleukin4inatorvastatingroupswerehigherattheonset.HigherdoseatorvastatinshowedbetterprotectionagainstEAEdevelopment.ConclusionToacertainextentatorvastatincouldeffectivelyameliorateEAEinrats.Theeffectswereinadosedependentfashion,whichmightbemechanisticallyrelatedtothebalancebetweenTh1/Th2cytokines.

KEYWORDS:experimentalautoimmuneencephalomyelitis;atorvastatin;IL4;IFNγ

多發性硬化(multiplesclerosis,MS)是一種由免疫細胞介導攻擊中樞神經系統髓鞘為特征的自身免疫性疾病,好發于青壯年,是青壯年人群致殘的常見疾病之一。目前臨床上經美國FDA批準用于治療MS的藥物有:β干擾素(IFNβ)、格拉默(Glatirameracetate)和米托蒽醌(Mitoxantrone)等。這些藥物作用有限,且有非腸道給藥、價格昂貴、不良反應發生率高等缺點,故有必要尋找新的更安全有效的治療藥物。他汀類藥物主要用于降脂治療,近年來發現其具有獨立于降脂作用的免疫調節作用的多效性[1]。筆者研究阿托伐他汀對人MS的經典動物模型——實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimentalautoimmuneencephalomyelitis,EAE)模型的影響,探討其在EAE中的可能作用機制。

1材料和方法

1.1主要材料白細胞介素4（IL4）和IFNγELISA試劑盒(北京晶美生物工程有限公司);阿托伐他汀(輝瑞制藥有限公司);豚鼠和雌性Wistar大鼠[湖南農業大學實驗動物養殖場:許可證號SCXK(湘)20030003],8～10周齡,體質量180～220g。

1.2動物健康雌性Wistar大鼠60只,隨機分成4組:對照組，EAE組(蒸餾水灌胃),阿托伐他汀干預一組(阿托伐他汀1mg·kg-1·d-1)和阿托伐他汀干預二組(阿托伐他汀10mg·kg-1·d-1)。每組再隨機分成3小組,每小組各5只,分別自免疫接種日開始灌胃至第8,11,17天。

1.3免疫原乳劑的制備及模型的建立參照文獻[23]法,取體質量300～400g豚鼠處死后,在無菌操作下,迅速剝出脊髓,制成50%(M/V)的豚鼠脊髓勻漿,再與等量的完全福氏佐劑(含6mg/mL卡介苗)充分混合,制成免疫原乳劑。大鼠兩后足墊內各注射等量免疫原乳劑(共計100g/0.2mL),同時尾根皮下注射百日咳疫苗(5.8×1010mL-1)0.2mL。對照組免疫原乳劑中的豚鼠脊髓勻漿用等量的生理鹽水代替,余同其他組。

大鼠免疫接種后每日稱體質量,觀察病情并進行神經功能障礙評分。神經功能障礙評分標準采用5分評分法[4]:0分,無明顯異常;1分,大鼠尾部無力麻痹;2分,尾部無力+后肢無力;3分,后肢輕度麻痹;4分,后肢嚴重麻痹伴前肢無力,被動翻身不能復原;5分,全身癱瘓或瀕臨死亡。

1.4血清中IL4和IFNγ水平檢測各組3小組分別于免疫接種后第8,11,17天(相當于EAE組發病初期、高峰期和緩解期),通過摘除眼球取全血1.5mL,離心后獲得血清于-20℃冰箱保存待檢。用ELISA法檢測IL4和IFNγ水平。

1.5病理檢查取各組中免疫接種后第11天(相當于EAE組發病高峰期)的大鼠各5只,斷頭處死后,剝取腦和脊髓用4%多聚甲醛固定,石蠟包埋。取大腦頂葉、小腦腦干及腰髓切片,進行常規HE染色和Weil’s髓鞘染色。光鏡下按呈袖套樣改變或超過15～20個炎性細胞浸潤者稱為1個炎性灶進行病灶計數,將各節段病灶數相加后取均數,進行顯著性檢驗。

1.6統計學處理數據采用x±s表示。成組設計多個樣本均數比較用方差分析,組間均數比較用LSDt檢驗。發病率比較用χ2檢驗。以P<0.05為差別有統計學意義。

2結果

2.1動物發病情況EAE組大鼠在致敏后約7～10d陸續出現活動減少,體質量減輕,尾部麻痹,雙后肢癱瘓,嚴重者四肢癱瘓,伴大小便失禁,甚至出現瀕死狀態。整個病程持續8～10d,發病率100%。對照組均無發病。阿托伐他汀干預一組和干預二組發病率分別為60%和40%,其中干預二組與EAE組比較,差別有統計學意義。兩干預組平均發病潛伏期相對EAE組延后1～2d,臨床癥狀相對較輕,尤以發病高峰期干預組和EAE組比較臨床癥狀明顯減輕(表1,圖1)。

表1EAE組和干預組各期臨床神經功能障礙評分（略）

Tab1Theclinicalscoresatdifferentperiods

EAE：實驗性自身免疫性腦脊髓炎.與EAE組同期比較,☆:P<0.05;與干預一組同期比較,＃:P<0.05.

圖1實驗性自身免疫性腦脊髓炎發病大鼠（略）

Fig1Aratindiseasestate

2.2血清細胞因子的變化與對照組比較,EAE組血清IFNγ水平在發病初期即升高,并隨病情加重進一步升高,到免疫接種后第11天臨床神經功能評分達高峰時,IFNγ水平亦達到高峰,而血清IL4水平在發病緩解期升高。阿托伐他汀干預組血清IFNγ水平也出現升高,但升高幅度顯著低于EAE組,而血清IL4水平在發病初期即出現升高,在緩解期更明顯。IFNγ水平升高的降低程度和IL4水平的升高程度,隨著藥物劑量增加而更加明顯(圖2)。

2.3病理觀察EAE組腦和脊髓內小血管尤其是A:對照組;B:EAE組;C:干預一組;D:干預二組.與對照組同期比較,☆:P<0.01;與EAE組同期比較,△:P<0.05;與干預一組同期比較,＃:P<0.01.

圖2大鼠血清IFNγ和IL4水平（略）

Fig2TheserumlevelsofIFNγandIL4

小靜脈周圍大量炎性細胞浸潤,血管袖套樣改變。浸潤的炎性細胞類型以淋巴細胞為主,亦可見膠質細胞和一定數量的巨噬細胞,伴有海馬錐體細胞和脊髓前角運動神經元變性。對照組無病理改變。阿托伐他汀干預組可見類似EAE組病理改變(圖3)。EAE組、阿托伐他汀干預一組和干預二組的病灶數分別為(11.96±1.83),(5.25±0.98)和(3.16±0.94)。兩干預組病灶數較EAE組明顯減少(P<0.01),尤以干預二組為甚(與干預一組比較,P<0.05)。而在Weil’s髓鞘染色中,僅EAE組少數大鼠在腦干和小腦白質內可見片狀脫髓鞘,對照組與藥物干預組均未發現明顯脫髓鞘改變。

3討論

3.1EAE模型血清IFNγ、IL4變化特點EAE是一種獲得性髓鞘脫失的動物模型,在臨床、病理等方面與MS極其相似,是MS的經典動物模型[5]。本實驗在建立Wistar大鼠EAE模型基礎上,觀察不同劑量的阿托伐他汀對EAE大鼠的治療作用。

MS和EAE是細胞免疫與體液免疫均參與的錯綜復雜疾病,但以細胞免疫為主[6]。而CD4+Th細胞是主要參與的免疫應答細胞,根據生成細胞因子的不同,CD4+Th細胞又可分為Th1和Th2兩個亞群。Th1類細胞因子主要有IL1、IL2、IL12、TNFα和IFNγ等;Th2類細胞因子主要有IL4、IL5和IL10等。在正常情況下,Th1/Th2細胞因子互相拮抗處于動態平衡,使機體處于免疫穩定狀態;病理情況時,兩者平衡被打破,Th1細胞因子水平上升,Th2細胞因子水平下降,則導致細胞免疫介導的炎性疾病發生。

A:EAE組小腦內小血管周圍炎性細胞浸潤;B:阿托伐他汀干預一組小腦小血管周圍炎性細胞浸潤;C:阿托伐他汀干預二組小腦內小血管周圍炎性細胞浸潤;D:EAE組海馬顆粒細胞變性;E:EAE組腦干內脫髓鞘病灶.EAE：實驗性自身免疫性腦脊髓炎.A～D:HE染色×100.E:Weil’s染色×100.

圖3EAE組和阿托伐他汀干預組大鼠病理改變（略）

Fig3ThepathologicchangsinEAEgroupandatorvastatintreatedgroups

本實驗通過雙抗體夾心ELISA法檢測大鼠血清中細胞因子水平。結果顯示,EAE組血清IFNγ水平在發病初期即出現升高,在發病高峰期亦達到高峰,隨著病情緩解而下降;與對照組相比,其差別具有統計學意義(P<0.05)。并且,血清IFNγ水平的變化趨勢與大鼠神經功能障礙評分、病理改變中的炎性病灶數目變化趨勢相同,提示IFNγ參與了大鼠EAE的發生和發展,呈促進炎癥作用。而EAE組血清IL4水平早期輕度下降,與對照組相比無差異性;在病情緩解期出現升高,與對照組相比差別具有統計學意義(P<0.05),此與Begolka等發現到EAE病情緩解期才能檢測到IL4mRNA的表達相吻合[7],說明IL4參與疾病的緩解過程,起到抑制炎癥作用。

3.2阿托伐他汀對EAE模型具有一定干預治療作用他汀類藥物是一種3羥基3甲基戊二酰輔酶A(HMGCoA)還原酶抑制劑,是當前調脂藥物中最有效的一類藥物。近年來其非降脂作用屢見報道[1]。他汀類藥物非降脂作用的可能機制是通過抑制HMGCoA還原酶,阻斷甲羥戊酸下游中間產物的產生,包括焦磷酸法呢酯(FPP)、焦磷酸牻牛兒基牻牛兒基酯(GGPP)等類異戊二烯化合物,進而阻斷Ras、Rho、Rac等蛋白的異戊二烯化,影響細胞的增殖、分化和遷移作用[8]。

阿托伐他汀是他汀類藥物中安全性能最好的藥物之一。本實驗發現干預組與模型組相比發病率明顯下降,發病日相對推后,病情嚴重程度明顯下降,病理檢查所示病灶數也顯著減少,顯示阿托伐他汀具有干預治療大鼠EAE作用。血清標志性的細胞因子檢測結果表明這種干預治療作用可能與阿托伐他汀下調IFNγ的促炎作用及上調IL4的抑炎作用相關。其可能機制是:阿托伐他汀降低IFNγ分泌,減少抗原遞呈細胞(APC)上MHCⅠ、MHCⅡ類分子的表達,阻斷抗原遞呈作用,降低外周T淋巴細胞的激活;亦減少血管內皮細胞上粘附分子的表達,阻斷T淋巴細胞通過血腦屏障,使中樞神經系統炎癥反應及組織破壞減輕[1]。同時阿托伐他汀增加IL4分泌,而IL4可通過增加T細胞IL4受體的表達,并與受體結合后激活細胞內信號傳導和轉錄激活因子6(STAT6),誘導Th2類細胞因子相關基因的表達,從而增加Th2細胞的效應[9]。

參考Nath等的研究報道[10],本實驗中血清細胞因子變化機制可能是:阿托伐他汀通過抑制NFκΒ和Tbet(T盒子轉錄分子)的表達,并阻斷JAKSTAT4通道,從而阻斷Th0細胞向Th1細胞分化,減少Th1類細胞因子(IFNγ、TNFα)的分泌有關;另一方面,阿托伐他汀誘導GATA3(IL4的主要調控子)的表達和STAT6磷酸化,促使Th0向Th2細胞分化,增加Th2類細胞因子(IL4、IL5、IL10)分泌。實驗中兩不同劑量組比較,高劑量組(10mg·kg-1·d-1)的神經功能障礙評分、病理檢查中病灶數、血清IFNγ水平升高的幅度均顯著低于小劑量組(1mg·kg-1·d-1),而血清IL4水平升高的幅度顯著高于小劑量組,提示在一定范圍內阿托伐他汀劑量越大,干預治療作用越明顯。

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