大鼠垂體前葉內神經纖維對LH分泌的興奮性調節作用

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【關鍵詞】電場刺激；黃體生成素；垂體前葉；神經纖維；卵巢切除術；河豚毒素；大鼠

ExcitatoryregulativeeffectofnervefibersonLHsecretioninratanteriorpituitary

【Abstract】AIM:Toinvestigatethedirectregulativeeffectofnervefibersonluteinizinghormone（LH）secretioninratanteriorpituitary.METHODS:Eightydiestrusratsdeterminedbyvaginalsmearwererandomlydividedintoshamoperation(SO)andovariectomy(OVX)groups.Sevendaysafteroperations,theanteriorpituitarywasharvestedandsuperfusedwithKrebssolution(KrebsRingerbicabonateBSAbuffer,KRBGA)withorwithouttetrodotoxin(TTX).Electricalfieldstimulation(EFS)wasperformedat10Hzor2Hzfor10minor2min,respectively,andtheperfusatewascontinuouslycollectedevery10minfor130minfromthetime10minbeforeEFSandmeasuredforLHbyradioimmunoassay.RESULTS:IntheanteriorpituitarysuperfusedwithKRBGAwithoutEFS,LHconcentrationwereinasteadybasallevelwithdifferencebetweenthe2groups,(4.8±0.5)IU/LinSOgroup,and(7.1±1.3)IU/LinOVXgroup(P<0.05).EFSat10Hzfor10minsignificantlyincreasedLHsecretioninthetime10minafterceaseofstimulation,from(4.9±0.1)IU/Lto(15.7±0.8)IU/LinSOgroupandfrom(7.5±4.7)IU/Lto(20.0±1.4)IU/LinOVXgroup,respectively(P<0.05).However,theeffectofthesameparameterofEFSwasabolishediftheTTXwasaddedintotheperfusate,andLHconcentrationdecreasedto(5.4±0.5)IU/LinSOgroupand(7.7±0.9)IU/LinOVXgroup10minafterceaseofstimulation.OthervariablesofEFShavenoeffectonLHsecretion.CONCLUSION:ThenervefibersintheanteriorpituitarymayhaveadirectregulativeeffectonLHsecretion.

【Keywords】electricalfieldstimulation;luteinizinghormone;anteriorpituitary;nervefibers;ovariectomy;tetrodotoxin;rat

【摘要】目的：探討垂體前葉神經纖維對黃體生成素（lh）分泌的神經調節.方法：陰道涂片篩選出動情間期大鼠80只，隨機等分為假手術組（SO）和去卵巢組（OVX），術后7d處死，取出垂體前葉，用Krebs液或含河豚毒素（TTX）的Krebs液離體灌流，同時施加10Hz或2Hz,時間為10min或2min的電場刺激（EFS）.從施加EFS前10min開始，每10min收集灌流液1次，連續收集130min，放免法檢測LH濃度.結果：Krebs液單純灌流時，SO組的LH平均濃度為(4.8±0.5)IU/L，OVX組LH平均濃度為(7.1±1.3)IU/L，兩組間存在顯著差異（P<0.05）.10Hz持續10min的EFS后10min內兩組的LH濃度較基礎水平有顯著增高.SO組由(4.9±0.1)IU/L升高至(15.7±0.8)IU/L;OVX組由(7.5±4.7)IU/L升高至(20.0±1.4)IU/L（P<0.05）.而改用含TTX的Krebs液灌流后，同參數的EFS后10min內LH濃度在SO組和OVX組分別為(5.4±0.5)IU/L和(7.7±0.9)IU/L，提示其分泌被顯著抑制.其余各參數的EFS對LH分泌均無明顯影響.結論：垂體前葉內神經纖維可能對LH的分泌存在直接的調節.

【關鍵詞】電場刺激；黃體生成素；垂體前葉；神經纖維；卵巢切除術；河豚毒素；大鼠

黃體生成素（luteinizinghormone,LH）是由垂體前葉（anteriorpituitary,AP）促性腺激素細胞合成和分泌的一種激素，分泌調控傳統上認為是下丘腦通過體液途徑實現的.近年來研究表明，哺乳類動物AP內存在P物質（substanceP,SP）、降鈣素基因相關肽(calcitoningenerelatedpeptide,CGRP)等多種肽能神經纖維［1-2］，且SP免疫反應陽性神經纖維可與促性腺激素細胞形成突觸［3］，但這些纖維對LH的分泌是否有直接調節，目前的研究報道較少.本實驗采用離體灌流大鼠AP組織薄片結合電場刺激（electricalfieldstimulation,EFS）的方法［4-5］，通過觀察灌流液中LH的分泌變化，探討AP神經纖維對LH分泌是否有直接調控作用，為垂體前葉激素分泌的神經－體液雙重調節假說提供實驗依據.

1材料和方法

1.1材料成年雌性SD大鼠80只，體質量200~220g，由第四軍醫大學實驗動物中心提供.125I標記LH的放射免疫檢測試劑盒為天津協和生物有限公司產品；河豚毒素(tetrodotoxin,TTX)為原中科院上海生理所產品；SEN301型電刺激儀、監視器為日本NikonKohden公司產品；FJ2003全自動晶體閃爍計數儀為西安國營262廠產品.

1.2方法

1.2.1電場刺激和分組每日作陰道涂片確定其動情周期，待動情周期穩定后，選取動情間期大鼠80只隨機等分到假手術(shamoperation,SO)組和去卵巢(ovariectomy,OVX)組.麻醉下，手術暴露SO組大鼠雙側卵巢后即縫合腹腔；OVX組大鼠進行雙側卵巢切除術.術后7d處死動物，取出AP，行電場刺激實驗.根據電場刺激頻率和強度的不同，SO組40只大鼠隨機又分為10個亞組（分別稱為SA1~SA5組，SB1~SB5組），每組4只.SA1~SA5組均用Krebs液灌流.其中SA1組不施加電場刺激；SA2組用10Hz電場刺激10min，SA3組用10Hz電場刺激2min；SA4組用2Hz電場刺激10min；SA5組用2Hz電場刺激2min.SB1~SB5組用含1μmol/LTTX的Krebs液灌流，刺激條件與對應的A1~A5組分別相同.OVX組分組同SO組，分別稱為OA1~OA5組和OB1~OB5組.

1.2.2組織薄片制備和灌流大鼠斷頭，迅速取出AP.用自制的多頭刀架將AP沿矢狀軸切成厚度為0.8mm的組織薄片，迅速移至灌流小室內，用氧飽和的(含950mL/LO2和50mL/LCO2)Krebs液（KrebsRingerbicarbonateBSAbuffer,KRBGA）或含1μmol/LTTX的Krebs液灌流，流速為1×10-4L/min.Krebs液的成分(mmol/L):NaCl119;KCl4.7;CaCl22.5;KH2PO41.2;MgSO41.2;NaHCO325;Glucose11;另含牛血清白蛋白1g/L和桿菌肽40mg/L.平衡灌流50min后開始收集灌流液，每10min收集灌流液1次，連續收集130min，其中第1次灌流液收集后的10min期間施加EFS，繼續收集灌流液100min后改用含高鉀的Krebs液(mmol/L:NaCl64.9;KCl58.8;余成分同前)灌流10min，以高鉀誘發垂體前葉促性腺激素細胞LH的功能性釋放，借以判定所測定的垂體細胞的功能狀態，各組各時段收集的樣品置-20℃凍存待測.

1.2.3LH測定按125I標記LH的放射免疫檢測試劑盒說明書進行灌流液中LH濃度的測定.LH濃度以IU/L表示.

統計學處理：數據用x±s表示，采用SPSS10.0軟件進行重復測量設計的方差分析，P＜0.05認為差異有統計學意義.

2結果

①SA1組：未施加EFS，僅Krebs液單純灌流，整個灌注過程LH一直處于較低的穩定狀態，在4.3~5.5IU/L之間浮動，LH平均濃度為(4.8±0.5)IU/L；②SB1組：用含TTX的Krebs液灌流對LH基礎分泌水平無影響，LH平均濃度為(5.0±0.6)IU/L；③SA2組,SB2組：10Hz，10min的EFS后10minLH分泌顯著升高（SA2組），這種作用可被TTX阻斷（SB2組）；④SA3~SA5組,SB3~SB5組的LH濃度在其相應參數EFS后與基礎水平相比均無顯著性變化.⑤OA1組：未施加EFS，LH濃度在5.0~10.4IU/L之間波動，平均分泌水平(7.1±1.3)IU/L，較SA1組相比有明顯增高（P<0.05）；⑥OA2組,OB2組：10Hz，10min的EFS可引發LH分泌的短暫升高（OA2組），這種作用可被TTX阻斷（OB2組）；⑦OA3~OA5組,OB3~OB5組LH濃度在其相應參數EFS后與基礎水平相比均無顯著性變化.SA2，SB2，OA2和OB2組的LH值變化曲線見圖1.

3討論

LH是AP分泌的一種重要的生殖激素，傳統觀點認為其分泌受到下丘腦促性腺激素釋放激素脈沖分泌和性腺甾體激素的負反饋雙重調節［6］.我們研究組以前的工作發現，卵巢切除可增加AP中神經纖維的數量及其與促性腺激素細胞形成的突觸的比例［3,7］.在本實驗中為了更加容易監測到EFS對離體垂體LH分泌的影響，我們采用了卵巢切除術后7d大鼠作為實驗動物.與假手術組的大鼠相比，無論單純灌流還是施加各種參數的EFS，OVX組灌流液中LH的濃度均明顯高于SO組，提示卵巢切除可使垂體前葉LH分泌增加.

本實驗發現，Krebs液灌流的AP組織薄片在10Hz，10min的EFS下LH的分泌明顯增加，且該效應在用含1μmol/LTTX的Krebs液灌流時被明顯抑制，因而我們認為這種現象主要是電場刺激興奮了垂體前葉的神經纖維所致.盡管垂體腺細胞上存在TTX敏感型Na+通道［8］，但它并不與激素的基礎分泌有關，促性腺激素（gonadotropin,GTH）分泌主要是由持久型電壓門控Ca2+通道引起的，離體培養的促性腺激素細胞受到刺激興奮后加入TTX并不能抑制GTH的分泌［9］.因此，我們認為EFS主要是興奮了神經纖維而介導了LH分泌效應，提示垂體前葉內神經纖維對LH存在直接神經調節.

以前我們曾報道，AP神經纖維對ACTH的分泌存在神經調節［4-5］，本實驗中我們進一步觀察到AP神經纖維對LH的分泌也存在直接的神經調節，引起LH分泌的刺激參數與誘發ACTH分泌的刺激參數不同.LH只有在10Hz，10min的EFS下才出現了分泌水平的改變，而10Hz，2min和2Hz，10min或2min的EFS刺激卻沒有任何效應，考慮其原因可能是AP內腺細胞膜上遞質受體的種類、數量及分布的不同而引起的.10Hz高頻刺激可引起AP神經纖維末梢釋放經典遞質和多肽類遞質，而2Hz低頻刺激引起經典類遞質的釋放［10］.LH對低頻刺激的不敏感的現象提示我們，AP神經纖維調控LH分泌可能是通過促性腺激素細胞膜上的多肽類受體介導的.另外，本實驗還觀察到LH分泌對10Hz刺激10min與同頻率刺激2min表現出不同的反應性，說明LH的分泌不僅依賴于刺激頻率，還依賴于刺激的時程，這可能與不同刺激方式釋放出遞質的量有關系.該實驗為AP受神經直接調控提供了初步的實驗依據，也使我們對LH的分泌模式增加了一種新的認識.但是與體液途徑相比，垂體前葉內神經纖維的“快速調節”在激素分泌調節中所占的比重及地位尚不明確，還有待我們進一步深入研究.

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